CN109234397B

CN109234397B - 用于检测丁酸合成基因的引物对及试剂盒

Info

Publication number: CN109234397B
Application number: CN201811203026.0A
Authority: CN
Inventors: 李菁; 王雪; 王马洁
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109234397A

Abstract

本发明公开了一种用于检测丁酸（丁酰CoA:乙酸CoA转移酶，butyryl‑CoA:acetate CoA transferase）合成基因的引物对及试剂盒。基于筛选到的一种来自于肠道细菌Alistipes putredinis的丁酸合成基因在人体内高表达（命名为but基因），其基因序列如SEQ ID NO.1所示，找到了具有特异性且定量效果理想的引物对组合，并设计了检测试剂盒。本发明有效克服了现有技术对肠道细菌中结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）风险基因检测的不足，能提高CRC疾病的预测率。本发明的试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景，且具有高度产业化利用价值。

Description

用于检测丁酸合成基因的引物对及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测丁酸(丁酰CoA:乙酸CoA转移酶，butyryl-CoA:acetate CoA transferase)合成基因的引物对及试剂盒。

背景技术

近年来，散发性结肠直肠癌(CRC)的发病率和死亡率在全球范围呈上升趋势，寻找诊断和治疗的新靶点很有必要。CRC发病率高的同时，预后也让人感到担忧，其早期症状隐匿，无特异性，早期诊断很困难是主要原因之一。现如今，CRC早期的特异性标记物多是血浆和血清生物标志物，且大多灵敏度和特异性受限，急需寻找更理想的CRC特异性生物标记物以改进当前的CRC诊断策略。

国内外大量研究表明，CRC患者体内的肠道菌群变化极其明显，尤其是产丁酸菌群(如Roseburia、Eubacterium、Faecalibacterium等)的变化，研究其变化及作用机制对阐明CRC的发生发展具有重要意义。研究发现，CRC粪便中的细菌可作为预测CRC癌前诊断的一种非侵入性的生物标志物。

截止目前，已有较多研究证实丁酸在CRC发生发展过程中起到重要的调控作用，丁酸多是为结肠上皮细胞提供能量，并结合宿主免疫反应减缓炎症反应，从而达到抗癌的效果。其实，微生物在癌症发生发展过程中扮演的角色较为复杂，抑癌和促癌可以兼而有之。研究表明，Alistipes是与CRC相关性较强的细菌之一，Alistipes的感染会增加CRC风险，尽管这种促进性效应机制不是很明晰，其所含的丁酰CoA:乙酸CoA转移酶(butyryl-CoA:acetate CoA transferase)产生基因在CRC患者中的表达水平显著高于健康人群中的表达水平，因此可以作为CRC的一个潜在的有效诊断靶标。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种用于检测丁酸(丁酰CoA:乙酸CoA转移酶，butyryl-CoA:acetate CoA transferase)合成基因的引物对及试剂盒，有效克服了对肠道细菌中CRC风险相关菌属基因检测的不足，能提高结直肠癌CRC疾病的预测率。

本发明系统性地在人类微生物组计划中发现了一系列丁酸合成基因(丁酰CoA:乙酸CoA转移酶，butyryl-CoA:acetate CoA transferase)，并筛选到一种来自于肠道细菌Alistipes putredinis的丁酸合成基因在人体内高表达，将其命名为but基因。其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于检测丁酸合成基因的引物对，所述引物对是用于扩增来自于肠道细菌Alistipes putredinis的丁酸合成基因的引物对，包括如下至少一组引物对：

第一组：如SEQ ID NO.2所示的上游引物，如SEQ ID NO.3所示的下游引物；

第二组：如SEQ ID NO.4所示的上游引物，如SEQ ID NO.5所示的下游引物；

第三组：如SEQ ID NO.6所示的上游引物，如SEQ ID NO.7所示的下游引物；

第四组：如SEQ ID NO.8所示的上游引物，如SEQ ID NO.9所示的下游引物；

第五组：如SEQ ID NO.10所示的上游引物，如SEQ ID NO.11所示的下游引物；

第六组：如SEQ ID NO.12所示的上游引物，如SEQ ID NO.13所示的下游引物；

第七组：如SEQ ID NO.14所示的上游引物，如SEQ ID NO.15所示的下游引物；

第八组：如SEQ ID NO.16所示的上游引物，如SEQ ID NO.17所示的下游引物；

第九组：如SEQ ID NO.18所示的上游引物，如SEQ ID NO.19所示的下游引物；

第十组：如SEQ ID NO.20所示的上游引物，如SEQ ID NO.21所示的下游引物。

进一步地，所述来自于肠道细菌Alistipes putredinis的丁酸合成基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于检测丁酸合成基因的试剂盒，包括至少一组上述引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料和qRT-PCR反应液。

进一步地，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg²⁺和dNTP。

一种用于检测丁酸合成基因的方法，包括以下步骤：

步骤1，提取待测对象粪便样本的基因组DNA；

步骤2，以步骤1的基因组DNA为模板，以上述引物对为引物进行qRT-PCR扩增；

步骤3，根据qRT-PCR扩增结果计算丁酸合成基因的表达水平。

进一步地，qRT-PCR扩增体系为：10μL的2×qRT-PCR反应液、10μM的引物各0.8μL、加ddH₂O至25μL，30μg/μL的DNA模板。

进一步地，qRT-PCR扩增反应程序为：95℃30s预变性；接40个循环：95℃5s、60℃45s。

本发明的有益效果是：本发明基于but基因，设计并获得其检测引物和试剂盒，有效克服了对肠道细菌中CRC风险相关菌属基因检测的不足，能提高结直肠癌CRC疾病的预测率。该qRT-PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景，且具有高度产业化利用价值。

附图说明

图1为实施例1中癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)作为诊断指标的ROC曲线。

图2为实施例2中癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)和but联合作为诊断指标的ROC曲线。

图3为实施例2中Alistipes putredinis细菌对CRC细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本领域的普通技术员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

本发明系统性地在人类微生物组计划中发现了一系列丁酸合成基因(丁酰CoA:乙酸CoA转移酶，butyryl-CoA:acetate CoA transferase)后，筛选到一种来自于肠道细菌Alistipes putredinis的丁酸合成基因在人体内高表达，命名为but基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

针对上述but基因，在前期大量的研究、分析后，包括序列特异性比较、扩增效率比较、定量准确性比较等。经过比对和实验验证，找到了具有特异性且定量效果理想的引物对组合，所述的引物序列如下：

第一组

如SEQ ID NO.2所示的上游引物(5’-CAGCGTCTACATTCAGGGCA-3’)，

如SEQ ID NO.3所示的下游引物(5’-CCGGAGTAGAGCGTGACATC-3’)；

第二组

如SEQ ID NO.4所示的上游引物(5’-GAAGTACTCGTCCGTGCCAT-3’)，

如SEQ ID NO.5所示的下游引物(5’-GTTATTGGCCACGAACAGGC-3’)；

第三组

如SEQ ID NO.6所示的上游引物(5’-CGATCCCCGAAGTACTCGTC-3’)，

如SEQ ID NO.7所示的下游引物(5’-AGGTTGAGGATTGCCACGTC-3’)；

第四组

如SEQ ID NO.8所示的上游引物(5’-GCACAGCAGCGTCTACATTC-3’)，

如SEQ ID NO.9所示的下游引物(5’-TCCGGAGTAGAGCGTGACAT-3’)；

第五组

如SEQ ID NO.10所示的上游引物(5’-TCACCGATGTCACGCTCTAC-3’)，

如SEQ ID NO.11所示的下游引物(5’-TATTCGGGGCTGCAATAGGG-3’)；

第六组

如SEQ ID NO.12所示的上游引物(5’-GATCCCCGAAGTACTCGTCC-3’)，

如SEQ ID NO.13所示的下游引物(5’-ATCCGGAGTAGAGCGTGACA-3’)；

第七组

如SEQ ID NO.14所示的上游引物(5’-TAAAGCTCATCTGCCCGCAC-3’)，

如SEQ ID NO.15所示的下游引物(5’-GTAGAGCGTGACATCGGTGA-3’)；

第八组

如SEQ ID NO.16所示的上游引物(5’-ATCCCCGAAGTACTCGTCCG-3’)，

如SEQ ID NO.17所示的下游引物(5’-AATCCGGAGTAGAGCGTGAC-3’)；

第九组

如SEQ ID NO.18所示上游引物(5’-GAAGCCGTAAAGCTCATCTGC-3’)，

如SEQ ID NO.19所示的下游引物(5’-CGAGTACTTCGGGGATCGAG-3’)；

第十组

如SEQ ID NO.20所示的上游引物(5’-CCCGAAGTACTCGTCCGTG-3’)，

如SEQ ID NO.21所示的下游引物(5’-GAATCCGGAGTAGAGCGTGA-3’)。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测but基因的试剂盒，包括至少一组上述引物对。还包括：DNA模板(如SEQ ID NO.1所示)、荧光染料SYBR Green II、qRT-PCR反应液。

其中，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、热启动Taq酶、Mg²⁺及dNTP。

本试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例1

实时荧光定量qRT-PCR初步验证Alistipes在CRC模型鼠和正常对照鼠中的丰度差异。

一、实验材料

选取CRC模型鼠和正常对照鼠的粪便样本提取样本的细菌基因组对Alistipes的丰度差异进行qRT-PCR的第一次实例验证。

二、试验方法

粪便细菌的基因组提取：采用MinkaGene Stool DNA kit试剂盒(货号DX1050-02)对粪便样本进行基因组的提取，获取终浓度在500-2000μg/μL的DNA样本。

目的基因but的扩增：使用Vazyme公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(货号Q331-02/03)进行实时荧光定量PCR。

采用第一组引物对进行扩增，上游引物(Primer1)5’-CAGCGTCTACATTCAGGGCA-3’，下游引物(Primer2)5’-CCGGAGTAGAGCGTGACATC-3’。

反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		2X ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)	10μL
Primer1(10μM)	0.8μL
		Primer2(10μM)	0.8μL
Template DNA	up to 30μg/μL
		ddH<sub>2</sub>O	To 20μL

qRT-PCR反应程序：95℃30s预变性；接40个循环：95℃5s、60℃45s。

三、实验结果

根据qRT-PCR的相对运量公式：2-△△Ct，分别计算出but基因在结直肠癌(CRC)模型组和配对正常组(CON)的粪便样本中的表达水平，比较结果如图1所示：but基因在CON中的表达水平主要集中在0.000～1.5e-05之间，而CRC中的but基因的表达量主要集中在1e-05～2.5e-05之间，显著高于CON组(p＝0.035)，以上结果说明该指标在CRC模型鼠的肠道细菌中普遍高表达。

实施例2

构建ROC曲线验证but基因序列SEQ ID NO.1用于辅助诊断区分CRC患者和健康志愿者的能力。

采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，CRC患者和健康志愿者粪便中特征菌属标志性基因but的表达水平判断其用于预测区分CRC疾病风险的能力。结果如图2所示，表明单独基本指标区分CRC患者的ROC曲线下面积(AUC)仅0.51，加入了but的表达指标后，AUC提高到0.72，具有临床预诊意义。

实施例3

用于探究Alistipes putredinis细菌对CRC细胞增殖产生的影响。

使用标准培养基(ATCC medium 260)培养Alistipes putredinis细菌培养值菌液密度OD₆₀₀＝0.5，以确认细菌达到对数期。通过离心(1000×g，15分钟)收集培养基，并通过0.22μm孔径的过滤器过滤，将pH调节至7.2-7.4。然后将细菌培养液与培养基混合，至终浓度为总培养基的5％、10％、20％、40％。将不同浓度的细菌培养液与结肠癌Caco-2细胞在96孔板里(细胞密度为5×10³/孔)共同孵育24h，48h，72h，观察Caco-2细胞的增殖情况。最后，将10μL CCK-8溶液加入每孔中，并将板在37℃下温育2h，于450nm处测得吸光度读数确定细胞活力。如图3所示，发现随着Alistipes putredinis菌液浓度的增加，癌细胞增殖能力更强，说明该菌株对CRC进程有一定的促进作用。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 用于检测丁酸合成基因的引物对及试剂盒

<130> 20181015

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgattca cgacagccgc cgaagccgta aagctcatct gcccgcacag cagcgtctac 60

attcagggca gcacctcgat ccccgaagta ctcgtccgtg ccatgaccga ccgtgccgcc 120

gagctcaccg atgtcacgct ctactccgga ttcgccgtcg ggagggcaga cgccccctat 180

tgcagccccg aatacaagga tacgttcctg gtcaacagcc tgttcgtggc caataacatc 240

cgccgctggc tggcccaggg ctacggacag tcgaccccgg ccttcctggg cgaaatccca 300

gggctgttcc gcgacgggac gctgcccgtc gacgtggcaa tcctcaacct ctcgcgcccc 360

aacgaggagg gctactgctc gttcggcgtc 390

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcgtctac attcagggca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggagtaga gcgtgacatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaagtactcg tccgtgccat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttattggcc acgaacaggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgatccccga agtactcgtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggttgagga ttgccacgtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcacagcagc gtctacattc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccggagtag agcgtgacat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaccgatgt cacgctctac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tattcggggc tgcaataggg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatccccgaa gtactcgtcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atccggagta gagcgtgaca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taaagctcat ctgcccgcac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtagagcgtg acatcggtga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

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<400> 16

atccccgaag tactcgtccg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

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<400> 17

aatccggagt agagcgtgac 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaagccgtaa agctcatctg c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgagtacttc ggggatcgag 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccgaagtac tcgtccgtg 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaatccggag tagagcgtga 20

Claims

1.一种用于检测丁酸合成基因的引物对，所述引物对是用于扩增如SEQ ID NO.1所示的but基因，包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

2.一种用于检测丁酸合成基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料和qRT-PCR反应液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg²⁺和dNTP。

5.一种用于检测丁酸合成基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，提取待测对象粪便样本的基因组DNA；

步骤2，以步骤1的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物对为引物进行qRT-PCR扩增；

步骤3，根据qRT-PCR扩增结果计算丁酸合成基因的表达水平。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：qRT-PCR扩增体系为：10 μL 的2×qRT-PCR反应液、10μM的引物各0.8 μL、加ddH₂O至25μL，30 μg/μL 的DNA模板。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：qRT-PCR扩增反应程序为：95℃ 30s预变性；接40个循环：95℃ 5s、60℃ 45s。