CN114965733B - 结直肠进展期腺瘤诊断代谢标志物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结直肠进展期腺瘤诊断代谢标志物及其应用，该代谢标志物选自D‑山梨糖醇、羟基色胺、N‑乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5‑羟色胺、十二烷酸、1‑萘乙酸、4‑硝基苯酚中的一种或多种。本发明提供8种代谢标志物能准确诊断结直肠进展期腺瘤，灵敏度高，特异性强，能够替代现有基于血液和粪便检测诊断结直肠进展期腺瘤的方法，减少创伤和漏诊率，降低检测费用，具备临床使用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及诊断检测技术领域，具体涉及一种结直肠进展期腺瘤诊断代谢标志物组合及其应用。
背景技术
进展期腺瘤包括直径≥10mm的腺瘤、包含25％以上绒毛成分的腺瘤、或伴有高级别异型增生/黏膜内癌的腺瘤。进展期腺瘤是结直肠癌发展的前期阶段。目前常用的进展期腺瘤筛查手段主要是结直肠镜检查、大便潜血测试(FOBT)和粪便免疫化学测试(FIT)检测技术。其中，结直肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，是癌前病变和发病最有效的筛查方法。结肠镜检查的优点是高灵敏度，缺点是侵入性检查，会引起肠道不适，并且依赖于大型设备和医生的专业知识水平。因此，结肠镜检测筛查的依从性差，不适用在普通人群中进行大规模推广。大便潜血测试(FOBT)和粪便免疫化学测试(FIT)检测技术具有非侵入性、成本低的优点，但是容易出现假阳性、漏诊率高，其灵敏度只有20％～40％。
另外，近些年新发展起来的基因突变检测和如糖抗原(CA19-9)以及血浆癌胚抗原(CEA)等血浆标志物检测具有低侵入性、简单、快捷的优点，但是基因检测价格昂贵，血浆肿瘤抗原标志物检测的特异度和灵敏度很低，对进展期腺瘤无特异性，早期诊断不明显。因此，开发一种具有低成本、较高准确性的进展期腺瘤筛查和诊断的方法迫在眉睫。
发明内容
基于此，有必要提供一种结直肠进展期腺瘤诊断代谢标志物组合及其应用，能够很好地替代现有结直肠镜检查及化学法检测诊断模式，减少创伤和漏诊率，具备临床使用推广价值。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物，所述代谢标志物至少选自D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚中的至少一种。
本发明提供一种用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物，所述代谢标志物至少选自D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺中的至少一种。
进一步地，所述代谢标志物的组合还选自十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚中的至少一种。
本发明还提供上述用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物及其组合在制备诊断或监测进展期腺瘤的代谢物数据库、试剂盒中的应用。
本发明提供一种试剂盒，包括用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物的标准品。所述检测试剂盒还可以包括溶解试剂、提取试剂和内标物。所述内标物为L-苯基丙氨酸。
本发明还提供一种用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：分别采集健康对照组样本和进展期腺瘤患者组样本；采用LC-MS检测健康对照组样本和进展期腺瘤患者组样本，经判别分析，获得候选差异代谢物；对所述差异代谢物及其组合进行受试者工作特征曲线分析，确定用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的代谢标志物。
在其中一些实施例中，LC-MS检测的条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；
流动相：A相为含0.04％乙酸水溶液，B相为含0.04％乙酸的乙腈溶液，流速0.4mL/min；
洗脱梯度程序为：
0min，A相与B相的体积比为95:5；
11.0min，A相与B相的体积比为10:90；
12.0min，A相与B相的体积比为10:90；
12.1min，A相与B相的体积比为95:5；
14.0min，A相与B相的体积比为95:5。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明采用大规模临床样本进行血浆代谢组学研究获得针对结直肠进展期腺瘤诊断的8种代谢标志物，单个代谢标志物ROC曲线下的面积AUC值大于0.6，在0.603～0.741之间；多个代谢标志物组合的性能明显优于单个代谢标志物，ROC曲线下的面积AUC值为0.638～0.857，并且代谢物组合诊断进展期腺瘤的灵敏度达到64％，特异性超过90％。采用本发明的8种血浆代谢标志物进行检测诊断时能够在降低筛查成本的同时提升结直肠癌诊断的特异性，仅通过取血检测就能实现诊断，无需额外采集组织样本，能够很好地替代现有的组织活检及化学法检测诊断模式，减少创伤和漏诊率，具备临床使用推广价值。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的代谢物OPLS-DA的S-plot图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
关键仪器信息分别见下表1：
表1实验仪器信息
| 名称 | 型号 | 品牌 |
| HPLC-TOF-MS | TripleTOF 6600 | SCIEX |
| LC-MS/MS | QTRAP 6500+ | SCIEX |
| 离心机 | 5424R | Eppendorf |
| 离心浓缩仪 | CentriVap | LABCONCO |
| 涡旋混合器 | VORTEX-5 | Kyllin-Be11 |
实施例1
本实施例提供一种结直肠进展期腺瘤血浆代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：
S1，采集样品
本研究在取得患者同意后，收集临床医学研究中心的100例健康对照(健康对照组)和88例进展期腺瘤患者(肠道进展期腺瘤组)的外周静脉血血浆样本。其中健康对照来源于体检后无肠道疾病的人群；进展期腺瘤患者经过结直肠镜检查和术后确诊。所有样本均无其它任何恶性肿瘤病史，无其他全身性重大疾病，无长期用药的慢性病史。各组样本间的年龄和性别均相匹配，采血时间均为清晨空腹状态。所有血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时分别取出血浆样品解冻后进行后续分析。
S2，血浆广泛靶向代谢组学分析
(1)样品预处理
从-80℃冰箱中取出步骤S1采集的样品，于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；样本解冻后，涡旋10s混匀，取样本50μL加入到对应编号的离心管中；加入300μL纯甲醇内标提取液(含100ppm浓度的L-苯基丙氨酸内标)；涡旋5min，静置24h，再于12000r/min、4℃条件下离心10min；吸取上清液270μL浓缩24h；再加入100μL由乙腈和水按照体积比1:1组成的复溶液中，用于LC-MS/MS分析。每个样本各取20μL混合成质控样本(QC)，每间隔15个样本采集一次。
(2)样品代谢物检测
表2实验试剂
| 化合物 | CAS编号 | 品牌 |
| 甲醇 | 67-56-1 | Merck |
| 乙腈 | 75-05-8 | Merck |
| 乙酸 | 64-19-7 | Aladdin |
| L-苯基丙氨酸 | 63-91-2 | isoreag |
确定液相色谱条件如下：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；柱温为40℃；进样量为2μL。
流动相：A相为含0.04％乙酸水溶液，B相为含0.04％乙酸的乙腈溶液。洗脱梯度程序为：0min，A相与B相的体积比为95:5；11.0min，A相与B相的体积比为10:90；12.0min，A相与B相的体积比为10:90；12.1min，A相与B相的体积比为95:5；14.0min，A相与B相的体积比为95:5。流速0.4mL/min。
确定质谱条件如下：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度500℃，质谱电压5500V(positive)或者-4500V(negative)，离子源气体I(GS I)55psi，气体II(GSII)60psi，气帘气(curtain gas,CUR)25psi，碰撞诱导电离(collision-activateddissociation，CAD)参数设置为高。
在三重四极杆(Qtrap)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declusteringpotential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行MRM模式扫描检测。
按照确定的液相色谱条件和质谱条件分别对样本进行分析检测：随机挑选健康对照组和肠道进展期腺瘤组中各20％的样本，采用增强离子扫描质谱(MIM-EPI)和飞行时间质谱(TOF)结合多反应监测采集模式的代谢组学方法，以及整合本地标准品数据库进行肠道进展期腺瘤血浆代谢物数据库构建。用液相色谱-质谱联用代谢组学方法和构建的肠道进展期腺瘤血浆代谢物数据库对采集的血浆样本进行分析，得到各血浆样本的原始质谱数据。
(3)图谱峰面积预处理和积分
基于肠道进展期腺瘤血浆特异性代谢物数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。通过液相色谱能够分离不同分子量的代谢物。利用三重四极杆的多反应监测模式(MRM)筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)。用MultiQuant软件打开样本下机质谱文件，根据质荷比、保留时间对原始质谱数据进行预处理和校正，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量，设置S/N>5，保留时间偏移不超过0.2min的峰保留；根据质谱峰强度计算峰面积得到代谢物相对含量信息，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存，用于下一步统计分析。
(4)实验质量控制
通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。CV值即变异系数(Coefficient of Variation)，是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数(Empirical CumulativeDistribution Function,ECDF)可以分析小于参考值的物质CV出现的频率，QC样本的CV值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：QC样本CV值小于0.5的物质占比高于85％，表明实验数据较稳定；QC样本CV值小于0.3的物质占比高于75％，表明实验数据非常稳定。同时监测检测过程中L-苯基丙氨酸内标CV值变化情况，内标CV值的变化小于20％，表明检测过程中仪器稳定性好。
(5)数据处理、分析及标志物筛选
将峰面积积分数据导入SIMCA软件(Version 14.1，Sweden)进行多元统计分析。通过建立正交-偏最小二乘法判别(OPLS-DA)模型，寻找健康人与进展期腺瘤患者之间贡献较大的代谢物(VIP>1.0)。如图1中深色色标记的点为VIP>1.0的代谢物，浅色标记的点为VIP<1.0的代谢物。然后通过T-test检验和FDR校正，设置FRD<0.05为差异显著性标准。最终筛选出VIP>1.0且FDR<0.05的差异代谢物，可能是潜在的诊断进展期腺瘤代谢生物标志物。
上述分析筛选的潜在进展期腺瘤代谢标志物，根据其保留时间，一级和二级质谱推测标志物的分子质量和分子式，并且与代谢物谱图数据库中的谱图信息进行比对，从而对代谢物进行定性鉴定。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，验证代谢标志物的结构。
利用二元逻辑回归向前逐步法筛选到8种差异代谢物能够诊断区分肠道进展期腺瘤：D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚，代谢物具体信息见下表3和表4：
表3筛选的8种血浆代谢标志物
表4肠道进展期腺瘤患者VS健康人代谢物差异
| 中文名称 | 差异倍数 | VIP | P value |
| D-山梨糖醇 | 0.80 | 1.48 | 2.25E-02 |
| 羟基色胺 | 0.92 | 1.38 | 6.43E-03 |
| N-乙酰基甘氨酸 | 1.13 | 1.87 | 5.93E-05 |
| 胸腺嘧啶 | 0.95 | 1.51 | 1.94E-02 |
| 5-羟色胺 | 0.95 | 1.51 | 7.81E-03 |
| 十二烷酸 | 0.93 | 1.17 | 1.18E-02 |
| 1-萘乙酸 | 0.91 | 1.05 | 1.47E-02 |
| 4-硝基苯酚 | 1.02 | 1.02 | 4.89E-02 |
由上表可以看出，与健康对照相比，肠道进展期腺瘤患者组中的N-乙酰基甘氨酸、4-硝基苯酚的代谢物含量同步提升，D-山梨糖醇、羟基色胺、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸以及1-萘乙酸的代谢物含量同步降低。
采用受试者工作特征曲线(ROC)分析代谢物对肠道进展期腺瘤的诊断性能。结果表明，D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚这8个差异代谢物单个用于诊断进展期腺瘤能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.6，具有临床诊断意义；这8个差异代谢物联合用于诊断时，AUC进一步提高，8个联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值达到0.857，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为64.0％和92.8％。单个及任意2～7个代谢物联合用于诊断时的AUC值见表5和表6：
表5单个代谢物用于进展期腺瘤诊断的AUC值
| 编号 | 中文名称 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | D-山梨糖醇 | 0.741 | 49.1％ | 84.4％ |
| 2 | 羟基色胺 | 0.719 | 44.5％ | 81.8％ |
| 3 | N-乙酰基甘氨酸 | 0.701 | 43.8％ | 80.5％ |
| 4 | 胸腺嘧啶 | 0.673 | 40.4％ | 77.1％ |
| 5 | 5-羟色胺 | 0.656 | 38.3％ | 75.7％ |
| 6 | 十二烷酸 | 0.646 | 36.7％ | 74.2％ |
| 7 | 1-萘乙酸 | 0.632 | 33.5％ | 72.8％ |
| 8 | 4-硝基苯酚 | 0.608 | 25.2％ | 70.6％ |
表6任意代谢物联合用于进展期腺瘤诊断的AUC值
| 联合个数 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 任意二个 | ≥0.643 | ≥36.1％ | ≥73.3％ |
| 任意三个 | ≥0.668 | ≥39.8％ | ≥76.1％ |
| 任意四个 | ≥0.682 | ≥41.3％ | ≥78.5％ |
| 任意五个 | ≥0.733 | ≥47.7％ | ≥82.4％ |
| 任意六个 | ≥0.758 | ≥50.5％ | ≥85.2％ |
| 任意七个 | ≥0.818 | ≥55.6％ | ≥88.7％ |
进一步优选代谢标志物组合D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸，构建诊断进展期腺瘤模型。这3个代谢标志物联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值达到0.803，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为52.4％和86.3％。
进一步优选代谢标志物组合D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺构建诊断进展期腺瘤模型。这5个代谢标志物联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值达到0.832，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为59.2％和90.2％。
实施例2检测验证
本实施例在取得患者同意后，收集了临床医学研究中心的100例健康对照和93例肠道进展期腺瘤患者的外周静脉血血浆样本。其中健康对照来源于体检后无肠道疾病的人群；肠道进展期腺瘤患者经过结直肠镜检查和术后确诊。所有样本均无其它任何恶性肿瘤病史，无其他全身性重大疾病，无长期用药的慢性病史。各组样本间的年龄和性别均相匹配，采血时间均为清晨空腹状态。所有血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时分别取出血浆样品解冻后进行后续分析。
本实施例与实施例1的检测条件和数据分析方法相同，检测和分析的差异代谢物为以下8种：D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚。
用于进展期腺瘤诊断模型，上述8个代谢标志物在进展期腺瘤患者体内发生显著变化，具体信息见表7：
表7肠道进展期腺瘤患者VS健康人代谢物
| 中文名称 | 差异倍数 | VIP | P value |
| D-山梨糖醇 | 0.82 | 1.66 | 3.25E-04 |
| 羟基色胺 | 0.91 | 1.42 | 3.46E-04 |
| N-乙酰基甘氨酸 | 1.09 | 1.44 | 3.12E-03 |
| 胸腺嘧啶 | 0.93 | 1.25 | 1.94E-02 |
| 5-羟色胺 | 0.94 | 1.13 | 2.81E-02 |
| 十二烷酸 | 0.94 | 1.06 | 3.18E-02 |
| 1-萘乙酸 | 0.92 | 1.07 | 3.71E-02 |
| 4-硝基苯酚 | 1.03 | 1.02 | 4.89E-02 |
这8个差异代谢物单个用于诊断进展期腺瘤患者能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.6，具有临床诊断意义。
这8个差异代谢物联合用于诊断时，AUC进一步提高，8个联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值达到0.851，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为64.5％和90.6％。单个及任意2～9个代谢物联合用于诊断时的AUC值见表8和表9：
表8单个代谢物用于进展期腺瘤诊断的AUC值
表9任意差异代谢物联合用于进展期腺瘤诊断的AUC值
| 联合个数 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 任意二个 | ≥0.638 | ≥37.1％ | ≥71.8％ |
| 任意三个 | ≥0.659 | ≥40.8％ | ≥74.1％ |
| 任意四个 | ≥0.676 | ≥43.1％ | ≥76.5％ |
| 任意五个 | ≥0.721 | ≥49.7％ | ≥79.6％ |
| 任意六个 | ≥0.753 | ≥52.3％ | ≥81.4％ |
| 任意七个 | ≥0.820 | ≥57.2％ | ≥85.7％ |
进一步优选代谢标志物组合：D-山梨糖醇、羟基色胺和N-乙酰基甘氨酸，构建诊断进展期腺瘤模型。这3个代谢物联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值到0.798，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为53.8％和84.5％。
进一步优选代谢标志物组合：D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺构建诊断进展期腺瘤模型。这5个代谢物联合起来诊断进展期腺瘤的AUC值达到0.823，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为58.4％和88.6％。
实施例3
本实施例提供一种用于肠道进展期腺瘤诊断或监测的试剂盒，包括：
(1)代谢标志物的标准品：D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚，单独分装或者混合封装。
(2)溶剂：
纯甲醇和50％乙腈水溶液，用于样品提取。
50％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂。
(3)内标物：L-苯基丙氨酸。
使用本实施例中用于诊断或监测肠道进展期腺瘤的检测试剂盒的筛查方法，包括如下步骤：
S1，收集血浆样本，预处理，获得供试液。
S2，采用LC-MS分析检测供试液，获得D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚的含量变化信息。
S3，依据上述代谢标志物的含量变化信息，判定是否可能属于肠道进展期腺瘤患者。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于结直肠进展期腺瘤诊断或监测的血浆代谢标志物组合，其特征在于，所述代谢标志物组合由D-山梨糖醇、5-羟色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚组成。
2.权利要求1所述的用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的血浆代谢标志物组合在制备诊断或监测结直肠进展期腺瘤的试剂盒中的应用。
3.一种用于结直肠进展期腺瘤诊断或监测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于诊断或监测结直肠进展期腺瘤的血浆代谢标志物组合的标准品。
4.根据权利要求3所述的用于结直肠进展期腺瘤诊断或监测的试剂盒，其特征在于，还包括提取试剂和内标物。
5.根据权利要求4所述的用于结直肠进展期腺瘤诊断或监测的试剂盒，其特征在于，所述内标物为L-苯基丙氨酸。
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