CN112362793A - 高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法 - Google Patents

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周旋
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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，步骤如下：S1.标准曲线的绘制：制备人血清中8个浓度的ALC，8个浓度的LC；在一定液相色谱和质谱条件下，采用基线减法构建标准曲线，在每批测定中，通过运行仅添加内标（IS）的空白血浆样品进行基线减法，根据分析物浓度绘制一系列标准曲线，以样品的分析物与IS峰面积比值减去空白样品中分析物与IS峰面积比值为纵坐标，以浓度为横坐标，分别在一定的浓度范围内线性拟合标准曲线；S2.样本处理与上机测试。本申请能够同时测定抑郁症患者血清中ALC和LC的含量，步骤简单，检测结果准确。

Description

高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和 乙酰左旋肉碱含量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法。
背景技术
左旋肉碱（LC）是脂肪代谢过程中的关键物质，可促进脂肪酸在线粒体氧化分解，乙酰左旋肉碱（ALC）是左旋肉碱的天然形式。在线粒体内膜上，ALC 由肉碱乙酰转移酶催化乙酰辅酶A(CoA) 与左旋肉碱合成，并通过肉碱/乙酰肉碱酰基转位酶进入线粒体基质，同时一分子肉碱穿出线粒体基质。然后线粒体基质中的肉碱乙酰转移酶将酰基肉碱转化为肉碱和乙酰CoA。乙酰CoA 和胆碱在胆碱乙酰转移酶催化下生成乙酰胆碱。 ALC广泛存在于组织细胞中，尤其在肌肉，大脑和精子中含量丰富，并且很容易通过血脑屏障到达中枢神经。
ALC具有多种生理活性，包括营养作用，神经保护作用，周围神经系统的镇痛作用，抗氧化作用以及在男性生殖系统中的作用。临床主要用于改善男性的生育能力，治疗阿尔茨海默氏病，肝性脑病，抑郁症和糖尿病周围神经病变。
抑郁症是一种常见的精神障碍，研究表明神经可塑性受损可能是抑郁症的核心病理生理机制。ALC具有许多与神经可塑性有关的多种功能，是一种潜在的抗抑郁药。ALC通过乙酰化组蛋白调节突触可塑性，以产生快速的抗抑郁作用。值得注意的是 Carla Nasca等人发现对补充ALC迅速产生抗抑郁反应的动物的血浆和大脑中均表现出内源性ALC水平降低。另外，LC和ALC在体内可以相互转化。因此，为了研究抑郁症患者体内的LC和ALC水平与抑郁症发病的相关性，需要开发一种灵敏可靠的方法来定量LC和ALC。
已验证了许多高效液相色谱方法可用于LC和ALC的含量测定。然而，这些方法需要添加离子对试剂或固相萃取，这对于样品制备而言既费时又费力。所以，有必要建立一种同时测定抑郁症患者血清中LC和ALC含量的方法。
发明内容
本发明为了解决上述的技术问题，而提供一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法。
本发明是按照以下技术方案实现的：
一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，包括以下步骤：
S1.标准曲线的绘制：
制备人血清中浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的ALC，浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的LC；在一定液相色谱和质谱条件下，采用基线减法构建标准曲线，在每批测定中，通过运行仅添加IS的空白血浆样品进行基线减法，根据分析物浓度绘制一系列标准曲线，以样品的分析物与IS峰面积比值减去空白样品中分析物与IS峰面积比值为纵坐标，以浓度为横坐标，分别在0.1-16.0 μg/mL和0.5-16.0 μg/mL的浓度范围内建立标准曲线；
S2.样本处理与上机测试：
100 μL血清中加入10 μL 内标溶液，涡旋振荡30 s后，加入1mL ACN /水到每个样品中以沉淀蛋白质，涡旋振荡1分钟后在4°C下16000 rpm/min 离心10分钟除去沉淀物；取上清液注入UPLC-MS/MS系统进行分析。
进一步的，步骤S1中，色谱条件为：流动相A为水，B为甲醇；流速为0.2 ml/min；内标为乙酰左旋肉碱-d3；梯度洗脱，梯度曲线如下：0～0.5min，20%～20% B；0.5～1.5min，20%～95% B；1.5～2.0min，95%～95% B；2.0～2.1min，95%～20% B；2.1～2.5min，20%～20%B；进样量为0.2 μL。
进一步的，所述流动相A为含0.01%氨水的水。
进一步的，步骤S1中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；电离模式：正离子模式；操作方式：多重反应监测；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 °C；去溶剂温度：450 °C；氮气脱溶气流量：1000 L/h；氮气锥气流量：150 L/h。
进一步的，步骤S2中，ACN与水的体积比为2:1。
本发明具有的优点和有益效果是：
本申请针对现有技术中还没有通过UPLC-MS/MS同时测定内源性LC和ALC含量的方法的现状而提出，本申请能够同时测定抑郁症患者血清中内源性左旋肉碱和乙酰左旋肉碱的含量，检测步骤简单，检测结果准确，为临床研究抑郁症患者体内LC和ALC水平与抑郁症发病的相关性奠定了实验基础。
附图说明
图1是本发明乙酰左旋肉碱的标准曲线图；
图2是本发明左旋肉碱的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
1.仪器和色谱条件
UPLC-MS/MS仪器由Waters Acquity超高效液相色谱（IPLC）I类二元溶剂管理器，Acquity UPLC样品管理器-FTN与Waters Xevo TQ-S质谱仪组成。色谱柱为XSelect HSS T3C18（2.1mm×100 mm，2.5μm，Waters，美国）分析柱，流动相为水（流动相A，含0.01%氨水）和甲醇（流动相B），流速为0.2 ml/min，内标为乙酰左旋肉碱-d3 (ALC- d3)，梯度洗脱，梯度曲线如下：0～0.5min，20%～20% B；0.5～1.5min，20%～95% B；1.5～2.0min，95%～95% B；2.0～2.1min，95%～20% B，2.1～2.5min，20%～20% B，进样量为0.2 μL。
2.质谱条件
离子源：电喷雾离子源；电离模式：正离子模式；操作方式：多重反应监测；毛细管电压：3.0 kV； 离子源温度：150 °C；去溶剂温度：450 °C；氮气脱溶气流量：1000 L/h；氮气锥气流量：150 L/h。表1列出了每种分析物的母离子、子离子、锥孔电压（CV）和碰撞能量（CE）。
表1. LC、ALC和ALC- d3的母离子、子离子、锥孔电压（CV）和碰撞能量（CE）
分析物 母离子 子离子 CV(V) CE(eV)
LC 162.10 102.97 26 14
ALC 204.14 85.03 10 16
ALC-d3 207.19 85.03 32 18
3. 样本处理方法
100 μL血清中加入10 μL内标溶液，涡旋振荡30 s后，加入1mL ACN /水（2:1，v / v）到每个样品中以沉淀蛋白质，涡旋振荡1分钟后在4°C下16000 rpm/min 离心10分钟除去沉淀物。取上清液（0.2 μL）注入UPLC-MS /MS系统进行分析。
4. 标准曲线的建立
制备人血清中ALC的浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL，LC的浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和16.0 μg/ mL。 LC和ALC是内源性生理物质，没有不含LC和ALC的空白血浆。因此，采用基线减法构建标准曲线，如下所示：在每批测定中，通过运行仅添加IS的空白血浆样品进行基线减法，根据分析物浓度绘制了一系列标准曲线样品的分析物峰面积/IS峰面积减去空白样品的分析物峰面积/IS峰面积，用浓度倒数（1/x）的加权因子，分别在0.1-16.0 μg/mL和0.5-16.0 μg/mL的浓度范围内建立标准曲线。乙酰左旋肉碱的标准曲线参见图1，左旋肉碱的标准曲线参加图2。
5．方法学的验证
对以上建立的同时测定内源性LC和ALC含量的UPLC-MS/MS方法进行了验证，考察了LC和ALC的日内、日间准确度和精密度，提取回收率，基质效应，以及在室温放置4h、2-8℃放置24h、−20℃放置30 天和−20℃三次冻融循环条件下的稳定性。考察结果表明，在该方法中LC和ALC具有良好的日内、日间准确度和精密度（具体数据见表2）；在该方法中LC和ALC的提取回收率均在90%以上（具体数据见表3）；在该方法中LC和ALC在普通血清、发生溶血的血清和高脂血症的血清中的基质效应为71.92-107.63%，CV均小于15%（具体数据见表4）；在该方法中LC和ALC在在室温放置4h、2-8℃放置24h、−20℃放置30 天和−20℃三次冻融循环条件下稳定，CV均小于15%（具体数据见表5）；以上实验结果均符合符合《中国药典生物样品定量分析与验证指导原则》的要求。
表2. 左旋肉碱（LC）和乙酰左旋肉碱（ALC）的日内、日间准确度和精密度 (n=6)
Figure 413372DEST_PATH_IMAGE002
表3. 左旋肉碱和乙酰左旋肉碱的提取回收率(n=6).
Figure 861671DEST_PATH_IMAGE004
表4. 左旋肉碱和乙酰左旋肉碱的基质效应(n=6)
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5. 左旋肉碱和乙酰左旋肉碱的稳定性(n=6)
Figure 844671DEST_PATH_IMAGE006

Claims (5)

1.一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.标准曲线的绘制：
制备人血清中浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的ALC，浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的LC；在一定液相色谱和质谱条件下，采用基线减法构建标准曲线，在每批测定中，通过运行仅添加IS的空白血浆样品进行基线减法，根据分析物浓度绘制一系列标准曲线，以样品的分析物与IS峰面积比值减去空白样品中分析物与IS峰面积比值为纵坐标，以浓度为横坐标，分别在0.1-16.0 μg/mL和0.5-16.0 μg/mL的浓度范围内建立标准曲线；
S2.样本处理与上机测试：
100 μL血清中加入10 μL 内标溶液，涡旋振荡30 s后，加入1mL ACN /水到每个样品中以沉淀蛋白质，涡旋振荡1分钟后在4°C下16000 rpm/min 离心10分钟除去沉淀物；取上清液注入UPLC-MS/MS系统进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，其特征在于：步骤S1中，色谱条件为：流动相A为水，B为甲醇；流速为0.2 ml/min；内标为乙酰左旋肉碱-d3；梯度洗脱，梯度曲线如下：0～0.5min，20%～20% B；0.5～1.5min，20%～95% B；1.5～2.0min，95%～95% B；2.0～2.1min，95%～20% B；2.1～2.5min，20%～20% B；进样量为0.2 μL。
3.根据权利要求2所述的一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，其特征在于：所述流动相A为含0.01%氨水的水。
4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，其特征在于：步骤S1中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；电离模式：正离子模式；操作方式：多重反应监测；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150°C；去溶剂温度：450 °C；氮气脱溶气流量：1000 L/h；氮气锥气流量：150 L/h。
5.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串联质谱法测定抑郁症患者血清中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量的方法，其特征在于：步骤S2中，ACN与水的体积比为2:1。
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