BRPI0813954A2 - análise de aminoácidos no fluido do corpo através de cromatografia líquida-espectometria de massa - Google Patents

Abstract

ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS NO FLUIDO DO · CORPO ATRAVÉS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA-ESPECTOMETRIA DE MASSA. A presente invenção refere-se a métodos para quantificar aminoácidos individuais em vários fluídos corporais obtidos de um paciente humano. São providas também faixas de referência para niveis normais de aminoácido em vários fluidos corporais (por exemplo, plasma do sangue, urina, fluido cérebro espinhal e saliva) e para vários grupos de idade (por exemplo, neonatais, crianças e adultos).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS NO FLUIDO DO CORPO ATRAVÉS DE CROMATOGRA- l FIA LÍQUIDA-ESPECTOMETRIA DE MASSA". - CAMPO DE INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente à detecção e análise de aminoácidos, particularmente aminoácidos contidos nos fluidos biológi- cos.

ANTECEDENTES A identidade e quantidade de aminoácidos no fluido do corpo de um paciente (por exemplo, no plasma) são importantes para a saúde do pa- ciente por diversos motivos. Níveis de aminoácido aberrantes podem ser usados para diagnóstico de doença ou enfermidade. Por exemplo, níveis baixos de aminoácidos no plasma podem ocorrer em pacientes com câncer, - anorexia, artrite, foliculite, abuso de álcool, glucagonoma, e/ou gravidez. Pa- . “15 cientes sofrendo de estresse ou depressão podem também ter níveis baixos a de aminoácidos no plasma. Em particular, pacientes deprimidos podem tam- bém ser deficientes em fenilalanina, tirosina, metionina, glicina, triptofano, e/ou taurina. Pacientes psicóticos podem ter níveis baixos de aminoácidos tais como glicina, triptofano, e/ou histidina e níveis elevados de aminoácidos tais como fenilalanina, tirosina, e/ou serina.

Pacientes com doença infecciosa e/ou febre também podem ter níveis de aminoácidos reduzidos, embora alguns aminoácidos em tais paci- entes, tal como fenilalanina, podem estar presentes em níveis elevados. Pa- cientes com insuficiência renal podem ter baixos níveis de aminoácidos tais como tirosina, treonina, leucina, isoleucina, valina, lisina, e/ou histidina. Pa- cientes com doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome de fadiga crônica podem ter níveis anormalmente baixos de cistina e glutamina em seu plas- ma.

Além disso, os níveis de aminoácido que são mais altos do que o normal podem ser indicativos de um estado de doença. Por exemplo, ní- veis de aminoácidos no plasma elevados podem ser observados em pacien- tes com doença no fígado, pancreatite, intoxicação por metal pesado, defici-

ência de vitamina C e/ou deficiência de vitamina D. Em particular, pacientes com doença de Wilson podem exibir níveis elevados de triptofano e histidina. Pacientes com doença de Cushing ou gota podem exibir níveis elevados de - alanina. Pacientes diabéticos podem exibir níveis elevados de valina, leuci- na, elou isoleucina. Crianças hiperativas podem exibir níveis elevados de tirosina e fenilalanina. Pacientes com Doença da Urina em Xarope de Bordo podem ter níveis elevados de leucina, isoleucina, e valina em seu plasma. Como tal, os métodos para analisar aminoácidos nos fluidos do corpo, tais como o plasma, são úteis em situações médicas e científicas.

Tradicionalmente, métodos analíticos para aminoácidos têm in- cluído uma etapa de derivação. Durante a derivação, o aminoácido é reagido com o reagente de derivação que facilita a análise de aminoácidos na amos- tra. Agentes de derivação tipicamente reagem com os grupos amino livres - de aminoácidos na amostra. Reagentes comuns para aminoácidos de deri- . 5 vação incluem isotiocianatos (por exemplo, fenil isotiocinato (PITC)), o- ? ftaldialdeido (OPA), 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB), e Na-(2,4-dinitro-5- fluorofenil)-L-alainamida (FDAA). Agentes de derivação são úteis porque podem incluir substituintes que facilitam a análise dos aminoácidos deriva- dos. Por exemplo, agentes de derivação podem incluir cromóforos para de- tecção de absorção de UV ou detecção de fluoróforos para detecção fluo- rescente.

Aminoácidos derivados podem ser separados e detectados rea- lizando cromatografia tal como cromatografia líquida (LC) ou cromatografia de gás (GC), acoplada com espectrometria de massa (isto é, LC-MS ou GC- MS) Os aminoácidos, entretanto, têm diversas estruturas químicas (por e- xemplo, básica, acídica, aromática, polar, não-polar, etc.), e por causa de diferenças significativas nas estruturas químicas de vários aminoácidos que podem estar presentes nos fluidos do corpo, esses compostos apresentam uma tarefa difícil para o analista resolver a respeito da derivação/separação emLC-MSouGC-MS.

Métodos para detectar aminoácidos usando LC e MS têm sido reportados e incluem, por exemplo, Casetta et al. "Development of a método for rapid quantification of aminoácidos by liquid chromatrography, tandem mass spectrometry" (LC-MSMS) in plasma" Clin Chem lab Med (2000) 38: 391-401; Hess et al, "Acid hydrolysis of silk fibroins and determination of the - enrichment of isotopically labeled amino acids using precolumn derivitization and high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry" Anal Biochem (2002) 311:19-26; Ji et al., “Determination of phenethy! isothiocyanate in human plasma and urine by ammonia derivatiza- tion and liquid chromatography-tandem mass spectrometry" Anal Biochem (2003) 323:39-47; Van Eijik et al., "Determination of amino ácid isotope enri- chment using liquid chromatography-mass spectrometry" (1999) Anal Bio- chem 271:8-17; and Liu et al. "Derivitization of amino acids with N,N-dimetil- 2,4-dinitro-5-fluorobenzylamine for liquid chromatography/electrospray ioni- zation mass spectrometry" (2004) Rapid Commun Mass Spectrom 18:1059- . 65. Métodos melhorados para detectar aminoácidos nos fluidos do corpo são desejáveis.

: SUMÁRIO DA INVENÇÃO São descritos métodos para detectar vários aminoácidos indivi- duais que podem estar presentes no fluido do corpo de um indivíduo. A de- tecção dos aminoácidos individuais no fluido do corpo pode ser usada para determinar se o fluido do corpo contém um anormal de um ou mais aminoá- cidos. Em um aspecto, o método envolve derivação dos aminoácidos do flui- do do corpo, separando os aminoácidos derivados através de cromatografia líquida (LC), identificando os derivados aminoácidos usando análise de es- pectrometria de massa (MS), e quantificando os aminoácidos derivados a- través de comparação com os aminoácidos estruturalmente similares de um conjunto de aminoácidos padrão. Preferivelmente, a MS é distinta da MS em série incluindo, por exemplo, MS única. Aminoácidos estruturalmente simila- res compartilham características estruturais significativas tais como grupos funcionais chave, de tal modo que a identificação de um aminoácido por es- pectrometria de massa pode ser usada para identificar o outro aminoácido estruturalmente similar no mesmo método. O conjunto de aminoácidos indi- viduais padrão é preferivelmente usado como um conjunto de padrões inter-

nos adicionando o conjunto ao fluido do corpo antes do processamento. Fluidos do corpo apropriados incluem, por exemplo, plasma, so- l ro, saliva, urina, e fluidos cérebro-espinhais (CSF). Para os métodos em que - aminoácidos individuais são detectados, identificados, e/ou quantificados no plasma,os níveis podem ser comparados às faixas de referência providas na Tabela 1. Níveis de aminoácidos no plasma, que se encontram fora das faixas de referência da Tabela 1, podem ser identificados como anormais. Para os métodos em que aminoácidos individuais são detectados, identifica- dos, e/ou quantificados na urina, os níveis podem ser comparados às varia- ções de referência providas na Tabela 2. Níveis de aminoácidos na urina, que se encontram fora das faixas de referência da Tabela 2, podem ser iden- tificados como anormais. Para os métodos em que aminoácidos individuais são detectados, identificados, e/ou quantificados em CSF, os níveis podem . ser comparados às faixas de referência providas na Tabela 3. Os níveis de aminoácidos CSF que se encontram fora das faixas de referência da Tabela ' 3 podem ser identificados como anormais. Para os métodos em que amino- ácidos individuais são detectados, identificados, e/ou quantificados na saliva, os niveis podem ser comparados às faixas de referência providas na Tabela

4. Níveis de aminoácidos na saliva, que se encontram fora das faixas de re- ferênciada Tabela 4, podem ser identificados como anormais. Em algumas modalidades, a faixa de referência para cada aminoácido varia com base na idade do sujeito (isto é, neonatal, bebê, criança ou adulto).

O conjunto de padrões pode ser não-derivado e adicionado ao fluido do corpo de início, ou à qualquer etapa pós-processamento antes da derivação. Em uma modalidade preferida, os padrões compreendem amino- ácidos deuterados individuais (isto é, aminoácidos únicos contendo um ou mais íons de deutério). O conjunto de padrões também pode ser adicionado aos aminoácidos do fluido do corpo depois da etapa de derivação. Neste caso, os padrões adicionados devem ser derivados da mesma maneira que os amincácidos dos fluidos do corpo. Em uma abordagem, os aminoácidos são derivados com um isotiocianato (por exemplo, isotiocinato de fenila (PITC). Em uma modalidade preferida, o agente de derivação é PITC. Ou-

tros agentes de derivação apropriados podem incluir o-ftaldialdeído (OPA), 2 A4-dinitrofluorobenzeno (DNFB), e Na-(2,4-dinitro-S-fluorofenil)-L-alainamida (FDAA). : A quantidade de cada aminoácido identificado a partir de um vo- 5 lume de fluido do corpo pode ser determinada comparando o sinal de MS ao sinal de uma quantidade conhecida de aminoácido estruturalmente similar. À quantidade do aminoácido no fluido do corpo pode depois ser expressa com relação ao volume de fluido do corpo analisado a fim de obter uma concen- tração do aminoácido no fluido do corpo original. A análise quantitativa é fei- tapreferivelmente com padrões internos.

Em algumas modalidades, o fluido do corpo pode ser processa- do para obter uma fração com uma concentração de aminoácidos enriqueci- da antes de análise adicional. Em uma abordagem, uma fração de peso mo- - lecular do fluido do corpo é obtida (por exemplo, passando o fluido do corpo através de um filtro de peso molecular).

7 Em uma modalidade, o método pode ser usado para detectar pelo menos 20 aminoácidos individuais diferentes. Em outras modalidades, o método pode ser usado para detectar pelo menos 25, 30, 35, ou 40 aminoá- cidos individuais.

Por exemplo, o método pode ser útil para detectar e/ou quantifi- car qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, fosfoserina, sulfocisteina, ácido arginossuccínico, hidroxiprolina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, serina, fosfoetanolamina (PE- A), glutamina, glicina, histidina, sarcosina, taurina, carnosina, citrulina, argi- nina, anserina, I-metil-histidina, 3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico (AAD), treonina, alanina, beta-alanina (BALA), prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico (GABA), ácido beta-amino-isobutírico (BAIA), ácido al- fa-amino-butírico (AAB), cisteina, tirosina, valinay metionina, L-alo- cistationina (cistationina-A), L-cistationina (cistationina-B), cistina, isoleucina, —aloisoleucina, leucina, DL-hidroxilisina (hidroxilisina (1)), DL-alo-hidroxilisina (hidroxilisina (2)), fenilalanina, ornitina, triptofan, homocistina, ácido argino- succínico (ASA), lisina, e Hawkinsin ((ácido 2-L-cistein-S-il-I, 4-di-hidroxiciclo-

hex-5-en-l-il)-acético). Além disso, o método pode ser usado para diagnosti- car um estado doentio com base no nível de qualquer um dos aminoácidos individuais detectados no fluido do corpo. - Em uma modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, ácido aspártico, ASA, S-cisteina, ácido glutâmico, OH-prolina, serina, asparagina, PEA, AAD, glicina, glutamina, sarcosina, histidina, beta- alanina, taurina, citrulina, carnosina, treonina, arginina, anserina, 1 -metil- histidina, 3-metil-histidina, alanina, GABA, BAIB, prolina, etanolamina, AAB, tirosina, valina, metionina, cistationina A, cistationina B, cistina, isoleucina, alo-isoleucina, leucina, OH-lisina-1, OH-lisina-2, homocistina, fenilalanina, triptofan, ornitina, e lisina.

Em outra modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou - quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, hidroxiprolina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, ' serina, glutamina, glicina, histidina, sarcosina, taurina, citrulina, arginina, 1,3- metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, treonina, alanina, beta-alanina, pro- lina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, ácido alfa-amino-butírico, tirosina, valina, metionina, L-cistationina, isoleuci- na, leucina, fenilalanina, ornitina, triptofan, homocistina, e lisina.

Em ainda outra modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, hidroxiprolina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutã- mico, serina, glutamina, glicina, histidina, sarcosina, taurina, citrulina, argini- na, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, treonina, alanina, beta- alanina, prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino- isobutírico, ácido alfa-amino-butírico, tirosina, valinay metionina, L- cistationina, isoleucina, leucina, fenilalanina, ornitina, triptofan, homocistina, lisina, cistina, e hidroxilisina.

Em ainda outra modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, hidroxiprolina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutãâ-

mico, serina, glutamina, glicina, histidina, sarcosina, taurina, citrulina, argini- : na, ácido alfa-amino-adípico, treonina, alanina, beta-alanina, prolina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, ácido alfa-amino-butírico, : tirosina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, ornitina, triptofan, homocistina,elisina.

Em uma modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas não limitado a, fosfoserina, sulfo-cisteina, ácido arginossuccínico, hidroxipro- lina, ácido aspártico, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3- metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, cisteina, L-alo- cistationina-A, L-cistationina, cistina, alo-isoleucina, DL-hidroxilisina, DL-alo- hidroxilisina, e homocistina.

- Em outra modalidade, o método pode ser útil para detectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais incluindo, mas " não limitado a, fosfoserina, sulfo-cisteina, ácido arginossuccínico, hidroxipro- lina, ácido aspártico, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3- metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, cisteíina, L-alo- cistationina-A, L-cistationina, cistina, DL-hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina, Em uma modalidade adicional, o método pode ser útil para i- dentificar qualquer cisteina, fosfoserina ou ácido arginossuccínico, Em uma modalidade adicional, o método pode ser útil para de- tectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais in- cluindo, mas não limitado a, fosfoserina,y sulfo-cisteina,y ácido arginossuccinico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, an- serina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, ciste- ína, L-alo-cistationina-A, L-cistationina, cistinay alo-isoleucinay DL- hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.

Em uma modalidade adicional, o método pode ser útil para de- tectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais in-

cluindo, mas não limitado a, fosfoserina, sulfo-cisteína, ácido arginossuccini- co, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3- metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, etanolamina, ácido gama-amino- : butírico, ácido beta-amino-isobutírico, L-alo-cistationina-A, L-cistationina, cis- tina, alo-isoleucina, DL-hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.

Em uma modalidade adicional, o método pode ser útil para de- tectar e/ou quantificar qualquer combinação dos aminoácidos individuais in- cluindo, mas não limitado a, fosfoserina, cisteina, ácido arginossuccínico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3-metil- histidina, ácido alfa-amino-adípico, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, L-alo-cistationina-A, L-cistationina, cistina, DL- hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.

Em outras modalidades, o método quantifica pelo menos dois, - pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos sete, pelomenos dez, pelo menos quinze, pelo menos vinte, pelo menos vinte e ' cinco, ou pelo menos trinta ou mais aminoácidos individuais.

Os métodos descritos podem ser usados como uma base para diagnóstico, ou para monitorar a eficácia do tratamento para uma variedade de doenças conhecidas como sendo associadas com níveis anormais de aminoácido individual (isto é, aminoácidos únicos separadamente de dipep- tídeos e polipeptídeos). Por exemplo, os níveis de leucina, isoleucina, valina, lisina, e/ou histidina podem ser usados para diagnosticar e/ou monitorar in- suficiência renal; cistina e/ou glutamina podem ser usadas para diagnosticar e/ou monitorar doença de Crohn, colite ulcerativa, e/ou síndrome de fadiga crônica; triptofano e/ou histidina podem ser usados para diagnosticar e/ou monitorar doença de Wilson; alanina pode ser usada para diagnosticar e/ou monitorar doença de Cushing ou guta; valina, leucina, e/ou isoleucina podem ser usadas para diagnóstico e/ou monitorar diabetes e/ou Doença da Urina em Xarope de Bordo; tirosina e/ou fenilalanina podem ser usadas para diag- —nosticar e/ou monitorar distúrbios de hiperatividade; e “hawkinsin" pode ser usada para diagnosticar e/ou monitorar “hawkinsinuria”.

A separação de LC de aminoácidos derivados pode ser realiza-

da usando qualquer tipo de sistema de LC tal como estão comercialmente : disponíveis. Uma coluna de LC apropriada é aquela que tem um material de embalagem que inclui partículas diminutas (por exemplo, partículas de sílica : tendo um diâmetro de cerca de 2-5 um, e preferivelmente cerca de 3 um). As partículas tipicamente têm poros de cerca de 50 a 300 angstroms, e preferi- velmente cerca de 150 angstroms. As partículas tipicamente têm uma área de superfície de cerca de 50 - 600 m?/g, e preferivelmente cerca de 100 m?/g. As partículas podem incluir uma fase estacionária hidrofóbica ligada às suas superfícies. Em uma modalidade, a fase estacionária hidrofó- bica pode ser uma fase de alquila, que pode incluir C4, C-8, e C-18 (preferi- velmente C-18). A coluna pode ter quaisquer dimensões apropriadas. Preferivel- - mente, a coluna tem um diâmetro de cerca de 0,5 mm a cerca de 5 mm e um comprimento de cerca de 15 mm a cerca de 300 mm, e mais preferivelmen- Ú te, um diâmetro de cerca de 2 mm e um comprimento de cerca de 50 mm.

A separação de LC de aminoácidos derivados pode também ser realizada usando um solvente hidrofóbico ou uma mistura de solvente que inclui um solvente hidrofóbico e um gradiente como uma fase móvel para depurar os aminoácidos. Em uma modalidade, a fração derivada pode ser aplicada à coluna em um tampão aquoso (isto é, um solvente hidrofílico) e os aminoácidos podem ser depurados aplicando uma fase móvel para a co- luna que tem um aumento na quantidade de solvente orgânico (isto é, um solvente hidrofóbico). Por exemplo, o tampão aquoso pode incluir (95% de FLO,5% de acetonitrila), e os aminoácidos podem ser depurados a partir da coluna gradualmente aumentado a concentração de acetonitrila para cerca de 100% na fase móvel. Se desejável, a fase móvel pode ser aquecida até uma temperatura de cerca de 40 - 60ºC, preferivelmente cerca de 50ºC. Adi- cionalmente, a fase móvel pode opcionalmente incluir um ou mais reagentes adicionais que são úteis durante LC e/ou MS. Por exemplo, acetato de amô- nio ou ácido acético, A análise de MS de aminoácidos derivados pode ser realizada pela ionização da amostra. Técnicas de ionização apropriadas incluem ioni- . zação por electrospray (ESI), ionização química por pressão atmosférica (APCI), fotoinonização, ionização por elétron, bombardeamento de átomo ' ligeiro (FAB)/ionizlação secundária líquida (LSIMS), ionização de desorção de laser assistido por matriz (MALDI), ionização de campo, desorção de campo, ionização por termospray/plasmaspray, e ionização de raio de partí- cula. Preferivelmente, MS é realizado usando ESI. A MS ainda pode ser rea- lizada usando um modo de íon negativo ou positivo, e preferivelmente um modo de íon negativo, A análise de MS de aminoácidos derivados pode ser realizada com qualquer um dos diversos tipos de analisadores de íon incluindo anali- sadores quadrapolos, analisadores de alçapão de fon, e analisadores de tempo de vôo. Preferivelmente, a MS pode ser realizada usando um analisa- - dor quadrapolo. Os íons gerados durante MS podem ser detectados usando diversos modos de detecção incluindo modo de monitoração seletiva (SIM) e ' modo de escâner. Preferivelmente, os íons são detectados usando SIM. MS é preferível em vez de MS em série.

É também provido um método de diagnosticar à existência de um distúrbio metabólico envolvendo metabolismo de aminoácidos em um indivíduo. O método compreende determinar se um fluido do corpo contém um nível anormal de um ou mais aminoácidos, primeiro (a) pela derivação dos aminoácidos dos fluidos do corpo; (b) separando os aminoácidos deri- vados por cromatografia líquida (LC); (c) submetendo os aminoácidos deri- vados separados a uma análise espectroscópica de massa (MS) usando um espectrômetro de massa; e (d) usando a análise de MS para identificar a quantidade de aminoácidos derivados do fluido do corpo comparando aos aminoácidos estruturalmente similares de um conjunto de padrões de ami- noácido. Várias modalidades desse método são similares àquelas já discuti- das.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 é uma tabela mostrando os vários aminoácidos detec- tados e quantificando pelos métodos descritos aqui no presente, A terceira

1" coluna indica o MW "peso molecular"; a quarta coluna indica peso molecular : de PITC; a quinta coluna indica o peso molecular de cada aminoácido deri- vado de PITC; a sexta coluna é o tempo de retenção de LC; a sétima coluna ' indica os íons de espectrometria de massa observados. A figura 2 mostra os resultados de uma análise de MS de uma amostra únical contendo os aminoácidos indicados, previamente submetidos a LC. A característica de tamanho do ion de cada aminoácido é indicada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS Como usado aqui no presente, "aminoácido" significa qualquer molécula que inclui um átomo de carbono alfa ligado covalentemente a um grupo amino e um grupo ácido. O grupo ácido pode incluir um grupo carboxi- la. "Aminoácido" pode incluir moléculas que têm uma das fórmulas: 4 Pata NE A oo A, +H4JN COO' ou AIN Ccoo, em que R é um grupo lateral e Z inclui pelo menos 3 átomos de carbono. "Aminoácido" inclui, mas não é limitado a, os vinte aminoácidos endógenos de serhumano e seus derivados tais como lisina, asparagina, treonina, seri- na, isoleucina, metionina, prolina, histidina, glutamina, arginina, glicina, ácido aspártico, ácido glutâmico, alanina, valina, fenilalanina, leucina, tirosina, cis- teina, triptofano, fosfoserina (PSER), sulfo-cisteína, ácido arginossuccínico (ASA), hidroxiprolina, fosfoetanolamina (PEA), sarcosina (SARC), taurina (TAU), carnosina (CARN), citrulina (CIT), anserina (ANS), 1,3-metil-histidina (ME-HIS), ácido alfa-amino-adípico (AAA), beta-alanina (BALA), etanolamina (ETN), ácido gama-amino-butírico (GABA), ácido beta-amino-isobutírico (BAIA), ácido alfa-amino-butírico (BABA), L-alo-cistationina (cistationina-A; CYSTA-A), L-cistationina (cistationina-B; CYSTA-B), cistina, alo-isoleucina (ALLO-ILE), DL-hidroxilisina (hidroxilisina (1)), DL-alo-hidroxilisina (hidroxili- sina (2)), ornitina (ORN), homocistina (HCY), e derivados dos mesmos. "A- minoácidos" também incluem estereoisômeros tais como formas de D- aminoácido e L-aminoácido. A menos que especificamente indicado de outra maneira, o termo "aminoácido" refere-se às moléculas de aminoácidos do indivíduo (isto é, livre) separadamente dos aminoácidos presentes em dipep- tídeos, polipeptídeos, e proteínas.

Como usado aqui no presente, "fluido do corpo" significa qual- ' quer fluido que pode ser isolado do corpo de um indivíduo.

Por exemplo, "fluido do corpo" pode incluir sangue, plasma, soro, bile, saliva, urina, lágri- mas, suor, fluido cérebro-espinhal (CSF), e similares.

Preferivelmente o flui- do do corpo é plasma, soro, fluido cérebro-espinhal, urina, ou saliva, com plasma sendo o mais preferido.

Como usado aqui a seguir, "derivatização" significa a reação de duas moléculas para formar uma nova molécula.

Por exemplo, um aminoá- cido pode ser derivatizado pela reação do aminoácido com um agente de derivatização para formar um agente de derivatização para formar um ami- noácido derivatizado.

A derivatização pode incluir a reação do grupo alfa - amino do aminoácido com um átomo eletrofílico de um agente de derivatiza- ção para formar uma ligação covalente.

Os agentes de derivatização podem " incluir os grupos isotiocianato, grupos dinitro-fluorofenila, grupos nitrofenoxi- carbonila, e/ou grupos ftalaldeído.

Como usado aqui a seguir, "cromatografia líquida" (LC) significa um processo de retardamento seletivo de um ou mais componentes de uma solução fluida à medida que o fluido passa uniformemente através de uma coluna de uma substância finamente dividida, ou através de passagens capi- lares.

Os resultados de retardamento a partir da distribuição dos componen- tes da mistura entre uma ou mais fases estacionárias e o fluido volumoso, (isto é, fase móvel), à medida que este fluido se move contracorrente em relação às fases estacionárias.

O processo é usado para análise e separa- ção de misturas de duas ou mais substâncias. "Cromatografia líquida" incluí a cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) e a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Como usado aqui a seguir, análise "espectroscópica de massa" — ou"espectrometria de massa" (análise de MS) significa uma técnica analítica para identificar compostos desconhecidos incluindo: (1) a ionização dos compostos e o fracionamento potencial dos compostos para formar compos-

tos carregados, e (2) a detecção do peso molecular do composto carregado e o cálculo de uma razão massa para carga (m/z). O composto pode ser io- nizado e detectado por qualquer meio adequado. Um "espectrômetro de - massa” inclui os meios para a ionização dos compostos e a detecção dos compostos carregados.

Como usado aqui a seguir, "ionização por eletropulverização" significa uma técnica usada em espectrometria de massa para ionizar ma- cromoléculas e superar a propensão das macromoléculas a fragmentar. Em "ionização por eletropulverização" um líquido é empurrado através de um capilarde metal carregado muito pequeno por um gás veículo. O líquido con- tém a substância que deve ser estudada, o analito, assim como uma grande quantidade de solvente, a qual é geralmente muito mais volátil do que o ana- lito. A mudança contida no capilar transfere o para o líquido que carrega a - molécula de analito. Visto que a carga repele, o líquido o empurra para fora do capilar e forma uma névoa ou um aerossol de pequenas gotículas com ' cerca de 10 um através do mesmo, para aumentar a distância entre as mo- léculas similarmente carregadas. Um gás veículo neutro é usado para eva- porar o solvente neutro nas pequenas gotículas, isto por sua vez une as mo- léculas de analito carregadas bem próximas. A proximidade das moléculas astorna instáveis, no entanto, visto que as moléculas similarmente carrega- das se aproximam, as gotículas explodem repetidamente. Este processo se repete até que o analito esteja livre do solvente e que um íon isolado seja formado. O íon isolado é transportado para um analisador de massa.

Como usado aqui a seguir, um "analisador de quadrupolo" é um analisador de massa composto de quads (isto é, dois pares de hastes metá- licas alinhadas em paralelo), em que um par de hastes tem um potencial elé- trico positivo e o outro conjunto de hastes tem um potencial negativo. Para ser detectado, um íon deve passar através do centro de uma trajetória limi- tada e em paralelo às hastes alinhadas. Quando os quads são operados em uma amplitude dada de corrente direta e voltagens de frequência de rádio, apenas jons de uma razão de m/z dada irão ressoar e ter uma trajetória es- tável para passar através do quadrupolo e serão detectados. "Modo de ion positivo" significa um modo em que os íons carregados positivamente são : detectados por meio do analisador de massa. "Modo de fon negativo" signifi- ca um modo em que os jons carregados negativamente são detectados por ' meio do analisador de massa.

Para o "monitoramento de íon único" ou "mo- nitoramento de ion selecionado" (isto é, SIM), a amplitude da corrente direta e as voltagens da frequência de rádio são ajustadas para observar somente a massa específica.

Como usado aqui a seguir, uma "fração de baixo peso molecu- lar" é uma fração que é enriquecida em uma ou mais das moléculas de baixo peso molecular.

Uma molécula de baixo peso molecular tipicamente tem um peso molecular de menos do que cerca de 1000 dáltons, e mais tipicamente menos do que cerca de 500 dáltons.

Como usado aqui a seguir, "hidrofóbico" significa não dissolven- - do ou dissolvendo pobremente em água.

Compostos "Hidrofóbicos" incluem —alcanos de cadeia longa.

Um solvente hidrofóbico é um solvente que é ca- ' paz de dissolver um composto hidrofóbico.

Como usado aqui a seguir "cerca de" quando usado no contexto de um número significa o número mais ou menos 10%. Descrito é um método para a identificação e/ou quantificação de aminoácidos em fluido do corpo.

O fluido do corpo pode ser sangue, plasma, soro, bile, saliva, urina, fluido cerebrospinal, e similares.

Fluidos do corpo preferidos são plasma, soro, CSF, urina, ou saliva, com plasma sendo o mais preferido.

Um conjunto de padrões de aminoácido individuais representan- doostiposde aminoácidos que devem estar presentes em um fluido do cor- po particular é preferivelmente adicionado à amostra do fluido do corpo an- tes de qualquer processamento.

O conjunto de padrões de aminoácido pre- ferivelmente contém uma quantidade conhecida de cada aminoácido indivi- dual presente no conjunto.

Um conjunto de padrões de aminoácido pode incluir um ou mais aminoácidos do grupo que consiste em lisina, asparagina, treonina, serina, isoleucina, metionina, prolina, histídina, glutamina, arginina, glicina, ácido aspártico, ácido glutâmico, alanina, valina, fenilalanina, leucina,

tirosina, cisteína, triptofano, fosfosserina, sulfo-cisteina, ácido arginossucci- : nico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, taurina, carnosina, citrulina, anserina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, etano- ' lamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino isobutírico, ácido alfa- amino-butírico, L-alo-cistationina (cistationina-A), L-cistationina (cistationina- B), cistina, alo-isoleucina, leucina, DL-hidroxilisina (hidroxilisina (1)), DL-alo- hidroxilisina (hidroxilisina (2)), ornitina, triptofano, homocistina, e isômeros dos mesmos (por exemplo, estereoisômeros).

Os aminoácidos do conjunto de padrões de aminoácido podem ser modificados de modo que eles possam ser facilmente discriminados dos aminoácidos correspondentes encontrados no fluido do corpo. O aminoácido interno padrão preferivelmente se comporta de forma próxima ao aminoácido que é escolhido para representar química e fisicamente, mas fragmentos - para os íons de uma massa diferente mediante a análise de espectrometria demassa. Assim, um conjunto preferido de padrões de aminoácido é deute- ' rado.

O fluido do corpo pode ser processado antes da derivatização para obter uma preparação enriquecida dos aminoácidos. Vários procedi- mentos podem ser usados para este propósito dependendo do tipo do fluido do corpo. Estes incluem a filtração, a precipitação, a centrifugação, as com- binações dos mesmos e similares. A separação de uma fração de baixo pe- so molecular é uma abordagem preferida. A separação por tamanho em vo- lumes pequenos da amostra é preferivelmente realizada pela filtração usan- do um filtro de corte de baixo peso molecular. A amostra do fluido do corpo filtrada (isto é, permeado) incluirá os aminoácidos livres e os componentes retidos (isto é, retentado) incluirão os componentes de alto peso molecular tais como as proteínas. Os filtros adequados para a geração de um filtrado incluem filtros de corte de 45 mícrons, 22 mícrons e 100,000, 50,000 e 10,000 dáltons. Além disso, componentes de alto peso molecular podem ser precipitados da amostra de plasma pela adição de álcool (por exemplo, me- tano!) ou ácido à amostra. Os componentes de alto peso molecular podem também ser removidos da amostra por centrifugação em alta velocidade.

A derivatização de aminoácidos é realizada seguindo qualquer : processamento necessário da amostra do fluido do corpo. Os aminoácidos na amostra tipicamente são derivatizados para facilitar a separação e/ou de- ' tecção de aminoácidos livres na amostra durante LC-MS (por exemplo, deri- vatização de pré-coluna é realizada primeiro onde LC é subsequentemente realizada). O agente de derivatização pode incluir substituintes que facilitam a detecção dos aminoácidos derivatizados durante ou após a cromatografia (por exemplo, fluoróforos ou cromóforos). Além disso, o agente de derivati- zação pode incluir substituintes que facilitam a ionização dos aminoácidos derivatizados durante a espectrometria de massa. Os agentes de derivatiza- ção típicos incluem os isotiocianatos (por exemplo, isotiocianato de fenila (PITO)), o-ftaldialdeído (OPA), 2 ,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB), e Nao-(2,4- dinitro-S-fluorofenil)-L-alaninamida (FDAA). Em uma modalidade preferida, o - agente de derivatização é PITC. Após os aminoácidos na amostra terem sido derivatizados, a : amostra é submetida à separação cromatográfica, preferivelmente a separa- ção por cromatografia líquida de alta pressão, e a espectrometria de massa (isto é, LC-MS).

A cromatografia líquida e a espectrometria de massa podem ser realizadas colocando a amostra derivatizada em um instrumento que inclua uma coluna cromatográfica em comunicação fluida com um espectrômetro de massa. A coluna cromatográfica tipicamente inclui um meio (isto é, um material para acondicionamento) para facilitar a separação dos aminoácidos derivatizados (isto é, o fracionamento). O meio pode incluir partículas minu- tas que tenham um diâmetro de aproximadamente 2-6 um, preferivelmente cerca de 3 um. Por exemplo, as partículas podem ser partículas de sílica. As partículas podem ter poros que tenham um diâmetro de aproximadamente 50 - 300 angstroms, preferivelmente 150 angstroms. Adicionalmente, as par- tículas podem ter uma área de superfície de aproximadamente 50 — 600 mg, preferivelmente 100 m?/g. As partículas incluem uma superfície ligada que interage com os aminoácidos derivatizados para facilitar a separação dos aminoácidos. Uma superfície ligada adequada é uma superfície ligada hidrofóbica tal como uma . superfície ligada por alquila. Superfícies ligadas por alquila podem incluir grupos alquila ligados C-4, C-8, ou C-18 , preferivelmente grupos ligados C- ' 18.

A coluna pode ter quaisquer dimensões adequadas. Em particu- lar, a coluna pode ter um diâmetro de cerca de 0.5 - 5 mm e um comprimen- to de cerca de 15 - 300 mm. Preferivelmente, a coluna tem um diâmetro de cerca de 2 mm e um comprimento de cerca de 50 mm.

Os meios adequados para a preparação de uma coluna croma- tográfica e/ou colunas preparadas podem ser obtidos a partir de fontes co- merciais. Em particular, as colunas adequadas podem ser obtidas a partir de Thermo Electron Corporation (por exemplo, 250x2,1 mm, 5 um, coluna Be- taBasic C18). - A coluna cromatográfica inclui um orifício de entrada para rece- ber uma amostra e um orífício de saída para descarregar um efluente que Ú inclui a amostra fracionada. No método, a amostra derivatizada é aplicada à coluna no orifício de entrada, eluída com um solvente ou mistura de solven- te, e descarregada no orifício de saída. Os modos de solvente diferentes podem ser selecionados para a eluição dos aminoácidos. Por exemplo, a cromatografia líquida pode ser realizada usando um modo de gradiente, um modo isocrático, ou um modo politíptico (isto é misturado). Preferivelmente, a cromatografia líquida é realizada usando um modo de gradiente. No modo de gradiente, à amostra derivatizada é aplicada à coluna e uma mistura de dois solventes (isto é, a fase móvel) é passada através da coluna para eluir os aminoácidos. Geralmente, como conhecido na técnica, um dos solventes tenderá a ser relativamente hidrofílico, e o outro solvente tenderá a ser rela- tivamente hidrofóbico. Como um exemplo específico de uma combinação de solvente verificada ser adequada na prática do presente método, o solvente hidrofílico pode ser 95% de H2O, 5% de acetonitrila e o solvente hidrofóbico pode ser 100% de acetonitrila, Opcionalmente, a combinação de solvente pode incluir um ou mais reagentes para facilitar a separação e/ou detecção dos aminoácidos derivatizados (por exemplo, acetato de amônio a 20 mM).

Alguns reagentes podem ser adicionados à fase móvel para melhorar o for- mato do pico cromatográfico e/ou para prover uma fonte de íons para LC- MS. ' Na maioria dos casos, para realizar uma cromatografia líquida comum solvente de gradiente, duas bombas são usadas que misturam os dois solventes.

Inicialmente, como os solventes são misturados, a mistura de solvente que é passada através da coluna (isto é, fase móvel) inclui na sua maioria o solvente hidrofílico.

Gradualmente, a quantidade de solvente hidro- fílico na mistura é diminuída e a quantidade de solvente hidrofóbico na mis- turaé aumentada para criar um gradiente de solvente.

Por fim, a mistura de solvente que é passada através da coluna inclui na sua maioria o solvente hidrofóbico.

Dessa maneira, os aminoácidos hidrofílicos serão eluídos antes dos aminoácidos hidrofóbicos. - O espectrômetro de massa inclui um orifício de entrada para re- cebera amostra fracionada que está em comunicação de fluxo com o orifício ' de saída da coluna cromatográfica.

O espectrômetro de massa é capaz de gerar um ou mais conjuntos de dados de espectroscopia de massa para i- dentificar um ou mais aminoácidos na amostra.

Os instrumentos adequados para a realização de LC-MS podem ser obtidos a partir de fontes comerciais.

Em particular, os instrumentos adequados para a realização de LC-MS po- dem ser obtidos a partir de Agilent Technologies (por exemplo, Agilent Série 1100 LC/MSD). O espectrômetro de massa incluirá uma fonte de íons para a io- nização da amostra fracionada e criação das moléculas carregadas para análise adicional.

A ionização da amostra pode ser realizada por ionização por eletropulverização (ESI), ionização química por pressão atmosférica (ACPI), fotoionização, ionização por elétrons, ionização por bombardeio de átomos rápida (FAB)/secundária líquida (LSIMS), ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI), ionização de campo, dessorção de cam- po, ionização por termopulverização, e ionização por feixe de partícula.

A ionização por eletropulverização é preferida.

Após a amostra ter sido ionizada, os íons carregados positiva-

mente ou carregados negativamente criados dessa forma podem ser analisa- : dos para determinar uma razão de massa para carga (isto é, m/z). Preferivel- mente, os íons carregados negativamente são analisados. Os analisadores ' adequados para a determinação das razões de massa para carga incluem os analisadores de quadrupolo, analisadores de armadilhas de jons, e analisado- res de tempo de vôo. Preferivelmente, a razão de massa para carga é deter- minada usando um analisador de quadrupolo. Os íons podem ser detectados usando vários modos de detecção. Por exemplo, os íons selecionados podem ser detectados (isto é, usando um modo de monitoramento de fons seletivo (SIM)), ou alternativamente, os íons podem ser detectados usando um modo de varredura. Preferivelmente, os ions são detectados usando SIM. Exemplo 1 — Procedimentos Analíticos Amostras de urina, plasma, e fluido cerebrospinal (CSF) foram - obtidas a partir de indivíduos normais. As amostras de plasma heparinizadas foram coletadas a partir de pacientes após um jejum durante a noite.

' As amostras de não jejum para pacientes pediátricos foram usa- das. O procedimento a seguir foi usado para a quantificação de aminoácido em urina, plasma, e CSF.

Os padrões internos deuterados foram adicionados a cerca de 100 4uldo material de teste (isto é, plasma, urina, ou CSF) para formar uma mistura de teste. A mistura de teste a seguir foi passada através de um filtro de peso molecular 10.000 para prover uma fração de filtrado de baixo peso molecular como uma amostra de teste e a seguir seca sob nitrogênio a 40- 75ºC. A amostra seca foi dissolvida em cerca de 25 ul de uma solução a- vermelhada (volumes iguais de metanol, acetato de sódio a 1M, e trietilami- na) e seca sob nitrogênio a 40ºC. A amostra foi dissolvida em 50 ul de uma solução de derivatização (1,12 ul de 100% de metanol, 1,60 (| de água, 1,60 (1 de 100% de trietilamina e 1,60 (| de 100 fenilisotiocianato (PITC)). A amos- tra dissolvida foi a seguir aquecida a cerca de 40ºC por cerca de 15 - 20 mi- nutosea seguir seca sob nitrogênio líquido a 50-60ºC. A amostra seca foi dissolvida em 100 (| de uma solução de reconstituição (95% > H20, 5% > acetonitrila), submetida a vórtex, e transferida para frascos para LC/MS.

A determinação de LC/MS dos aminoácidos da amostra foi reali- : zada usando um Agilent Série 1100 LC/MSD com um Thermo Beta-Basic C- 18 (250 x 2,1 mm) coluna HPLC. A fase móvel consistia em (A) acetato de ' amônio a 20 mM e (B) 100% de acetonitrila, aquecidos a 50ºC. Os aminoá- cidos na amostra foram eluídos da coluna usando um gradiente de etapa como a seguir: Máximo Tempo Fase móvel fluxo Pressão 1 om TO | osso [60 [e a To osso | 50 | 13 | 450 | oo | osso | 350 |

[4] eso | so | osso | 350 | [E eso TO ro TT osso | ao — [CET | o [oo | ao [Goes Tre TO os [ao — Er [O so oo | ao | 8 | 1850 | 500 | osso | ao | ro] sn To [osso so [nin JO o [osso | ao rn TO osso so À medida que os aminoácidos separados saem da coluna de HPLC, eles foram introduzidos na câmara de pulverização onde o efluente é pulverizado e dessolvatado pela fonte de íons por eletropulverização. Os derivados de PITC foram carregados negativamente durante o processo de eletropulverização e a seguir ainda separados através do filtro de massa quadrupolo. Os íons de aminoácido foram detectados e suas abundâncias medidas. A razão das abundâncias de área de cada íon de aminoácido em relação a seu padrão interno foi plotada contra uma curva de calibração de seis pontos. As figuras 1 e 2 mostram os resultados de uma rodada típica. Exemplo 2 - Quantificação do teor de aminoácido em plasma A análise de aminoácido foi realizada em amostras de plasma heparinizado obtidas a partir de neonatos (< 30 dias), bebês (1 — 23,9 meses),

crianças (2 — 17,9 anos), e adultos (= 18 anos). Todos os indivíduos foram : avaliados como clinicamente normais ou obtidos a partir de amostras subme- tidas a determinações de doença infecciosa.

Todos os indivíduos estavam ' completamente saudáveis ambulatoriamente, na comunidade social e sem — nenhuma medicação.

A demografia dos grupos de teste é como a seguir: [Bebês (T230meses) || 115 — | se | 6 | [cranças E tamos | aaa [| 7 68 | [autos e 18anos | Ia TT Ta TT Com base na análise destas amostras de plasma, faixas de refe- rência normais foram construídas usando procedimentos-padrão estatísticos paramétricos e não paramétricos.

Se os dados eram determinados para se- rem Gaussianos, a faixa média apropriada + 2 SD era escolhida.

Se os da- dos eram não gaussianos, a faixa percentil 95 não paramétrica ou a faixa - observada era escolhida.

A tabela 1 provê faixas de referência normais para cada aminoácido avaliado, junto com o limite de quantificação (LOQ). Faixas de referência são providas em uM (micromols por litro). A faixa normal para aminoácidos os quais são não detectáveis deve ser tomada para ser menor doque ouigualaLOQ.

Tabela 1: Níveis de aminoácidos adultos e pediátricos no plasma mem A Se as eee 28 tável | Asdoaspárico —|10|24-195 [23-143] 1382 | 0039 | Cisteina) (ASA) Prolina) tável tectável tável tectável

[Sema —funK| 8r207 | 63212 | 65185 | 651386 | . a-Ácido amino adípico | 1,0 <2,8 <ss6 <21 <2,4 Mr a a A 1459 (PEA) ' tável tectável tável tectável [emma “1o| ass | 450 | os | 1651) tável tectável eta | 92 | 99 | E | em His) tável tectável tável tectável CO(GABA) tável tectável eee e [2 [166 js His) 3-Amino-Ácido isobu- Não de- [Pena ro] 6757 Tosa | s6s5T [104365 | a -Ácido amino butírico

— [O vetonma — [10] 1345 | 1250 | 1437 [163 | A) tável tectável tável tectável B) tável tectável tável tectável [sm | 2 | sm | so | 55 | | soeuna — [1.0] 1292 [10700 | 3397 | 3406 | tável tectável tável tectável renan o 1 [| Lisina-1) - Lisina-2) tável tectável tável menos : tável tectável tável tectável [| Tintotano — |10[ 1785 | 1692 | 3004 | 2097 | Exemplo 3 — Quantificação do teor de aminoácido na urina A análise de aminoácido foi realizada em amostras de urina ob- tidas a partir de neonatos (<30 dias), bebês (1 — 23,9 meses), crianças (2 - 17 anos), e adultos (> 17 anos). Todos os indivíduos foram avaliados como clinicamente normais ou obtidos a partir de amostras submetidas para de- terminações de doenças infecciosas.

Todos os indivíduos estavam comple- tamente saudáveis ambulatoriamente, na comunidade social e sem nenhu- ma medicação.

A emografia dos grupos de teste é como a seguir: [Bebes T239meses)| ao | 23 | tm [eranças (2-iTanos) | ao [ar 1 ss [adutost trans [| mo [ss [| s |

O teor de aminoácido da urina é inicialmente medido em uma base de concentração (umol de aminoácido por litro de urina; uM). As con- centrações de aminoácido foram a seguir normalizadas com base nos níveis : de creatinina na urina e Faixas de Referência normais foram construídas usandoos procedimentos padrão, estatísticos paramétricos e não paramétri- cos.

Se os dados eram determinados para serem Gaussianos, a faixa média apropriada + 2 SD era escolhida.

Se os dados eram não gaussianos, a faixa percentil não paramétrica 95 ou a faixa observada era escolhida.

A tabela 2 provê faixas de referência normais (mmol/moi de creatinina) para cada ami- —noácido avaliado.

O limite de quantificação (LOQ) é baseado na determina- ção de aminoácido na urina, não ajustada para creatinina.

A faixa normal para aminoácidos, os quais são não detectáveis, deve ser tomada para ser menos do que ou igual a LOQ. creatinina) | mc | 9 | e e tável (S-Cisteina) succínico (ASA) (OH-Prolina) e o dae a | eo | use | tectável tável tável tável [aaaana | 7 | se | mm | e | 257 | adípico (AAD) [eins | TT [zi6205] 105219 | 25415 | sx |

Tabela 2: Níveis de aminoácidos adultos e pediátricos na urina (mmol/mol de creatinina) Fosfo- <23 <32 <15 <a etanolamina (PEA) p-Alanina (BA- 2 <o <15 <5 <10 LA) 40-301 | 56-543 | 9425 17-266 — [reme [7 Tem [se | a | 6 1-Metil-histidina <16 4-71 5-400 <204 (1-Me-His) y-Ácido amino butírico (GABA) Es <14 <1,5 <16 <16 3-Metil-histidina UNK 9-45 14-35 11-40 10-35 (3-Me-His) B-Amino-Ácido isobutírico 3 <269 <309 <133 <88 (BAIB) [Pora TT em e e | Etanolamina [| 1 | 87400 [| 54176 | 27114 21-65 a-Ácido amino < butírico (AB) Cisteína 1 Não de- | Não detec- <A <5 tectável tável creatinina) | | | vana | 2 | 220 | 421 | 220 | 25 | | Metonina [a | so | so | ss | << | ee e ee (Cista-A) (Cista-B) [ osma [um | 155 | om | sm | ss | (alo-lle) tectável tável tável tável : Ú (OH-Lisina-1) (OH-Lisina-2) tável tável tectável tável tável [Feminina | Nx | oa | om 1 22 | 20 [mean | 7 [22 | sa | 22 | 27 | [om Tr Ts Ts | = [Tao TER SS Total Total Exemplo 4 — Quantificação do teor de aminoácido no fluido cerebrospinal (CSF) A análise do aminoácido foi realizada em amostras de CSF obti- das a partir de neonatos (com meses), bebês (3 - 23,9 meses), crianças (2- 10anos),eadultos(>10 anos). Todos os indivíduos foram avaliados como clinicamente normais ou obtidos a partir de amostras submetidas para de- : terminações de doenças infecciosas.

Todos os indivíduos foram avaliados como clinicamente normais ou obtidos a partir de amostras submetidas para " determinações de doenças infecciosas.

Todos os indivíduos estavam com- pletamente saudáveis ambulatoriamente, na comunidade social e sem ne- nhuma medicação.

A demografia dos grupos de teste é como a seguir: [Nsonstos zameses] — 27 —[ 2 | 2 | Bones (325.0 meses) 22 | 16 | 6 | [oranças(toanos) | 21 q o | 1 Com base na análise destas amostras de CSF, as faixas de refe- rência normais foram construídas usando procedimentos-padrão estatísticos paramétricos e não paramétricos.

Se os dados eram determinados para se- l 10 rem Gaussianos, a faixa média apropriada + 2 SD foi escolhida.

Se os dados - eram não gaussianos, a faixa percentil não paramétrica 95 ou a faixa obser- vada era escolhida.

A tabela 3 provê faixas de referência normais para cada aminoácido avaliado, junto com o limite de quantificação (LOQ). Faixas de referência são providas em uM (micromols por litro). A faixa normal para a- minoácidos os quais são não detectáveis deve ser tomada para ser menor do que ou igual ao LOQ. tectável tável ema po Cisteina) [Amo guamico [10] | st | <me [1762] (ASA) | Om [16 eee | emo pen =" | Prolina) tável em [EST ea Dao | caso tável tectável tável tectável — [Os | | soss [2261 | 1562 [ om | [enem es [se | 2 | =) (AAD) tável tectável tável tectável A a OO Luana | ta | eai | tável tectável tável tectável Fosfo-etanolamina Não detec- | Não de- e [eo ua Rasa | 2 | se | ; 2,0 | Não detec- | Não de- |Não detec-| Não de- O | even PMI TER ME] EE ama fone om | « | 1 | 18] tável tectável tável tectável His) i-Ácido amino butírico Não detec- | Não de- ra TO a Lama | 22 | 9 | Da o | | | His) rico (BAIB) ' tável tectável tável tectável [Pena Trof so | 23 | <i7 | so |

' a -Ácido amino butírico tável tectável tável tectável [vaia June nat [ans [as | 722 | [ vennma no] 2m | mw | se | 1) A) tável tectável tável tectável B) tável tectável tável tectável [| soewna [no] an De | 2 | so | tável tectável tável tectável : Lisina-1) tável tectável tável tectável Lisina-2) tável tectável tável tectável e SIT Ras 2 | | tável tectável [renan fone at [4 | 25 | om | [roma [20] 257 | «5 | «7 | suz | [sn une 636 | 320 | 956 | 1960 | Exemplo 5 — Quantificação do teor de aminoácido na saliva A análise de aminoácido foi realizada nas amostras de saliva de nove (9) adultos (3 machos e 6 fêmeas). Todos os indivíduos foram avalia- dos como clinicamente normais e estavam completamente saudáveis ambu- latoriamente, na comunidade social e sem nenhuma medicação.

A tabela 4 provê as faixas medidas atuais dos níveis de aminoácido.

Para propósitos diagnósticos, estas faixas podem ser consideradas faixas "normais". A faixa

. normal para aminoácidos os quais são não detectáveis deve ser tomada pa-

* ra ser menor do que ou igual ao LOQ. & | : : [Lemon TO ow | [oem sas |

O CO meme Togo ' ! sem o [e | | - Todas as patentes e outras referências citadas no relatório des- : critivo são indicativas do nível de habilidade daqueles versados na técnica a qual a invenção pertence, e são incorporadas por referência em suas totali- dades, incluindo quaisquer tabelas e figuras, no mesmo grau que se cada referência tivesse sido incorporada por referência em sua totalidade indivi- dualmente.

Alguém versado na técnica apreciaria prontamente o fato de que a presente invenção está bem adaptada para obter os fins e as vantagens mencionados assim como aqueles herdados no mesmo. Os métodos, vari- âncias, e composições, descritos aqui a seguir atualmente como representa- tivos de modalidades preferidas, são exemplares e não pretendem ser con- siderados como limitações sobre o escopo da invenção. As mudanças na mesma e outros usos que ocorrerão àqueles versados na técnica, os quais são abrangidos dentro do espírito da invenção, são definidos pelo escopo dasreivindicações. Será prontamente aparente a alguém versado na técnica que as substituições e modificações variantes podem ser feitas à invenção descrita aqui a seguir sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. Assim,

: tais modalidades adicionais estão dentro do escopo da presente invenção e . das seguintes reivindicações. - A invenção descrita ilustrativamente aqui a seguir pode ser prati- 7 cada adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limi- tação ou limitações as quais não são especificamente descritas aqui a se- guir. Assim, por exemplo, em cada exemplo aqui a seguir qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em” e "consistindo em” pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Os termos e expressões que têm sido empregados são usados como termos de descri- çãoenão de limitação, e não existe qualquer intenção de que o uso de tais termos e expressões exclua quaisquer equivalentes das características mos- tradas e descritas ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Por- . tanto, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido espe- - 15 cificamente descrita pelas modalidades preferidas e características opcio- ' nais, modificação e variação dos conceitos aqui a seguir descritos podem ser reclassificadas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do escopo desta invenção como definido pelas reivindicações em anexo.

Além disso, onde as características ou aspectos da invenção são descritos em termos dos grupos de Markush ou outro grupamento de alternativas, aqueles versados na técnica irão reconhecer que a invenção é também por meio disso descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush ou outro grupo.

Também, a menos que indicado o contrário, onde vários valores numéricos são providos para as modalidades, as modalidades adicionais são descritas tomando quaisquer dois valores diferentes como os valores finais de uma faixa. Tais faixas estão também dentro do escopo da invenção descrita.

Assim, as modalidades adicionais estão dentro do escopo da invenção e dentro das reivindicações a seguir.

Claims (22)

1. . REIVINDICAÇÕES : 1. Método para identificar a presença de um ou mais aminoáci- . dos individuais no fluido do corpo de um indivíduo, compreendendo: ' (a) derivatizar aminoácidos no fluído do corpo; (b) separar os aminoácidos derivatizados através de cromatogra- fia líquida (LC); e (o) identificar os aminoácidos derivatizados da etapa (b) usando análise de espectrometria de massa (MS) e quantificando o aminoácido deri- vatizado por comparação com aminoácidos estruturalmente similares, a par- tirde um conjunto de padrões de aminoácidos, e em que a MS é distinta de MS de tandem.
2. 2. Método para determinar se um fluido do corpo de um indivído contem um nível anormal de um ou mais aminoácidos compreendendo: - (a) derivatizar aminoácido no fluido do corpo; . 15 (b) separar os aminoácidos derivatizados através de cromatogra- ' fia líquida (LC) ; e (c) identificar os aminoácidos derivatizados a partir da etapa (b) usando análise de espectrometria de massa (MS), e quantificar o aminoáci- do derivatizado em comparação com aminoácidos estruturalmente similares, a partirde um conjunto de padrões de aminoácidos, e em que a MS é distin- ta de MS de tandem.
3. 3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados é selecionado do grupo consistindo em fosfoserina, sulfo-cisteina, ácido arginosuccínico, hi- droxiprolina, ácido aspártico, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anseri- na, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, prolina, etano- lamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, cisteína, L- alo-cistationina-A, L- cistationina, cistina, alo-isoleucina, DL-hidroxilisina, DL- alo-hidroxilisina, e homocistina.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em fosfosserina, sulfo-cisteina, ácido argino-

   . succínico, hidroxiprolina, ácido aspártico, fosfoetanolamina, sarcosina, car- : nosina, anserina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adiípico, beta-alanina, . prolina, etanolamina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino- ' isobutírico, cisteina, L-alo-cistationina-A, L-cistationina, cistinay Dl- hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em fosfoserina, sulfo-cisteina, ácido argino- succínico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, beta-alanina, prolina, etanola- mina, ácido gama-amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, cisteina, L- alo-cistationina-A, L-cistationina, cistina, alo-isoleucina, DL-hidroxilisina, DL- hidroxilisina, e homocistina. -
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,emque pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em fosfosserina, sulfo-cisteina, ácido argino- succínico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, etanolamina, ácido gama- amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, L-alo-cistationina-A, L- cistationina, cistina, alo-isoleucina, DL-hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em fosfosserina, sulfo-cisteina, ácido argino- succínico, hidroxiprolina, fosfoetanolamina, sarcosina, carnosina, anserina, 1,3-metil-histidina, ácido alfa-amino-adípico, etanolamina, ácido gama- amino-butírico, ácido beta-amino-isobutírico, L-alo-cistationina-A, L- cistationina, cistina, DL-hidroxilisina, DL-alo-hidroxilisina, e homocistina.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,emque pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em tirosina, treonina, leucina, isoleucina, va- lina, lisina, e histidina.

   .
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- j lecionado do grupo consistindo em cistina e glutamina. '
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,emque pelomenos um dos aminoácidos derivatizados identificados é se- lecionado do grupo consistindo em triptofan e histidina.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 à 10, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é alanina.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é selecionado do grupo consistindo em tirosina e fenilalanina.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a é 12, em que o fluido do corpo é selecionado do grupo consistindo em plasma, - 15 urina fluidocérebro espinhal (CSF), e saliva, i
14. 14. Método de acordo com reivindicação 13, em que o fluido do corpo é saliva.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o fluido do corpo é plasma, e a quantidade de pelo menos um aminoácido derivatizado identificado é comparado às faixas de referência providas na Tabela 1.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o fluido do corpo é urina, e a quantidade de pelo menos um ami- noácido derivatizado identificado é comparada às faixas de referência provi- dasnaTabela2.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o fluido do corpo é CSF, e a quantidade de pelo menos um ami- noácido derivatizado identificado é comparada às faixas de referência provi- das na Tabela 3.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o fluido do corpo é saliva, e a quantidade de pelo menos um dos aminoácidos derivatizados identificados é comparada às faixas de referência
19. . providas na Tabela 4. . 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a . 18, em que o dito pelo menos um aminoácido é derivatizado com fenilisotio- " cianato (PITC), o-ftaldialdeído (OPA), 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB), ou Na(2,4-dinitro-S-fluorofenil)-L-alainamida (FDAA).
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o dito pelo menos um aminoácido é derivatizado com PITC.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que o dito método quantifica a quantidade de pelo menos cinco ami- —noácidos.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que o dito método quantifica a quantidade de pelo menos quinze a- minoácidos.