CN101788528A - 氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明一种提供氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒，由氨基酸和肉毒碱同位素标准品、衍生化溶液、萃取溶液、复溶液、流动相、96孔反应板、包装盒体、衬垫和操作说明书组成，衬垫设有容器孔，分别放置同位素标准品、衍生化溶液、萃取溶液、复溶液、流动相，96孔反应板单独排列放置。本发明试剂盒运用串联质谱方法实现一次测定能对几十种物质的定性和定量分析，有效地解决了以往一次测定只得到一种分析物的问题，对多种代谢性疾病进行联合筛查检测，提高了筛查检测的效率和检出率，为代谢性疾病的早期检测提供依据。
Description
技术领域
本发明属生物化学技术领域，涉及氨基酸与肉毒碱定量检测试剂盒，具体涉及一种串联质谱检测先天代谢性疾病患儿血液样本中氨基酸与肉毒碱的试剂盒。
背景技术
氨基酸和肉毒碱是参与人体生理代谢的重要物质，这类物质在人体内正常代谢保持一定的水平。这类物质的浓度改变往往提示人体代谢途径发生异常。通过检测这些物质的浓度，结合临床表现，帮助临床疾病的判断。
串联质谱定量技术的基本原理：利用同位素取代的方法，将待分析物(包括氨基酸和肉毒碱)中的氢原子、碳原子或氮原子用氘原子或碳13原子置换，形成与待分析物分子结构一致而分子量相差1-9的标准物质。标准物质与样品中的待分析物一起被送入到串联质谱仪中被检测到。被分析物的浓度与通过串联质谱检测到的离子丰度成正比。而高分辨的串联质谱又可以将相差1-9个质子大小的分子区分开。根据已知浓度的内标准品的离子丰度和被分析物的离子丰度，就可以得到被分析物的浓度。
先天代谢性疾病是由于先天代谢的酶缺乏而导致。这些先天代谢异常疾病通常在出生后会有一段时间的无症状期，之后会出现急性症状(如呕吐、昏迷、肝衰竭)或其它症状。
先天代谢性疾病种类多，缺乏特异性临床症状及早期可靠的实验室指标，早期诊断十分困难。目前尚无有效的手段进行早期确诊。串联质谱检测是近几年兴起的技术，具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于蛋白分子结构研究、生物小分子定性定量检测等诸多领域，在检测与应用领域是目前的研究热点之一。
建立快速可靠的筛查和诊断新生儿先天代谢性疾病的新方法已成为可能并被尝试。
发明内容
本发明的目的是提供氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒，该试剂盒由氨基酸和肉毒碱同位素标准品、衍生化溶液、萃取溶液、复溶液、流动相、96孔反应板、包装盒体、衬垫和操作说明书组成，衬垫设有容器孔，分别放置同位素标准品、衍生化溶液、萃取溶液、复溶液和流动相，96孔反应板单独排列放置。
其中氨基酸和肉毒碱同位素标准品含有12种氨基酸和8种肉毒碱，衍生化溶液含丁醇，萃取溶液含甲醇和水，复溶液含乙腈和水，流动相含乙腈、水或甲酸中的一种。所有溶液必须用0.22μm膜过滤预处理。
其中：
氨基酸内标准品为：
| 15N，2-13C-Glycine |
| 2H4-Alanine |
| 2H8-Valine |
| 2H3-Leucine |
| 2H3-Methionine |
| 2H5-Phenylalanine |
| 13C6-Tyrosine |
| 2H3-Aspartate |
| 2H3-Glutamate |
| 2H2-Ornithine·2HCl |
| 2H2-Citrulline |
| 2H4，13C-Arginine·HCl |
肉毒碱内标准品为：
| 2H9-carnitine(free carnitine，CN) |
| 2H3-acetylcarnitine(C2) |
| 2H3-propionylcarnitine(C3) |
| 2H3-butyrylcarnitine(C4) |
| 2H9-isovalerylcarnitine(C5) |
| 2H3-octanoylcarnitine(C8) |
| 2H9-myristoylcarnitine(C14) |
| 2H9-carnitine(free carnitine，CN) |
| 2H3-palmitoylcarnitine(C16) |
本试剂盒保存于2-8℃。
本发明试剂盒使用方法：
一、干血片的制作：新生儿在出生后喂饱母乳48小时后进行血样采集。用穿刺针进行足跟采血，滴在S&S 903滤纸片上，让血液均匀扩散，并在室温下风干4小时以上，及时送检，如不能及时送检，套入有封口的塑料袋内密封后放2-8℃冰箱保存。
二、实验操作：
内标标准萃取工作溶液准备
依据本次实验标本量计算内标标准萃取工作溶液的量，按1∶200浓度将浓缩的内标标准用萃取溶液稀释，注意充分混匀。
萃取
用打孔器从血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相应孔的位置，用多孔移液器或连续移液器以90μL/孔，加入预先配制好的含内标萃取溶液。封上粘性膜进行恒温振荡，温度设定为30℃，频率为750rpm/分钟，振荡30分钟。每孔取60μL转移到V型96孔微孔板对应的孔内，放96孔氮气吹干仪上进行吹干，条件设定：上部45℃，流量50L/min，下部45℃，流量25L/min；时间为10-15分钟。
衍生
目测V型底微孔板已经吹干，每孔加50μL的衍生化试剂：3N-HCl-n-Butanol。封上热封膜恒温静置，温度设定为60℃，放置30分钟。揭去热封膜，放96孔氮气吹干仪上进行吹干，条件设定：上部45℃，流量50L/min，下部45℃，流量25L/min；时间为10-15分钟。
复溶
取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75μL的复溶液，用铝膜包起，恒温振荡，温度设定为27℃，频率为750rpm/分钟，振荡10分钟。
三、上机测定。
四、定量结果报告：根据仪器设定程序自动得到各种氨基酸和肉毒碱的浓度。
本发明的有益之处是：该试剂盒运用串联质谱方法实现了一次测定能对几十种物质的定性和定量分析。有效地解决了以往一次测定只得到一种分析物的问题，对多种代谢性疾病进行联合筛查检测，提高了筛查检测的效率和检出率，为代谢性疾病的早期检测提供依据。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
图2为苯丙氨尿症患者质谱分析图谱。
图3为正常人的质谱分析图谱。
图4为丙酸血症患者质谱分析图谱。
图5为正常人的质谱分析图谱。
图6为枫糖尿症患者质谱分析图谱。
图7为正常人的质谱分析图谱。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
参见图1，试剂盒由氨基酸和肉毒碱同位素标准品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、复溶液4、流动相5、96孔反应板6、包装盒体7、衬垫8和操作说明书9组成，衬垫8设有容器孔，分别放置同位素标准品1、萃取溶液2、衍生化溶液3、复溶液4和流动相5，96孔反应板6单独排列放置。本试剂盒保存于2-8℃。
其中氨基酸和肉毒碱同位素标准品含有12种氨基酸和8种肉毒碱，衍生化溶液含丁醇，萃取溶液含甲醇和水，复溶液含乙腈和水，流动相含乙腈、水或甲酸中的一种。所有溶液必须用0.22μm膜过滤预处理。
氨基酸内标准品为：
| 15N，2-13C-Glycine |
| 2H4-Alanine |
| 2H8-Valine |
| 2H3-Leucine |
| 2H3-Methionine |
| 2H5-Phenylalanine |
| 13C6-Tyrosine |
| 2H3-Aspartate |
| 2H3-Glutamate |
| 2H2-Ornithine·2HCl |
| 2H2-Citrulline |
| 2H4，13C-Arginine·HCl |
肉毒碱内标准品为：
| 2H9-carnitine(free carnitine，CN) |
| 2H3-acetylcarnitine(C2) |
| 2H3-propionylcarnitine(C3) |
| 2H3-butyrylcarnitine(C4) |
| 2H9-isovalerylcarnitine(C5) |
| 2H3-octanoylcarnitine(C8) |
| 2H9-myristoylcarnitine(C14) |
| 2H3-palmitoylcarnitine(C16) |
实施例2
应用实施例1试剂盒对5000余例新生儿血样标本进行检测。累计检测出苯丙酮尿症患儿4例，丙酸血症患儿2例，枫糖尿症患儿2例。苯丙酮尿症患儿及正常人的质谱分析图谱结果分别参见图2、3，丙酸血症患儿及正常人的质谱分析图谱结果分别参见图4、5，枫糖尿症患儿及正常人的质谱分析图谱结果分别参见图6、7。
试剂材料：实施例1所描述试剂盒(960T)；
标本：全省收集的新生儿血斑；
检测方法：
1.按1∶200浓度将浓缩的内标标准用萃取溶液稀释；
2.用打孔器从血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相应孔的位置，用多孔移液器或连续移液器以90μL/孔，加入预先配制好的含内标萃取溶液。封上粘性膜进行恒温振荡，温度设定为30℃，频率为750rpm/分钟，振荡30分钟。每孔取60μL转移到V型96孔微孔板对应的孔内，放96孔氮气吹干仪上进行吹干，条件设定：上部45℃，流量50L/min，下部45℃，流量25L/min；时间为10-15分钟；
3.目测V型底微孔板已经吹干，每孔加50μL的衍生化试剂：3N-HCl-n-Butanol。封上热封膜恒温静置，温度设定为60℃，放置30分钟。揭去热封膜，放96孔氮气吹干仪上进行吹干，条件设定：上部45℃，流量50L/min，下部45℃，流量25L/min；时间为10-15分钟；
4.取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75μL的复溶液，用铝膜包起，恒温振荡，温度设定为27℃，频率为750rpm/分钟，振荡10分钟；
5.上机测定，根据仪器设定程序自动得到各种氨基酸和肉毒碱的浓度。
图2和图3中，代表苯丙氨酸的峰与代表苯丙氨酸内标准品的峰分别表示的是样本中的苯丙氨酸和苯丙氨酸内标准品的离子丰度，与他们的浓度成正比。在正常人图谱中，样本的苯丙氨酸与内标准品相比其浓度低，在正常范围内；在本丙酮尿症患者的图谱中，样本的苯丙氨酸与内标准品相比其浓度高出很多，超出正常范围。
本发明是结合试剂盒进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.一种氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒，其特征是由氨基酸和肉毒碱同位素标准品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、复溶液(4)、流动相(5)、96孔反应板(6)、包装盒体(7)、衬垫(8)和操作说明书(9)组成，衬垫(8)设有容器孔，分别放置同位素标准品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、复溶液(4)、流动相(5)，96孔反应板(6)单独排列放置。
2.根据权利要求1所述的一种氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒，其特征是：其中氨基酸和肉毒碱同位素标准品(1)含有12种氨基酸和8种肉毒碱，衍生化溶液(2)含丁醇，萃取溶液(3)含甲醇和水，复溶液(4)含乙腈和水，流动相(5)含乙腈、水或甲酸中的一种，所有溶液必须用0.22μm膜过滤预处理。
3.根据权利要求1所述的一种氨基酸与肉毒碱串联质谱法检测试剂盒，其特征是：试剂盒保存于2-8℃。
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2009
- 2009-12-22 CN CN200910157135A patent/CN101788528A/zh active Pending
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