CN107064508A - 辅助结直肠癌早期诊断及预后监测的分子标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于结直肠癌筛查和监测的代谢标志物，所述代谢标志物为β‑羟基丁酸、5‑羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α‑酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2‑辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸、柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸和瓜氨酸。本发明还提供了辅助结直肠癌早期筛查、诊断及预后监控的试剂盒。利用本发明的小分子代谢标志物监测结直肠癌，不仅精确度大大提高，同时对后续临床应用研究的开展具有指导意义。

Description

辅助结直肠癌早期诊断及预后监测的分子标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及与结直肠癌早期筛查和预后监测相关的分子标志物及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是当今人类常见的四大恶性肿瘤之一，全世界每年有超过一百万的结直肠癌新增病例，其死亡率高达33％，位居各种癌症的第三位。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率正逐年增加，且呈年轻化趋势。结直肠癌的发生发展是一个多因素、多步骤的过程，发病机制尚不完全清楚。目前CRC病人5年存活率仍低于60％，临床疗效评价及预后监控还有待进一步改善。CRC患者的存活率与诊断时疾病的严重程度密切相关：早期患者的5年存活率可达90％以上，而晚期患者的存活率不到10％。
目前，用于结直肠癌早期筛查、诊断的方法主要包括：直肠指诊、粪便潜血试验、粪便脱落标记物检测、血清标记物检测以及结肠镜检查等。直肠指诊只能检查直肠癌对结肠癌的诊断无明显帮助。粪便潜血试验是最普遍的筛查方法，但是容易出现假阳性，漏诊率高。粪便脱落标记物检测是新技术，检测费用昂贵，难以用于大规模人群筛查。血清CEA检查诊断结直肠癌的敏感性低，早期诊断不明显。结肠镜检查则是一种侵入性检查，具有一定的危险性，不适用与结直肠癌的早期筛查。
因此，发展简单、可行的结直肠癌诊断及监控方法是提高CRC病人生存率亟待解决的关键问题。
代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是近年来系统生物学研究领域中最活跃的分支学科之一，广泛应用于癌症研究领域。代谢组学采用高灵敏度、高通量的现代仪器分析手段，定性、定量地研究肿瘤发生发展过程中代谢物的变化，筛选和鉴别新型肿瘤生物标志物，对肿瘤临床诊断及预后监控具有重要价值，展现出广阔的临床应用前景。多数研究都证实了代谢异常与结直肠癌的发生发展密切相关，为寻找结直肠癌相关的代谢性生物标志物奠定了基础。
发明内容
为了实现结直肠癌的早期发现、早期干预，及预后监控，本发明的目的在于提供用于结直肠癌早期筛查及预后监测的代谢标志物。
本发明的还一目的是提供所述代谢标志物在结直肠癌早期筛查及预后监测产品中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供用于结直肠癌检测的代谢标志物，所述代谢标志物为β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸、柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸。
本发明经进一步验证发现，在结直肠癌病人血清样本中所述代谢标志物β-羟基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸、甘油在结直肠癌患者中显著上调(高于健康对照者水平)，所述代谢标志物5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸在结直肠癌患者中显著下调(低于健康对照者水平)；所述代谢标志物柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸、延胡索酸在结直肠癌预后不良患者中显著下调(低于结直肠癌预后良好患者)。
进一步地，本发明提供了所述代谢标志物在结直肠癌筛查和监测中的应用。
优选的，利用所述代谢标志物筛查和监测结直肠癌的步骤为：(1)获取受试者生物样本；(2)检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物的浓度，确定受试者的代谢物谱；(3)将受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱中所述代谢标志物比较；(4)鉴定受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱的差异，受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱相比，其中所述代谢标志物β-羟基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸和甘油的浓度出现升高，所述代谢标志物5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸的浓度出现下降时，表明受试者易患有结直肠癌；(5)对于已确诊为结直肠癌的受试者，其术前血清中所述代谢标志物柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的浓度出现下降时，表明受试者结直肠癌预后不良。
优选的，检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物浓度的方法包括气相色谱-质谱分析、液相色谱-质谱分析、核磁共振分析、酶速法。
进一步地，本发明提供了一种辅助结直肠癌早期筛查及诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸组合标志物浓度的试剂。
优选的，所述试剂盒包括：
(1)标准品：β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸，所述标准品分别用于对应的血清样本中β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸的定性；
(2)血清样本处理液：所述血清样本处理液用于预处理来自受试者的血清样品，包括试剂1和试剂2，
试剂1包括甲醇-氯仿混合溶液(体积比为3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％TMCS的BSTFA)；
试剂2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、水-甲醇-乙腈混合溶液(体积比为1∶2∶7)；
(3)洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，纯水和乙腈。
进一步地，本发明提供了一种辅助结直肠癌早期筛查及诊断的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述β-羟基丁酸代谢标志物浓度的试剂。
优选的，所述试剂包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓剂、四乙酸二氨基乙烯二钠盐、β-羟基丁酸脱氢酶，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化镁。
进一步地，本发明提供了一种辅助结直肠癌预后监测的试剂盒，所述试剂盒为利用柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸组合标志物共同诊断结直肠癌患者预后情况的试剂盒。
优选的，所述试剂盒包括：
(1)标准品：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，所述标准品分别用于对应的血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的定性；
(2)血清样本处理液：所述血清样本处理液用于预处理来自受试者的血清样品，包括试剂1和试剂2，
试剂1包括甲醇-氯仿混合溶液(体积比为3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％TMCS的BSTFA)；
试剂2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、水-甲醇-乙腈混合溶液(体积比为1∶2∶7)；
(3)洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，纯水和乙腈。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了与结直肠癌相关的代谢标志物，并进一步证实所述代谢物可以作为检测结直肠癌的代谢性标志物。利用本发明的代谢标志物筛查并监测结直肠癌，不仅精确度大大提高，同时对后续临床应用研究的开展具有指导意义。
附图说明
图1. 12个潜在诊断标志物在CRC病人组和健康对照者组中的变化情况；
图2. 8个潜在预后标志物在两组CRC病人(预后良好组vs预后不良组)之间的变化情况；
图3.β-羟基丁酸在训练集和测试集中的ROC曲线分析结果；
图4. 12个代谢性诊断标志物组合变量在训练集和测试集中的ROC曲线分析结果；
图5.血清延胡索酸水平在不同病理分期CRC患者中的变化趋势；
图6.血清β-羟基丁酸水平在不同病理分期CRC病人中的变化趋势；
图7.结直肠癌预后相关代谢标志物组合变量、CEA及综合指标的ROC曲线分析结果；
图8. 8个预后标志物与CEA组成的综合指标的生存曲线分析结果；
图9.实施例5中血清β-羟基丁酸在CRC患者和健康对照者中的变化情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件提取血清。
本发明的病理分期是根据美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)联合修订的结直肠癌TNM分期(2010年第七版)。
本发明所用术语CEA(carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)为血清抗癌抗原，是一种常见的肿瘤标记物，已广泛应用于胃肠道肿瘤的临床辅助诊断及预后监控，对良恶肿瘤的判断有一定的临床价值，但CEA并非肿瘤特异性抗原，对结直肠癌的特异性不高。
本发明所用术语CRC为结直肠癌(Colorectal cancer)的英文缩写。
本发明的发明人利用气相色谱-飞行时间-质谱(GC-TOF-MS)和超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)平台，对结直肠癌(CRC)患者和健康对照者的血清样本进行检测分析，利用训练样本集和测试样本集，采用统计学分析和生物信息学分析，筛选出12个代谢标志物，上述代谢物与结直肠癌有关，提示上述代谢标志物可能具有很好的辅助诊断价值，可成为结直肠癌诊断标志物；另外，结合CRC病人的术后随访资料，对预后良好的CRC患者和预后不良的CRC患者术前血清代谢物进行统计学分析和生物信息学分析，筛选出8个与CRC预后相关的代谢物，提示这些代谢标志物可能具有很好的预后监测价值，可成为结直肠癌预后标志物。
实施例1基于GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS平台筛选差异代谢标志物
一、取样
临床样本1：收集101例经检查确诊的结直肠癌病人(CRC病人)和102例健康对照者的血清，编号后置于-80℃冰箱保存。结直肠癌病人样本来源于上海交通大学附属瑞金医院的住院患者，健康对照组样本来源于上海交通大学附属瑞金医院的体检中心。随机选取62例结直肠癌病人和62例健康对照者作为训练样本集，其余39例结直肠癌病人和40例健康对照者作为测试样本集，相关的临床信息见表1。本发明的所有临床样本均得到了上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准。
表1.样本临床信息
aCEA，carcinoembryonic antigen，癌胚抗原
临床样本2：基于临床样本1收集经手术切除治疗的结直肠癌病人，并对其术后生存状况进行随访调查，将具有详细预后信息的CRC病人分成了两组：预后良好组(3年以上随访结果：存活且无复发，n＝29例)和预后不良组(3年随访结果：死于癌症复发或转移，n＝23例)，两组CRC病人在性别组成(卡方检验，p＝0.65)和年龄分布(t-检验，p＝0.65)上均无显著差异，相关临床信息见表2：
表2预后良好组与预后不良组结直肠癌病人组织样本临床信息
a，3年以上随访结果存活且无复发；b，3年随访结果死于癌症复发或转移
二、血清样本前处理及检测
1、基于气相色谱-飞行时间-质谱(GC-TOF-MS)平台的血清样本前处理及检测
(1)将收集的血清样本室温下解冻，涡旋混匀后取100μL置干净的离心管中，加入300μL甲醇-氯仿混合溶液(体积比甲醇∶氯仿＝3∶1)，涡旋振荡30s，充分混匀，-20℃静置10min以帮助蛋白沉淀。接着12,000rpm离心10min(室温)，取300μL上清液至GC高回收进样瓶中。
(2)分别加入10μL 2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)和10μL十七烷酸(1mg/mL)作为内标，室温下真空干燥浓缩。干燥完毕后，用氮气(N2)对样品进行再次干燥，以保证样品中无水并排除空气中的湿气对后续衍生步骤的影响(空气湿度控制在35％以下)。
(3)氮气吹干后，迅速加入80μL甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)并加盖密封，振荡30s，置于30℃摇床(200rpm)上反应90min。反应完毕后，开启密封盖，迅速加入80μL硅烷化试剂BSTFA(含1％TMCS)，并立即加盖密封，振荡30s，置于70℃烘箱中反应60min，进行衍生化反应。反应结束后，再振荡10s，室温下静置1小时后进样检测。
(4)采用Leco公司的气相色谱-飞行时间-质谱联用仪(Agilent 6890N GC/Pegasus HT TOF-MS)进行分析测定。
气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱，进样口温度270℃；离子源温度220℃，接口温度270℃，程序升温起始温度为80℃，保持2min；以10℃/min的速度升至180℃，再以6℃/min的速度升至230℃，最后以40℃/min的速度升至295℃，保持8min。载气为氦气，载气流速为1mL/min。
质谱条件：离子源为标准EI源，电子能量为70eV；全扫描方式扫描。扫描范围：m/z30-600；以20张/秒进行质谱图采集。
2、基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)平台的血清样本前处理及检测
(1)将收集的血清样本室温下解冻，涡旋混匀后取80μL置干净的离心管中，分别加入10μL 2-氯苯丙氨酸水溶液(0.3mg/mL)和10μL十七烷酸(1mg/mL)作为内标。
(2)然后加入400μL萃取溶剂(水∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶7)，涡旋振荡2min，充分混匀，超声1min，-20℃静置10min以帮助蛋白沉淀。4℃，12，000rpm，离心20min。取上清液150μL于玻璃进样瓶的尖底内衬管，用于UPLC-Q-TOFMS正离子检测。
(3)另外，取上清液150μL于1.5mL离心管，-80℃冻存，负离子检测备用。负离子进样检测前，涡旋混匀2min，4℃，12，000rpm，离心15min，取100μL于玻璃进样瓶的尖底内衬管，用于UPLC-Q-TOF-MS负离子检测。
(4)采用美国Waters公司超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪(Acquity Ultra Performance LC-Q-TOF Premier)进行分析测定。
液相色谱条件：
1)正离子模式(ES+)：流动相A为含1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；
2)负离子模式(ES-)：流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液。
流动相洗脱梯度如下表：
表3流动相洗脱梯度
质谱条件：以氮气作为雾化、锥孔气。飞行管检测模式V型；离子源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流50L/h；脱溶剂气650L/h；
对于电喷雾电离正离子(ESI+)模式：毛细管电压设为3.2kv，锥孔电压设为35v，亮氨酸脑啡肽作为锁定质量数：m/z＝556.2771；
对于电喷雾电离负离子(ESI-)模式：毛细管电压设为3kv，锥孔电压设为50v，亮氨酸脑啡肽作为锁定质量数：m/z＝554.2615。
质荷比范围：50-1000m/z；扫描时间设为0.3s，扫描时间间隔为0.02s。
三、数据处理
1、GC-TOF-MS数据的提取及代谢物鉴定
采用Leco公司的代谢组学数据处理软件包ChromaTOF software(版本4.34，LECO，USA)对于原始GC-TOFMS数据进行提取，得到由化合物的样本信息(物质名及特征性指标m/z)、保留时间及峰强度组成的三维矩阵数据。通过将谱峰的保留时间和质荷比信息导入NIST 11标准质谱数据库进行搜索匹配(质谱碎片离子图匹配度阈值设为＞800)，并利用合作实验室(上海交通大学系统生物医学研究院贾伟教授课题组)自行建立的代谢物标准品质谱库进行代谢物的鉴定。
2、UPLC-Q-TOF-MS数据的提取及代谢物鉴定
采用Waters公司提供的商业软件MassLynx(v4.1Waters，Manchester，U.K.)对原始UPLC-Q-TOFMS数据进行提取，得到由样本名(观测值)、保留时间(R.T.)-质荷比(m/z)成对的分配峰指数及离子峰强度(变量)组成的三维数据矩阵。
相关参数设置为：色谱保留时间范围设为0～9.5min；提取质荷比范围及窗口分别设为50-1000Da和0.05Da；最小峰强度设为基峰的5％；保留时间的容许误差设为0.3min。数据处理中，剔除了数据矩阵中在大于80％样本中均缺失的峰、内标峰、一些溶剂峰和系统冗余峰。通过合作实验室自行建立的代谢物标准品质谱库和开放的人类代谢组数据库(HMDB，http：//www.hmdb.ca/)搜索匹配鉴定血清代谢谱中的代谢物。
对于标准品质谱数据库，设定匹配标准为：精确质量数差异(实测质量数与数据库中质量数)＜0.02Da，保留时间差异(实测保留时间与数据库中保留时间)＜0.5min。对于HMDB数据库搜索匹配标准为：准分子峰精确质量数差异(实测质量数与数据库记载)＜0.005Da。
四、差异代谢标志物筛选
1、结直肠癌潜在的代谢性诊断标志物筛选
利用临床样本1中训练样本集的血清代谢数据，通过多维统计分析(正交偏最小二乘法-判别分析，OPLS-DA)建立CRC患者和健康对照者的诊断模型，再利用测试样本集对建立的诊断模型的预测能力进行检验。然后结合多维统计分析(OPLS-DA)、单维统计分析(Mann-Whitney U检验)、以及经典的医学统计分析(ROC曲线)来进行结直肠癌相关代谢性标志物的筛选，并对其进行代谢通路分析。设定潜在的代谢性诊断标志物筛选标准为：OPLS-DA模型中的变量重要性投影值VIP＞1，Mann-Whitney U检验p＜0.05，且ROC曲线分析曲线下面积(AUC)＞0.85。经筛选，有12个差异代谢物：5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、β-羟基丁酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸符合上述筛选标准，如表4所示：
表4.结直肠癌潜在的代谢性诊断标志物筛选结果
aVIP，Variable importance in the projection，变量重要性投影值。b，P，UPLC-Q-TOF-MS平台正离子模式；N，UPLC-Q-TOF-MS平台负离子模式；G，GC-TOF-MS平台
这12个潜在诊断标志物在CRC病人组和健康对照者组中的变化情况如图1所示，结果显示它们在训练集和测试集中具有一致的变化趋势，具备良好的稳定性，可以作为结直肠癌早期筛查和诊断的代谢标志物。
2、结直肠癌潜在的代谢性预后标志物筛选
利用临床样本2的血清代谢数据，对两组CRC患者(预后良好组vs预后不良组)的血清代谢物数据进行统计分析(Mann-Whitney U检验)和经典的医学统计分析(ROC分析)，基于统计分析结果进行结直肠癌预后相关差异代谢物的筛选，设定筛选标准为：Mann-Whitney U检验p＜0.05，且ROC分析中AUC＞0.7。经筛选，有8个差异代谢物：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸、延胡索酸满足上述筛选标准，如表5所示。
表5.结直肠癌潜在的代谢性预后标志物筛选
这8个潜在预后标志物在两组CRC患者(预后良好组vs预后不良组)之间的变化情况如图2所示，结果显示它们在结直肠癌预后不良病人中显著下调，可以作为结直肠癌预后代谢标志物。
实施例2代谢性诊断标志物在临床上区分CRC患者和健康人的ROC分析
一、取样
样本的收集同实施例1中临床样本1。
二、血清样本前处理及检测
血清的处理及检测方法同实施例1。
三、数据处理
数据处理方法也同实施例1
四、ROC分析
1、β-羟基丁酸的ROC分析
利用统计分析软件SPSS(v19，IBM，USA)对其进行ROC分析。结果如图3所示：在训练样本集和测试样本集中，利用血清中β-羟基丁酸水平来区分CRC患者和健康人的曲线下面积(AUC值)分别高达0.925和0.951，而且其诊断敏感度均高于90％，特异度也达80％以上。
2、12个代谢性诊断标志物组合变量的ROC分析
利用SPSS统计分析软件中的逻辑回归算法，拟合代谢物组合变量P＝160.4073+(-0.2908)×5-羟色胺+(0.0214)×溶血磷脂酰胆碱(C14：0)+(-0.0263)×溶血磷脂酰胆碱(C16：1)+(0.0072)×α-酮丁酸+(-0.0354)×延胡索酸+(-0.0122)×天冬氨酸+(-0.0001)×β-羟基丁酸+(-0.1423)×2-辛烯二酸+(-0.0004)×甘油+(-0.0502)×甘油酸+(-0.0130)×色氨酸+(0.0098)×顺乌头酸。对该组合变量进行ROC分析，计算其曲线下面积(AUC)。
结果显示：该代谢物组合变量在训练集中区分CRC病人和健康对照者的AUC值高达1.00，灵敏度和特异度均为1.00。其在测试集中区分CRC病人和健康对照者的AUC值达0.977，敏感度为0.927，特异度为0.965，如图4所示。该组合变量P具有很好的诊断准确性和稳定性，筛选出的这12个关键性差异代谢物可用作结直肠癌潜在的诊断标志物。
实施例3代谢标记物在不同病理分期的结直肠癌患者中的分析
一、取样
样本的收集同实施例1中临床样本1。
二、血清样本前处理及检测
血清的处理及检测方法同实施例1。
三、数据处理
数据处理方法也同实施例1。
四、根据临床病理资料进行分析，其中，延胡索酸随着病理严重程度的增加(I期→IV期)依次降低(如图5所示)，而且在早期患者(I期+II期)和晚期患者(III期+IV期)之间存在显著差异(p＝0.03)。血清β-羟基丁酸在早期的CRC患者中已经显著升高，而且随着病理严重程度的增加(I期→IV期)而依次升高(如图6所示)。
实施例4代谢性预后标志物在临床上辅助监控结直肠癌患者的预后
一、取样
样本的收集同实施例1中临床样本2。
二、血清样本前处理及检测
血清的处理及检测方法同实施例1。
三、数据处理
数据处理方法也同实施例1
四、ROC分析
1、8个代谢性预后标志物组合变量的ROC分析
利用SPSS统计分析软件中的逻辑回归算法，拟合预后代谢物组合变量Q＝4.17005+(-0.00534)×柠檬酸+(-0.00032)×鸟氨酸+(-0.00244)×单棕榈酸甘油酯+(-0.00023)×肌酐+(-0.00065)×甲硫氨酸+(0.00138)×瓜氨酸+(-0.00004)×色氨酸+(-0.00004)×延胡索酸，对该组合变量进行ROC分析，计算其曲线下面积(AUC)。
结果显示：该代谢物组合变量区分预后良好和预后不良的两组结直肠癌病人的AUC值达0.821，如图7所示中点画线所示，而传统预后标记物CEA的AUC值仅为0.656，如图7所示中长虚线所示。该组合变量Q具有比传统预后标记物更好的预后准确性，筛选出的这8个差异代谢物可用作结直肠癌潜在的预后监控标志物。
2、进一步地，利用SPSS统计分析软件中的逻辑回归算法，联合以上8个差异代谢物和CEA拟合综合指标I＝6.1298+(-0.0212)×柠檬酸+(-0.0006)×鸟氨酸+(-0.0045)×单棕榈酸甘油酯+(-0.0005)×肌酐+(0.0033)×甲硫氨酸+(0.0024)×瓜氨酸+(-0.0007)×色氨酸+(0.0020)×延胡索酸+(0.1561)×CEA。
结果显示：该综合指标区分预后良好和预后不良的两组CRC病人的AUC值高达0.906，图7中实黑线所示。联合使用上述8个代谢性标志物和临床指标CEA，将能更好地辅助结直肠癌的预后监控。
五、生存分析
基于ROC分析结果，设定约登指数为最大值时所对应的综合指标值为区分阈值(Cut off＝-1.2126)，将52例有预后信息的结直肠癌病人分为两组：高水平组(综合指标＞-1.2126，n＝34)和低水平组(综合指标＜-1.2126，n＝18)，然后进行Kaplan-Meier生存分析。
结果发现：综合指标值处于高、低水平的两组结直肠癌病人之间的生存率存在非常显著的差异(Log-rank检验，p＜0.0001)，结果如图8所示。进一步说明该综合指标(即联合CEA和8个CRC预后相关的代谢性标志物)具有良好的临床应用潜能。
实施例5辅助结直肠癌早期筛查及诊断试剂盒1
用于辅助结直肠早期筛查及诊断的试剂盒包括：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓剂(60mM)、四乙酸二氨基乙烯二钠盐(25mM)、β-羟基丁酸脱氢酶(32M)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(2.5mM)、氯化镁(2mM)、蔗糖(35mM)。
一、取样
收集96例经检查确诊的结直肠癌患者和80例健康对照者的血清，编号后置于-80℃冰箱保存。本实验中选用了来自多个中心的临床样本，CRC患者样本来源于中山大学第一附属医院和中山大学肿瘤防治中心的住院患者，健康对照组样本来源于中山大学第一附属医院的体检中心。本发明的所有临床样本均得到中山大学第一附属医院和中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准。
二、检测
1、采用本发明所述辅助结直肠早期筛查及诊断试剂盒和自动生化分析仪定量分别检测96例CRC病人血清样本和80例健康对照者血清样本中β-羟基丁酸的浓度。
2、将得到的数据进行统计分析，结果如图9所示：新一批多中心来源的临床样本中，CRC患者的血清β-羟基丁酸水平显著高于健康对照者的水平(FC＝2.64，p＜0.0001)，与基于色谱-质谱平台的检测结果一致，验证了该诊断试剂盒用作辅助CRC临床筛查和诊断的可靠性。
实施例6辅助结直肠癌早期筛查及诊断试剂盒2
用于辅助结直肠癌早期筛查及诊断试剂盒包括：β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸，血清样本处理液，洗脱液；
(1)标准品：β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸，所述标准品分别用于对应的血清样本中β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸的定性；
(2)血清样本处理液：所述血清样本处理液用于预处理来自受试者的血清样品，包括试剂1和试剂2，
试剂1包括甲醇-氯仿混合溶液(体积比为3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％TMCS的BSTFA)；
试剂2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、水-甲醇-乙腈混合溶液(体积比为1∶2∶7)；
(3)洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，纯水和乙腈。
利用该试剂盒中的血清样本处理液对血清样本进行处理，通过GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS平台对血清样本进行检测，洗脱液使用该试剂盒中的洗脱液，利用该试剂盒中的标准品对血清样本中β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸进行定性定量分析，最后得出血清样本中β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸的浓度。
实施例7辅助结直肠癌预后监测试剂盒
用于辅助结直肠癌预后监测的试剂盒1包括：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，血清样本处理液，洗脱液；
(1)标准品：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，所述标准品分别用于对应的血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的定性；
(2)血清样本处理液：所述血清样本处理液用于预处理来自受试者的血清样品，包括试剂1和试剂2，
试剂1包括甲醇-氯仿混合溶液(体积比为3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/mL)、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅基)三氟乙酰胺；
试剂2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL)、十七烷酸(1mg/mL)、水-甲醇-乙腈混合溶液(体积比为1∶2∶7)；
(3)洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，水和乙腈。
一、取样
收集10例经手术切除治疗的结直肠癌病人和10例对照者的血清样本，编号后置于-80℃冰箱保存。结直肠癌病人样本来源于中山大学第一附属医院的住院患者，对照者为经手术切除治疗三年以上且无复发的结直肠癌病人，样本同样来源于中山大学第一附属医院。本发明的所有临床样本均得到中山大学第一附属医院伦理委员会批准。
二、检测
1、采用本发明所述辅助结直肠预后试剂盒检测10例结直肠病人血清样本和10例对照者血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的浓度。利用该试剂盒中的血清样本处理液对每一例血清样本进行处理，通过GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS平台对血清样本进行检测，洗脱液使用该试剂盒中的洗脱液，利用该试剂盒中的标准品对血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸进行定性定量分析，最后得出血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的浓度。
2、将10例结直肠癌病人血清样本中预后标志物(柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸)浓度和10例对照者血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的浓度均值进行对比，判断其预后情况，判断标准定为：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸8个标记物的全部下调判断为结直肠癌病人转移复发，否则判断为无进展生存，同时，结合病人临床随访资料分析该预后试剂盒的结果。结果如表6所示：
表6结直肠癌预后检测试剂盒检测转移复发
由表6可知，结直肠癌预后检测试剂盒检测结果为10例病人中有6例结直肠癌病人转移复发，有4例无进展生存，临床随访资料显示，10例病人中有4例转移复发，6例无进展生存，其中标号分别为4、10号病人的试剂盒检测结果和临床随访结果不一致。结果显示：试剂盒检测结果与临床结果的符合率达80％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于结直肠癌筛查和监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物为β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸、柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸和/或瓜氨酸中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物β-羟基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸、甘油在结直肠癌患者中显著上调(高于健康对照者水平)，所述代谢标志物5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸在结直肠癌患者中显著下调(低于健康对照者水平)；所述代谢标志物柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸、延胡索酸在结直肠癌预后不良患者中显著下调(低于结直肠癌预后良好患者)。
3.如权利要求1或2所述的代谢标志物在结直肠癌筛查和监测中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述代谢标志物筛查和监测结直肠癌的步骤为：(1)获取受试者血清样本；(2)检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物的浓度，确定受试者的代谢物谱；(3)将受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱中所述代谢标志物进行比较；(4)鉴定受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱的差异，受试者代谢物谱与健康对照者代谢物谱相比，其中所述代谢标志物β-羟基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸和甘油的浓度出现升高，所述代谢标志物5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸和顺乌头酸的浓度出现下降时，表明受试者易患有结直肠癌；(5)对于已确诊为结直肠癌的受试者，其术前血清中所述代谢标志物柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的浓度出现下降时，表明受试者结直肠癌预后不良。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物浓度的方法包括气相色谱-质谱分析、液相色谱-质谱分析、核磁共振分析、酶速法。
6.一种辅助结直肠癌早期筛查及诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测β-羟基丁酸、5-羟色胺、溶血磷脂酰胆碱(C14：0)、溶血磷脂酰胆碱(C16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、顺乌头酸这些标志物组的浓度的试剂。
7.一种辅助结直肠癌早期筛查及诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测所述β-羟基丁酸代谢标志物浓度的试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓剂、四乙酸二氨基乙烯二钠盐、β-羟基丁酸脱氢酶，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化镁。
9.一种辅助结直肠癌预后监测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为利用柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸组合标志物共同预测结直肠癌患者预后情况的试剂盒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)标准品：柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，所述标准品分别用于对应的血清样本中柠檬酸、鸟氨酸、单棕榈酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的定性；
(2)血清样本处理液：所述血清样本处理液用于预处理来自受试者的血清样品，包括试剂1和试剂2，
试剂1包括甲醇-氯仿混合溶液、2-氯苯丙氨酸、十七烷酸、甲氧胺吡啶溶液、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺；
试剂2包括2-氯苯丙氨酸、十七烷酸、水-甲醇-乙腈混合溶液；
(3)洗脱液：水溶液(含1％甲酸)、乙腈溶液(含0.1％甲酸)、纯水、乙腈。
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