CN117929749A - 一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用。本发明基于代谢组学方法，利用结直肠癌患者和健康对照组的尿液样本，筛选获得12个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、5‑氨基乙酰丙酸、黄嘌呤、泛酸、L‑犬尿氨酸、正亮氨酸、刺桐碱、N‑甲酰基‑L‑蛋氨酸、胆碱、马尿酸和甜菜碱，从这12种标志物中选择7种或4种同样具有较好的临床诊断意义，并进一步将所述标志物在验证组中进行了验证。将12个代谢标志物在血浆样本中区分健康对照组和结直肠癌组，也具有很好的诊断效果。本发明提供的代谢标志物可同时应用于尿液和血浆生物样本，不仅样本获取方便，而且样本选择也具有多样性，因此，有潜力成为早期诊断和预后评估的工具。

Description

一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于代谢标志物分析及检测领域，具体涉及利用代谢组学筛选结直肠癌的生物标志物并用于结直肠癌的诊断，尤其涉及一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是作为世界最常见的癌症类型之一，具有高发病率和死亡率。据最新数据报道，2020年，估计全球范围内有超过190万例结直肠癌新发病例和超过93万例结直肠癌死亡病例，预计到2040年，结直肠癌负担将增加到每年320万例新发病例（增加63%）和160万例死亡病例（增加73%）。相比于2019年国家癌症中心发布的统计数据，结果发现我国结直肠癌发病率跃升至第二位，死亡率居第五位。CRC已成为全球日益严峻的临床挑战，而早期诊断被认为是提高CRC患者生存率的有效方法。

目前，临床上常用的结直肠癌筛查与诊断方法主要包括肛门指检、影像学检查、结直肠镜检查、粪便潜血、血液肿瘤标志物检测等方法。以上的检测方法主要分为侵入性与非侵入性检测，侵入性检测方法主要指结直肠镜检测，结合病理学组织切片，作为结直肠癌检测的金标准，该方法准确性较高，但具有侵入性、且容易造成并发症，导致患者依从性较低，且结直肠镜检查成本较高，资金高昂，不适用于大规模的高危人群筛查。非侵入性的检测方法主要包括影像学检查、肿瘤标志物检测等，影像学检查，包括CT扫描、MRI（磁共振成像）和超声等影像学技术，用于观察结直肠肿瘤的位置和范围，可以直接提供结直肠肿瘤的详细信息，如位置、大小和扩散情况，但其无法检测到较小的病变，只能作为结直肠癌诊断的辅助手段，经初步筛查确诊为阳性后，仍需结肠镜检查进行最终诊断。肿瘤标志物检测，常用到例如CEA（癌胚抗原）和CA199（糖类抗原199），但如CEA并非肿瘤特异性抗原，而是肿瘤相关性抗原，常导致检测结果缺乏特异性，且检测结果容易受到生活习惯、饮食摄入和药物等因素的影响、因此，目前仅作为结直肠癌辅助诊断指标和疗效监测手段。因此，急切需要找到可以为检测CRC的非侵入性检测手段带来更高准确度的新的生物标志物。

代谢组学作为一门新兴学科，近年来得到了巨大发展，尤其在疾病诊断领域得到了广泛研究与应用。代谢组学可以通过标准制备的血清、血浆、尿液等生物样本实现机体小分子代谢物的高通量检测，结合多元统计学分析，筛选差异显著的代谢标志物，将与疾病诊断与分型相关的一组代谢标志物，用于疾病的诊断与分型。基于代谢组学的疾病诊断方法相比于现有的方法，它具有非侵入性、微创性、以及较高的灵敏度与特异性，样本获取更加方便，在生物标志物的研究中具有广阔前景，虽然需要高度专业的技术和设备支持，数据分析复杂，且标准化程度相对较低，但这种方法可以明确结直肠癌的潜在分子机制，能够为早期和精确的预防、诊断和治疗结直肠癌提供方向，提高诊断的准确性，进一步提高结直肠癌患者的临床诊断效率和判断能力，有潜力成为早期诊断和预后评估的工具。

发明内容

本发明专利要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷与不足，基于代谢组学的方法，探寻结直肠癌代谢标志物，通过构建结直肠癌诊断模型预测结直肠癌，这有助于提高结直肠癌诊断的准确性，且适用于大规模的普通人群筛查，并有助于制定结直肠癌的预防和治疗措施。

通常，尿液和血浆中发现的代谢物种类存在显著差异。例如，尿液中能够检测到的尿素，血液中不存在，反观脂类和葡萄糖等能够在血浆中检测到的物质，并不能在尿液中检测到。即使有一些代谢物均存在于血浆和尿液中，但他们也不一定就能够成为结直肠癌诊断代谢标志物。本发明提供了一组可应用于尿液和血浆生物样本的代谢标志物，不仅样本获取方便，而且样本选择也具有多样性，因此，这一方法有潜力成为早期诊断和预后评估的工具。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了一种结直肠癌诊断生物标志物，所述标志物包括：次黄嘌呤、辛二酸、L-犬尿氨酸和马尿酸。

优选的，所述标志物还包括：5-氨基乙酰丙酸、刺桐碱和甜菜碱。

优选的，所述标志物还包括：黄嘌呤、泛酸、正亮氨酸、N-甲酰基-L-蛋氨酸和胆碱。

优选的，所述标志物为标志物组合。

本发明公开了一种组合物，所述组合物包括：次黄嘌呤、辛二酸、5-氨基乙酰丙酸、黄嘌呤、泛酸、L-犬尿氨酸、正亮氨酸、刺桐碱、N-甲酰基-L-蛋氨酸、胆碱、马尿酸、甜菜碱。

本发明公开了所述的标志物在制备诊断结直肠癌的试剂中的用途。

优选的，所述诊断过程中采用的样本选自血清、血浆，血液、干血片、尿液、干尿片或体液。

本发明公开了所述的标志物在制备诊断结直肠癌的试剂盒中的用途。

优选的，所述诊断过程中采用的样本选自血清、血浆，血液、干血片、尿液、干尿片或体液。

本发明公开了一种诊断结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的标志物。

优选的，所述试剂盒还包括质控品或标准品。

与现有结直肠癌诊断的技术相比，本发明通过代谢组学方法筛选出代谢标志物，构建具有较高灵敏度与特异性的结直肠癌诊断模型，提供了一种非侵入性，且准确性较高的方法。

附图说明

图1.尿液样本建模组中，区分健康对照组（HC）和结直肠癌组（CRC）的12个重要代谢标志物的多变量ROC曲线图。

图2.尿液样本验证组中，区分健康对照组（HC）和结直肠癌组（CRC）的12个重要代谢标志物的多变量ROC曲线图。

图3.血浆样本中，区分健康对照组（HC）和结直肠癌组（CRC）的12个重要代谢标志物的多变量ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1 结直肠癌尿液特异性代谢物离子对构建

1）受试者情况及样本采集

结直肠癌患者的纳入标准和排除标准如下：

纳入标准：

（1）年龄≥18岁的男性或女性；

（2）受试者阅读并充分理解患者须知，签署知情同意书；

（3）结直肠癌组：由活检/术后病理确诊或经由临床医生综合评估临床诊断为结直肠癌的患者。

排除标准：

（1）妊娠或哺乳期；

（2）急诊或需抢救；

（3）恶性肿瘤病史或采样前经过任何抗肿瘤治疗；

（4）同时合并多个原发恶性肿瘤。

收集了192例结直肠癌患者(Colorectal cancer，CRC)和128例健康对照组（Healthy Control，HC）的尿液样本。尿液样本均在清晨空腹时采集。所有采集的尿液离心后，放置-80度冰箱内保管。

2）尿液靶向代谢组学分析

（1）分析用试剂

- 试剂：质谱级别纯度的甲醇、乙腈、水、乙酸、异丙醇，色谱(HPLC)级别纯度的甲酸、乙酸铵和甲基叔丁基醚均购于美国Sigma-Aldrich公司；

（2）样本制备

尿液样本从-80度冰箱取出，冰上解冻后，涡旋10s混匀，取40 μL的尿液，置于400μL的预冷甲基叔丁基醚和甲醇混合溶液中，涡旋混匀获得样本提取液；向样本提取液中加入360 μL甲醇水混合溶液，超声、静置，涡旋，并离心分层；取下层300μL至离心管中，并向其中加入冰甲醇900 μL，沉淀蛋白质；将离心管离心，取上清液1000 μL转移至新离心管中，并干燥过夜；向干燥后的离心管中加入200 μL水复溶，室温下离心5分钟（12000 rpm）后，取180 μL上清液至2 mL玻璃进样小瓶中，为水相物质，上机（LC-MS）检测。

（3）代谢物检测离子对构建

基于代谢组学数据库(Metlin；(https://metlin.scripps.edu)、质谱数据库(http://www.massbank.jp/)等公共数据库，以及标准品数据库和文献等方式收集了尿液特异性代谢物的离子对，并且在结直肠癌患者和健康对照组中，随机各选取10个样本混合后，进行了检测，最终获得2138个尿液特异性代谢物数据库。

实施例2：结直肠癌尿液特异性代谢物靶向检测

1）色谱、质谱检测条件

液相色谱条件如下：

仪器与柱子信息：使用Waters ACQUTTY UPLC ® HSS T3 1.8µm 2.1*100mmcolumn柱子，进行小分子分离；仪器使用安捷伦1290液相；

流动相参数如下：流动相A 为含0.1%甲酸的水溶液；流动相B 为含0.1%甲酸的乙腈溶液。分离洗脱梯度如下：0-13 分钟为1%-70%流动相B，13-18 分钟为99%流动相B；

质谱参数如下：

质谱仪使用安捷伦6495三重四极杆；

质谱数据以多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式的扫描方式（含正负两种模式）进行采集，质谱所用的电离方式为电喷雾离子源（electrosprayionization, ESI），喷雾电压为3000V，雾化气20psi，鞘气流速11L/min；碰撞能电压（collision energy, CE）在5ev到80ev依据代谢物离子对进行优化,停留时间（Dwelltime）依据代谢物离子对强度时间在5ms到50ms内优化。

2）MRM图谱峰面积预处理

基于离子对MRM检测构建的尿液特异性代谢物数据库，针对尿液的代谢物检测进行靶向定性分析。样本制备方法与实施例1的样本制备方法相同。首先利用色谱技术对尿液中小分子代谢物进行分离，通过三重四级杆的MRM模式检测特定母离子的m/z值，以及碰撞能下从母离子掉下来的子离子的m/z值。前提是这一对母、子离子的质荷比与代谢物数据库中的离子对吻合时，才会检测保留特定离子的信号强度。接着，对质谱图进行检查，以确保离子峰的形状和信号质量良好，并进行去噪声或基线校正。随后，对每个母离子和子离子对进行峰识别，包括确定峰的位置和形状，在识别峰后，计算每个峰的峰面积，最后导出所有质谱峰面积积分数据保存。

实施例3 结直肠癌诊断代谢标志物筛选以及诊断模型构建

1）受试者情况

建模组与验证组所用的样本均为我们自己采集到的，且建模组样本与验证组样本不同，具体建模组人数：结直肠癌组147例尿液样本、健康对照组92例尿液样本；验证组人数：结直肠癌组45例尿液样本、健康对照组36例尿液样本（表1）；采用建模组尿液样本，筛选结直肠癌组和健康对照组显著差异代谢标志物，以及利用显著差异性代谢标志物构建结直肠癌诊断模型，最后为了评估诊断模型的有效性，采用验证组尿液样本，进行验证。

表1：受试者情况

2）结直肠癌诊断用代谢标志物筛选

基于尿液样本的建模组数据，利用峰面积积分数据，在健康对照组和结直肠癌组进行有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）,然后基于OPLS-DA结果的VIP>1，以及P值<0.05为差异显著性作为交集条件，筛选出的12个诊断结直肠癌的代谢标志物（表2）；

表2：区分健康对照组和结直肠癌组的12个重要代谢标志物

3）结直肠癌诊断模型构建

为了验证所筛选出的12个差异代谢物在区分健康对照组和结直肠癌组的高效性，进行了多变量ROC分析。随机将建模组样本数据的3/4分为训练集(training)，1/4作为测试集(test)，其中，训练集用于构建和训练机器学习分类模型，测试集用于验证训练后模型的判别能力，并使用SVM随机循环迭戈1000次，通过统计最终模型准确度的平均值的方法，构建了评估模型，结果显示，AUC=0.951，灵敏度=88.9%，特异性=87.5%（图1），说明该诊断模型能够有效诊断结直肠癌患者。ROC曲线是研究模型灵敏度和特异性之间相互关系的方法，以灵敏度(sensitivity)为纵坐标，1-特异性(1-specificity)为横坐标，评估依据是比较曲线下方的面积AUC大小，AUC在大于0.5的情况下，AUC越接近于1，则代表模型性能越好，说明诊断效果越好，若小于0.5，则表示模型的准确性不佳。

实施例4：使用7个尿液代谢标志物进行结直肠癌诊断模型的构建

本实施例与实施例1的研究对象，实施例2的检测分析方法相同，仅在用SVM方法构建结直肠癌诊断模型时，使用7个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、5-氨基乙酰丙酸、L-犬尿氨酸、刺桐碱、马尿酸和甜菜碱组合联合起来，在建模组尿液样本中，诊断结直肠癌的AUC=0.966，灵敏度=91.7%，特异性=95.8%，具有临床诊断意义。

实施例5：使用4个尿液代谢标志物进行结直肠癌诊断模型的构建

本实施例与实施例1的研究对象，实施例2的检测分析方法相同，仅在用SVM方法构建结直肠癌诊断模型时，使用4个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、L-犬尿氨酸和马尿酸组合联合起来，在建模组尿液样本中，诊断结直肠癌的AUC=0.932，灵敏度=75.0%，特异性=91.7%，具有临床诊断意义。

实施例6：使用验证组尿液样本进行模型验证

本实施例与实施例1的研究对象，实施例2的检测分析方法相同，为了验证所构建的诊断模型的有效性，我们把验证组尿液样本作为未知样本进行了验证。使用12个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、5-氨基乙酰丙酸、黄嘌呤、泛酸、L-犬尿氨酸、正亮氨酸、刺桐碱、N-甲酰基-L-蛋氨酸、胆碱、马尿酸、甜菜碱组合联合起来构建的结直肠癌诊断模型中，验证结果为，AUC=0.909，灵敏度=77.1%，特异性=78.1%（图2）；使用7个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、5-氨基乙酰丙酸、L-犬尿氨酸、刺桐碱、马尿酸和甜菜碱组合联合起来构建的诊断模型中，验证结果为，AUC=0.88，灵敏度=77.1%，特异性=78.1%；使用4个尿液代谢标志物，次黄嘌呤、辛二酸、L-犬尿氨酸和马尿酸组合联合起来构建的诊断模型中，验证结果为，AUC=0.854，灵敏度=79.2%，特异性=0.75%；以上结果表明我们建立的预测模型在验证组中同样具有较好的诊断效果。

实施例7.基于血浆样本靶向代谢组构建结直肠癌诊断模型

1）受试者情况及样本采集

该实施例中结直肠癌的纳入标准和排除标准同实施例1一样，共收集了209例结直肠癌患者和236例健康对照组的血浆样本（表1）。血浆样本均在清晨空腹时采集。所有采集的血浆样本，放置-80度冰箱内保管。

2）样本制备：血浆样本从-80度冰箱取出，冰上解冻后，涡旋10s混匀，取100μL的血浆，置于1000μL预冷甲基叔丁基醚和甲醇混合液中，涡旋混匀获得样本提取液；向样本提取液中加入500μL甲醇水混合液，超声、静置，涡旋，并离心分层；取下层400μL至离心管中，并向其中加入冰甲醇1100μL，沉淀蛋白质；离心管中蛋白质沉淀后，将离心管离心，取上清液1000μL转移至新离心管中，并干燥过夜；向干燥后的离心管中加入200μL水，并在室温下孵化15分钟，再离心5分钟（12000 rpm）后，取180μL上清液至2 mL玻璃进样小瓶中，为水相物质，上机（LC-MS）检测。

3）结直肠癌诊断代谢标志物靶向检测

（1）色谱、质谱检测条件

液相色谱条件如下：

仪器与柱子信息：使用Waters ACQUTTY UPLC ® HSS T3 1.8µm 2.1*100mmcolumn柱子，进行小分子分离；仪器使用安捷伦1290液相；

流动相参数如下：A 为含0.1%甲酸的水溶液；流动相B 为含0.1%甲酸的乙腈溶液。分离洗脱梯度如下：0-13 分钟为1%-70%流动相B，13-18 分钟为99%流动相B；

质谱参数如下：

质谱仪使用安捷伦6495三重四极杆；

质谱数据以多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式的扫描方式（含正负两种模式）进行采集，质谱所用的电离方式为电喷雾离子源（electrosprayionization, ESI），喷雾电压为3000V，雾化气20psi，鞘气流速11L/min；碰撞能电压（collision energy, CE）在5ev到80ev依据代谢物离子对进行优化,停留时间（Dwelltime）依据代谢物离子对强度时间在5ms到50ms内优化。

（2）结直肠癌诊断代谢标志物靶向检测

本实施例与实施例2的代谢物检测和分析方法相同。基于离子对MRM检测构建的代谢物数据库,针对结直肠癌诊断用12个代谢标志物，在血浆样本中进行靶向检测，包括：次黄嘌呤、辛二酸、5-氨基乙酰丙酸、黄嘌呤、泛酸、L-犬尿氨酸、正亮氨酸、刺桐碱、N-甲酰基-L-蛋氨酸、胆碱、马尿酸、甜菜碱，最后导出质谱峰面积积分数据保存。

4）利用12个代谢标志物构建结直肠癌诊断模型

为了验证这12个代谢标志物在血浆样本中区分健康对照组和结直肠癌组的诊断效果，将验证组血浆样本作为未知样本，执行了多变量ROC曲线分析，结果显示AUC=0.957，灵敏度=90.6%，特异性=88.1%（图3），说明诊断模型在血浆样本中，同样具有较好的诊断效果。以上结果说明，我们筛选出来的代谢标志物，无论采集的是尿液样本，还是血浆样本，均可以通过靶向检测12个代谢标志物，能够高效区分结直肠癌组和健康对照组，表现出俱佳的诊断效能。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种结直肠癌诊断生物标志物，其特征在于，所述标志物包括：次黄嘌呤、辛二酸、L-犬尿氨酸和马尿酸。

2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括：5-氨基乙酰丙酸、刺桐碱和甜菜碱。

3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括：黄嘌呤、泛酸、正亮氨酸、N-甲酰基-L-蛋氨酸和胆碱。

4.权利要求1-3任一所述的标志物在制备诊断结直肠癌的试剂中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述诊断过程中采用的样本选自血清、血浆，血液、干血片、尿液、干尿片或体液。

6.权利要求1-3任一所述的标志物在制备诊断结直肠癌的试剂盒中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诊断过程中采用的样本选自血清、血浆，血液、干血片、尿液、干尿片或体液。

8.一种诊断结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的标志物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品或标准品。