WO2015033636A1 - ３－ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素 - Google Patents

３－ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素 Download PDF

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amino acid
acid sequence
hydroxyproline
dehydrase
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誠也 渡邉
佳彰 谷本
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国立大学法人愛媛大学
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    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing 3-hydroxyproline using an enzyme, a method for measuring collagen, and a novel ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase used therefor.
  • a method for analyzing collagen in a sample a method of measuring collagen indirectly by measuring the content of hydroxyproline contained in collagen is common.
  • Collagen contains hydroxyproline which does not correspond to a basic amino acid constituting a general protein, that is, a non-collagen protein. For this reason, if the hydroxyproline in a sample is analyzed, the collagen in the sample can be indirectly analyzed.
  • HPLC analysis is widely used (Patent Document 1).
  • a sample is pretreated, and hydroxyproline is liberated by degradation of collagen.
  • the pretreated sample is subjected to HPLC, and the amount of hydroxyproline is calculated from the peak area of hydroxyproline.
  • the amount of collagen in the sample can be determined from the calculated value and the amount of hydroxyproline per molecule of collagen.
  • hydroxyproline When analyzing hydroxyproline by HPLC analysis, the hydroxyproline must be separated from L-hydroxyproline which is released by the degradation of collagen. However, it is difficult to separate hydroxyproline from L-hydroxyproline by HPLC analysis. Further, since hydroxyproline is a secondary amine, it needs to be opened with a special developing solvent. Furthermore, HPLC analysis requires expensive analytical columns and instruments, and there is a problem that analysis takes time.
  • collagen IV has been reported to increase in concentration in the urine of cancer patients and can be a marker for cancer. Since collagen IV contains about 8 to 25 times as much 3-hydroxyproline as other types (for example, I to III), by analyzing 3-hydroxyproline, Collagen IV that is indirectly a cancer marker can be analyzed. Therefore, there is a demand for a method that enables simple analysis of 3-hydroxyproline.
  • an object of the present invention is to provide a new analysis method that enables simple analysis of 3-hydroxyproline and a method for measuring collagen using the same.
  • the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention is an analysis method for analyzing 3-hydroxyproline in a test sample, and includes the following steps (s1) to (s3): Features.
  • (S1) Dehydration step of dehydrating 3-hydroxyproline in the test sample into ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid by 3-hydroxyproline dehydrase (s2) by ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase
  • the method for measuring collagen of the present invention is a method for measuring collagen in a test sample, and includes the following steps (S1) to (S3).
  • S1 Release step of releasing 3-hydroxyproline from collagen in the test sample (S2) Measurement step of measuring the amount of 3-hydroxyproline released in the step (S1) by the analysis method of the present invention (S3)
  • S3 A calculation step of calculating the amount of collagen from the amount of 3-hydroxyproline measured in the step (S2) based on the ratio coefficient of 3-hydroxyproline to the collagen obtained in advance
  • the novel protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following (R1 Tl ) to (R3 Tl ).
  • (R1 Tl ) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (R2 Tl ) In the amino acid sequence of (R1 Tl ), comprising one or several amino acids deleted, substituted, inserted and / or added.
  • ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity protein (R3 Tl ), comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of (R1 Tl ), and ⁇ 1 -pyrroline- Protein having 2-carboxylate reductase activity
  • the novel protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following (R1 Ab ) to (R3 Ab ).
  • (R1 Ab ) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (R2 Ab ) In the amino acid sequence of (R1 Ab ), comprising one or several amino acids deleted, substituted, inserted and / or added.
  • ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity protein (R3 Ab ) comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of (R1 Ab ), and ⁇ 1 -pyrroline- Protein having 2-carboxylate reductase activity
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase of the present invention is characterized in that it is at least one protein selected from the group consisting of (R1 Cp ) to (R3 Cp ) below.
  • (R1 Cp ) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (R2 Cp ) In the amino acid sequence of (R1 Cp ), consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylate reductase activity protein (R3 Cp ), comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of (R1 Cp ), and ⁇ 1 -pyrroline- Protein having 2-carboxylate reductase activity
  • the analysis reagent of the present invention is an analysis reagent for 3-hydroxyproline, and is characterized by containing 3-hydroxyproline dehydrase and ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylate reductase.
  • the measurement reagent of the present invention is a collagen measurement reagent, characterized in that it contains the aforementioned 3-hydroxyproline analysis reagent of the present invention.
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (r1 Tl ) to (r3 Tl ).
  • R1 Tl consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 polynucleotide (r2 Tl) in the nucleotide sequence of the (r1 Tl), 1 or several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence
  • a polynucleotide encoding a protein having ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylate reductase activity (r3 Tl ), comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of the (r1 Tl )
  • the novel gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (r1 Ab ) to (r3 Ab ).
  • (R1 Ab) comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 polynucleotide (r2 Ab) in the nucleotide sequence of the (r1 Ab), 1 or several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence
  • a polynucleotide encoding a protein having ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity (r3 Ab ), comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (r1 Ab ) A polynucleotide encoding a protein having ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (r1 Cp ) to (r3 Cp ).
  • R1 Cp consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 polynucleotide (r2 Cp) in the nucleotide sequence of the (r1 Cp), 1 or several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence
  • a polynucleotide encoding a protein having ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity (r3 Cp ), comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (r1 Cp )
  • the present inventor has found a new method using an enzyme as a method for analyzing 3-hydroxyproline. Specifically, first, the 3-hydroxyproline anhydrase, 3-hydroxyproline delta 1 - converted to pyrophosphoric 2-carboxylic acid, further, delta 1 - by pyrroline-2-carboxylic acid reductase, delta 1 -A reduction reaction of pyrroline-2-carboxylic acid is performed. By analyzing this reduction reaction, the inventors have obtained knowledge that 3-hydroxyproline can be analyzed enzymatically, and the present invention has been completed. According to the analysis method of the present invention, 3-hydroxyproline can be easily analyzed by an enzymatic reaction without using HPLC as in the prior art. Further, since 3-hydroxyproline can be analyzed by the analysis method of the present invention, it is possible to indirectly measure collagen indirectly. For this reason, the present invention can be said to be a very useful technique in the fields of medicine, food, and beauty.
  • FIG. 1 shows that in Example 1 of the present invention, Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase and Ps .
  • 2 is a photograph showing the results of CBB staining of aeruginosa- derived ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid (hereinafter also referred to as “Pyr2C”) reductase.
  • FIG. 2 is also referred to as 3-hydroxyproline (hereinafter, 3-Hyp) in Example 1 of the present invention. It is a graph which shows Pyr2C reductase activity when the density
  • FIG. 3 is a graph showing a calibration curve prepared using 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing Pyr2C reductase activity when the amount of 3-Hyp dehydrase and the amount of Pyr2C reductase were changed in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing Pyr2C reductase activity when the timing of adding Pyr2C reductase was changed in Example 2 of the present invention.
  • Figure 6 is the third embodiment of the present invention, A. It is a photograph which shows the result of CBB dyeing
  • FIG. 7 is a graph showing Pyr2C reductase activity when coenzyme is changed in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing Pyr2C reductase activity when the substrate is changed in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 9 shows Ps . aeruginosa- derived Pyr2C reductase and A. It is a graph which shows Pyr2C reductase activity of brasilense origin Pyr2C reductase.
  • FIG. 10 shows A ... When the carbon source was changed in Example 5 of the present invention. It is a graph which shows 3-Hyp dehydrase activity and Pyr2C reductase activity of a cell-free extract derived from brasilense .
  • FIG. 9 shows Ps . aeruginosa- derived Pyr2C reductase and A. It is a graph which shows Pyr2C reductase activity of brasilense origin Pyr2
  • FIG. 11 is a photograph showing a result of SDS-PAGE of recombinant protein in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing specific activity and K cat / K m value in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing specific activity and K cat / K m values in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing specific activities at different pHs in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 15 is a graph showing specific activities at different pHs in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 16 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement in Example 8 of the present invention.
  • FIG. 17 is a graph showing relative activity in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing specific activity and K cat / K m value in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing specific activity and K cat / K m values in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 14 is
  • FIG. 18 is a graph showing the results of HPLC analysis in Example 10 of the present invention.
  • FIG. 19 is a graph showing a calibration curve prepared using 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase in Example 11 of the present invention.
  • FIG. 20 is a graph showing the 3-hydroxyproline concentration determined from the calibration curve and the 3-hydroxyproline concentration measured by HPLC in Example 11 of the present invention.
  • FIG. 21 is a graph showing relative activity in Example 12 of the present invention.
  • FIG. 22 is a graph showing relative activity in Example 12 of the present invention.
  • FIG. 23 is a photograph showing a result of SDS-PAGE of recombinant protein in Example 13 of the present invention.
  • FIG. 24 is a graph showing relative activity in Example 13 of the present invention.
  • FIG. 25 is a graph showing relative activity in Example 13 of the present invention.
  • FIG. 26 is a graph showing relative activity in Example 13 of the present invention.
  • FIG. 27 is a graph showing the absorbance in the
  • the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention is an analytical method for analyzing 3-hydroxyproline in a test sample, and includes the following steps (s1) to (s3): .
  • (S1) Dehydration step of dehydrating 3-hydroxyproline in the test sample into ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid by 3-hydroxyproline dehydrase (s2) by ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase
  • 3-hydroxyproline dehydrase is also referred to as 3-Hyp dehydrase
  • ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase is also referred to as Pyr2C reductase.
  • the 3-Hyp dehydrase may be a protein having a catalytic function for the dehydration reaction of 3-hydroxyproline, and the type and origin thereof are not particularly limited.
  • the 3-Hyp anhydrase for example, Homo genus, Pseudomonas genus, Burkholderia genus Azospirillum genus Mus genus Saccoglossus genus Colwellia genus, like Thermococcus genus, and the like.
  • Examples of the Homo genus include Homo sapiens and the like.
  • the genus Pseudomonas is, for example, Ps . aeruginosa and the like.
  • the Burkholderia genus is, for example, B. cenocepacia , B. pseudomallei , B. sp . 383 and the like.
  • the genus Azospirillum is, for example, A. brasilense and the like, and specific examples include: A. brasilense ATCC 29145.
  • Examples of the Mus genus include Mus musculus .
  • Saccoglossus genus for example, Saccoglossus kowalevskii, and the like.
  • the Colwellia genus includes, for example, Colwellia p redesignrythrea, etc., and specific examples include Colwellia p redesignrythrea 34H.
  • Examples of the Thermococcus genus include Thermococcus literalis , Thermococcus sibiricus and the like.
  • Examples of the 3-Hyp dehydrase include the following.
  • Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase includes, for example, GenBank accession no. Examples thereof include a protein comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) registered under NP_653182.1.
  • Mus musculus- derived 3-Hyp dehydrase for example, GenBank has accession no. Examples thereof include a protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) registered under NP_080314.1.
  • the Saccoglossus kowalevskii from 3-Hyp anhydrase for example, accession in GenBank session No.
  • Examples thereof include a protein comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) registered under XP_002734182.1. B. sp .
  • Examples of 383-derived 3-Hyp dehydrase include Genbank accession no.
  • Examples thereof include a protein comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) registered under YP — 37248.1.
  • 3-Hyp dehydrase Specific examples of the 3-Hyp dehydrase are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
  • two square residues (C / T) are active sites involved in the catalytic function of 3-Hyp dehydrase.
  • the 3-Hyp dehydrase for example, at least one of the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention and the 3-Hyp dehydrase of the present invention can be used.
  • the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention and the 3-Hyp dehydrase of the present invention will be described later.
  • the 3-Hyp dehydrase is, for example, at least one protein selected from the group consisting of (D1) to (D3) below.
  • (D1) A protein comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 7, 8, 9, 10, 11 and 12
  • (D2) In the amino acid sequence of (D1), one or several A protein comprising an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having 3-hydroxyproline dehydrase activity (D3) 80% or more identity to the amino acid sequence of (D1) A protein comprising an amino acid sequence having 3-hydroxyproline dehydrase activity
  • SEQ ID NO: 3 in the (D1) the (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Hs ), (D2 Hs ) and (D3 Hs ), respectively.
  • SEQ ID NO: 9 in (D1), (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Cp ), (D2 Cp ) and (D3 Cp ), respectively.
  • SEQ ID NO: 11 in the (D1) the (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Ab ), (D2 Ab ) and (D3 Ab ), respectively.
  • SEQ ID NO: 12 in (D1), (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Tl ), (D2 Tl ) and (D3 Tl ), respectively.
  • “1 or several” may be in the range where, for example, the (D2) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “one or several” of (D2) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of (D1).
  • the numerical range of numbers discloses, for example, all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 3” means all disclosures of “1, 2, 3” (hereinafter the same).
  • the “identity” may be, for example, within a range where the (D3) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “identity” of (D3) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the amino acid sequence of (D1). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the residues at the two active sites are preferably conserved in C / T.
  • the two active sites are, for example, aligned based on Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase (SEQ ID NO: 3), and the corresponding two sites are the active sites. It can be judged.
  • the identity is, for example, 40% or more, Preferably it is 60% or more, more preferably 80% or more.
  • the enzyme activity of the 3-Hyp dehydrase is not particularly limited, and 1 unit (U) can be defined as, for example, the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of L-proline per minute under the conditions of 30 ° C. and pH 8.
  • 3-hydroxyproline is, for example, cis-3-hydroxy-L-proline (hereinafter also referred to as cis-3-hydroxyproline) and trans-3-hydroxy-L-proline (hereinafter also referred to as trans-3-hydroxyproline). ).
  • the cis-type or trans-type of the 3-Hyp dehydrase may be used as a substrate, and both may be used as substrates.
  • 3-Hyp dehydrase using trans form as a substrate is preferable.
  • the Pyr2C reductase is not particularly limited as long as it is a protein having a catalytic function for the reduction reaction of ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid.
  • Examples of the Pyr2C reductase include Pseudomonas genus, Azospirillum genus, Burkholderia genus, Colwellia genus, Thermococcus genus and the like.
  • the genus Pseudomonas is, for example, Ps . aeruginosa , Ps . putida, Pseudomonas syringae and Pseudomonas chlororaphis, and the like.
  • Ps . aeruginosa is a PAO1 strain (for example, Bater, AJ, Venables, WA, and Thomas, S. (1977) Arch. Microbiol. 112, 287-289, Manoharan, HT (1980) J. Biosci. 107-120).
  • Ps . Examples of putida include the KT2422 strain (see, for example, Gryder, RM, and Adams, E. (1969) J. Bacteriol. 97, 292-306).
  • the genus Azospirillum is, for example, A. brasilense and the like.
  • A. brasilense as a specific example, ATCC29145 strain, and the like.
  • the Burkholderia genus is, for example, B.
  • the Colwellia genus includes, for example, Colwellia p redesignrythrea, etc., and specific examples include Colwellia p redesignrythrea 34H.
  • Examples of the Thermococcus genus include Thermococcus literalis , Thermococcus sibiricus and the like.
  • Genbank has accession no. Examples thereof include a protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) registered under NP — 249943.1.
  • Ps . aeruginosa- derived Pyr2C reductase (SEQ ID NO: 2) MIRMTLDEVRELAVRILRRHAFSEAHVQAVADTLVAGERDECASHGIWRLLGCIATLKAGKVSADAEPELHDIAPGLLRVDAHGGFSQCAFRLGLPHLLEKARSQGIAAMAVNRCVHFSALWVEVEALTEAGLVALATTPSHAWVAPAGGRKPIFGTNPIAFGWPRPDGPPFVFDFATSAVARGEIQLHERAGKPIPLGWGVDEQGEPTTDASAALRGAMLTFGGHKGSALAAMVELLAGPLIGDLTSAESLAYDEGSRSSPYGGELLIAIDPRRMLGASAEEHLARAETLFEGIVEQGARLPSQRRFEARERSARDGVTIPEALHRELLALLE
  • dpkA-like enzyme or ornithine cyclodeaminase-like (OCD-like) enzyme may be used.
  • the putida from dpkA-like enzyme for example, accession to the GenBank session No. Examples thereof include a protein having an amino acid sequence registered under NP — 74577.1.
  • Genbank has accession no. Examples thereof include a protein having an amino acid sequence registered under NP_792175.1.
  • B. sp As the d383A-like enzyme derived from 383, for example, Genbank accession no. Examples thereof include a protein having an amino acid sequence registered in YP_3725656.1.
  • Examples of the OCD-like enzyme derived from 383 include GenBank accession no. Examples thereof include a protein having an amino acid sequence registered under YP — 372421.1. As an OCD-like enzyme derived from Pseudomonas chlororaphis , for example, GenBank has accession no. Examples thereof include a protein having an amino acid sequence registered in EIM16948.
  • the Pyr2C reductase for example, at least one of the novel Pyr2C reductase of the present invention and the Pyr2C reductase of the present invention can be used.
  • the novel Pyr2C reductase of the present invention and the Pyr2C reductase of the present invention will be described later.
  • the Pyr2C reductase is, for example, at least one protein selected from the group consisting of the following (R1) to (R3).
  • (R1) A protein comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 13, and 14 (R2)
  • R3 A protein having a ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase activity (R3) having an amino acid sequence inserted and / or added and having 80% or more identity to the amino acid sequence of (R1)
  • R3 having an amino acid sequence inserted and / or added and having 80% or more identity to the amino acid sequence of (R1)
  • the (R1), (R2) and (R3) are also referred to as (R1 Ab ), (R2 Ab ) and (R3 Ab ), respectively, as will be described later.
  • the (R1), (R2) and (R3) are also referred to as (R1 Ps ), (R2 Ps ) and (R3 Ps ), respectively.
  • the (R1), (R2) and (R3) are also referred to as (R1 Cp ), (R2 Cp ) and (R3 Cp ), respectively.
  • SEQ ID NO: 14 in the (R1) the (R1), (R2) and (R3) are also referred to as (R1 Tl ), (R2 Tl ) and (R3 Tl ), respectively.
  • “1 or several” may be in a range where, for example, the (R2) has the Pyr2C reductase activity.
  • the “one or several” of (R2) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of (R1).
  • the “identity” may be, for example, a range in which the (R3) has the Pyr2C reductase activity.
  • the “identity” of (R3) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the amino acid sequence of (R1). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the enzyme activity of the Pyr2C reductase is not particularly limited, and 1 unit (U) can be defined as, for example, the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of L-proline per minute under the conditions of 30 ° C. and pH 8.
  • the 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase may be, for example, a crude enzyme (non-purified enzyme), a partially purified partially purified enzyme, or a single purified enzyme, preferably a purified enzyme. is there.
  • the type of the test sample is not particularly limited, and for example, a sample containing 3-hydroxyproline, a sample considered to contain, a sample whose presence or absence is unknown, and the like are targeted.
  • the test sample may be solid or liquid, for example.
  • pretreatment such as suspension, dispersion or dissolution in a solvent is preferably performed, and the sample after pretreatment is preferably used as the test sample for the analysis method of the present invention.
  • the test sample contains a protein such as collagen and the 3-hydroxyproline in the protein is analyzed, for example, a pretreatment for decomposing the protein to release the 3-hydroxyproline may be performed.
  • the pretreatment method for releasing 3-hydroxyproline is not particularly limited, and examples thereof include protein hydrolysis treatment.
  • the step (s1) is a dehydration step in which 3-hydroxyproline in a test sample is dehydrated to ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid by 3-Hyp dehydrase as described above.
  • the step (s1) can be performed, for example, by contacting the test sample with the 3-Hyp dehydrase.
  • the contact method is not particularly limited, and for example, a general means using an enzyme can be adopted.
  • a reaction system including the test sample and the 3-Hyp dehydrase can be used.
  • the 3-Hyp dehydrase may be used, for example, in a released state or in a state immobilized on a carrier.
  • the type of the carrier is not particularly limited, and a known carrier such as a substrate such as a plate or a container, beads, or a filter can be used.
  • the reaction system is, for example, a reaction solution.
  • the amount of 3-Hyp dehydrase used is not particularly limited, and in the case of unit U, it is, for example, 0.01 to 10 U with respect to 1 ml of the test sample, preferably 0. 0.01 to 1 U, and more preferably 0.01 to 0.05 U.
  • the amount of the 3-Hyp dehydrase used is, for example, 0.1 to 10 ⁇ g, preferably 0.1 to 1 ⁇ g, more preferably, with respect to 1 ml of the test sample. 0.1 to 0.5 ⁇ g.
  • the amount of the 3-Hyp dehydrase used may be, for example, the amount added to the protein in the test sample.
  • the amount of protein in the test sample can be set, for example, from the total amount of collagen protein and non-collagen protein.
  • the conditions for the dehydration reaction are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the chemical characteristics of the 3-Hyp dehydrase used.
  • the reaction temperature is, for example, 10 to 100 ° C., preferably 15 to 90 ° C., more preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time is, for example, 0 to 10 minutes, preferably 0.5 to 5 minutes, and more preferably 1 to 5 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 5 to 10, preferably 6 to 9, and more preferably 7 to 9.
  • the 3-Hyp anhydrase A In the case of 3-Hyp dehydrase derived from brasilense , the reaction temperature is, for example, 30 to 50 ° C., preferably 35 to 45 ° C., more preferably 37 to 40 ° C.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 5 to 10, preferably 6 to 9, and more preferably 7 to 9.
  • the reaction temperature is, for example, 10-50 ° C., preferably 15-30 ° C., more preferably 20-30 ° C. It is.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 5 to 10, preferably 6 to 9, and more preferably 7 to 9.
  • the reaction temperature is, for example, 50 to 100 ° C., preferably 60 to 90 ° C., more preferably 70 to 80 ° C.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 5 to 10, preferably 6 to 9, and more preferably 7 to 9.
  • the reaction system includes, for example, a solvent, a coenzyme for the 3-Hyp dehydrase, an ionic compound, a reducing agent such as dithiothreitol, and a chelate such as EDTA.
  • a solvent such as water and buffer.
  • the buffer include Tris-HCl, potassium phosphate, and sodium phosphate.
  • the reaction can be performed. It is preferable to adjust the pH of the system.
  • the step (s2) is a reduction step in which the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid obtained in the step (s1) is hydrogenated with Pyr2C reductase.
  • the step (s2) can be performed, for example, by contacting the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid obtained in the step (s1) with the Pyr2C reductase.
  • the step (s2) may be performed after the step (s1), or the step (s1) and the step (s2). May be performed in parallel.
  • the contact between the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid and the Pyr2C reductase is performed by, for example, performing a dehydration reaction in the step (s1).
  • the reaction system may be brought into contact with the Pyr2C reductase as it is, or a product obtained by treating the reaction system may be brought into contact with the Pyr2C reductase.
  • the treatment is not particularly limited, and may be, for example, a concentration treatment of the reaction system, an isolation treatment of the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid from the reaction system, or the like.
  • the concentrate of the reaction system may be brought into contact with the Pyr2C reductase, and when the isolation treatment is performed, the isolated ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxyl is isolated.
  • An acid may be contacted with the Pyr2C reductase.
  • the 3-Hyp dehydrase immobilized in the step (s1) for example, the liquid fraction and the solid fraction are separated from the reaction system, and the (s2) In the step, it is preferable that the liquid fraction is contacted with the Pyr2C reductase.
  • the reaction system after the step (s1) or the liquid fraction of the reaction system is preferably brought into contact with the Pyr2C reductase.
  • step (s1) and the step (s2) are performed in parallel, for example, a reaction system including the test sample, the 3-Hyp dehydrase, and the Pyr2C reductase is used.
  • a reaction system including the test sample, the 3-Hyp dehydrase, and the Pyr2C reductase is used.
  • dehydration of 3-hydroxyproline to ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid and hydrogenation of the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid can be performed.
  • the Pyr2C reductase may be used, for example, in a released state or in a state immobilized on a carrier.
  • the type of the carrier is not particularly limited and is the same as described above.
  • the origin of the Pyr2C reductase used in the step (s2) may be the same as or different from the origin of the 3-Hyp dehydrase used in the step (s1).
  • the combination of the 3-Hyp dehydrase used in the step (s1) and the Pyr2C reductase used in the step (s2) is not particularly limited. The combination is, for example, enzymatic activity is higher, because it can measure in a shorter period of time 3-Hyp, A. brasilense derived 3-Hyp dehydrase and A.
  • the combination of Pyr2C reductase is derived from brasilense is preferable.
  • the combination is, for example, high heat resistance, because it can more prolonged storage, for example, Thermococcus litoralis DSM 5473 combinations 3-Hyp anhydrase and Thermococcus litoralis DSM 5473 from Pyr2C reductase derived are preferred.
  • the combination is, for example, high cold resistance, since it can measure the lower temperature in 3-Hyp, the combination of Colwellia psychrerythraea 34H-derived 3-Hyp anhydrase and Colwellia psychrerythraea 34H from Pyr2C reductase is preferred.
  • the amount of the Pyr2C reductase used is not particularly limited, and in the case of unit U, for example, 0.01 to 10 U with respect to 1 ml of the test sample in the step (s1). More preferably, it is 0.01 to 1 U, and still more preferably 0.01 to 0.05 U.
  • the amount of Pyr2C reductase used is, for example, 0.1 to 10 ⁇ g, preferably 0.1 to 1 ⁇ g, with respect to 1 ml of the test sample in the step (s1). More preferably, it is 0.1 to 0.5 ⁇ g.
  • the usage-amount of the said Pyr2C reductase may be the addition amount with respect to the protein in the said test sample, for example.
  • the amount of protein in the test sample can be set, for example, from the total amount of collagen protein and non-collagen protein.
  • the conditions for the reduction reaction are not particularly limited, and can be appropriately set according to the chemical characteristics of the Pyr2C reductase used.
  • the reaction temperature is, for example, 10 to 100 ° C., preferably 15 to 90 ° C., more preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time is, for example, 0.5 to 10 minutes, preferably 0.5 to 5 minutes, and preferably 1 to 5 minutes.
  • the reaction pH is, for example, 4 to 9, preferably 5 to 8, and more preferably 6 to 8.
  • the Pyr2C reductase is A.
  • the reaction temperature is, for example, 30 to 50 ° C., preferably 35 to 45 ° C., more preferably 37 to 40 ° C.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5, and more preferably 6.8 to 7.2.
  • the reaction temperature is, for example, 10 to 50 ° C., preferably 15 to 30 ° C., more preferably 20 to 30 ° C.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5, and more preferably 6.8 to 7.2.
  • the reaction temperature is, for example, 50 to 100 ° C., preferably 60 to 90 ° C., more preferably 70 to 80 ° C.
  • the reaction time is, for example, 1 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes, and more preferably 1 to 2 minutes.
  • the pH of the reaction system is, for example, 4 to 9, preferably 5 to 8, and more preferably 6 to 8.
  • the reaction system includes, for example, a solvent, a coenzyme for the Pyr2C reductase, an ionic compound, the reducing agent such as dithiothreitol, and the like. May be included.
  • the solvent include aqueous solvents such as water and buffer solutions.
  • the buffer solution for example, Tris-HCl, potassium phosphate, sodium phosphate, or the like can be used, and it is preferable to adjust the pH of the reaction system, for example, with the buffer solution.
  • the ionic compound include compounds that liberate divalent ions, and examples of the divalent ions include magnesium.
  • the coenzyme is not particularly limited, and examples thereof include NADH and NADPH.
  • the step (s3) is an analysis step for analyzing the reduction reaction of (s2).
  • the analysis may be, for example, any of qualitative analysis, quantitative analysis, and semi-quantitative analysis.
  • the analysis of the reduction reaction can be performed, for example, by detecting a signal generated by the reaction.
  • the signal is preferably used in combination with, for example, a substrate that generates a signal by the reduction reaction or a substrate in which the signal disappears or decreases by the reduction reaction.
  • the reaction system in the step (s1), may include a substrate, and in the step (s2), the reaction system may include a substrate.
  • the reaction system may include a substrate after the step (s2) and before the step (s3).
  • the method for analyzing the reduction reaction is not particularly limited, and may be, for example, either optical analysis or electrical analysis.
  • the optical signal includes signals such as color development, luminescence, and fluorescence
  • the optical signal can be measured, for example, by measuring absorbance, reflectance, fluorescence intensity, and the like.
  • the reduction reaction causes a substrate that emits color, luminescence, or fluorescence, and the color development, luminescence, or fluorescence disappears or decreases. It is preferable to use a substrate or the like together.
  • the transfer of electrons generated by the reduction reaction is measured as an electrical signal.
  • the measurement of the electric signal include a method of measuring the intensity of an electric signal such as an electric current.
  • the substrate is not particularly limited, and is preferably an electron donor, for example, NADH and NADPH.
  • NADH and NADPH generate NAD + and NADP + by oxidation, respectively.
  • NADH and NADPH absorb 340 nm ultraviolet light
  • NAD + and NADP + do not absorb 340 nm ultraviolet light. Therefore, Pyr2C reductase reduces ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid to produce L-proline, and at the same time, NAD + and NADP + are produced from NADH and NADPH, respectively.
  • the timing of adding the substrate is not particularly limited, and for example, it is preferable that the substrate coexists with the Pyr2C reductase in the step (s2).
  • the reaction system in the step (s1) when used, for example, in the step (s1), the reaction system may contain the substrate.
  • the present invention may further include the following step (s4).
  • step (s4) Based on the correlation between the amount of 3-hydroxyproline in a standard sample containing a known amount of 3-hydroxyproline and the analysis results obtained by performing the steps (s1) to (s3) on the standard sample A calculation step of calculating the amount of 3-hydroxyproline in the test sample from the analysis result of the test sample in the step (s3)
  • the order of the steps is not particularly limited, and for example, the following order can be exemplified.
  • the order in which the steps are performed can be appropriately adjusted depending on, for example, the timing of addition of the substrate in the reduction reaction by 3-Hyp dehydrase, Pyr2C reductase and / or the Pyr2C reductase. 1: Perform processing in the order of (s1), (s2) and (s3) 2: Perform (s1) and (s2) in parallel, then perform (s3) 3: Perform (s1) Later, (s2) and (s3) are performed in parallel 4: (s1), (s2) and (s3) are performed in parallel
  • reaction solution s1 containing a test sample, the 3-Hyp dehydrase, and a substrate for the Pyr2C reductase is prepared.
  • the reaction solution s1 for example, the composition per ml is shown below.
  • the substrate include NADH and NADPH.
  • the reaction solution s1 is incubated and a dehydration reaction with the 3-Hyp dehydrase is performed.
  • the incubation conditions are not particularly limited, and the temperature is, for example, 10 to 100 ° C., preferably 15 to 90 ° C., and the time is, for example, 0 to 10 minutes, preferably 0.5 -5 minutes, more preferably 1-5 minutes.
  • the Pyr2C reductase is further added to the reaction solution s1 to prepare a reaction solution s2 for the reduction reaction.
  • the concentration of the Pyr2C reductase per ml is, for example, 0.1 to 0.5 ⁇ g or 0.01 to 0.05 U.
  • a substrate (NADH or NADPH) for Pyr2C reductase was added to the reaction solution s1, but for example, these were added in the preparation of the reaction solution s2 instead of the addition to the reaction solution s1. May be.
  • the reaction solution s2 is incubated and subjected to a reduction reaction with the Pyr2C reductase.
  • the incubation conditions are not particularly limited, and the temperature is, for example, 10 to 100 ° C., preferably 15 to 90 ° C., and the time is, for example, 0.5 to 10 minutes, preferably 0.5. 5 to 5 minutes.
  • the measurement wavelength of the absorbance can be appropriately determined according to, for example, the type of the substrate of the Pyr2C reductase, and specific examples include 340 nm when NADH and NADPH are used.
  • the dehydration reaction with the 3-Hyp dehydrase and the reduction reaction with the Pyr2C reductase are performed, and the absorbance is measured. Then, the correlation between the concentration of each standard sample and the absorbance corresponding thereto is obtained.
  • the correlation can be expressed by, for example, a linear expression, a calibration curve, or the like.
  • the amount of 3-hydroxyproline in the test sample is calculated from the measurement result of the absorbance with respect to the test sample and the correlation.
  • the amount of 3-hydroxyproline in the test sample can be quantified.
  • the method for measuring collagen according to the present invention is a method for measuring collagen in a test sample, and includes the following steps (S1) to (S3).
  • S1 Release step of releasing 3-hydroxyproline from collagen in the test sample S2
  • the amount of 3-hydroxyproline released in the step (S1) is determined according to the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention.
  • S3 a measurement step for measuring the amount of collagen from the amount of 3-hydroxyproline measured in the step (S2) based on the ratio coefficient of 3-hydroxyproline to the collagen determined in advance.
  • analysis of collagen in a test sample can be performed indirectly by analysis of 3-hydroxyproline in the test sample. Therefore, when used in the above-described method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention, unlike the conventional HPLC method, the 3-hydroxyproline is simply analyzed by simply performing an enzyme reaction, and the analysis results are used. Indirectly, collagen in the test sample can be measured.
  • the present invention is characterized in that 3-hydroxyproline in the test sample is measured by the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention, and other steps and other conditions are not limited at all.
  • the kind of the test sample is not particularly limited, and for example, a sample containing collagen, a sample considered to contain, a sample whose presence or absence is unknown, and the like are targeted.
  • the test sample may be solid or liquid, for example.
  • pretreatment such as suspension, dispersion or dissolution in a solvent, and use the pretreated sample as a test sample for the measurement method of the present invention.
  • Specific examples of the test sample include foods, cosmetics, pharmaceuticals, living tissue, and the like.
  • the type of the collagen is not particularly limited, and examples thereof include collagen I, collagen II, collagen III, collagen IV, collagen V, collagen VIII, collagen X, collagen XI, collagen XVIII, and preferably collagen IV is there.
  • the step (S1) is a release step of releasing 3-hydroxyproline from collagen in the test sample.
  • the method for releasing the 3-hydroxyproline from the collagen is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • a specific example is the hydrolysis treatment of the collagen.
  • the hydrolysis treatment can be performed, for example, by treating the test sample under acidic conditions and heating conditions.
  • the adjustment to the acidic condition can be performed, for example, by adding an acid to the test sample.
  • the acid is not particularly limited, and for example, hydrochloric acid, sulfuric acid and the like can be used.
  • the treatment liquid after the hydrolysis treatment can be used in the next step (S2).
  • the treatment liquid is under acidic conditions, it is preferably adjusted to a pH suitable for the step (S2).
  • the pH can be adjusted using, for example, an alkali or a buffer solution.
  • the pH is not particularly limited, and examples include the pH shown in the step (S2), that is, the step (s1) in the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention.
  • the step (S2) is a step of measuring the amount of 3-hydroxyproline released in the step (S1) by the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention.
  • the description of the method for analyzing 3-hydroxyproline of the present invention can be used.
  • the step (S3) is a step of calculating the amount of collagen from the amount of 3-hydroxyproline measured in the step (S2) based on the ratio coefficient of 3-hydroxyproline to the collagen obtained in advance.
  • the ratio coefficient of 3-hydroxyproline with respect to the collagen examples include known ratio coefficients.
  • the ratio coefficient is, for example, a correlation between the amount of collagen in a standard sample containing a known amount of collagen and the amount of 3-hydroxyproline obtained by performing the steps (S1) and (S2) on the standard sample. It may be.
  • the correlation can be expressed by, for example, a linear expression, a calibration curve, or the like.
  • the novel protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of (R1) to (R3) below.
  • (R1) Protein consisting of at least one amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 and 14
  • R2 In the amino acid sequence of (R1), an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added
  • a protein having Pyr2C reductase activity (R3)
  • novel protein is also referred to as a novel ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid (Pyr2C) reductase.
  • the novel Pyr2C reductase is a protein newly identified by the present inventors.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the above (R1 Ab ) is as follows.
  • the (R1 Ab ) is, for example, A. can be obtained from brasilense .
  • R1 Ab Amino acid sequence of (R1 Ab ) (SEQ ID NO: 1) MTALSPIPVFDAADTAALLDYPALLATLRQAVADYAAGEIVSPERLVVPLQAGGVMLSMPSSARDLATHKLVNVCPGNGARGLPTILGQVTAYDATTGEMRFALDGPTVTGRRTAAITALGIQALHGVAPRDILLIGTGKQAANHAEALAAIFPDARLHVRGTSADSAAAFCAAHRTQAPHLVPLDGDAIPDAIDVVVTLTTSRTPVYREAAREGRLVVGVGAFTADAAEIDANTVRASRLVVDDPAGARHEAGDLIVAQVDWQDVASLADVLRGAFDRSGPLLFKSVGCAAWDLAACRTARDALAARRAG
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 in the above (R1 Tl ) is as follows.
  • the (R1 Tl ) can be obtained from Thermococcus literalis DSM 5473, for example.
  • “1 or several” may be in a range where, for example, the (R2) has the Pyr2C reductase activity.
  • the “one or several” of (R2) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of (R1).
  • the numerical range of numbers discloses, for example, all positive integers belonging to the range.
  • the “identity” may be, for example, a range in which the (R3) has the Pyr2C reductase activity.
  • the “identity” of (R3) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the amino acid sequence of (R1). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the novel Pyr2C reductase of the present invention has the following chemical characteristics, for example.
  • the novel Pyr2C reductase only needs to have a reductase activity using ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid as a substrate, and may further have other catalytic activities, for example.
  • the novel Pyr2C reductase preferably has, for example, a substrate specificity for ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid that is higher than that for ⁇ 1 -piperidine-2-carboxylic acid.
  • ⁇ 1 -piperidine-2-carboxylic acid was used as a substrate when the metabolic efficiency (K cat / K m ) using ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid as a substrate was defined as 100% relative activity.
  • the relative activity is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and further preferably 1% or less.
  • the novel Pyr2C reductase has a K m value for ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid of, for example, 5 mM or less, preferably 1 mM or less.
  • the novel Pyr2C reductase can use, for example, both NADH and NADPH as coenzymes.
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase of the present invention is at least one protein selected from the group consisting of the following (R1 Cp ) to (R3 Cp ).
  • (R1 Cp ) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (R2 Cp ) In the amino acid sequence of (R1 Cp ), consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • R3 Cp A protein having Pyr2C reductase activity
  • the Pyr2C reductase is a Pyr2C reductase newly identified by the present inventors.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 in the above (R1 Cp ) is as follows.
  • the (R1 Cp ) is, for example, Colwellia psycherrythrea 34H-derived Pyr2C reductase, for example, Genbank accession no.
  • a protein having the amino acid sequence registered under YP — 268197.1 (SEQ ID NO: 13) can be mentioned.
  • the Pyr2C reductase of the present invention has the following chemical characteristics, for example.
  • the Pyr2C reductase only needs to have reductase activity using ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid as a substrate.
  • it may have other catalytic activity.
  • the Pyr2C reductase preferably has a substrate specificity for ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid higher than that for ⁇ 1 -piperidine-2-carboxylic acid.
  • ⁇ 1 -piperidine-2-carboxylic acid was used as a substrate when the metabolic efficiency (K cat / K m ) using ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid as a substrate was defined as 100% relative activity.
  • the relative activity is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and further preferably 1% or less.
  • the Pyr2C reductase has a K m value for ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid of, for example, 5 mM or less, preferably 1 mM or less.
  • both NADH and NADPH can be used as a coenzyme.
  • the novel gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (r1 Ab ) to (r7 Ab ).
  • R1 Ab comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 polynucleotide (r2 Ab) in the nucleotide sequence of the (r1 Ab), 1 or several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence
  • novel gene is a gene encoding the novel protein of the present invention (a novel ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase), hereinafter, it is also referred to as a novel ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene.
  • novel Pyr2C reductase gene is a gene newly identified by the present inventors.
  • novel ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene of the present invention is useful for, for example, the synthesis of the novel Pyr2C reductase of the present invention as described above by genetic engineering techniques.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is as follows.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is a coding sequence of the novel Pyr2C reductase (R1 Ab ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: 4 (r1 Ab ) can be, for example, A. can be obtained from brasilense .
  • “1 or several” may be in a range in which the protein encoded by the polynucleotide (r2 Ab ) has the Pyr2C reductase activity, for example.
  • “1 or several” of (r2 Ab ) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, and more preferably 1 ⁇ 5, particularly preferably 1 to 3, most preferably 1 or 2, may be deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the “identity” may be, for example, a range in which the protein encoded by the polynucleotide (r3 Ab ) has the Pyr2C reductase activity.
  • the identity of the (r3 Ab ) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the base sequence of the (r1 Ab ). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide of (r1 Ab ).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • stringent conditions may be, for example, low stringent conditions, medium stringent conditions, or high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • High stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the polynucleotide of (r5 Ab ) may be, for example, if the protein encoded by the polynucleotide of (r5 Ab ) is a base sequence having the Pyr2C reductase activity.
  • the base sequence of the polynucleotide (r5 Ab ) can be designed, for example, by replacing it with a corresponding codon based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the “one or several” related to the amino acid sequence may be within a range in which the protein encoded by the polynucleotide of the (r6 Ab ) has the Pyr2C reductase activity.
  • the “one or several” of (r6 Ab ) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the “identity” relating to the amino acid sequence may be, for example, within a range in which the protein encoded by the polynucleotide (r7 Ab ) has the Pyr2C reductase activity.
  • the identity of (r7 Ab ) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, it is 98% or more, and still more preferably 99% or more.
  • the various polynucleotides can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique or an organic synthetic technique, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA or synthetic RNA.
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (r1) to (r7).
  • (R1) a polynucleotide comprising at least one base sequence of SEQ ID NOS: 15 and 16 (r2) a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (r1)
  • a protein comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (r1) and having Pyr2C reductase activity R4)
  • the Pyr2C reductase gene is a Pyr2C reductase gene newly identified by the present inventors.
  • the ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase gene of the present invention is useful for, for example, the synthesis of the Pyr2C reductase of the present invention as described above by a genetic engineering technique.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 15 in the above (r1 cp ) is as follows.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 15 is the coding sequence of Pyr2C reductase (R1 Cp ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the polynucleotide (r1 Cp ) of SEQ ID NO: 15 is, for example, a Colwellia p redesignrythrea 34H-derived Pyr2C reductase gene.
  • Genbank has accession no.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 15) having a base sequence registered by CPS — 1455 can be mentioned.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 16 in the above (r1 Tl ) is as follows.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 16 is the coding sequence of the Pyr2C reductase (R1 Tl ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: 16 (r1 Tl ) can be obtained, for example, from Thermococcus literalis DSM 5473.
  • the various polynucleotides can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique or an organic synthetic technique, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA or synthetic RNA.
  • the expression vector for the Pyr2C reductase of the present invention is at least one of the polynucleotide that is the novel Pyr2C reductase gene of the present invention and the polynucleotide that is the Pyr2C reductase gene of the present invention (hereinafter referred to as “the Pyr2C of the present invention”). It is also called "reductase polynucleotide”.
  • the expression vector of Pyr2C reductase of the present invention for example, by introducing the expression vector of Pyr2C reductase into the host, at least one of the novel Pyr2C reductase of the present invention and the Pyr2C reductase of the present invention Can be easily manufactured.
  • the Pyr2C reductase expression vector may contain, for example, the Pyr2C reductase polynucleotide so that the Pyr2C reductase encoded by the Pyr2C reductase polynucleotide of the present invention can be expressed. There is no limit.
  • the Pyr2C reductase expression vector can be prepared, for example, by inserting the Pyr2C reductase polynucleotide into a backbone vector (hereinafter also referred to as “basic vector”).
  • the type of the vector is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of the host.
  • examples of the vector include viral vectors and non-viral vectors.
  • examples of the vector include a binary vector.
  • examples of the vector include pETDuet-1 vector, pQE-80L vector, and pUCP26Km vector.
  • examples of the vector include pETDuet-1 vector (Novagen), for example, pQE-80L vector (QIAGEN).
  • the expression vector of the Pyr2C reductase regulates, for example, the expression of the polynucleotide of the Pyr2C reductase and the expression of at least one of the novel Pyr2C reductase and the Pyr2C reductase of the present invention encoded by the polynucleotide of the Pyr2C reductase Preferably, it has a regulatory sequence.
  • the regulatory sequence include a promoter, terminator, enhancer, polyadenylation signal sequence, origin of replication sequence (ori) and the like.
  • the arrangement of the regulatory sequences is not particularly limited.
  • the regulatory sequence can functionally regulate, for example, the expression of the polynucleotide of the Pyr2C reductase and the expression of at least one of the novel Pyr2C reductase and the Pyr2C reductase encoded thereby. It can be arranged based on a known method.
  • the regulatory sequence for example, a sequence provided in advance in the basic vector may be used, the regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, and the regulatory sequence provided in the basic vector It may be replaced with the regulatory sequence.
  • the Pyr2C reductase expression vector may further have a selection marker coding sequence, for example.
  • the selection marker include drug resistance markers, fluorescent protein markers, enzyme markers, cell surface receptor markers, and the like.
  • the production method of the novel protein (novel Pyr2C reductase) of the present invention is not particularly limited.
  • it may be produced by a genetic engineering technique, or a bacterium expressing the novel Pyr2C reductase is cultured by a known means.
  • it may be produced by producing a novel Pyr2C reductase.
  • the production method of the present invention includes, for example, a step of expressing at least one of the novel gene of the present invention (new Pyr2C reductase gene) and the Pyr2C reductase gene.
  • a bacterium expressing at least one of a novel Pyr2C reductase and a Pyr2C reductase is cultured to produce at least one of the new Pyr2C reductase and the Pyr2C reductase.
  • a step of causing Thereby, the novel Pyr2C reductase of the present invention can be produced.
  • the method for producing the Pyr2C reductase of the present invention is not particularly limited.
  • the method for producing the Pyr2C reductase of the present invention is described in the above description of the method for producing the novel Pyr2C reductase of the present invention, wherein “new Pyr2C reductase” is “Pyr2C reductase” and “new Pyr2C reductase gene” is “Pyr2C “Reductase gene” can be used by replacing “at least one of a novel Pyr2C reductase and Pyr2C reductase” with “Pyr2C reductase” (hereinafter the same).
  • the expression of the Pyr2C reductase polynucleotide may be performed, for example, using the Pyr2C reductase expression vector of the present invention.
  • the method for expressing the Pyr2C reductase polynucleotide is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • a host or a cell-free protein synthesis system may be used.
  • the host into which the polynucleotide of the Pyr2C reductase is introduced it is preferable to use the host into which the polynucleotide of the Pyr2C reductase is introduced, and to express the polynucleotide of the Pyr2C reductase in the host by culturing the host.
  • a transformant that synthesizes the novel Pyr2C reductase of the present invention can be produced, and by culturing the transformant, the novel Pyr2C reductase can be synthesized.
  • Examples of the host include non-human hosts such as microorganisms, animal cells, insect cells, or cultured cells thereof, isolated human cells, or cultured cells thereof.
  • the prokaryotes for example, E. coli (Escherichia coli) Escherichia genus such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) Pseudomonas such as bacteria and the like.
  • Examples of the eukaryote include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae .
  • Examples of the animal cells include COS cells and CHO cells, and examples of the insect cells include Sf9 and Sf21.
  • the method for culturing the host is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the host.
  • the medium used for the culture is not particularly limited and can be appropriately determined according to the type of the host.
  • the method for introducing the Pyr2C reductase polynucleotide into the host is not particularly limited, and can be performed by a known method.
  • the Pyr2C reductase polynucleotide may be introduced by, for example, an expression vector of the Pyr2C reductase.
  • the introduction method can be appropriately set depending on, for example, the type of the host. Examples of the introduction method include introduction method using gene gun such as particle gun, calcium phosphate method, polyethylene glycol method, lipofection method using liposome, electroporation method, ultrasonic nucleic acid introduction method, DEAE-dextran method, micro glass tube, etc.
  • Examples include a direct injection method using a hydrogel, a hydrodynamic method, a cationic liposome method, a method using an introduction aid, and a method using Agrobacterium.
  • Examples of the liposome include lipofectamine and cationic liposome, and examples of the introduction aid include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • the host is a microorganism, for example, among others: E. E. coli or Ps .
  • a method via putida or the like is preferred.
  • the Pyr2C reductase polynucleotide of the present invention may be introduced into the host by, for example, the expression vector of the Pyr2C reductase of the present invention.
  • the Pyr2C reductase polynucleotide is preferably expressed in a cell-free protein synthesis system.
  • the expression vector of the Pyr2C reductase may be used for the expression of the polynucleotide of the Pyr2C reductase.
  • the cell-free protein synthesis system can be performed by a known method using, for example, a cell extract, a buffer containing various components, and an expression vector into which a polynucleotide of the target Pyr2C reductase has been introduced.
  • a commercially available reagent kit can be used.
  • the culture method of bacteria expressing the novel Pyr2C reductase is not particularly limited and can be appropriately performed based on conventionally known culture methods.
  • the bacteria are not particularly limited, and are as described above, for example.
  • the form of the medium used for culturing the bacteria is not particularly limited, and a conventionally known medium such as a solid medium or a liquid medium can be appropriately used.
  • the components contained in the medium are not particularly limited, and examples thereof include a nitrogen source, a carbon source, and salts.
  • the nitrogen source is not particularly limited, and examples thereof include casein, gelatin, fish-derived protein, and bean-derived protein.
  • the carbon source is not particularly limited, and examples thereof include glucose, sucrose, fructose, raffinose and the like.
  • the salts are not particularly limited, and examples thereof include sodium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may further contain an expression inducer for the novel Pyr2C reductase.
  • Examples of the expression inducer include L-proline, L-proline, D-proline, L-hydroxyproline, and D-hydroxy. Proline, 3-hydroxyproline, D-lysine and the like.
  • the medium may include a commercially available medium, for example.
  • the commercial medium is not particularly limited, and examples thereof include LB medium, super broth medium, and M9 medium. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the pH of the medium is not particularly limited, and is, for example, in the range of pH 6 to 8, and preferably in the range of pH 6.5 to 7.5.
  • the method for culturing the bacteria is not particularly limited, and examples thereof include a plate culture method and a slope culture method when the solid medium is used. Moreover, when using the said liquid culture medium, it does not restrict
  • the culture temperature is not particularly limited, and examples thereof include the aforementioned temperature at which the bacteria can grow and the optimum temperature for growth. Specifically, the culture temperature can be performed in the range of 0 to 80 ° C., for example.
  • the bacteria are: A.
  • the culture temperature can be, for example, in the range of 15 to 40 ° C., in the range of 30 to 37 ° C., or the like.
  • the culture temperature can be performed, for example, in the range of 0 to 10 ° C.
  • the culture temperature can be performed, for example, in the range of 70 to 80 ° C.
  • the bacteria may be cultured under an aerobic condition or an anaerobic condition, for example.
  • the aerobic condition or the anaerobic condition is not particularly limited, and can be set using a conventionally known method.
  • the production method of the present invention may include, for example, a purification step of the novel Pyr2C reductase.
  • the purification method is not particularly limited, and examples thereof include salting out and various column chromatography.
  • the solvent used in the various purification steps is not particularly limited, and for example, a buffer solution can be used.
  • the pH of the solvent is, for example, 6-8.
  • the novel Pyr2C reductase obtained by the production method of the present invention may be used, for example, as a crude enzyme (non-purified enzyme) as it is, as a partially purified partially purified enzyme, or as a simple enzyme. Alternatively, the purified enzyme may be used as a purified enzyme.
  • the novel protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following (D1 Ab ) to (D3 Ab ).
  • (D1 Ab ) Protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (D2 Ab ) In the amino acid sequence of (D1 Ab ), consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added ,
  • a protein having 3-Hyp dehydrase activity (D3 Ab )
  • novel protein is also referred to as novel 3-hydroxyproline (3-Hyp) dehydrase.
  • novel 3-Hyp dehydrase is a protein newly identified by the present inventors.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the (D1 Ab ) is as follows.
  • the (D1 Ab ) is, for example, A. can be obtained from brasilense .
  • two square residues (C / T) are active sites involved in the catalytic function of 3-Hyp dehydrase.
  • “one or several” may be, for example, within a range where the (D2 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • “1 or several” of (D2 Ab ) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, and more preferably 1 ⁇ 5, particularly preferably 1 to 3, most preferably 1 or 2.
  • the numerical range of numbers discloses, for example, all positive integers belonging to the range.
  • the “identity” may be, for example, a range in which the (D3 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “identity” of (D3 Ab ) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, with respect to the amino acid sequence of (D1 Ab ). It is 97% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more.
  • the residues at the two active sites are preferably conserved in C / T.
  • the two active sites are aligned based on, for example, Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase (SEQ ID NO: 3), and the corresponding two sites are the active sites. It can be judged.
  • the protein of (D3 Ab ) has the identity of, for example, 40% or more when the two active site residues are conserved in C / T. , Preferably it is 60% or more, More preferably, it is 80% or more.
  • novel 3-Hyp dehydrase of the present invention has the following chemical characteristics, for example.
  • novel 3-Hyp dehydrase only needs to have dehydrase activity using 3-hydroxyproline as a substrate, and may further have other catalytic activity, for example.
  • the novel 3-Hyp dehydrase preferably has, for example, higher substrate specificity for 3-hydroxyproline than substrate specificity for 4-hydroxyproline.
  • the metabolic efficiency (K cat / K m ) using 3-hydroxyproline as a substrate is 100% relative activity
  • the relative activity using 4-hydroxyproline as a substrate may be 10% or less. Preferably, it is 5% or less, more preferably 1% or less.
  • the new 3-Hyp anhydrase for example, K m values for 3-hydroxyproline, for example, a 1mM or less, preferably 0.5mM or less.
  • the 3-hydroxyproline dehydrase of the present invention is at least one selected from the group consisting of the following (D1) to (D3).
  • D1 Protein consisting of at least one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 9 and 12
  • D2 In the amino acid sequence of (D1), one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • D3 A protein having 3-Hyp dehydrase activity
  • D3 A protein having an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of (D1) and having 3-Hyp dehydrase activity
  • the 3-Hyp dehydrase is a 3-Hyp dehydrase newly identified by the present inventors.
  • SEQ ID NO: 9 in (D1), (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Cp ), (D2 Cp ) and (D3 Cp ), respectively.
  • SEQ ID NO: 12 in (D1), (D1), (D2) and (D3) are also referred to as (D1 Tl ), (D2 Tl ) and (D3 Tl ), respectively.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the (D1 Cp ) is as follows.
  • the (D1 Cp ) is, for example, Colwellia p redesignrythrea 34H-derived 3-Hyp dehydrase , for example, Genbank accession no. Examples thereof include a protein comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) registered by CPS — 1453. In the following sequences, two square residues (C / T) are active sites involved in the catalytic function of 3-Hyp dehydrase.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 in (D1 Tl ) is as follows.
  • the (D1 Tl ) is, for example, Thermococcus literalis DSM 5473-derived 3-Hyp dehydrase , for example, Genbank accession no. Examples thereof include a protein comprising the amino acid sequence registered in OCC_00387 (SEQ ID NO: 12).
  • two square residues (C / T) are active sites involved in the catalytic function of 3-Hyp dehydrase.
  • “1 or several” may be in the range where, for example, the (D2) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “one or several” of (D2) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of (D1).
  • the numerical range of numbers discloses, for example, all positive integers belonging to the range.
  • the “identity” may be, for example, within a range where the (D3) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “identity” of (D3) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the amino acid sequence of (D1). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the residues at the two active sites are preferably conserved in C / T.
  • the two active sites are, for example, aligned based on Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase (SEQ ID NO: 3), and the corresponding two sites are the active sites. It can be judged.
  • the identity is, for example, 40% or more, Preferably it is 60% or more, more preferably 80% or more.
  • the 3-Hyp dehydrase of the present invention has the following chemical characteristics, for example.
  • the 3-Hyp dehydrase may have a dehydrase activity using 3-hydroxyproline as a substrate, and may have other catalytic activity, for example.
  • the novel 3-Hyp dehydrase preferably has, for example, higher substrate specificity for 3-hydroxyproline than substrate specificity for 4-hydroxyproline.
  • the metabolic efficiency (K cat / K m ) using 3-hydroxyproline as a substrate is 100% relative activity
  • the relative activity using 4-hydroxyproline as a substrate may be 10% or less. Preferably, it is 5% or less, more preferably 1% or less.
  • the new 3-Hyp anhydrase for example, K m values for 3-hydroxyproline, for example, a 1mM or less, preferably 0.5mM or less.
  • the novel gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (d1 Ab ) to (d7 Ab ).
  • (D1 Ab) polynucleotide (d2 Ab) comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 in the nucleotide sequence of the (d1 Ab), 1 or several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence
  • a polynucleotide (d5 Ab ) encoding a protein having Hyp dehydrase activity A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of column No. 11 (d6 Ab ) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; Polynucleotide (d7 Ab ) encoding a protein having 3-Hyp dehydrase activity A protein having an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and having 3-Hyp dehydrase activity Polynucleotide encoding
  • novel gene is a gene encoding the novel protein (novel 3-hydroxyproline dehydrase) of the present invention, it is hereinafter also referred to as a novel 3-hydroxyproline dehydrase gene.
  • novel 3-Hyp dehydrase gene is a gene newly identified by the inventors of the present invention.
  • novel 3-hydroxyproline dehydrase gene of the present invention is useful for, for example, the synthesis of the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention as described above by genetic engineering techniques.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 17 is as follows.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is a coding sequence of the novel 3-Hyp dehydrase (D1 Ab ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: 17 (d1 Ab ) is, for example, A. It can be obtained from bdasilense .
  • “1 or several” may be in the range where the protein encoded by the polynucleotide of the (d2 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • “1 or several” of (d2 Ab ) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably 1 ⁇ 5, particularly preferably 1 to 3, most preferably 1 or 2, may be deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the “identity” may be, for example, within a range in which the protein encoded by the polynucleotide of the (d3 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the identity of the (d3 Ab ) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% with respect to the base sequence of the (d1 Ab ). Above, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide of the (d1 Ab ).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambdook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (Moleculad Cloning:. A Labodatody Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spding Hadbod Labodatody Pdes (1989)] and the like can also be employed.
  • stringent conditions may be, for example, low stringency conditions, medium stringency conditions, or high stringency conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • High stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku described above (Sambdook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Moleculad Cloning:. A Labodatody Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spding Hadbod Labodatody Pdess (1989)] and the like can also be employed.
  • the polynucleotide of the (d5 Ab) for example, the protein encoded by the polynucleotide of the (d5 Ab) is, may be a nucleotide sequence having a 3-Hyp anhydrase activity.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide (d5 Ab ) can be designed, for example, by replacing it with a corresponding codon based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the “one or several” related to the amino acid sequence may be in the range where the protein encoded by the polynucleotide of the (d6 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the “1 or several” of (d6 Ab ) is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, more preferably in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2.
  • the “identity” with respect to the amino acid sequence may be, for example, within the range where the protein encoded by the polynucleotide of the (d7 Ab ) has the 3-Hyp dehydrase activity.
  • the identity of (d7 Ab ) is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. More preferably, it is 98% or more, and further preferably 99% or more.
  • the various polynucleotides can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique or an organic synthetic technique, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA or synthetic RNA.
  • the 3-hydroxyproline dehydrase gene of the present invention is characterized by comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (d1) to (d7).
  • (D1) a polynucleotide comprising at least one base sequence of SEQ ID NOs: 18 and 19 (d2) a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (d1)
  • a polynucleotide encoding a protein having 3-Hyp dehydrase activity (d3) comprising a base sequence having 80% or more identity to the base sequence of (d1), and comprising 3-Hyp dehydrase
  • a polynucleotide encoding a protein having activity (d4) comprising a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the base sequence of (d1), and comprising 3-Hyp
  • Polynucleotide (d6) encoding a protein consisting of at least one
  • a polynucleotide encoding a protein having 3-Hyp dehydrase activity (d7) comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to at least one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 9 and 12;
  • a polynucleotide encoding a protein having Hyp dehydrase activity (d7) comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to at least one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 9 and 12;
  • the 3-Hyp dehydrase gene is a 3-Hyp dehydrase gene newly identified by the inventors of the present invention.
  • the 3-hydroxyproline dehydrase gene of the present invention is useful for, for example, the synthesis of the 3-Hyp dehydrase of the present invention as described above by genetic engineering techniques.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 18 in the above (d1 cp ) is as follows.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 is the coding sequence of 3-Hyp dehydrase (D1 Cp ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the polynucleotide (d1 Cp ) of SEQ ID NO: 18 is, for example, a Colwellia p redesignrythrea 34H-derived 3-Hyp dehydrase gene, for example, Genbank accession no.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 18) having a base sequence registered by CPS — 1453 is exemplified.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 19 in the above (d1 Tl ) is as follows.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 19 is the coding sequence of 3-Hyp dehydrase (D1 Tl ) of the present invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 19) having a base sequence registered under OCC_0038 is exemplified.
  • the various polynucleotides can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique or an organic synthetic technique, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA or synthetic RNA.
  • the expression vector for the 3-Hyp dehydrase of the present invention is at least one of the polynucleotide that is the novel 3-Hyp dehydrase gene of the present invention and the polynucleotide that is the 3-Hyp dehydrase gene of the present invention (hereinafter referred to as “the polynucleotide”). , Also referred to as “polynucleotide of 3-Hyp dehydrase of the present invention”).
  • the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention for example, by introducing the 3-hydroxyproline dehydrase expression vector into the host, the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention and the present invention
  • the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention at least one of the 3-Hyp dehydrases can be easily produced.
  • the description of the expression vector of 3-Hyp dehydrase of the present invention is as follows.
  • expression vector of Pyr2C reductase is referred to as “3-Hyp dehydrase expression vector”.
  • the production method of the novel protein (novel 3-Hyp dehydrase) of the present invention is not particularly limited, and for example, it may be produced by a genetic engineering technique, or a bacterium expressing the novel 3-Hyp dehydrase is known. It may be produced by culturing by the above means to produce novel 3-Hyp dehydrase.
  • the production method of the present invention includes, for example, a step of expressing the novel gene of the present invention (a novel 3-Hyp dehydrase gene).
  • the production method of the present invention includes, for example, a step of culturing bacteria expressing a novel 3-Hyp dehydrase to produce the novel 3-Hyp dehydrase.
  • the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention can be produced.
  • the method for producing the 3-Hyp dehydrase of the present invention is not particularly limited.
  • the method for producing 3-Hyp dehydrase of the present invention is described in the above description of the method for producing novel 3-Hyp dehydrase of the present invention by referring to “3-Hyp dehydrase” as “3-Hyp dehydrase”.
  • “3-Hyp dehydrase gene” can be read as “3-Hyp dehydrase gene”.
  • the analysis reagent of the present invention is an analysis reagent for 3-hydroxyproline, and is characterized by containing 3-hydroxyproline dehydrase and ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylate reductase.
  • the analysis reagent of the present invention is characterized by containing the 3-Hyp dehydrase and the Pyr2C reductase, and other configurations are not particularly limited.
  • the 3-Hyp dehydrase and the Pyr2C reductase are as described above.
  • the Pyr2C reductase is preferably at least one of the novel Pyr2C reductase of the present invention and the Pyr2C reductase of the present invention.
  • the 3-Hyp dehydrase is preferably at least one of the novel 3-Hyp dehydrase of the present invention and the 3-Hyp dehydrase of the present invention.
  • the analysis reagent of the present invention may further include, for example, components that can be used in the analysis method of the present invention.
  • the component include a buffer solution and a substrate as described above.
  • the substrate is not particularly limited, and examples thereof include NADH and NADPH.
  • each component of the analytical reagent of the present invention may be stored in one container, or each component may be stored separately in a plurality of containers.
  • the analysis reagent of the present invention is also referred to as an analysis kit, for example.
  • the analysis kit of the present invention may further include instructions for use, for example.
  • the 3-hydroxyproline standard sample for preparing the “correlation” in the step (s4) may be provided.
  • the measurement reagent of the present invention is a collagen measurement reagent, which contains an analysis reagent of 3-hydroxyproline, and the analysis reagent is the analysis reagent of the present invention.
  • the measuring reagent of the present invention is characterized by including the analytical reagent of the present invention, and other configurations are not particularly limited.
  • the measurement reagent of the present invention is also referred to as a measurement kit, for example.
  • the measurement kit of the present invention may further include instructions for use, for example.
  • Example 1 Homo sapiens- derived 3-Hyp dehydrase (C14orf149) and Ps . 3-hydroxyproline was measured using aeruginosa- derived Pyr2C reductase (PaLhpD).
  • Expression Vector C14orf149 cDNA (SEQ ID NO: 5) encoding 3-Hyp dehydrase derived from Homo sapiens (SEQ ID NO: 3) was obtained from RIKEN BioResource Center.
  • Ps . PaLhpD cDNA (SEQ ID NO: 6) encoding PaPyr2C reductase (SEQ ID NO: 2) was amplified using the genomic DNA of aeruginosa PAO1 strain as a template.
  • PaLhpD cDNA (SEQ ID NO: 6) GTGATCCGAATGACGCTGGACGAGGTCCGCGAGCTGGCCGTGCGCATCCTGCGCCGGCACGCTTTCAGCGAAGCCCATGTACAGGCGGTGGCCGATACCCTGGTGGCGGGGGAGCGTGACGAATGCGCGTCCCACGGTATCTGGCGGTTGCTCGGCTGCATCGCCACCCTGAAGGCCGGCAAGGTATCCGCCGACGCCGAGCCGGAACTGCACGACATCGCTCCCGGCCTGCTGCGGGTCGACGCCCATGGCGGGTTCTCCCAGTGCGCATTCCGGCTGGGGCTGCCGCATCTGCTGGAGAAGGCCCGCAGGGTATCGCGGCGATGGCGGTGAACCGCTGTGCATTTCTCCGCGCTATGGGTTGAGGTCGAGGCACTCACCGAGGCGGGCCTGGTGGCCCTGGCGACCACGCCGAGTCATGCCTGGGTGGCGCCGGCGGGCGGGCGGACGCAAGCCGATCTTCGGCACCAACCCGATCGCCTTTGGCTG
  • the C14orf149 cDNA and the obtained PCR product were ligated to a pETDuet-1 vector (Novagen) and a pQE-80L vector (Qiagen) each having an ampicillin resistance gene.
  • a vector into which C14orf149 cDNA was inserted was used as a C14orf149 expression vector, and a vector into which PaLhpD cDNA was inserted was used as a PaLhpD expression vector.
  • Each of the vectors is designed to add a peptide (histidine tag) in which six histidine molecules are linked to the N-terminus of the expressed protein.
  • the cultured cells were collected, suspended in 50 mmol / L sodium phosphate buffer (pH 8) containing 300 mmol / L NaCl and 10 mmol / L imidazole, and sonicated. Then, the supernatant (cell-free extract) was collected by centrifugation and subjected to column chromatography under the following conditions to purify the expressed recombinant protein.
  • the recombinant protein obtained from the transformant introduced with the C14orf149 expression vector was designated as “C14orf149”
  • the recombinant protein obtained from the transformant introduced with the PaLhpD expression vector was designated as “PaLhpD”.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of the recombinant protein.
  • the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and each lane shows the results of the molecular weight marker (M), C14orf149, and PaLhpD from the left.
  • FIG. 2 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, where the horizontal axis represents the reaction time and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm. As shown in FIG. 2, the same degree of linearity was obtained at any 3-hydroxyproline concentration.
  • the horizontal axis represents the reciprocal of the substrate concentration (1 / S)
  • the vertical axis represents the reciprocal of the reaction rate (1 / V)
  • the function in each graph represents the correlation function
  • R 2 Indicates a correlation coefficient.
  • C14orf149 and PaLhpD were used, a highly correlated calibration curve with a correlation coefficient of 0.99 or more could be created between substrate concentrations of 1 to 10 mmol / L. From these results, it was found that by using C14orf149 and PaLhpD, quantitative determination with excellent accuracy of 3-hydroxyproline was possible over a wide concentration range.
  • Example 2 In this example, for the analysis of 3-hydroxyproline using 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase, the amount of 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase added, and 3-Hyp before addition of Pyr2C reductase was confirmed. C14orf149 of Example 1 (2) was used as 3-Hyp dehydrase, and PaLhpD of Example 1 (2) was used as Pyr2C reductase.
  • FIG. 4 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, in which the horizontal axis represents the reaction time, the vertical axis represents the absorbance at 340 nm, and (i)-(iii ) Shows the above conditions for added C14orf149 and PaLhpD.
  • FIG. 4 in any of the conditions (i) to (iii), a decrease in absorbance was observed. Above all, the conditions (ii) and (iii) showed a faster decrease in absorbance than the condition (i), and showed excellent linearity immediately after the start of the reaction. From these results, it was found that by increasing the amount of 3-Hyp dehydrase or Pyr2C reductase, 3-hydroxyproline can be measured accurately even immediately after the start of the reaction.
  • FIG. 5 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, where the horizontal axis shows the reaction time, the vertical axis shows the absorbance at 340 nm, and the time in the figure is 3 times before the addition of PaLhpD. -Hyp dehydrase incubation time (0, 1, 2, 5, 10 minutes).
  • the absorbance decreased with time regardless of the incubation time.
  • the incubation time was 5 minutes or more, the absorbance decreased more rapidly, and excellent linearity was exhibited immediately after the start of the reaction. From these results, it was found that 3-hydroxyproline can be accurately measured even at 0 hours of incubation, and the accuracy can be further improved by setting the incubation time to 5 minutes or longer.
  • Example 3 A. brasilense- derived Pyr2C reductase (AbLhpI) was purified and its properties were confirmed.
  • AbLhpI cDNA (SEQ ID NO: 4) encoding AbPyr2C reductase (SEQ ID NO: 1) was amplified using the genomic DNA of brasilense ATCC29145 as a template.
  • the obtained PCR product was ligated to a pETDuet-1 vector (manufactured by Novagen) having an ampicillin resistance gene.
  • a vector into which the AbLhpI cDNA was inserted was used as an AbLhpI expression vector.
  • the vector is designed to add a peptide (histidine tag) in which six histidine molecules are linked to the N-terminus of the expressed protein.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of the cell-free extract and the recombinant protein.
  • the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and each lane shows the results of the molecular weight marker (M), the cell-free extract, and AbLhpI from the left.
  • FIG. 7 is a graph showing the absorbance in the reaction solution, where the horizontal axis represents the reaction time and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm. As shown in FIG. 7, in both cases of NADPH and NADH, the absorbance decreased with time, and excellent linearity was exhibited. From these results, it was found that AbLhpI can use both NADPH and NADH as a coenzyme.
  • the specific activity of AbLhpI when NADPH was used was 171.5 units / mg protein, and the specific activity of AbLhpI when NADH was used was 126.2 units / mg protein.
  • the specific activity of PaLhpD used in Example 1 is 18.6 units / mg protein when NADH is used, it is found that AbLhpI exhibits a specific activity about 10 times higher than that of PaLhpD. It was. From this, it can be said that the protein amount of the enzyme to be used can be reduced by using ApLhpI as the Pyr2C reductase.
  • reaction reagents having the composition shown in Table 3 below, 1 ⁇ L (20 ⁇ g) AbLhpI and NADP + were added, and the following substrate was further added.
  • the absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured with 0 seconds when the substrate was added.
  • the relative activity of AbLhpI with respect to L-proline was defined as 100%, and the relative activity with respect to other substrates was calculated.
  • the final concentration of NADP + was 0.0015 mmol / L
  • the final concentration of the substrate was 10 mmol / L.
  • the relative activity of PaLhpD to the substrate was calculated in the same manner except that PaLhpD of Example 1 (2) was added instead of AbLhpI.
  • FIG. 8 is a graph showing the substrate specificity of AbLhpI and PaLhpD.
  • the horizontal axis indicates the substrate, and the vertical axis indicates the relative activity.
  • PaLhpD exhibits weak activity against trans-3-hydroxy-L-proline, cis-4-hydroxy-L-proline, cis-3-hydroxy-L-proline, and L -Strong activity against proline.
  • AbLhpI showed no activity against proline analogs other than L-proline. From these results, it was found that AbLhpI and PaLhpD are Pyr2C reductases that hydrogenate ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid to produce L-proline. In addition, AbLhpI is less suitable for trans-3-hydroxy-L-proline than PaLhpD, indicating that it is more suitable for the analysis of 3-hydroxyproline.
  • Example 4 3-hydroxyproline was measured using C14orf149 of Example 1 (2) as 3-Hyp dehydrase and AbLhpI of Example 3 (2) as Pyr2C reductase.
  • FIG. 9 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, in which the horizontal axis represents the measurement time and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm.
  • the measurement time is the time when the time point at which the 5-minute incubation is completed is used as a reference.
  • AbLhpI AbLhpI
  • the absorbance decreased with time, and excellent linearity was exhibited. From these results, it was found that 3-hydroxyproline can be measured with excellent accuracy by using AbLhpI.
  • AbLhpI showed a faster decrease in absorbance than PaLhpD (LhpD), and showed excellent linearity during the 0-60 seconds of the measurement. From these results, it was found that, among Pyr2C reductases, AbLhpI showed extremely excellent Pyr2C reductase activity, and its linearity was suitable for analysis of 3-hydroxyproline.
  • Example 5 A. Brasilense ATCC29145 strain was cultured to prepare a cell-free extract, and 3-Hyp dehydrase activity and Pyr2C reductase activity were measured.
  • the brasilense ATCC29145 strain was cultured with shaking at 30 ° C. under aerobic conditions.
  • Medium is 0.8 g KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 , 2 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.002 g FeSO 4 , 0.080 g MgSO 4 .7H 2 O and 37 mmol / L carbon source per liter
  • the carbon source is glucose, L-proline, D-proline, cis-L-hydroxyproline (L-Hyp), cis-D-hydroxyproline (D-Hyp), 3-hydroxyproline (3-L-Hyp)
  • D-lysine (D-Lys) was used.
  • the cultured cells were collected by centrifugation (30000 ⁇ g, 20 minutes), suspended in 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), and sonicated. Then, the suspension was centrifuged to recover the supernatant, which was used as a cell-free extract.
  • Tween-20 was added to Tris-HCl so as to be 1% (v / v).
  • the 3-Hyp dehydrase activity and the Pyr2C reductase activity were confirmed for the cell-free extract prepared using each medium.
  • the measurement of 3-Hyp dehydrase activity was performed in the same manner as in Example 2 (1) except that the cell-free extract was used instead of the recombinant protein.
  • the reaction cell was charged with 900 ⁇ L of 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mmol / L ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid and the cell-free extract. Furthermore, 100 ⁇ L of 0.0015 mmol / L NADPH was added and incubated at 30 ° C. The absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured by setting NADPH addition time as 0 seconds, and was defined as Pyr2C reductase activity. Then, the specific activity (units / mg protein) per 1 mg of protein was calculated for 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase.
  • FIG. 10 (A) is a graph showing the activity of 3-Hyp dehydrase in a cell-free extract, and (B) is a graph showing the activity of Pyr2C reductase.
  • the horizontal axis indicates the carbon source, and the vertical axis indicates the specific activity.
  • FIG. 10 (A) when D-proline, 3-hydroxyproline and D-lysine were used as carbon sources, 3-Hyp dehydrase activity was high.
  • FIG. 10 (A) when D-proline, 3-hydroxyproline and D-lysine were used as carbon sources, 3-Hyp dehydrase activity was high.
  • Example 6 A. brasilense- derived 3-Hyp dehydrase (AbLhpH) and Colwellia p redesignrythrae- derived Pyr2C reductase (CpLhpI) and 3-Hyp dehydrase (CpLhpH) were purified. Also, AbLhpH, CpLhpH, and 3-Hyp dehydrase activity of C14orf149 of Example 1 (2), and CpLhpI, PaLhpD of Example 1 (2), and Pyr2C reductase of AbLhpI of Example 3 (2) Activity was compared.
  • the obtained PCR product was ligated to a pETDuet-1 vector (manufactured by Novagen) having an ampicillin resistance gene.
  • the vector in which AbLhpH cDNA was inserted was used as the AbLhpH expression vector
  • the vector in which CpLhpI cDNA was inserted was used as the CpLhpI expression vector
  • the vector in which CpLhpH cDNA was inserted was used as the CpLhpH expression vector.
  • the vector is designed to add a peptide (histidine tag) in which six histidine molecules are linked to the N-terminus of the expressed protein.
  • Example 2 Purification of Recombinant Protein
  • the supernatant (none) was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that the AbLhpH expression vector, the CpLhpI expression vector, or the CpLhpH expression vector was introduced into the E. coli BL21 (DE3) strain. Cell extract) was collected. The supernatant was subjected to column chromatography in the same manner as in Example 1 (2), and the expressed recombinant protein was purified.
  • the recombinant protein obtained from the transformant introduced with the AbLhpH expression vector is referred to as “AbLhpH”
  • the recombinant protein obtained from the transformant introduced with the CpLhpI expression vector is designated as “CpLhpI”
  • the CpLhpH expression vector was designated as “CpLhpH”.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of the recombinant protein.
  • the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and each lane shows the results of the molecular weight marker (Marker), AbLhpH, CpLhpH, and CpLhpI from the left.
  • FIG. 12 is a graph showing specific activity and K cat / K m values.
  • the horizontal axis indicates the type of 3-Hyp dehydrase, and the vertical axis indicates the specific activity or K cat / K m value.
  • white bars indicate specific activity and black bars indicate K cat / K m values.
  • AbLhpH and CpLhpH showed significantly superior specific activity compared to C14orf149. Further, in the K cat / K m value, AbLhpH showed a higher K cat / K m value compared to C14orf149.
  • CpLhpH showed higher K cat / K m values compared to C14orf149 and AbLhpH. From these results, it was found that AbLhpH and CpLhpH have higher 3-Hyp dehydrase activity compared to C14orf149. Further, since AbLhpH and CpLhpH have high 3-Hyp dehydrase activity, it was found that 3-hydroxyproline can be measured even when a smaller amount of protein is used.
  • FIG. 13 is a graph showing specific activity and K cat / K m values.
  • the horizontal axis indicates the type of Pyr2C reductase, and the vertical axis indicates the specific activity or K cat / K m value.
  • the white bar indicates specific activity, and the black bar indicates the K cat / K m value.
  • AbLhpI showed a markedly superior specific activity compared to PaLhpD and CpLhpI.
  • K cat / K m values AbLhpI, compared to PaLhpD and CpLhpI, showed higher K cat / K m values.
  • Example 7 In this example, the optimum pH of C14orf149 of Example 1 (2), AbLhpH of Example 6 (1), and CpLhpH of Example 6 (1) was confirmed. Moreover, the optimum pH of PaLhpD of Example 1 (2), AbLhpI of Example 3 (2), and CpLhpI of Example 6 (1) was confirmed.
  • sodium acetate buffer (acetate buffer), potassium phosphate buffer (phosphate buffer), Tris-HCl, or glycine-NaOH was used.
  • the pH of the acetate buffer is pH 4, 4.5, 5, 5.5 or 6, and the pH of the phosphate buffer is pH 6, 6.5, 7, 7.5, 8 or 8.5.
  • the pH of the Tris-HCl was 7, 7.5, 8, 8.5 or 9, and the pH of the glycine-NaOH was 9, 9.5, 10, 10.5 or 11.
  • FIG. 14 shows the result of C14orf149
  • (B) shows the result of AbLhpH
  • (C) shows the result of CpLhpH.
  • the horizontal axis represents the pH of the various buffers
  • the vertical axis represents the specific activity
  • ⁇ in the figure represents the result of the acetate buffer
  • ⁇ represents the result of the phosphate buffer.
  • ⁇ indicates the result of Tris-HCl
  • ⁇ indicates the result of glycine-NaOH.
  • C14orf149, AbLhpH and CpLhpH all showed a high specific activity when the pH was near neutral (pH 7 to 9).
  • the final concentration of ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid in the reaction solution is 1 mmol / L
  • the final concentration of NADPH is 0.15 mmol / L
  • the final concentration of L-proline is 10 mmol / L
  • the final concentration of NADP + is reached.
  • the concentration was 1.5 mmol / L.
  • As the various buffers acetate buffer, phosphate buffer, Tris-HCl, or glycine-NaOH was used.
  • the pH of the acetate buffer is pH 5, 5.25, 5.5, 5.75, or 6, and the pH of the phosphate buffer is pH 6, 6.25, 6.5, 6.75, 7, 7.25, 7.5, 7.75, 8, 8.25 or 8.5, and the pH of the Tris-HCl is 7, 7.25, 7.5, 7.75, 8, 8.25. 8.5 or 8.75, and the pH of the glycine-NaOH is 9, 9.25, 9.5, 9.75, 10, 10.25, 10.5, 10.75, 11, 11. 25, 11.5, 11.75 or 12.
  • an acetic acid buffer, a phosphate buffer or Tris-HCl is used as the various buffers, and in the reaction cell to which L-proline is added, Glycine-NaOH was used as various buffers.
  • FIG. 15 is a graph showing specific activities at different pHs.
  • (A) shows the result of PaLhpD
  • (B) shows the result of AbLhpI
  • (C) shows the result of CpLhpI.
  • the horizontal axis indicates the pH of the various buffers
  • the vertical axis indicates the specific activity
  • ⁇ in the figure indicates the result of the acetate buffer
  • ⁇ indicates the result of the phosphate buffer.
  • ⁇ indicates the result of Tris-HCl
  • ⁇ indicates the result of glycine-NaOH.
  • each of PaLhpD, AbLhpI, and CpLhpI showed high specific activity when the pH was near neutral (pH 6-7) and alkaline (pH 10-11).
  • Example 8 In this example, 3-Hydroxylase and Pyr2C reductase were combined to compare the ability to measure 3-hydroxyproline.
  • the incubation temperature of the spectrophotometer was maintained at 30 ° C., and the reaction cell was set. Then, a reaction reagent having the composition shown in Table 1 below, 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase of the following conditions (i) to (v) are added to the reaction cell, and further, The reaction was started by adding 100 ⁇ L of hydroxyproline. The absorbance of the reaction solution at a wavelength of 340 nm was measured over time, with the addition of 3-hydroxyproline being 0 seconds.
  • FIG. 16 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, in which the horizontal axis represents the measurement time and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm.
  • the absorbance decreased more rapidly in the order of condition (ii), condition (i), condition (iv), condition (v), and condition (iii).
  • Condition (i) also showed a decrease in absorbance equivalent to that in condition (ii) when 1/10 of the amount of Pyr2C reductase was used. From these results, it was found that by combining AbLhpH and AbLhpI, 3-hydroxyproline can be measured more accurately with a small amount of 3-Hyp dehydrase and Pyr2C reductase.
  • Example 9 In this example, the optimum pH when combining the Example 6 (1) AbLhpH and the AbLhpI of Example 3 (2) was confirmed.
  • the incubation temperature of the spectrophotometer was maintained at 30 ° C., and the reaction cell was set. Then, the reaction reagent having the composition shown in Table 5 below, 1 ⁇ L (10 ⁇ g) of AbLhpH, and 1 ⁇ L (1 ⁇ g) of AbLhpI were added to the reaction cell, and further 100 ⁇ L of 3-hydroxyproline was added so as to be 10 mmol / L. The reaction was started. The absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured with the addition of 3-hydroxyproline as 0 second.
  • Various buffers used were a phosphate buffer or Tris-HCl. The pH of the phosphate buffer was pH 7, 7.5 or 8, and the pH of the Tris-HCl was pH 7.5, 8, 8.5 or 9.
  • FIG. 17 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the pH of the various buffers
  • the vertical axis indicates the relative activity
  • ⁇ in the figure indicates the result of the phosphate buffer
  • ⁇ indicates the result of Tris-HCl.
  • 3-hydroxyproline can be measured with higher accuracy when using Tris-HCl at pH 8.0.
  • Example 10 3-hydroxyproline was dehydrated to ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid by AbLhpH when Example 6 (1) AbLhpH and AbLhpI of Example 3 (2) were used. Furthermore, it was confirmed that ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid was reduced to L-proline by AbLhpI.
  • reaction reagent having the composition shown in Table 1 below, 1 ⁇ L (10 ⁇ g) of AbLhpI, and 1 ⁇ L (10 ⁇ g) of AbLhpH to the reaction cell, and further adding 100 ⁇ L of 3-hydroxyproline to 10 mmol / L. The reaction started. The reaction was performed at 30 ° C. overnight.
  • the reaction solution after the reaction was analyzed using an HPLC analyzer (Hitachi High-Speed Amino Acid Analyzer L-8900, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation).
  • HPLC analyzer Hagachi High-Speed Amino Acid Analyzer L-8900, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation.
  • the control was analyzed in the same manner except that AbLhpI was not added.
  • 3-hydroxyproline was analyzed as standard sample 1 and L-proline was analyzed as standard sample 2 in the same manner.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of HPLC analysis.
  • (A) shows the result of the standard sample 1
  • (B) shows the result of the control
  • (C) shows the result of the example
  • (D) shows the result of the standard sample 2.
  • the horizontal axis represents retention time
  • the vertical axis represents voltage
  • the white arrow in the figure represents the 3-hydroxyproline peak
  • the black arrow represents the L-proline peak.
  • FIG. 18 (B) no L-proline peak was observed in the control treated only with 3-Lyp dehydrase, AbLhpH. Further, as shown in FIG.
  • Example 11 In this example, a calibration curve of 3-hydroxyproline was prepared, and it was confirmed that 3-hydroxyproline could be quantified with excellent accuracy.
  • FIG. 19 the horizontal axis represents the reciprocal of the substrate concentration (1 / S), the vertical axis represents the reciprocal of the reaction rate (1 / V), the function in each graph represents the correlation function, and R 2 Indicates a correlation coefficient.
  • the horizontal axis represents the reciprocal of the substrate concentration (1 / S)
  • the vertical axis represents the reciprocal of the reaction rate (1 / V)
  • the function in each graph represents the correlation function
  • R 2 Indicates a correlation coefficient.
  • FIG. 19 when AbLhpH and AbLhpI were used, a highly correlated calibration curve with a correlation coefficient of 0.99 or more could be created between substrate concentrations of 0.05 to 1 mmol / L. From these results, it was found that by using AbLhpH and AbLhpI, quantitative determination of 3-hydroxyproline with high accuracy was possible over a wide concentration range.
  • Table 7 shows the concentration of 3-hydroxyproline determined from the calibration curve and the concentration of 3-hydroxyproline measured by HPLC. As shown in Table 7, it was found that 3-hydroxyproline can be measured with the same accuracy as HPLC by using AbLhpH and AbLhpI.
  • FIG. 20 is a graph showing the concentration of 3-hydroxyproline determined from a calibration curve and the concentration of 3-hydroxyproline measured by HPLC.
  • the horizontal axis indicates the type of the mixed sample, and the vertical axis indicates the concentration of 3-hydroxyproline.
  • the black bar in the figure indicates the 3-hydroxyproline concentration measured by HLPC, and the white bar indicates the 3-hydroxyproline concentration determined from the calibration curve.
  • 3-hydroxyproline could be measured with the same accuracy as HPLC. That is, it was found that even in the presence of 4-hydroxyproline, measurement can be performed with the same accuracy as HPLC by using AbLhpH and AbLhpI. From these results, it was found that 3-hydroxyproline can be measured with the same accuracy as HPLC even in biological samples in which 4-hydroxyproline and the like are present.
  • Example 12 In this example, the optimum temperature and thermal stability of AbLhpI of Example 3 (2) and CpLhpI of Example 6 (1) were confirmed.
  • the incubation temperature of the spectrophotometer is maintained at a predetermined temperature (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 or 70 ° C.), and the reaction cell is I set it. Then, a reaction reagent having the composition shown in Table 1 below, 1 ⁇ L (10 ⁇ g) of AbLhpH, and 1 ⁇ L (1 ⁇ g) of AbLhpI or CpLhpI were added to the reaction cell, and 3-hydroxyproline 100 ⁇ L was further added to 10 mmol / L. The reaction was started by adding. The absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured with the addition of 3-hydroxyproline as 0 second.
  • FIG. 21 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the incubation temperature
  • the vertical axis indicates the relative activity
  • ⁇ in the figure indicates the result of AbLhpI
  • ⁇ indicates the result of CpLhpI.
  • AbLhpI exhibits excellent Pyr2C reductase activity in the range of 45-60 ° C.
  • CpLhpI was found to exhibit excellent Pyr2C reductase activity in the range of 10 to 30 ° C.
  • the relative activity at each temperature of AbLhpI or CpLhpI was calculated with the absorbance when not heat-treated as 100%.
  • FIG. 22 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the treatment temperature
  • the vertical axis indicates the relative activity
  • ⁇ in the figure indicates the result of AbLhpI
  • ⁇ indicates the result of CpLhpI.
  • AbLhpI and CpLhpI were found to maintain high relative activity at processing temperatures of less than 55 ° C.
  • Example 13 Thermococcus litoralis DSM 5473-derived 3-Hyp dehydrase (TlLhpH) and Pyr2C reductase (TlLhpI) were purified. In addition, the chemical properties of TlLhpH and TlLhpI were confirmed.
  • the obtained PCR product was ligated to a pETDuet-1 vector (manufactured by Novagen) having an ampicillin resistance gene.
  • a vector into which TlLhpH cDNA was inserted was used as a TlLhpH expression vector, and a vector into which TlLhpI cDNA was inserted was used as a TlLhpI expression vector.
  • the vector is designed to add a peptide (histidine tag) in which six histidine molecules are linked to the N-terminus of the expressed protein.
  • FIG. 23 is a photograph showing a result of SDS-PAGE of the recombinant protein.
  • the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and each lane shows the results of the molecular weight marker (Marker), TlLhpI, and TlLhpH from the left.
  • the incubation temperature of the spectrophotometer is set to a predetermined temperature (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 ° C.) and the reaction cell was set. Then, the reaction reagent having the composition shown in Table 1 above, 1 ⁇ L (1 ⁇ g) of AbLhpI, and 1 ⁇ L (1 ⁇ g) of AbLhpH, CpLhpH, or TlLhpH were added to the reaction cell, and further, 3-hydroxyl to 10 mmol / L. The reaction was started by adding 100 ⁇ L of proline. The absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured with the addition of 3-hydroxyproline as 0 second.
  • FIG. 24 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the incubation temperature
  • the vertical axis indicates the relative activity
  • ⁇ in the figure indicates the result of AbLhpH
  • ⁇ indicates the result of CpLhpH
  • ⁇ indicates the result of TlLhpH.
  • AbLhpH was found to exhibit excellent 3-Hyp dehydrase activity in the range of 35 to 45 ° C.
  • CpLhpH was found to show excellent 3-Hyp dehydrase activity in the range of 45-50 ° C. It was found that TlLhpH exhibits excellent 3-Hyp dehydrase activity in the range of 80 to 100 ° C.
  • Optimal temperature of TlLhpI The incubation temperature of the spectrophotometer is set to a predetermined temperature (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 ° C.) and the reaction cell was set.
  • a reaction reagent having the composition shown in Table 3 below, ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid, and 1 ⁇ L (10 ⁇ g) of TlLhpI were added to the reaction cell.
  • NADPH was added to the reaction cell.
  • the absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution at 60 seconds was measured with NADPH added at 0 second.
  • the final concentration of ⁇ 1 -pyrroline-2-carboxylic acid in the reaction solution was 1 mmol / L, and the final concentration of NADPH was 0.15 mmol / L.
  • the relative activity at each temperature was calculated with the absorbance when incubated at 80 ° C. as 100%.
  • FIG. 25 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the incubation temperature, and the vertical axis indicates the relative activity.
  • TlLhpI exhibits excellent Pyr2C reductase activity in the range of 70 to 85 ° C.
  • FIG. FIG. 26 is a graph showing relative activity.
  • the horizontal axis indicates the treatment time
  • the vertical axis indicates the relative activity.
  • TlLhpH has extremely high heat resistance.
  • the heat resistance is extremely high, for example, it was found that the reactivity can be maintained even when stored for a long time.
  • FIG. 27 is a graph showing the absorbance in the reaction solution for 3-hydroxyproline measurement, in which the horizontal axis represents the reaction time and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm.
  • linearity was obtained in any incubation.
  • the absorbance decreased more rapidly, and excellent linearity was exhibited immediately after the start of the reaction. From these results, it was found that 3-hydroxyproline can be measured with high accuracy even immediately after the start of the reaction by increasing the incubation temperature.
  • 3-hydroxyproline can be easily analyzed by an enzymatic reaction without using HPLC as in the prior art. Further, since 3-hydroxyproline can be analyzed by the analysis method of the present invention, it is possible to indirectly measure collagen indirectly. For this reason, the present invention can be said to be a very useful technique in the fields of medicine, food, and beauty.

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Abstract

　簡便な３－ヒドロキシプロリンの分析を可能とする新たな分析方法の提供を目的とする。　下記（ｓ１）～（ｓ３）工程により、被検試料中の３－ヒドロキシプロリンを分析する。 （ｓ１）３－ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水する脱水工程 （ｓ２）Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化する還元工程 （ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程

Description

３－ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素
　本発明は、酵素を用いた３－ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素に関する。
　近年、健康および美容の観点から、コラーゲンが注目されており、コラーゲンの定性分析および定量分析が、重要視されている。
　試料中のコラーゲンの分析方法としては、コラーゲンに含まれるヒドロキシプロリンの含有量を測定することによって、間接的にコラーゲンを測定する方法が一般的である。コラーゲンは、一般的なタンパク質、すなわち非コラーゲンタンパク質を構成する基本アミノ酸には該当しないヒドロキシプロリンを含有している。このため、試料におけるヒドロキシプロリンを分析すれば、間接的に、前記試料におけるコラーゲンの分析が可能である。そして、ヒドロキシプロリンの測定は、ＨＰＬＣ分析が汎用されている（特許文献１）。具体的な方法としては、まず、試料に前処理を施し、コラーゲンの分解によりヒドロキシプロリンを遊離させる。前処理済みの試料をＨＰＬＣに供し、ヒドロキシプロリンのピーク面積からヒドロキシプロリン量を算出する。そして、前記算出値と、コラーゲン１分子あたりのヒドロキシプロリン量とから、前記試料のコラーゲン量を求めることができる。
　ＨＰＬＣ分析によりヒドロキシプロリンを分析する場合、ヒドロキシプロリンを、コラーゲンの分解により遊離するＬ－ヒドロキシプロリンから分離しなければならない。しかしながら、ＨＰＬＣ分析によっても、ヒドロキシプロリンとＬ－ヒドロキシプロリンとの分離は、困難である。また、ヒドロキシプロリンは２級アミンであることから、特殊な展開溶媒で開環する必要がある。さらに、ＨＰＬＣ分析は、高額な分析カラムおよび機器が必要であり、分析に時間を要するという問題がある。
　他方、コラーゲンの中でも、コラーゲンIVは、癌患者の尿中で濃度が上昇することが報告されており、癌のマーカーとなり得る。そして、コラーゲンIVには、他のタイプ（例えば、Ｉ～III）と比較して、約８～２５倍の３－ヒドロキシプロリンが含まれていることから、３－ヒドロキシプロリンを分析することで、間接的に癌マーカーとなるコラーゲンIVを分析することができる。このため、３－ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする方法が求められている。
特許公表２０１０－５０４５３３
　そこで、本発明は、３－ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする新たな分析方法、それを用いたコラーゲンの測定方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法は、被検試料中の３－ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）～（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）３－ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
　本発明のコラーゲンの測定方法は、被検試料中のコラーゲンの測定方法であり、下記（Ｓ１）～（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３－ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３－ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３－ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３－ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程
　本発明の新規タンパク質は、下記（Ｒ１Ｔｌ）～（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１Ｔｌ）　配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
　本発明の新規タンパク質は、下記（Ｒ１Ａｂ）～（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１Ａｂ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素は、下記（Ｒ１Ｃｐ）～（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｒ１Ｃｐ）　配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
　本発明の分析試薬は、３－ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする。
　本発明の測定試薬は、コラーゲンの測定試薬であって、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする。
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子は、下記（ｒ１Ｔｌ）～（ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ｔｌ）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明の新規遺伝子は、下記（ｒ１Ａｂ）～（ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子は、下記（ｒ１Ｃｐ）～（ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ｃｐ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明者は、鋭意研究の結果、３－ヒドロキシプロリンの分析方法として、酵素を用いる新たな方法を見出した。具体的には、まず、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素によって、３－ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に変換し、さらに、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素によって、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸の還元反応を行う。そして、この還元反応を分析することで、酵素的に３－ヒドロキシプロリンの分析が可能となるとの知見を得て、本発明を完成するに到った。本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって簡便に３－ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によって３－ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、医療、食品および美容等の分野において、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明の実施例１において、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Δ１－ピロリン－２－カルボン酸（以下、「Ｐｙｒ２Ｃ」ともいう。）還元酵素のＣＢＢ染色の結果を示す写真である。 図２は、本発明の実施例１において、３－ヒドロキシプロリン（以下、３－Ｈｙｐ）ともいう。）の濃度を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例１において、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を用いて作成した検量線を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例２において、３－Ｈｙｐ脱水酵素の量およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の量を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例２において、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を添加するタイミングを代えたときの、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例３において、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のＣＢＢ染色の結果を示す写真である。 図７は、本発明の実施例３において、補酵素を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例３において、基質を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例４において、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例５において、炭素源を変えたときのＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来無細胞抽出物の３－Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。 図１１は、本発明の実施例６において、リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 図１２は、本発明の実施例６において、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。 図１３は、本発明の実施例６において、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。 図１４は、本発明の実施例７において、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例７において、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。 図１６は、本発明の実施例８において、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフ 図１７は、本発明の実施例９において、相対活性を示すグラフである。 図１８は、本発明の実施例１０において、ＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。 図１９は、本発明の実施例１１において、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を用いて作成した検量線を示すグラフである。 図２０は、本発明の実施例１１において、検量線から求めた３－ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３－ヒドロキシプロリンの濃度とを示すグラフである。 図２１は、本発明の実施例１２において、相対活性を示すグラフである。 図２２は、本発明の実施例１２において、相対活性を示すグラフである。 図２３は、本発明の実施例１３において、リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 図２４は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。 図２５は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。 図２６は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。 図２７は、本発明の実施例１３において、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフである。
＜３－ヒドロキシプロリンの分析方法＞
　本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法は、前述のように、被検試料中の３－ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）～（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）３－ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
　本発明において、以下、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素を、３－Ｈｙｐ脱水酵素、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素を、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素ともいう。
　本発明において、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、３－ヒドロキシプロリンの脱水反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、Ｈｏｍｏ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｍｕｓ属、Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ属、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来等あげられる。Ｈｏｍｏ属は、例えば、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等があげられる。また、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属は、例えば、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｓｐ．３８３等があげられる。また、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ等があげられ、具体例として、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５があげられる。Ｍｕｓ属は、例えば、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ等があげられる。Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ属は、例えば、Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ　ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ等があげられる。Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ等があげられ、具体例として、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ等があげられる。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ等があげられる。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のようなものが例示できる。Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿６５３１８２．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号３）からなるタンパク質等があげられる。また、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０８０３１４．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号７）からなるタンパク質等があげられる。Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ　ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＸＰ＿００２７３４１８２．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号８）からなるタンパク質等があげられる。Ｂ．ｓｐ．３８３由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２４１８．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質等があげられる。
　以下に、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の具体例を示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３－Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素および本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方を使用できる。本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素および本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素については、後述する。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、下記（Ｄ１）～（Ｄ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｄ１）　配列番号３、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２）　前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３）　前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
　前記（Ｄ１）において配列番号３の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｈｓ）、（Ｄ２Ｈｓ）および（Ｄ３Ｈｓ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号９の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｃｐ）、（Ｄ２Ｃｐ）および（Ｄ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１１の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ａｂ）、（Ｄ２Ａｂ）および（Ｄ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１２の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｔｌ）、（Ｄ２Ｔｌ）および（Ｄ３Ｔｌ）ともいう。
　前記（Ｄ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～３個」との記載は、「１、２、３個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記（Ｄ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３）の「同一性」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（Ｄ２）および（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
　前記（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３０℃、ｐＨ８の条件下、１分間に１μｍｏｌのＬ－プロリンを生成する酵素量と定義できる。
　３－ヒドロキシプロリンは、例えば、シス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（以下、シス－３－ヒドロキシプロリンともいう）およびトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（以下、トランス－３－ヒドロキシプロリンともいう）があげられる。本発明において、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、シス型およびトランス型のいずれを基質としてもよく、両方を基質としてもよい。例えば、生体内における３－ヒドロキシプロリンを分析する場合、前記３－ヒドロキシプロリンはトランス型であるため、トランス型を基質とする３－Ｈｙｐ脱水酵素が好ましい。
　本発明において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸の還元反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ等があげられる。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、具体例として、ＰＡＯ１株（例えば、Bater,　A.　J.,　Venables,　W.　A.,　and　Thomas,　S.　(1977)　Arch.　Microbiol.　112,　287-289、Manoharan,　H.　T.　(1980)　J.　Biosci.　2,　107-120参照）等があげられる。Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａは、具体例として、ＫＴ２４２２株（例えば、Gryder,　R.　M.,　and　Adams,　E.　(1969)　J.　Bacteriol.　97,　292-306参照）等があげられる。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ等があげられる。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅは、具体例として、ＡＴＣＣ２９１４５株等があげられる。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属は、例えば、Ｂ．ｓｐ．３８３等があげられる。Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ等があげられ、具体例として、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ等があげられる。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ等があげられる。
　Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿２４９９４３．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質等があげられる。
　以下に、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の具体例を示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号２）
MIRMTLDEVRELAVRILRRHAFSEAHVQAVADTLVAGERDECASHGIWRLLGCIATLKAGKVSADAEPELHDIAPGLLRVDAHGGFSQCAFRLGLPHLLEKARSQGIAAMAVNRCVHFSALWVEVEALTEAGLVALATTPSHAWVAPAGGRKPIFGTNPIAFGWPRPDGPPFVFDFATSAVARGEIQLHERAGKPIPLGWGVDEQGEPTTDASAALRGAMLTFGGHKGSALAAMVELLAGPLIGDLTSAESLAYDEGSRSSPYGGELLIAIDPRRMLGASAEEHLARAETLFEGIVEQGARLPSQRRFEARERSARDGVTIPEALHRELLALLE
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、この他に、例えば、ｄｐｋＡ－ｌｉｋｅ酵素またはオルニチンシクロデアミナーゼ様（ＯＣＤ－ｌｉｋｅ）酵素等を用いてもよい。Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ由来ｄｐｋＡ－ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿７４５７２７．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ由来ｄｐｋＡ－ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ_７９２１７５．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｂ．ｓｐ．３８３由来ｄｐｋＡ－ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２６５６．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。
　Ｂ．ｓｐ．３８３由来ＯＣＤ－ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２４２１．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ由来ＯＣＤ－ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＥＩＭ１６９４８で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を使用できる。本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素については、後述する。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、下記（Ｒ１）～（Ｒ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｒ１）　配列番号１、２、１３および１４からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２）　前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３）　前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
　前記（Ｒ１）において配列番号１の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、後述するように、それぞれ、（Ｒ１Ａｂ）、（Ｒ２Ａｂ）および（Ｒ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号２の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｐｓ）、（Ｒ２Ｐｓ）および（Ｒ３Ｐｓ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１３の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｃｐ）、（Ｒ２Ｃｐ）および（Ｒ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１４の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｔｌ）、（Ｒ２Ｔｌ）および（Ｒ３Ｔｌ）ともいう。
　前記（Ｒ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｒ２）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　前記（Ｒ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｒ３）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ３）の「同一性」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３０℃、ｐＨ８の条件下、１分間に１μｍｏｌのＬ－プロリンを生成する酵素量と定義できる。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、粗酵素（非精製酵素）、部分的に精製した部分精製酵素、および、単一に精製した精製酵素のいずれでもよく、好ましくは精製酵素である。
　前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、３－ヒドロキシプロリンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が固体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の分析方法に供することが好ましい。また、前記被検試料が、コラーゲン等のタンパク質を含み、前記タンパク質における３－ヒドロキシプロリンを分析する場合は、例えば、前記タンパク質を分解して前記３－ヒドロキシプロリンを遊離する前処理を施すことが好ましい。前記３－ヒドロキシプロリンを遊離する前処理の方法は、特に制限されず、例えば、タンパク質の加水分解処理があげられる。
　前記（ｓ１）工程は、前述のように、３－Ｈｙｐ脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水する脱水工程である。前記（ｓ１）工程は、例えば、前記被検試料と前記３－Ｈｙｐ脱水酵素との接触により行うことができる。前記接触方法は、特に制限されず、例えば、酵素を用いる一般的な手段が採用でき、具体例として、前記被検試料と前記３－Ｈｙｐ脱水酵素とを含む反応系が使用できる。前記反応系において、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、例えば、プレート、容器等の基板、ビーズ、フィルター等、公知の担体が使用できる。前記反応系は、例えば、反応液である。
　前記（ｓ１）工程において、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、特に制限されず、単位Ｕの場合、前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．０１～１０Ｕであり、好ましくは０．０１～１Ｕであり、より好ましくは０．０１～０．０５Ｕである。また、タンパク質量の場合、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．１～１０μｇであり、好ましくは０．１～１μｇであり、より好ましくは０．１～０．５μｇである。また、例えば、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
　前記（ｓ１）工程において、脱水反応の条件は、特に制限されず、例えば、使用する前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、１０～１００℃であり、好ましくは１５～９０℃であり、より好ましくは２０～８０℃である。反応時間は、例えば、０～１０分であり、好ましくは０.５～５分であり、より好ましくは１～５分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５～１０であり、好ましくは６～９であり、より好ましくは７～９である。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素がＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、３０～５０℃であり、好ましくは３５～４５℃であり、より好ましくは３７～４０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５～１０であり、好ましくは６～９であり、より好ましくは７～９である。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素がＣｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、１０～５０℃であり、好ましくは１５～３０℃であり、より好ましくは２０～３０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５～１０であり、好ましくは６～９であり、より好ましくは７～９である。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、５０～１００℃であり、好ましくは６０～９０℃であり、より好ましくは７０～８０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５～１０であり、好ましくは６～９であり、より好ましくは７～９である。
　前記反応系は、前記被検試料および前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の他に、例えば、溶媒、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素に対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。
　つぎに、前記（ｓ２）工程は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化する還元工程である。前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程で得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素との接触により行うことができる。本発明において、前記（ｓ１）工程および前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程の後に、前記（ｓ２）工程を行ってもよいし、前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行ってもよい。
　前記（ｓ１）工程を行った後に前記（ｓ２）工程を行う場合、前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素との接触は、例えば、前記（ｓ１）工程で脱水反応を行った後の前記反応系を、そのまま前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させてもよいし、前記反応系に処理を施したものを前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させてもよい。後者の場合、前記処理は、特に制限されず、例えば、前記反応系の濃縮処理、前記反応系からの前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸の単離処理等でもよい。前記濃縮処理を行った場合、前記反応系の濃縮物と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを接触させればよく、また、前記単離処理を行った場合、単離した前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させればよい。また、前述のように、前記（ｓ１）工程において固定化した前記３－Ｈｙｐ脱水酵素を使用した場合、例えば、前記反応系について、液体画分と固形画分とを分離し、前記（ｓ２）工程において、前記液体画分を、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させることが好ましい。本発明においては、操作が簡便であることから、例えば、前記（ｓ１）工程後の前記反応系または前記反応系の前記液体画分と、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを接触させることが好ましい。
　前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行う場合、例えば、前記被検試料と前記３－Ｈｙｐ脱水酵素と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを含む反応系を用いて、前記反応系中で、３－ヒドロキシプロリンからΔ１－ピロリン－２－カルボン酸への脱水化と、前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸の水素化を行うことができる。
　前記反応系において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、前述と同様である。
　前記（ｓ２）工程において使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の由来は、前記（ｓ１）工程において使用する前記３－Ｈｙｐ脱水酵素の由来と同じであってもよいし、異なってもよい。前記（ｓ１）工程において使用する前記３－Ｈｙｐ脱水酵素および前記（ｓ２）において使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せは、特に制限されない。前記組合せは、例えば、酵素活性がより高く、より短時間で３－Ｈｙｐを測定できることから、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素がの組合せが好ましい。前記組合せは、例えば、耐熱性が高く、より長期の保存が可能なことから、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せが好ましい。前記組合せは、例えば、耐寒性が高く、より低温で３－Ｈｙｐを測定できることから、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来の３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＣｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せが好ましい。
　前記（ｓ２）工程において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、特に制限されず、単位Ｕの場合、前記（ｓ１）工程における前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．０１～１０Ｕであり、より好ましくは０．０１～１Ｕであり、さらに好ましくは０．０１～０．０５Ｕである。また、タンパク質量の場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、前記（ｓ１）工程における前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．１～１０μｇであり、好ましくは０．１～１μｇであり、より好ましくは０．１～０．５μｇである。また、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
　前記（ｓ２）工程において、還元反応の条件は、特に制限されず、使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、１０～１００℃であり、好ましくは１５～９０℃であり、より好ましくは２０～８０℃である。反応時間は、例えば、０.５～１０分であり、好ましくは０.５～５分であり、好ましくは１～５分である。反応ｐＨは、例えば、４～９であり、好ましくは５～８であり、より好ましくは６～８である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、３０～５０℃であり、好ましくは３５～４５℃であり、より好ましくは３７～４０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、６～８であり、好ましくは６．５～７．５であり、より好ましくは６．８～７．２である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＣｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、１０～５０℃であり、好ましくは１５～３０℃であり、より好ましくは２０～３０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、６～８であり、好ましくは６．５～７．５であり、より好ましくは６．８～７．２である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、５０～１００℃であり、好ましくは６０～９０℃であり、より好ましくは７０～８０℃である。反応時間は、例えば、１～１０分であり、好ましくは１～５分であり、より好ましくは１～２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、４～９であり、好ましくは５～８であり、より好ましくは６～８である。
　前記反応系は、前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の他に、例えば、溶媒、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素に対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の前記還元剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。前記イオン性化合物は、例えば、二価イオンを遊離する化合物等があげられ、前記二価イオンとしては、例えば、マグネシウム等があげられる。
　前記補酵素は、特に制限されず、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
　そして、前記（ｓ３）工程は、前記（ｓ２）の還元反応を分析する分析工程である。本発明において、前記分析は、例えば、定性分析、定量分析および半定量分析のいずれでもよい。
　前記還元反応の分析は、例えば、前記反応により生じるシグナルの検出により行うことができる。前記シグナルは、例えば、前記還元反応によりシグナルを生じる基質、または、前記還元反応によりシグナルが消失または減少する基質等を併用することが好ましい。
　前記基質の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記（ｓ１）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（ｓ２）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（ｓ２）工程の後であり前記（ｓ３）工程の前に、前記反応系が基質を含んでもよい。
　前記（ｓ３）工程において、前記還元反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的分析および電気的分析のいずれでもよい。
　光学的分析の場合、例えば、前記還元反応によって生じる光学的シグナルを測定する方法があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色、発光もしくは蛍光等のシグナルがあげられ、前記光学的シグナルの測定は、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等の測定により行うことができる。前記（ｓ３）工程において光学的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における還元反応において、例えば、前記還元反応によって、発色、発光もしくは蛍光を発する基質、発色、発光もしくは蛍光が消失または減少する基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の還元反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に依存した光学的シグナルの測定を行うことができる。
　また、電気的分析の場合、例えば、前記還元反応によって生じる電子の授受を、電気的シグナルとして測定する方法があげられる。前記電気的シグナルの測定は、例えば、電流等の電気シグナルの強度を測定する方法があげられる。前記（ｓ３）工程において電気的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における還元反応において、例えば、前記還元反応によって、電子の授受が可能な基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の還元反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に依存した電気的シグナルの測定を行うことができる。
　前記基質は、特に制限されず、例えば、電子供与体が好ましく、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
　前記補酵素および前記基質として、例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用した場合、以下のようなメカニズムによりＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を測定できると推定される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、酸化により、それぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋を生成する。また、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、３４０ｎｍの紫外光線を吸収するのに対し、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、３４０ｎｍの紫外光線を吸収しない。このため、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素により、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸が還元されＬ-プロリンが生成すると同時に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからそれぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋が生成される。そこで、３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸の還元、つまり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の活性を測定できる。なお、前記推定メカニズムは、本発明を何ら制限しない。
　前記基質の添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記（ｓ２）工程において前記基質が前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と共存していることが好ましい。また、前記（ｓ２）工程において、前記（ｓ１）工程における反応系を使用する場合、例えば、前記（ｓ１）工程において、その反応系が前記基質を含有してもよい。
　本発明は、さらに、下記（ｓ４）工程を有してもよい。
（ｓ４）既知量の３－ヒドロキシプロリンを含む標準試料の３－ヒドロキシプロリンの量と、前記標準試料に対する前記（ｓ１）～（ｓ３）工程の実行により得られる分析結果との相関関係に基づいて、前記（ｓ３）工程における前記被検試料の分析結果から、前記被検試料中の３－ヒドロキシプロリンの量を算出する算出工程
　本発明において、各工程の順序は、特に制限されず、例えば、以下のような順序が例示できる。各工程を実行する順序は、例えば、３－Ｈｙｐ脱水酵素、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および／または前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応における基質の添加のタイミングによって、適宜、調節できる。
１：　（ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）の順序で、処理を行う
２：　（ｓ１）および（ｓ２）を並行して行った後、（ｓ３）を行う
３：　（ｓ１）を行った後、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
４：　（ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
　本発明の分析方法について、以下に、光学的分析の一例を示すが、例示であって、本発明は、この方法には制限されない。
　まず、被検試料、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素、および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素に対する基質を含む反応液ｓ１を調製する。前記反応液ｓ１について、例えば、１ｍｌあたりの組成を以下に示す。前記基質は、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
（反応液ｓ１の組成：１ｍｌあたり）
　３－Ｈｙｐ脱水酵素　　０．１～０．５μｇまたは０．０１～０．０５Ｕ
　緩衝液　　　　　　　　５０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　基質　　　　　　　　　０．１～０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
　ｐＨ　　　　　　　　　６～８
　被検試料　　　　　　　１００～５００μL
　前記反応液ｓ１をインキュベートして、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素による脱水反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、温度が、例えば、１０～１００℃であり、好ましくは１５～９０℃であり、時間が、例えば、０～１０分間であり、好ましくは、０．５～５分間であり、より好ましくは、１～５分間である。
　つぎに、前記反応液ｓ１に、さらに、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を添加して、還元反応の反応液ｓ２を調製する。前記反応液ｓ２について、１ｍｌあたりの前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の濃度は、例えば、０．１～０．５μｇまたは０．０１～０．０５Ｕである。なお、本例では、前記反応液ｓ１にＰｙｒ２Ｃ還元酵素に対する基質（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）を添加したが、例えば、これらを、前記反応液ｓ１への添加に代えて、前記反応液ｓ２の調製において添加してもよい。
　前記反応液ｓ２をインキュベートして、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、温度が、例えば、１０～１００℃であり、好ましくは１５～９０℃であり、時間が、例えば、０.５～１０分間であり、好ましくは０.５～５分間である。
　そして、前記反応液ｓ２について、吸光度測定を行う。前記吸光度の測定波長は、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の基質の種類に応じて適宜決定でき、具体例として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを使用した場合、３４０ｎｍがあげられる。
　他方、既知濃度の３－ヒドロキシプロリンを含む複数の標準試料を使用し、同様の条件で、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素による脱水反応および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応を行い、吸光度を測定する。そして、前記各標準試料の濃度と、これらに対応する吸光度との相関関係を求める。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。そして、前記被検試料に関する吸光度の測定結果と前記相関関係とから、前記被検試料における３－ヒドロキシプロリンの量を算出する。このように、例えば、前記相関関係を利用することによって、前記被検試料における３－ヒドロキシプロリンの量を定量できる。
＜コラーゲンの測定方法＞
　本発明のコラーゲンの測定方法は、前述のように、被検試料中のコラーゲンの測定方法であって、下記（Ｓ１）～（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３－ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３－ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３－ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３－ヒドロキシプロリンの量からコラーゲン量を算出する算出工程
　前述のように、被検試料におけるコラーゲンの分析は、被検試料における３－ヒドロキシプロリンの分析によって、間接的に行うことができる。このため、前述の本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法に利用すれば、従来のＨＰＬＣ法とは異なり、酵素反応を行うのみで、簡便に前記３－ヒドロキシプロリンを分析し、その分析結果から、間接的に前記被検試料におけるコラーゲンを測定できる。
　本発明は、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法により前記被検試料中の３－ヒドロキシプロリンを測定することが特徴であって、その他の工程およびその他の条件は、何ら制限されない。
　前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、コラーゲンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が個体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の測定方法に供することが好ましい。前記被検試料の具体例としては、例えば、食品、化粧品、医薬品、生体由来の組織等があげられる。
　前記コラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンII、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンＶ、コラーゲンVIII、コラーゲンＸ、コラーゲンXI、コラーゲンXVIII等があげられ、好ましくは、コラーゲンIVである。
　前記（Ｓ１）工程は、被検試料中のコラーゲンから、３－ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程である。前記コラーゲンから前記３－ヒドロキシプロリンを遊離させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、前記コラーゲンの加水分解処理があげられる。前記加水分解処理は、例えば、前記被検試料を、酸性条件および加熱条件で処理することにより行える。前記酸性条件への調整は、例えば、前記被検試料への酸の添加により行える。前記酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸等が使用できる。
　前記加水分解処理後の処理液は、次工程である前記（Ｓ２）工程に使用できる。前記処理液は、例えば、酸性条件であることから、前記（Ｓ２）工程に適したｐＨに調整しておくことが好ましい。前記ｐＨの調整は、例えば、アルカリ、緩衝液等が使用できる。前記ｐＨは、特に制限されず、前記（Ｓ２）工程、すなわち、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法における前記（ｓ１）工程で示したｐＨがあげられる。
　つぎに、前記（Ｓ２）工程は、前記（Ｓ１）工程で遊離した３－ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する工程である。前記（Ｓ２）工程は、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法の記載を援用できる。
　続いて、前記（Ｓ３）工程は、予め求めた前記コラーゲンに対する３－ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３－ヒドロキシプロリンの量からコラーゲン量を算出する工程である。
　前記コラーゲンに対する３－ヒドロキシプロリンの割合係数は、例えば、公知の割合係数があげられる。また、前記割合係数は、例えば、既知量のコラーゲンを含む標準試料のコラーゲン量と、前記標準試料に対する前記（Ｓ１）および（Ｓ２）工程の実行により得られる３－ヒドロキシプロリンの量との相関関係であってもよい。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。
＜新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素＞
　本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｒ１）～（Ｒ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１）　配列番号１および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２）　前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３）　前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
　前記新規タンパク質は、以下、新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸（Ｐｙｒ２Ｃ）還元酵素ともいう。前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、本発明者らが新たに同定したタンパク質である。
　前記（Ｒ１）において配列番号１の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ａｂ）、（Ｒ２Ａｂ）および（Ｒ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１４の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｔｌ）、（Ｒ２Ｔｌ）および（Ｒ３Ｔｌ）ともいう。
　前記（Ｒ１Ａｂ）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列（配列番号１）
MTALSPIPVFDAADTAALLDYPALLATLRQAVADYAAGEIVSPERLVVPLQAGGVMLSMPSSARDLATHKLVNVCPGNGARGLPTILGQVTAYDATTGEMRFALDGPTVTGRRTAAITALGIQALHGVAPRDILLIGTGKQAANHAEALAAIFPDARLHVRGTSADSAAAFCAAHRTQAPHLVPLDGDAIPDAIDVVVTLTTSRTPVYREAAREGRLVVGVGAFTADAAEIDANTVRASRLVVDDPAGARHEAGDLIVAQVDWQDVASLADVLRGAFDRSGPLLFKSVGCAAWDLAACRTARDALAARRAG
　前記（Ｒ１Ｔｌ）における配列番号１４のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３から得ることができる。
（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列（配列番号１４）
MLLLSRSDLEKLISMKEVIESVERAFLELYNGKAKVPLRTIIEVEKHNGFILYMPSYLEDSEALAVKVVSLYPENTKKGLPSVLASILLNDPKTGAPLALMEGTFITAMRTGAASGVATKYLARKDSKIAGIIGAGVQARTQLWAVCEVRNIEKALVYDINPKNAKKFAEEMSKKLGIEIKTVESAREATEKSDILIVATTAREPVVKGGWIREGTHINSVGWVGRDARELDSETVRKSKLVVDSKEGVLNESGDIIIPMKEGVIDEGHIHAELAEIVAGVKKGRENNREITLFKSVGLAIEDAITAKLAYEKALEHGVGTNVEL
　前記（Ｒ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｒ２）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
　前記（Ｒ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｒ３）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ３）の「同一性」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
　前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を基質とする還元酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
　前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に対する基質特異性が、Δ１－ピペリジン－２－カルボン酸に対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Δ１－ピペリジン－２－カルボン酸を基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
　前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは１ｍＭ以下である。
　前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、補酵素として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのいずれも使用できる。
＜Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素＞
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素は、前述のように、下記（Ｒ１Ｃｐ）～（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｒ１Ｃｐ）　配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、本発明者らが新たに同定したＰｙｒ２Ｃ還元酵素である。
　前記（Ｒ１Ｃｐ）における配列番号１３のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿２６８１９７．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１３）があげられる。
（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列（配列番号１３）
MKIISAEQVHQNLNFEELIPLLKQSFSRPFSMPQRQVYSLAPEQSENHDAFALLPSWNEEVIGNKAFTYFPDNAKKHDLPGLFSKIMLFKRQTGEPLALVDGTSVTYWRTAAISALASQLLSRKNSQHLMLFGTGNLASYLVKAHLTVRDIKQVTLWGRNAKKVSKLIADFSILYPAVTFKTSVDVNAEVASADIICCATGAKTPLFDGNSVSAGCHIDCLGNHMTDARECDTTTILRARVFVDSLTNTLNEAGELLIPMAEDAFNKDEIVGELADMCKTPSMLRQSSDEITLFKSVGTAISDLVAAHSVVEKLAD
　本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を基質とする還元酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に対する基質特異性が、Δ１－ピペリジン－２－カルボン酸に対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Δ１－ピペリジン－２－カルボン酸を基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは１ｍＭ以下である。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、補酵素として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのいずれも使用できる。
＜新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子＞
　本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｒ１Ａｂ）～（ｒ７Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ４Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ５Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ６Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ７Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　前記新規遺伝子は、前記本発明の新規タンパク質（新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素）をコードする遺伝子であることから、以下、新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子ともいう。前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子は、本発明者らが新たに同定した遺伝子である。
　本発明の新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
　配列番号４の塩基配列は、以下の通りである。配列番号４の塩基配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ａｂ）のコード配列である。配列番号４のポリヌクレオチド（ｒ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（ｒ１Ａｂ）のポリヌクレオチド（配列番号４）
ATGACCGCTCTTTCCCCGATTCCCGTTTTCGATGCGGCCGACACGGCCGCGCTGCTCGACTACCCGGCGCTGCTCGCCACGCTCAGGCAGGCCGTCGCCGACTATGCGGCGGGCGAGATCGTCAGCCCCGAACGCCTGGTCGTGCCGTTGCAGGCGGGCGGCGTGATGCTGTCGATGCCGTCGAGCGCGCGCGACCTCGCGACCCACAAGCTCGTGAACGTGTGCCCGGGCAACGGCGCGCGCGGGCTGCCGACGATCCTCGGCCAGGTCACCGCATACGACGCGACCACCGGCGAGATGCGTTTCGCGCTCGACGGCCCGACGGTCACCGGACGCCGCACGGCGGCCATCACCGCGCTCGGCATCCAGGCGCTGCATGGCGTCGCCCCGCGCGACATCCTGCTGATCGGCACCGGGAAACAGGCAGCGAATCACGCGGAAGCGCTCGCCGCGATCTTTCCCGACGCGCGCCTTCACGTGCGCGGCACGAGCGCCGACAGCGCGGCTGCCTTCTGCGCCGCGCACCGCACACAGGCACCGCATCTCGTGCCGCTCGACGGCGACGCGATTCCCGATGCGATCGACGTCGTCGTCACGCTCACGACCAGCCGCACGCCCGTCTATCGCGAAGCCGCGCGCGAAGGCCGGCTGGTGGTCGGCGTCGGCGCGTTCACCGCGGACGCGGCCGAGATCGACGCGAACACCGTGCGCGCCAGCCGGCTGGTCGTCGACGATCCGGCCGGCGCGCGCCACGAAGCCGGCGACCTGATCGTCGCGCAGGTCGACTGGCAGGATGTCGCGTCGCTCGCCGACGTGCTGCGCGGCGCATTCGACCGCAGCGGGCCGCTGCTGTTCAAGAGCGTCGGCTGTGCCGCGTGGGATCTGGCCGCGTGCCGCACCGCGCGCGATGCGCTGGCCGCACGCCGGGCCGGCTGA
　前記（ｒ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｒ２Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
　前記（ｒ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｒ３Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ３Ａｂ）の同一性は、前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記（ｒ４Ａｂ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｒ１Ａｂ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｒ４Ａｂ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
　前記（ｒ６Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｒ６Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ６Ａｂ）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　前記（ｒ７Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｒ７Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ７Ａｂ）の同一性は、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
＜Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子＞
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子は、前述のように、下記（ｒ１）～（ｒ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１）配列番号１５および１６の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２）前記（ｒ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３）前記（ｒ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ４）前記（ｒ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ５）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ６）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ７）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子は、本発明者らが新たに同定したＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である。
　本発明のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
　前記（ｒ１）において配列番号１５の場合、前記（ｒ１）、（ｒ２）、（ｒ３）、（ｒ４）、（ｒ５）、（ｒ６）および（ｒ７）は、それぞれ、（ｒ１Ｃｐ）、（ｒ２Ｃｐ）、（ｒ３Ｃｐ）、（ｒ４Ｃｐ）、（ｒ５Ｃｐ）、（ｒ６Ｃｐ）および（ｒ７Ｃｐ）ともいう。前記（ｒ１）において配列番号１６の場合、前記ｒ１）、（ｒ２）、（ｒ３）、（ｒ４）、（ｒ５）、（ｒ６）および（ｒ７）は、それぞれ、（ｒ１Ｔｌ）、（ｒ２Ｔｌ）、（ｒ３Ｔｌ）、（ｒ４Ｔｌ）、（ｒ５Ｔｌ）、（ｒ６Ｔｌ）および（ｒ７Ｔｌ）ともいう。
　前記（ｒ１ｃｐ）における配列番号１５の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１５の塩基配列は、前記配列番号１３のアミノ酸配列からなる本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ｃｐ）のコード配列である。配列番号１５のポリヌクレオチド（ｒ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ_１４５５で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１５）があげられる。
（ｒ１Ｃｐ）のポリヌクレオチド（配列番号１５）
ATGAAAATTATTAGCGCCGAACAAGTCCACCAAAACCTAAACTTTGAAGAGTTGATCCCTTTACTAAAACAGAGTTTTAGTCGCCCATTTAGTATGCCTCAGCGTCAGGTTTACTCACTAGCGCCTGAGCAAAGTGAAAATCATGATGCGTTTGCCTTATTACCTTCATGGAATGAAGAAGTGATTGGTAATAAAGCTTTCACTTACTTTCCTGACAACGCGAAAAAGCATGATTTACCGGGTTTGTTTTCGAAAATAATGCTGTTTAAACGCCAAACAGGTGAGCCGTTAGCACTGGTTGATGGCACCAGTGTTACGTATTGGCGAACAGCAGCTATTTCAGCATTAGCCAGCCAATTACTTTCTCGAAAAAATAGCCAACATCTGATGTTATTTGGTACCGGAAATCTAGCAAGTTATTTAGTAAAAGCGCATTTAACTGTGCGAGATATTAAGCAAGTTACTCTGTGGGGACGTAATGCAAAAAAAGTTAGCAAACTGATTGCAGACTTTAGTATTTTGTATCCAGCTGTTACGTTTAAAACCAGTGTTGATGTCAATGCTGAGGTAGCAAGTGCTGATATTATTTGCTGTGCAACGGGGGCAAAAACACCTCTTTTTGATGGGAATAGCGTGAGTGCAGGTTGTCATATTGATTGCTTAGGTAATCACATGACTGATGCGCGTGAATGCGATACAACAACAATATTACGCGCTAGGGTATTTGTTGATAGTTTAACGAATACCTTAAATGAAGCGGGTGAATTACTTATCCCTATGGCAGAAGATGCTTTTAACAAGGATGAGATTGTAGGCGAATTAGCTGACATGTGTAAAACGCCATCAATGCTGCGCCAATCAAGCGATGAAATAACGTTATTTAAGTCTGTGGGCACAGCGATTAGTGATTTAGTAGCGGCACATAGCGTAGTAGAAAAGTTAGCAGATTAA
　前記（ｒ１Ｔｌ）における配列番号１６の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１６の塩基配列は、前記配列番号１４のアミノ酸配列からなる本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ｔｌ）のコード配列である。配列番号１６のポリヌクレオチド（ｒ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３から得ることができる。
（ｒ１Ｔｌ）のポリヌクレオチド（配列番号１６）
ATGTTGCTCCTCAGCAGAAGTGATCTTGAGAAGTTGATCTCAATGAAGGAAGTCATAGAGTCCGTTGAAAGAGCATTCTTAGAGCTCTATAACGGAAAAGCAAAAGTTCCGTTAAGGACTATAATAGAGGTTGAGAAGCACAACGGGTTCATTCTGTACATGCCAAGTTACTTAGAAGATTCCGAGGCTTTGGCTGTAAAGGTGGTTTCTTTATACCCTGAAAATACCAAGAAAGGTCTGCCGAGCGTTTTGGCGTCAATTCTTCTCAACGACCCAAAAACAGGTGCTCCATTGGCCTTGATGGAAGGCACCTTCATAACTGCCATGAGAACTGGGGCTGCAAGTGGTGTTGCCACAAAGTATCTTGCCAGAAAAGACTCAAAAATCGCGGGAATTATTGGCGCGGGGGTTCAAGCGAGAACTCAGCTCTGGGCAGTTTGCGAAGTTAGAAACATAGAAAAGGCACTTGTCTATGATATTAACCCCAAAAATGCTAAAAAATTTGCCGAAGAGATGTCTAAAAAGCTTGGAATCGAGATAAAAACAGTTGAATCTGCAAGGGAAGCTACTGAGAAGTCCGATATCCTAATAGTAGCAACAACGGCAAGAGAACCAGTAGTTAAGGGGGAaTGGATTAGGGAAGGCACGCACATCAACTCCGTAGGCTGGGTGGGGAGAGATGCCAGGGAACTCGATTCCGAAACAGTGAGAAAGTCTAAGCTGGTTGTGGACTCAAAAGAGGGTGTCCTAAATGAATCAGGGGACATAATAATTCCCATGAAAGAGGGGGTAATTGACGAGGGCCATATCCATGCCGAGCTTGCTGAAATCGTTGCTGGAGTTAAAAAAGGAAGGGAAAACAACAGAGAGATAACCCTTTTCAAGAGCGTCGGTTTGGCAATAGAAGATGCAATAACAGCCAAGTTAGCATATGAAAAAGCCCTTGAACATGGAGTTGGTACTAACGTGGAGCTTTAG
　前記（ｒ２）～（ｒ７）の説明は、前記本発明の新規Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子の説明において、「（ｒ２Ａｂ）」を「（ｒ２）」に、「（ｒ３Ａｂ）」を「（ｒ３）」に、「（ｒ４Ａｂ）」を「（ｒ４）」に、「（ｒ５Ａｂ）」を「（ｒ５）」に、「（ｒ６Ａｂ）」を「（ｒ６）」に、「（ｒ７Ａｂ）」を「（ｒ７）」に、「配列番号１」を「配列番号１３および１４の少なくも一方」読み替えて援用できる。
　本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
＜Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素の発現ベクター＞
　本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドおよび前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドの少なくとも一方（以下、「本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」ともいう。）を含むことを特徴とする。本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターによれば、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を容易に製造できる。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドがコードするＰｙｒ２Ｃ還元酵素を発現可能なように、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は何ら制限されない。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター、ｐＱＥ－８０ＬベクターおよびｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社）、例えば、ｐＱＥ－８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドがコードする前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
＜Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素の製造方法＞
　本発明の新規タンパク質（新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素）の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を発現する細菌等を公知の手段で培養し、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を産生させることにより製造してもよい。前者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の新規遺伝子（新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子）およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子の少なくとも一方を発現させる工程を有する。後者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を発現する細菌を培養し、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を産生させる工程を有する。これによって、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を製造できる。
　また、本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法は、特に制限されない。本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法は、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法の説明において、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」に、読み替えて援用できる（以下、同様）。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを使用して行ってもよい。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
　前者の場合、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を合成できる。
　前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
　前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
　前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドは、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
　後者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現には、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
　前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を発現する細菌の培養方法は、特に制限されず、従来公知の培養方法に基づいて、適宜実施できる。
　前記細菌は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
　前記細菌の培養に使用する培地の形態は、特に制限されず、例えば、固体培地、液体培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、塩類等が挙げられる。前記窒素源としては、特に制限されず、例えば、カゼイン、ゼラチン、魚由来タンパク質、豆由来タンパク質等のタンパク質が挙げられる。また、前記炭素源は、特に制限されず、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、ラフィノース等が挙げられる。前記塩類も、特に制限されず、例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、前記培地は、さらに、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現誘導剤を含んでもよく、前記発現誘導剤は、例えば、Ｌ－プロリン、Ｌ－プロリン、Ｄ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｄ－ヒドロキシプロリン、３－ヒドロキシプロリン、Ｄ－リジン等があげられる。前記培地は、例えば、市販培地を含んでもよい。前記市販培地としては、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等が挙げられる。これらは、一種類で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６～８の範囲であり、好ましくは、ｐＨ６．５～７．５の範囲である。
　前記細菌の培養方法は、特に制限されず、前記固体培地を用いた場合には、例えば、平板培養法、斜面培養法等が挙げられる。また、前記液体培地を用いた場合にも、特に制限されず、例えば、静置培養法、通気培養法、振とう培養法等が挙げられる。
　培養温度は、特に制限されないが、例えば、前述した前記細菌の生育可能温度や、前記生育最適温度等が挙げられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、０～８０℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅの場合、前記培養温度は、例えば、１５～４０℃の範囲、３０～３７℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈの場合、前記培養温度は、例えば、０～１０℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３の場合、前記培養温度は、例えば、７０～８０℃の範囲等で行うことができる。
　前記細菌は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
　本発明の製造方法は、例えば、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の精製工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。前記溶媒のｐＨは、例えば、６～８である。本発明の製造方法により得られた新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、そのまま粗酵素（非精製酵素）として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製酵素として使用してもよいし、単一に精製した精製酵素として使用してもよい。
＜新規３－ヒドロキシプロリン脱水酵素＞
　本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｄ１Ａｂ）～（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｄ１Ａｂ）　配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
　前記新規タンパク質は、以下、新規３－ヒドロキシプロリン（３－Ｈｙｐ）脱水酵素ともいう。前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、本発明者らが新たに同定したタンパク質である。
　前記（Ｄ１Ａｂ）における配列番号１１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３－Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　前記（Ｄ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２Ａｂ）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
　前記（Ｄ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３Ａｂ）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３Ａｂ）の「同一性」は、前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記（Ｄ２Ａｂ）および（Ｄ３Ａｂ）のタンパク質は、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
　前記（Ｄ３Ａｂ）のタンパク質は、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
　本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
　前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、３－ヒドロキシプロリンを基質とする脱水酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
　前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３－ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、４－ヒドロキシプロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、３－ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、４－ヒドロキシプロリンを基質とした相対活性が１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
　前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３－ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．５ｍＭ以下である。
＜３－ヒドロキシプロリン脱水酵素＞
　本発明の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素は、前述のように、下記（Ｄ１）～（Ｄ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｄ１）　配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２）　前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３）　前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、本発明者らが新たに同定した３－Ｈｙｐ脱水酵素である。
　前記（Ｄ１）において配列番号９の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｃｐ）、（Ｄ２Ｃｐ）および（Ｄ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１２の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｔｌ）、（Ｄ２Ｔｌ）および（Ｄ３Ｔｌ）ともいう。
　前記（Ｄ１Ｃｐ）における配列番号９のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ＿１４５３で登録されているアミノ酸配列（配列番号９）からなるタンパク質等があげられる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３－Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　前記（Ｄ１Ｔｌ）における配列番号１２のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来３－Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＯＣＣ＿００３８７で登録されているアミノ酸配列（配列番号１２）からなるタンパク質等があげられる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３－Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　前記（Ｄ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
　前記（Ｄ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３）が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３）の「同一性」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記（Ｄ２）および（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
　前記（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
　本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、３－ヒドロキシプロリンを基質とする脱水酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
　前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３－ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、４－ヒドロキシプロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、３－ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、４－ヒドロキシプロリンを基質とした相対活性が１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
　前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３－ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．５ｍＭ以下である。
＜新規３－ヒドロキシプロリン酵素遺伝子＞
　本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｄ１Ａｂ）～（ｄ７Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｄ１Ａｂ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ４Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ５Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ６Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ７Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　前記新規遺伝子は、前記本発明の新規タンパク質（新規３－ヒドロキシプロリン脱水酵素）をコードする遺伝子であることから、以下、新規３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子ともいう。前記新規３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子は、本発明の発明者らが新たに同定した遺伝子である。
　本発明の新規３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
　配列番号１７の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１７の塩基配列は、前記配列番号１１のアミノ酸配列からなる本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ａｂ）のコード配列である。配列番号１７のポリヌクレオチド（ｄ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｄａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（ｄ１Ａｂ）のポリヌクレオチド（配列番号１７）
ATGAAAATTACCCGATCCCTTTCCACCGTCGAAGTCCACACCGGCGGCGAAGCGTTCCGCATCGTCACGAGCGGGCTGCCGCGCGCGCCCGGCGACACGATCGTCCAGCGCCGCGCGTGGCTCAAGGAAAACGCCGACGAGATCCGCCGCGCGCTGATGTTCGAACCGCGCGGCCACGCCGACATGTACGGCGGCTACCTGACCGAGCCCGTGTCGCCGAACGCGGATTTCGGCGTGATCTTCGTGCACAACGAAGGCTACAGCGACCATTGCGGGCACGGCGTGATCGCGCTGTCGACCGCGGCCGTCGAGCTCGGCTGGGTGCAGCGCACGGTACCGGAAACGCGGGTCGGCATCGATGCGCCGTGCGGCTTCATCGAAGCGTTCGTCAAGTGGGACGGCGAGCATGCGGGACCGGTGCGCTTCGTCAACGTGCCGTCGTTCATCTGGCAGCGCGACGTGTCGGTCGAGACGCCGTCGTTCGGCACCGTGACCGGCGACATCGCGTACGGCGGCGCGTTCTACTTCTACGTCGACGGTGCGCCGTTCGACCTGCCGGTGCGCGAAGCGGCGGTGGAAAAGCTGATCCGTTTCGGCGCGGAAGTGAAGGCCGCCGCGAACGCGAAGTACCCGGTCGTGCATCCGGAGATCCCGGAAATCAACCATATCTACGGCACGATCATCGCGAATGCGCCGCGCCACCCGGGCTCGACGCAGGCGAACTGCTGCGTGTTCGCGGATCGCGAGGTCGACCGCTCGCCGACCGGTTCCGGCACCGGCGGCCGGGTCGCGCAGCTCTACCAGCGCGGGCTGCTCGCGGCGGGCGACACGCTCGTCAACGAATCGATCGTCGGCACGGTCTTCAAGGGGCGCGTGCTGCGCGAAACGACGGTCGGCGACATCCCGGCCGTGATTCCGGAAGTGGAAGGCAGCGCGCATATCTGCGGGTTCGCGAACTGGATCGTCGACGAGCGCGATCCGCTGACCTACGGTTTTCTCGTGCGCTGA
　前記（ｄ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ２Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
　前記（ｄ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｄ３Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ３Ａｂ）の同一性は、前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記（ｄ４Ａｂ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｄ１Ａｂ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｄｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｄｉｎｇ　Ｈａｄｂｏｄ　Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ　Ｐｄｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｄ４Ａｂ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｄｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｄｉｎｇ　Ｈａｄｂｏｄ　Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ　Ｐｄｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
　前記（ｄ６Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ６Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ６Ａｂ）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　前記（ｄ７Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｄ７Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ７Ａｂ）の同一性は、前記配列番号１１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
＜３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子＞
　本発明の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、前述のように、下記（ｄ１）～（ｄ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｄ１）配列番号１８および１９の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）前記（ｄ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ５）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ６）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ７）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　前記３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子は、本発明の発明者らが新たに同定した３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である。
　本発明の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
　前記（ｄ１）において配列番号１８の場合、前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）、（ｄ６）および（ｄ７）は、それぞれ、（ｄ１Ｃｐ）、（ｄ２Ｃｐ）、（ｄ３Ｃｐ）、（ｄ４Ｃｐ）、（ｄ５Ｃｐ）、（ｄ６Ｃｐ）および（ｄ７Ｃｐ）ともいう。前記（ｄ１）において配列番号１９の場合、、前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）、（ｄ６）および（ｄ７）は、それぞれ、（ｄ１Ｔｌ）、（ｄ２Ｔｌ）、（ｄ３Ｔｌ）、（ｄ４Ｔｌ）、（ｄ５Ｔｌ）、（ｄ６Ｔｌ）および（ｄ７Ｔｌ）ともいう。
　前記（ｄ１ｃｐ）における配列番号１８の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１８の塩基配列は、前記配列番号９のアミノ酸配列からなる本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ｃｐ）のコード配列である。配列番号１８のポリヌクレオチド（ｄ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ_１４５３で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１８）があげられる。
（ｄ１Ｃｐ）のポリヌクレオチド（配列番号１８）
ATGACAAAAAATATAGCGCAAGCAGCTGTAAAATTTGAACAATGGCAGCCAAAAATTGAGCAAGAAAGTTATTTAACCATTAATTCCCTTGAGTGCCATACCGGTGGTGAGCCATTGCGTATTATCACCAGTGGTTTTCCTGTATTAAAAGGCAATACCATTTTGGCAAAAGCAAATGATTGTAAGCAAAACTATGATCAACTTCGTCGAGCATTGATGTTTGAGCCTCGGGGGCATGCTGATATGTATGGCGCTATTATTACTGACGCTGAGCGAGACGATAGCCACTTTGGTGCTGTGTTTATTCATAACGAAGGTTATAGCAGTATGTGTGGTCATGCAGTTATAGCTTTGACAAAAACTGCGGTAGAGTCAGGTGTAGTTGCCAGAACAGGCGATGTTACTCAAGTTGTTATCGATGTACCTTGTGGACAGATTTACGCAATGGCTTATAGCCACAATAATGTAGTGAAACACGTTAGCTTTCAATGCGTACCTTCATTTGTTTATGCCAAAGATCAACAGGTTGAGGTTGATGGCATTGGCATGGTTCAGTTTGATATTGCTTACGGTGGTGCTTTTTATGCTTATGTACAAGCCTCTTCTCTTGGTTTGTCATTGGTGCCTGAGCAACAAGAAAAGCTCATAGCGTATGGCCGAAAAATCAAACAAGCCATTATTCCTCAGTTTGAAATTAATCATCCAACGACCGCAGAATTGAGTTTTTTATATGGCGTTATTTTTATTGATGACTCACCGAATCAAGATGTGCATTCACGCAATGTCTGTATTTTTGCTGATGGCGAATTAGATAGGAGTCCTACTGGCAGTGGGGTTAGTGGACGTATCGCTTTGCATCATGCCAAACAGCAAATAGTTTTAAATGAAACGATTACCATAGAGAGCATTTTAGCGAGTTCGTTTAGTGTCCGAGCTATTGAAACAGTATGCTTTGCCGGTTTTGATGCGGTGATTCCTGAGGTAACAGGCGATGCCTATGTCTGTGGTAAAGGCCAGTGGTTTATTAACGCTGAAGATCCGTTGAAATATGGTTTTTTATTAAGATAA
　前記（ｄ１Ｔｌ）における配列番号１９の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１９の塩基配列は、前記配列番号１２のアミノ酸配列からなる本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ｔｌ）のコード配列である。配列番号１９のポリヌクレオチド（ｄ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＯＣＣ_００３８で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１９）があげられる。
（ｄ１Ｔｌ）のポリヌクレオチド（配列番号１９）
ATGTTCAAAAAACTTGAGAACTTAGAGAAATGGGAACCCCCAAAAGATTGGATGGTAATTAAAACTCTCGATACTCACACTGCTGGAGAACCACTAAGGATAATCTTAAGCGGTTTCCCAGAGATTCCCGGAAAAACAATACTAGAAAAGAGGCGCTATCTCATGGAAAACCTAGATCACCTTAGAAAAGCCCTAATGTGGGAGCCAAGAGGACATGCAGATATGTATGGGGCAATAATAACGGAACCTGTTAGTGAAGAAGCAGACTTCGGCGTAATATTCATGCACAACGAAGGTTATAGTACAATGTGTGGTCATGCGACCATAGCCCTTGGAAAAGTTGCTGTGGAGTGCGGGCTTGTTGAAGCTAAAGAACCAATAACCGAGATAAAGATGGACAGCCCAGCTGGTCTAATCAAGATTTACGTTAAGGTTAGGGATGGAAAAGTGGAGAAAGTTTACTTCCACAACGTGCCATCTTTTGTTCTTTTCAAAGATGAAACTATCAACGTTCCAGGAATAGGGGAAGTTAAATACGATCTTGCCTATGGGGGAGCGTTCTACGCATTCGTGAATGCTGAAGAGATTGGATTAAAGTGCACTCCAGAATATTACAGGCAACTCATTGACGTCGGCATGAAAATTAAAAGAGCTATAATGTCCGAAAAAGAAATAAGGCACCCATTTGAGGAGGATTTAAGCTTTCTGTATGGGACGATATTCATAGGAGAGCCGGAAGATGAGAACTCTCACAGCAGGCATGTTTGCATATTCGCCGATGGTGAAGTTGATAGAAGTCCAACGGGAACCGGCGTAAGTGCAAGGCTTGCAATCCTCTATGAAAAAGGAGAAATCGACATAGGAGAAGAGATAACAATCGAGAGCATAATCGGCACAAAGTTCACCGGAAAAGTTGTTGAAGAGACAAGATACGGCCTTTACAGGGCAATAATCCCTGAAGTTGGAGGAAACGCCTACATAGTGGCTAAGAATACCTTTTTAATCGACCCCCAAGATCCACTCAAGTACGGATTTTTCTTAAGATGA
　前記（ｄ２）～（ｄ７）の説明は、前記本発明の新規３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子の説明において、「（ｄ２Ａｂ）」を「（ｄ２）」に、「（ｄ３Ａｂ）」を「（ｄ３）」に、「（ｄ４Ａｂ）」を「（ｄ４）」に、「（ｄ５Ａｂ）」を「（ｄ５）」に、「（ｄ６Ａｂ）」を「（ｄ６）」に、「（ｄ７Ａｂ）」を「（ｄ７）」に、「配列番号１１」を「配列番号９および１２の少なくとも一方」に読み替えて援用できる。
　本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
＜３－ヒドロキシプロリン脱水酵素の発現ベクター＞
　本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターは、前記本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドおよび前記本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドの少なくとも一方（以下、「本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」ともいう。）を含むことを特徴とする。本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターによれば、例えば、前記３－ヒドロキシプロリン脱水酵素の発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素および前記本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方を容易に製造できる。
　本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターの説明は、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターの説明において、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクター」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクター」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素」に読み替えて援用できる。
＜３－ヒドロキシプロリン脱水酵素の製造方法＞
　本発明の新規タンパク質（新規３－Ｈｙｐ脱水酵素）の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、新規３－Ｈｙｐ脱水酵素を発現する細菌等を公知の手段で培養し、新規３－Ｈｙｐ脱水酵素を産生させることにより製造してもよい。前者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の新規遺伝子（新規３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子）を発現させる工程を有する。後者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、新規３－Ｈｙｐ脱水酵素を発現する細菌を培養し、新規３－Ｈｙｐ脱水酵素を産生させる工程を有する。これによって、前記本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素を製造できる。
　本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法の説明は、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法の説明において、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクター」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクター」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子の少なくとも一方」を「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方」を「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素」に読み替えて援用できる。
　また、本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法は、特に制限されない。本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法は、前記本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法の説明において、「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素」に、「新規３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」を「３－Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」に読み替えて援用できる。
＜３－ヒドロキシプロリンの分析試薬＞
　本発明の分析試薬は、３－ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする。
　本発明の分析試薬によれば、前記本発明の３－ヒドロキシプロリンの分析方法を、より簡便に行うことができる。本発明の分析試薬は、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。前記３－Ｈｙｐ脱水酵素および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、前述の通りである。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方であることが好ましい。また、前記３－Ｈｙｐ脱水酵素は、前記本発明の新規３－Ｈｙｐ脱水酵素および前記本発明の３－Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方であることが好ましい。
　本発明の分析試薬は、例えば、さらに、前記本発明の分析方法において使用できる成分を備えてもよい。前記成分は、例えば、前述のような、緩衝液、基質等があげられる。前記基質は、特に制限されず、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
　本発明の分析試薬は、例えば、一つの容器に各成分が収容されてもよいし、複数の容器に各成分が別個に収容されてもよい。後者の場合、本発明の分析試薬は、例えば、分析用キットともいう。本発明の分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。また、本発明の分析方法において、前記（ｓ４）工程における「相関関係」を準備するための、前記３－ヒドロキシプロリンの標準試料を備えてもよい。
＜コラーゲンの測定試薬＞
　本発明の測定試薬は、コラーゲンの測定試薬であって、３－ヒドロキシプロリンの分析試薬を含み、前記分析試薬が、前記本発明の分析試薬であることを特徴とする。
　本発明の測定試薬を用いれば、前記本発明のコラーゲンの測定方法を、より簡便に行うことができる。本発明の測定試薬は、前記本発明の分析試薬を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。本発明の測定試薬は、例えば、測定用キットともいう。本発明の測定用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。
　次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
［実施例１］
　本例では、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（Ｃ１４ｏｒｆ１４９）およびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＰａＬｈｐＤ）を使用し、３－ヒドロキシプロリンの測定を行った。
（１）発現ベクターの構築
　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）をコードするＣ１４ｏｒｆ１４９　ｃＤＮＡ（配列番号５）は、理研バイオリソースセンターより取得した。また、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰａＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号２）をコードするＰａＬｈｐＤ　ｃＤＮＡ（配列番号６）を増幅した。
Ｃ１４ｏｒｆ１４９　ｃＤＮＡ（配列番号５）
ATGGAGAGCGCGCTGGCGGTGCCCCGGCTGCCCCCGCATGATCCAGGGACGCCGGTGCTGTCGGTGGTGGACATGCACACGGGCGGCGAGCCCTTGCGTATCGTGCTGGCGGGGTGTCCGGAGGTGTCTGGGCCCACCCTGCTGGCCAAGCGGCGCTACATGCGCCAGCACCTTGACCACGTGCGGCGACGGCTCATGTTCGAGCCCCGAGGGCACCGGGACATGTACGGGGCGGTCCTAGTCCCGAGCGAGCTGCCGGACGCGCATCTGGGCGTCCTGTTCCTGCACAACGAGGGCTACAGCTCCATGTGCGGCCACGCAGTGCTGGCGCTGGGCCGCTTCGCTTTGGACTTCGGGCTTGTGCCGGCGCCCCCTGCGGGCACCCGCGAGGCCCGCGTCAATATCCACTGCCCCTGCGGGCTGGTGACCGCCTTCGTGGCATGCGAGGACGGCCGCAGCCACGGACCGGTGCGCTTCCACAGCGTCCCGGCCTTCGTGCTGGCCACAGATCTCATGGTGGATGTTCCTGGACATGGAAAGGTGATGGTGGACATTGCATATGGCGGTGCATTTTATGCATTTGTTACTGCTGAAAAGTTAGGACTAGACATTTGTTCTGCAAAGACCAGGGACCTTGTGGATGCAGCGAGTGCAGTGACAGAGGCAGTGAAAGCTCAGTTTAAAATTAATCATCCTGATAGTGAAGACCTTGCCTTTTTATATGGAACTATATTAACAGATGGAAAAGATGCTTATACCAAGGAACCAACCACCAACATTTGTGTTTTTGCAGATGAACAGGTTGACAGAAGTCCCACTGGCTCAGGAGTGACAGCCCGAATTGCCTTACAGTATCACAAAGGGCTTCTGGAACTGAACCAGATGAGAGCCTTCAAAAGCAGTGCAACTGGCTCAGTATTCACAGGGAAAGCTGTGAGGGAAGCGAAATGTGGTGATTTTAAAGCTGTTATAGTGGAAGTATCAGGACAAGCCCATTACACGGGTACAGCAAGCTTTATAATAGAAGATGACGACCCATTGAGGGATGGATTTCTTCTCAAGTGA
ＰａＬｈｐＤ　ｃＤＮＡ（配列番号６）
GTGATCCGAATGACGCTGGACGAGGTCCGCGAGCTGGCCGTGCGCATCCTGCGCCGGCACGCTTTCAGCGAAGCCCATGTACAGGCGGTGGCCGATACCCTGGTGGCGGGGGAGCGTGACGAATGCGCGTCCCACGGTATCTGGCGGTTGCTCGGCTGCATCGCCACCCTGAAGGCCGGCAAGGTATCCGCCGACGCCGAGCCGGAACTGCACGACATCGCTCCCGGCCTGCTGCGGGTCGACGCCCATGGCGGGTTCTCCCAGTGCGCATTCCGGCTGGGGCTGCCGCATCTGCTGGAGAAGGCCCGCAGCCAGGGTATCGCGGCGATGGCGGTGAACCGCTGTGTGCATTTCTCCGCGCTATGGGTTGAGGTCGAGGCACTCACCGAGGCGGGCCTGGTGGCCCTGGCGACCACGCCGAGTCATGCCTGGGTGGCGCCGGCGGGCGGACGCAAGCCGATCTTCGGCACCAACCCGATCGCCTTTGGCTGGCCGCGTCCGGACGGCCCGCCGTTCGTCTTCGACTTCGCCACCAGCGCCGTGGCGCGTGGCGAGATCCAGTTGCACGAACGCGCCGGCAAGCCGATCCCGCTGGGCTGGGGGGTGGACGAGCAGGGCGAGCCGACCACCGATGCCAGCGCCGCGTTGCGAGGCGCCATGCTTACTTTCGGCGGGCACAAGGGCTCGGCCCTGGCGGCGATGGTCGAACTGCTCGCCGGTCCGCTGATCGGCGACCTGACCAGTGCCGAGTCGCTGGCCTACGACGAGGGCAGCCGTTCTTCTCCCTACGGTGGCGAACTGCTGATCGCCATCGATCCGCGGCGCATGCTCGGCGCCTCGGCGGAGGAGCACCTGGCGCGCGCCGAGACGCTGTTCGAAGGCATCGTCGAACAGGGCGCGCGCTTGCCCTCGCAGCGACGCTTCGAAGCGCGCGAACGCAGCGCCAGGGACGGCGTGACGATTCCCGAGGCGTTGCACCGGGAGCTGCTGGCGTTGCTGGAGTGA
　前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９　ｃＤＮＡおよび得られたＰＣＲ産物を、それぞれアンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社製）およびｐＱＥ－８０Ｌベクター（キアゲン社製）に連結した。Ｃ１４ｏｒｆ１４９　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクター、ＰａＬｈｐＤ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＰａＬｈｐＤ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、いずれも発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＤＨ５α株に、前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクターおよび前記ＰａＬｈｐＤ発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）を含有するＬＢ培地を用いて、ＯＤ６００＝０．６程度になるまで３７℃で培養した。前記培地における前記抗生物質濃度は、５０ｍｇ／Ｌとした。前記培養後、さらに、１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを前記培養液に添加し、６時間培養した。ＰａＬｈｐＤの発現の際には、ＩＰＴＧを添加し、前記添加後は、１８℃で培養した。培養した菌体を集菌し、３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌ　イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、超音波破砕した。そして、遠心分離によって上清（無細胞抽出液）を回収して、下記条件のカラムクロマトグラフィーに供して、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「Ｃ１４ｏｒｆ１４９」、前記ＰａＬｈｐＤ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「ＰａＬｈｐＤ」とした。
（カラムクロマトグラフィー）
カラム：Ｎｉ－ＮＴＡ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製)
洗浄用緩衝液：３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌおよび５０ｍｍｏｌ　イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）
溶出用緩衝液：３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌおよび２５０ｍｍｏｌ／Ｌ　イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
　前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図１に示す。図１は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＰａＬｈｐＤの結果である。
　図１に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９について、約４１ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＰａＬｈｐＤについて、約３９ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＣ１４ｏｒｆ１４９の理論値３９６１８．７２Ｄａ、ＰａＬｈｐＤの理論値３６９５０．６１Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。
（４）３－ヒドロキシプロリンの測定
　分光光度計（商品名シマズUV-1800分光光度計、島津GLC）のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９および１μＬ（１μｇ）のＰａＬｈｐＤを添加し、さらに、所定濃度（１、２、４、６、８または１０ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　これらの結果を図２に示す。図２は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図２に示すように、いずれの３－ヒドロキシプロリンの濃度においても、同程度の直線性が得られた。
（５）検量線の作成
　前記（４）の測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロット（検量線）を作成した。
　これらの結果を図３に示す。図３において、横軸は、基質濃度の逆数（１／Ｓ）を示し、縦軸は、反応速度の逆数（１／Ｖ）を示し、各グラフ内の関数は、相関関数を示し、Ｒ２は、相関係数を示す。図３に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤを用いた場合、基質濃度１～１０ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が作成できた。これらの結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤを使用することで、広い濃度範囲について、３－ヒドロキシプロリンの精度に優れる定量が可能であることがわかった。
［実施例２］
　本例では、３－Ｈｙｐ脱水酵素とＰｙｒ２Ｃ還元酵素とを用いた３－ヒドロキシプロリンの分析について、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の添加量、ならびに、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の添加前における３－Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間による影響を確認した。３－Ｈｙｐ脱水酵素として、前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを使用した。
（１）酵素の添加量
　反応液における３－ヒドロキシプロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ/Ｌとし、Ｃ１４ｏｒｆ１４９（Ｈ）およびＰａＬｈｐＤ（Ｄ）の添加量（Ｈ：Ｄ）を、それぞれ、下記条件とした以外は実施例１（４）と同様にして、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
条件（ｉ）　 Ｈ：１０μｇ　　　　　Ｄ：１０μｇ
条件（ii） 　Ｈ：３３．９μｇ　　　Ｄ：１０μｇ
条件（iii）　Ｈ：１０μｇ　　　　　Ｄ：８４μｇ
　これらの結果を、図４に示す。図４は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示し、図中に示した（ｉ）－（iii）は、添加したＣ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤの前記条件を示す。図４に示すように、条件（ｉ）－（iii）のいずれにおいても、吸光度の減少がみられた。中でも、前記条件（ii）および条件（iii）は、前記条件（ｉ）と比較して、吸光度の減少がより速く、また、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、３－Ｈｙｐ脱水酵素またはＰｙｒ２Ｃ還元酵素の量を増やすことにより、反応開始直後でも、３－ヒドロキシプロリンを精度よく測定できることがわかった。
（２）３－Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間
　前記反応セルに、前記表１の組成の反応試薬、Ｃ１４ｏｒｆ１４９　１μＬおよび３－ヒドロキシプロリン　１００μＬを添加し、所定時間（０、１、２、５、１０分）インキュベートした後、ＰａＬｈｐＤ　１μＬを添加した。ＰａＬｈｐＤの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤの添加量は、それぞれ、１０μｇとし、前記反応液における３－ヒドロキシプロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（１）と同様とした。
　これらの結果を図５に示す。図５は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示し、図中の時間は、ＰａＬｈｐＤ添加前における３－Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間（０、１、２、５、１０分）である。
　図５に示すように、インキュベート時間にかかわらず、経時的に吸光度の減少が見られた。中でも、インキュベート時間が５分以上である場合、吸光度の減少がより速く、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、インキュベート０時間であっても、３－ヒドロキシプロリンを精度よく測定でき、インキュベート時間５分以上とすることで、さらに精度を向上できることがわかった。
［実施例３］
　本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＡｂＬｈｐＩ）を精製し、特性を確認した。
（１）発現ベクターの構築
　Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡｂＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１）をコードするＡｂＬｈｐＩ　ｃＤＮＡ（配列番号４）を増幅した。
　得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＡｂＬｈｐＩ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＡｂＬｈｐＩ」とした。
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
　２５μｇの前記無細胞抽出液および１０μｇのＡｂＬｈｐＩについて、１２％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図６に示す。図６は、前記無細胞抽出液および前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図６において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記無細胞抽出液、ＡｂＬｈｐＩの結果である。
　図６に示すように、前記無細胞抽出液およびＡｂＬｈｐＩについて、約３７ＫＤａ付近にバンドが観察された。このバンドの分子量は、ＡｂＬｈｐＩの理論値３３５５５．７３Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＡｂＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。
（４）補酵素特異性
　前記反応セルに、下記表２の組成の反応試薬、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを添加した。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１－ピロリン－２－カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの終濃度を０．０００１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　これらの結果を図７に示す。図７は、前記反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図７に示すように、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨのいずれの場合においても、経時的に吸光度の減少が見られ、優れた直線性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨのいずれも、補酵素として利用できることがわかった。
　また、ＮＡＤＰＨを使用した際のＡｂＬｈｐＩの比活性は、１７１．５ｕｎｉｔ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであり、ＮＡＤＨを使用した際のＡｂＬｈｐＩの比活性は、１２６．２ｕｎｉｔ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。そして、前記実施例１で使用したＰａＬｈｐＤは、ＮＡＤＨを使用した際の比活性が１８．６ｕｎｉｔ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであることから、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤに対し、約１０倍高い比活性を示すことがわかった。このことから、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としてＡｐＬｈｐＩを使用することで、使用する酵素のタンパク質量を低減することが可能といえる。
（５）基質特異性
　前記反応セルに、下記表３の組成の反応試薬、１μＬ（２０μｇ）ＡｂＬｈｐＩおよびＮＡＤＰ＋を添加し、さらに、下記基質を添加した。基質の添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、ＡｂＬｈｐＩのＬ－プロリンに対する比活性を１００％として、その他の基質に対する相対活性を算出した。前記反応液において、ＮＡＤＰ＋の終濃度は０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌとし、基質の終濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌとした。また、ＡｂＬｈｐＩに代えて、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを添加した以外は同様にして、ＰａＬｈｐＤの基質に対する相対活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（基質）
Ｌ－プロリン、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、シス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、トランス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、トランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン、Ｄ－プロリン、シス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン
　これらの結果を図８に示す。図８は、ＡｂＬｈｐＩおよびＰａＬｈｐＤの基質特異性を示すグラフである。図８において、横軸は、基質を示し、縦軸は、相対的活性を示す。図８に示すように、ＰａＬｈｐＤは、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、シス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンに対し、弱い活性を示し、また、Ｌ－プロリンに対し、強い活性を示した。また、ＡｂＬｈｐＩは、Ｌ－プロリン以外のプロリンアナログに対し、活性を示さなかった。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩおよびＰａＬｈｐＤは、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化し、Ｌ－プロリンを生成するＰｙｒ２Ｃ還元酵素であることがわかった。また、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤと比較して、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンに対する活性が弱いことから、３－ヒドロキシプロリンの分析に、より適していることがわかった。
［実施例４］
　本例では、３－Ｈｙｐ脱水酵素として前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを使用し、３－ヒドロキシプロリンを測定した。
　３－ヒドロキシプロリンの測定は、ＡｂＬｈｐＩを用い、３－ヒドロキシプロリン添加後に５分間インキュベートしてから測定を開始した以外は、前記実施例１（４）と同様にして、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。ＡｂＬｈｐＩの添加量は、１μＬ（０．４μｇ）とした。また、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として、実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを使用し、添加量を１μＬ（１０μｇ）とした以外は同様に測定した。
　これらの結果を図９に示す。図９は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、測定時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図９において、測定時間は、５分間のインキュベートが終了した時点を基準としたときの時間である。図９に示すように、ＡｂＬｈｐＩ（ＬｈｐＩ）を用いた場合、経時的に吸光度の減少が見られ、優れた直線性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩを用いることで、優れた精度で３－ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。また、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤ（ＬｈｐＤ）よりも、吸光度の減少がより速く、また測定開始０－６０秒の間においても優れた直線性を示した。これらの結果から、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の中でもＡｂＬｈｐＩが極めて優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示し、その直線性から、３－ヒドロキシプロリンの分析に適していることがわかった。
［実施例５］
　本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株を培養して、無細胞抽出液を調製し、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を測定した。
　Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株ついて、好気条件下、３０℃で振とう培養を行った。培地は、１Ｌあたり、０．８ｇ　ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、２ｇ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００２ｇ　ＦｅＳＯ４、０．０８０ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび３７ｍｍｏｌ／Ｌの炭素源を含む最小培地（ｐＨ６．８）を使用した。前記炭素源は、グルコース、Ｌ－プロリン、Ｄ－プロリン、シス－Ｌ－ヒドロキシプロリン（Ｌ－Ｈｙｐ）、シス－Ｄ－ヒドロキシプロリン（Ｄ－Ｈｙｐ）、３－ヒドロキシプロリン（３－Ｌ－Ｈｙｐ）またはＤ－リジン（Ｄ－Ｌｙｓ）を使用した。そして、遠心分離（３００００×ｇ、２０分）により培養細胞を回収し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉs－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁して、超音波破砕した。そして、前記懸濁液を遠心分離して上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。なお、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の安定化のため、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌには、１％（ｖ／ｖ）となるようにＴｗｅｅｎ－２０を添加した。
　そして、前記各培地を使用して調製した無細胞抽出液について、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を確認した。３－Ｈｙｐ脱水酵素活性の測定については、リコンビナントタンパク質に代えて、前記無細胞抽出液を用いた以外は前記実施例２（１）と同様に測定した。
　また、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性の測定については、前記反応セルに、９００μＬの１ｍｍｏｌ／Ｌ　Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および前記無細胞抽出液を添加し、さらに、１００μＬの０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨを添加し、３０℃の条件下でインキュベートした。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定し、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性とした。そして、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素について、１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
　これらの結果を図１０に示す。図１０において、（Ａ）は、無細胞抽出液における３－Ｈｙｐ脱水酵素の活性を示すグラフであり、（Ｂ）は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の活性を示すグラフである。図１０において、横軸は、炭素源を示し、縦軸は、比活性を示す。図１０（Ａ）に示すように、Ｄ－プロリン、３－ヒドロキシプロリンおよびＤ－リジンを炭素源として用いた場合、３－Ｈｙｐ脱水酵素活性が高かった。また、図１０（Ｂ）に示すように、Ｄ－プロリン、シス－Ｌ－ヒドロキシプロリン、シス－Ｄ－ヒドロキシプロリン、３－ヒドロキシプロリンおよびＤ－リジンを炭素源として用いた場合、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性が高かった。これらの結果から、Ｄ－プロリン、シス－Ｌ－ヒドロキシプロリン、シス－Ｄ－ヒドロキシプロリン、３－ヒドロキシプロリンおよびＤ－リジンを炭素源とし、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株を培養することで、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の高い発現を誘導できることがわかった。また、中でも、Ｄ－プロリン、３－ヒドロキシプロリンおよびＤ－リジンを炭素源とし、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株を培養することで、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の高い発現を誘導できることがわかった。
［実施例６］
　本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（ＡｂＬｈｐＨ）、ならびにＣｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＣｐＬｈｐＩ）および３－Ｈｙｐ脱水酵素（ＣｐＬｈｐＨ）を精製した。また、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨ、および前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９の３－Ｈｙｐ脱水酵素活性、ならびにＣｐＬｈｐＩ、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を比較した。
（１）発現ベクターの構築
　Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ　ＡＴＣＣ２９１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ａｂ３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号１１）をコードするＡｂＬｈｐＨ　ｃＤＮＡ（配列番号１７）を増幅した。また、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ　３４Ｈ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣｐＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１３）をコードするＣｐＬｈｐＩ　ｃＤＮＡ（配列番号１５）およびＣｐ３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号９）をコードするＣｐＬｈｐＨ　ｃＤＮＡ（配列番号１８）を増幅した。
　得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＡｂＬｈｐＨ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＡｂＬｈｐＨ発現ベクター、ＣｐＬｈｐＩ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＣｐＬｈｐＩ発現ベクター、ＣｐＬｈｐＨ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＡｂＬｈｐＨ発現ベクター、前記ＣｐＬｈｐＩ発現ベクターまたは前記ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＡｂＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＡｂＬｈｐＨ」、前記ＣｐＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＣｐＬｈｐＩ」、前記ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＣｐＬｈｐＨ」とした。
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
　前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図１１に示す。図１１は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１１において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐIの結果である。
　図１１に示すように、ＡｂＬｈｐＨについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＣｐＬｈｐＨについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＣｐＬｈｐＩについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＡｂＬｈｐＨの理論値３７８０５．８７Ｄａ、ＣｐＬｈｐＨの理論値４０４３７．１５Ｄａ、ＣｐＬｈｐＩの理論値３６１８１．７６Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。
（４）３－Ｈｙｐ脱水酵素の酵素活性の比較
　分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、および１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨまたはＣｐＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　そして、得られた測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロットを作成した。そして、前記ラインウィンバー・バークプロットから、各酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）および速度定数（Ｋｃａｔ）を算出した。そして、ＫｍおよびＫｃａｔから、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。
　また、得られた測定結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
　これらの結果を図１２に示す。図１２は、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。図１２において、横軸は、３－Ｈｙｐ脱水酵素の種類を示し、縦軸は、比活性またはＫｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１２において、白色のバーは、比活性を示し、黒色のバーは、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１２に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、格段に優れた比活性を示した。また、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値においては、ＡｂＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、より高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。さらに、ＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＡｂＬｈｐＨと比較して、さらに高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、高い３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有することが分かった。また、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、高い３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を有することから、より少量のタンパク質量を使用した場合においても、３－ヒドロキシプロリンを測定できることが分かった。
（５）Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の酵素活性の比較
　前記反応セルに、下記表４の組成の反応試薬、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸、および１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加し、さらに、ＮＡＤＰＨを添加した。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１－ピロリン－２－カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。なお、ＰａＬｈｐＤは、ｐＨ７．０の条件下で、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩは、ｐＨ６．５の条件下で測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　そして、得られた測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロットを作成した。そして、前記ラインウィンバー・バークプロットから、各酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）および速度定数（Ｋｃａｔ）を算出した。そして、ＫｍおよびＫｃａｔから、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。
　また、得られた測定結果から、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
　これらの結果を図１３に示す。図１３は、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。図１３において、横軸は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の種類を示し、縦軸は、比活性またはＫｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１３において、白色のバーは、比活性を示し、黒色のバーは、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１３に示すように、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、格段に優れた比活性を示した。また、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値においても、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、より高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、高いＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有することが分かった。また、ＡｂＬｈｐＩは、高いＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有することから、より少量のタンパク質量を使用した場合においても、３－ヒドロキシプロリンを測定できることが分かった。
［実施例７］
　本例では、前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、前記実施例６（１）のＡｂＬｈｐＨ、および前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＨの至適ｐＨを確認した。また、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤ、前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩおよび前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＩの至適ｐＨを確認した。
（１）３－Ｈｙｐ脱水酵素の至適ｐＨ
　分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表５の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、および１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨまたはＣｐＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、各種バッファーは、酢酸ナトリウムバッファー（酢酸バッファー）、リン酸カリウムバッファー（リン酸バッファー）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、またはグリシン－ＮａＯＨを使用した。また、前記酢酸バッファーのｐＨは、ｐＨ４、４．５、５、５．５または６とし、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ６、６．５、７、７．５、８または８．５とし、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのｐＨは、７、７．５、８、８．５または９とし、前記グリシン－ＮａＯＨのｐＨは、９、９．５、１０、１０．５または１１とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　そして、得られた測定結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
　これらの結果を図１４に示す。図１４において、（Ａ）は、Ｃ１４ｏｒｆ１４９の結果を示し、（Ｂ）は、ＡｂＬｈｐＨの結果を示し、（Ｃ）は、ＣｐＬｈｐＨの結果を示す。また、図１４において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、比活性を示し、図中の□は、前記酢酸バッファーの結果を示し、○は、リン酸バッファーの結果を示し、△は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの結果を示し、◇は、グリシン－ＮａＯＨの結果を示す。図１４に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、いずれもｐＨが中性付近（ｐＨ７～９）の際に高い比活性を示した。
（２）Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の至適ｐＨ
　前記反応セルに、下記表６の組成の反応試薬、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸またはＬ－プロリン、および１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加した。さらに、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を添加した前記反応セルに、ＮＡＤＰＨを、Ｌ－プロリンを添加した前記反応セルに、ＮＡＤＰ＋を添加した。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰ＋の添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１－ピロリン－２－カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとし、Ｌ－プロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰ＋の終濃度を１．５ｍｍｏｌ／Ｌとした。なお、各種バッファーは、酢酸バッファー、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、またはグリシン－ＮａＯＨを使用した。また、前記酢酸バッファーのｐＨは、ｐＨ５、５．２５、５．５、５．７５または６とし、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５または８．５とし、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのｐＨは、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５または８．７５とし、前記グリシン－ＮａＯＨのｐＨは、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５または１２とした。そして、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸を添加した前記反応セルでは、前記各種バッファーとして、酢酸バッファー、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用し、Ｌ－プロリンを添加した前記反応セルでは、前記各種バッファーとして、グリシン－ＮａＯＨを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　そして、得られた測定結果から、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
　これらの結果を図１５に示す。図１５は、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。図１５において、（Ａ）は、ＰａＬｈｐＤの結果を示し、（Ｂ）は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、（Ｃ）は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。また、図１５において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、比活性を示し、図中の□は、酢酸バッファーの結果を示し、○は、リン酸バッファーの結果を示し、△は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの結果を示し、◇は、グリシン－ＮａＯＨの結果を示す。図１５に示すように、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩは、いずれもｐＨが中性付近（ｐＨ６～７）およびアルカリ性付近（ｐＨ１０～１１）の際に高い比活性を示した。
［実施例８］
　本例では、３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を組合せて、３－ヒドロキシプロリンの測定能を比較した。
　分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、下記条件（ｉ）～（ｖ）の３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
条件（ｉ） 　　　　ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ　　　ＡｂＬｈｐＩ：１μｇ
条件（ii） 　　　　ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ　　　ＣｐＬｈｐＩ：１０μｇ
条件（iii）　Ｃ１４ｏｒｆ１４９：１０μｇ　　　ＰａＬｈｐＤ：１０μｇ
条件（iv） 　　　　ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ　　　ＰａＬｈｐＤ：１０μｇ
条件（ｖ） 　Ｃ１４ｏｒｆ１４９：１０μｇ　　　ＡｂＬｈｐＩ：１０μｇ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　この結果を図１６に示す。図１６は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、測定時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図１６に示すように、条件（ii）、条件（ｉ）、条件（iv）、条件（ｖ）および条件（iii）の順番で、吸光度の減少がより速かった。また、条件（ｉ）は、１／１０の量のＰｙｒ２Ｃ還元酵素を使用した際にも、条件（ii）と同等の吸光度の減少を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを組合せることで、少ない３－Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量で、３－ヒドロキシプロリンをより精度よく測定できることがわかった。
［実施例９］
　本例では、前記実施例６（１）ＡｂＬｈｐＨおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを組合せた際の至適ｐＨを確認した。
　分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表５の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、各種バッファーは、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用した。また、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ７、７．５または８とし、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのｐＨは、ｐＨ７．５、８、８．５または９とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　そして、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用したときの吸光度を１００％とし、前記各種バッファーの各ｐＨにおける相対活性を算出した。
　この結果を図１７に示す。図１７は、相対活性を示すグラフである。図１７において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、リン酸バッファーの結果を示し、○は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの結果を示す。図１７に示すように、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用した際に、３－ヒドロキシプロリンをより精度よく測定できることがわかった。
［実施例１０］
　本例では、前記実施例６（１）ＡｂＬｈｐＨおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを使用した際に、３－ヒドロキシプロリンが、ＡｂＬｈｐＨにより、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水され、さらに、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸が、ＡｂＬｈｐＩにより、Ｌ－プロリンに還元されることを確認した。
　反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。前記反応は、３０℃とし、一晩行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　前記反応後の反応液について、ＨＰＬＣ分析装置（日立高速アミノ酸分析計Ｌ－８９００、日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、分析した。また、コントロールは、ＡｂＬｈｐＩを添加しない以外は同様にして、分析した。さららに、標準試料１として、３－ヒドロキシプロリンを、標準試料２として、Ｌ－プロリンを同様にして、分析した。
　これらの結果を図１８に示す。図１８は、ＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。図１８において、（Ａ）は、標準試料１の結果を示し、（Ｂ）は、コントロールの結果を示し、（Ｃ）は、実施例の結果を示し、（Ｄ）は標準試料２の結果を示す。また、図１８において、横軸は、リテンション時間を示し、縦軸は、電圧を示し、図中の白矢印は、３－ヒドロキシプロリンのピークを示し、黒矢印は、Ｌ－プロリンのピークを示す。図１８（Ｂ）に示すように、３－Ｈｙｐ脱水酵素であるＡｂＬｈｐＨのみで処理したコントロールでは、Ｌ－プロリンのピークが見られなくなった。また、図１８（Ｃ）に示すように、３－Ｈｙｐ脱水酵素であるＡｂＬｈｐＨおよびＰｙｒ２Ｃ還元酵素であるＡｂＬｈｐＩで処理した実施例では、黒矢印で示すＬ－プロリンのピークがみられた。これらの結果から、３－ヒドロキシプロリンが、ＡｂＬｈｐＨにより、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水され、さらに、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸が、ＡｂＬｈｐＩにより、Ｌ－プロリンに還元されることがわかった。
［実施例１１］
　本例では、３－ヒドロキシプロリンの検量線を作製し、優れた精度で３－ヒドロキシプロリンを定量できることを確認した。
（１）検量線の作製
　分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨおよび１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、所定濃度（０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５または１ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　前記測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロット（検量線）を作成した。
　これらの結果を図１９に示す。図１９において、横軸は、基質濃度の逆数（１／Ｓ）を示し、縦軸は、反応速度の逆数（１／Ｖ）を示し、各グラフ内の関数は、相関関数を示し、Ｒ２は、相関係数を示す。図１９に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを用いた場合、基質濃度０．０５～１ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が作成できた。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、広い濃度範囲について、３－ヒドロキシプロリンの精度に優れる定量が可能であることがわかった。
（２）３－ヒドロキシプロリンの定量
　１００ｍｍｏｌ／Ｌの３－ヒドロキシプロリン標準液を、任意に希釈した希釈サンプルＡ－Ｄを調製した。そして、前記３－ヒドロキシプロリン１００μＬに代えて前記希釈サンプルＡ－Ｄを各１００μＬ使用した以外は、前記（１）と同様にして、反応を行い、吸光度を測定した。そして、測定した吸光度と前記（１）の検量線とから、３－ヒドロキシプロリンの濃度を決定した。他方、前記希釈サンプルＡ－Ｄの３－ヒドロキシプロリンの濃度を、ＨＰＬＣ分析装置により決定した。
　検量線から求めた３－ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３－ヒドロキシプロリンの濃度とを、表７に示す。表７に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、ＨＰＬＣと同程度の精度で３－ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（３）３－ヒドロキシプロリンおよび４－ヒドロキシプロリンの混合物の測定
　１００ｍｍｏｌ／Ｌの３－ヒドロキシプロリン標準液および１００ｍｍｏｌ／Ｌの４－ヒドロキシプロリン標準液を作製した。そして、それぞれを任意に希釈および混合した混合サンプルＡ－Ｄを調製した。そして、前記３－ヒドロキシプロリン１００μＬに代えて前記混合サンプルＡ－Ｄを各１００μＬ使用した以外は、前記（１）と同様にして、反応を行い、吸光度を測定した。そして、測定した吸光度と前記（１）の検量線とから、３－ヒドロキシプロリンの濃度を決定した。他方、前記混合サンプルＡ－Ｄの３－ヒドロキシプロリンの濃度を、ＨＰＬＣ分析装置により決定した。
　この結果を図２０に示す。図２０は、検量線から求めた３－ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３－ヒドロキシプロリンの濃度とを示すグラフである。図２０において、横軸が、前記混合サンプルの種類を示し、縦軸が、３－ヒドロキシプロリンの濃度を示す。また、図中の黒色のバーは、ＨＬＰＣにより測定した３－ヒドロキシプロリンの濃度を示し、白色のバーは、前記検量線から求めた３－ヒドロキシプロリンの濃度を示す。図２０に示すように、混合サンプルＡ－Ｄのいずれにおいても、ＨＰＬＣと同程度の精度で３－ヒドロキシプロリンを測定できた。すなわち、４－ヒドロキシプロリンの共存下においても、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、ＨＰＬＣと同程度の精度で測定できることがわかった。これらのことから、４－ヒドロキシプロリン等が存在する生体試料においても、ＨＰＬＣと同程度の精度で３－ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。
［実施例１２］
　本例では、前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩおよび前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＩの至適温度および熱安定性を確認した。
（１）至適温度
　分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　そして、ＣｐＬｈｐＩを使用し、３０℃でインキュベートしたときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの各温度における相対活性を算出した。
　この結果を図２１に示す。図２１は、相対活性を示すグラフである。図２１において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。図２１に示すように、ＡｂＬｈｐＩは、４５～６０℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。また、ＣｐＬｈｐＩは、１０～３０℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。
（２）温度安定性
　反応セルに前記表１の反応試薬、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加した。そして、前記反応セルを、所定温度（３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０℃）とし、１０分間処理した。前記処理後の反応セルに、さらに、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
　そして、熱処理しなかったときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの各温度における相対活性を算出した。
　この結果を図２２に示す。図２２は、相対活性を示すグラフである。図２２において、横軸は、処理温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。図２２に示すように、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩは、５５℃未満の処理温度において、高い相対活性を維持することがわかった。
［実施例１３］
　本例では、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３由来３－Ｈｙｐ脱水酵素（ＴｌＬｈｐＨ）およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素（ＴｌＬｈｐＩ）を精製した。また、ＴｌＬｈｐＨおよびＴｌＬｈｐＩの化学特性を確認した。
（１）発現ベクターの構築
　Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ　ＤＳＭ　５４７３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｔｌ３－Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号１２）をコードするＴｌＬｈｐＨ　ｃＤＮＡ（配列番号１９）およびＴｌＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１４）をコードするＴｌＬｈｐＩ　ｃＤＮＡ（配列番号１６）を増幅した。
　得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＴｌＬｈｐＨ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＴｌＬｈｐＨ発現ベクター、ＴｌＬｈｐＩ　ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＴｌＬｈｐＨ発現ベクターまたは前記ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＴｌＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＴｌＬｈｐＨ」、前記ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＴｌＬｈｐＩ」とした。
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
　前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図２３に示す。図２３は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２３において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、ＴｌＬｈｐＩ、ＴｌＬｈｐＨの結果である。
　図２３に示すように、ＴｌＬｈｐＨについて、約４５ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＴｌＬｈｐＩについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＴｌＬｈｐＨの理論値４０７８１．０５Ｄａ、ＴｌＬｈｐＩの理論値３６９４３．０１Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＴｌＬｈｐＨおよびＴｌＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。
（４）３－Ｈｙｐ脱水酵素の至適温度
　分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、前記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨまたはＴｌＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
　そして、最大活性を示したときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨまたはＴｌＬｈｐＨの各温度における相対活性を算出した。
　この結果を図２４に示す。図２４は、相対活性を示すグラフである。図２４において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＨの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＨの結果を示し、△は、ＴｌＬｈｐＨの結果を示す。図２４に示すように、ＡｂＬｈｐＨは、３５～４５℃の範囲で、優れた３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。ＣｐＬｈｐＨは、４５～５０℃の範囲で、優れた３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。ＴｌＬｈｐＨは、８０～１００℃の範囲で、優れた３－Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。
（５）ＴｌＬｈｐＩの至適温度
　分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００℃）に保持し、反応セルをセットした。前記反応セルに、下記表３の組成の反応試薬、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸および１μＬ（１０μｇ）のＴｌＬｈｐＩを添加した。さらに、前記反応セルに、ＮＡＤＰＨを添加した。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１－ピロリン－２－カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　そして、８０℃でインキュベートしたしたときの吸光度を１００％とし、各温度における相対活性を算出した。
　この結果を図２５に示す。図２５は、相対活性を示すグラフである。図２５において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示す。図２５に示すように、ＴｌＬｈｐＩは、７０～８５℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。
（６）ＴｌＬｈｐＨの熱安定性
　反応セルに前記表１の反応試薬、および１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＨを添加した。そして、前記反応セルを、１００℃で所定時間（０、０．５、１、２、３、４または５時間）処理した。前記処理後の反応セルに、さらに、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
　そして、０時間処理したときの吸光度を１００％とし、各処理時間における相対活性を算出した。
　この結果を図２６に示す。図２６は、相対活性を示すグラフである。図２６において、横軸は、処理時間を示し、縦軸は、相対活性を示す。図２６に示すように、１００℃で５時間処理しても、２０％を超える相対活性を有していた。これらのことから、ＴｌＬｈｐＨは、極めて耐熱性が高いことが分かった。また、極めて耐熱性が高いことから、例えば、長期保存した場合においても、反応性を維持できることが分かった。
（７）３－ヒドロキシプロリンの測定
　分光光度計のインキュベート温度を所定温度（５０、６０または７０℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＨおよび１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＩを添加し、さらに１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３－ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３－ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　これらの結果を図２７に示す。図２７は、３－ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図２７に示すように、いずれのインキュベートにおいても、直線性が得られた。また、インキュベート温度が高くなるにつれ、吸光度の減少がより速く、また、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、インキュベート温度を高くすることで、反応開始直後でも、３－ヒドロキシプロリンを精度よく測定できることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１３年９月９日に出願された日本出願特願２０１３－１８６６４７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって、簡便に３－ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によって３－ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、医療、食品および美容等の分野において、極めて有用な技術といえる。

Claims (33)

  1. 下記（ｓ１）～（ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中の３－ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
    （ｓ１）３－ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１－ピロリン－２－カルボン酸に脱水する脱水工程
    （ｓ２）Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１－ピロリン－２－カルボン酸を水素化する還元工程
    （ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
  2. 前記（ｓ２）工程のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｔｌ）～（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｒ１Ｔｌ）　配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  3. 前記（ｓ２）工程のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ａｂ）～（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｒ１Ａｂ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  4. 前記（ｓ２）工程のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｃｐ）～（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｒ１Ｃｐ）　配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  5. 前記（ｓ２）工程のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）～（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｒ１Ｐｓ）　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｐｓ）　前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｐｓ）　前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  6. 前記（ｓ１）工程の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｔｌ）～（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
    （Ｄ１Ｔｌ）　配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｔｌ）　前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｔｌ）　前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  7. 前記（ｓ１）工程の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ａｂ）～（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
    （Ｄ１Ａｂ）　配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  8. 前記（ｓ１）工程の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｃｐ）～（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
    （Ｄ１Ｃｐ）　配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｃｐ）　前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｃｐ）　前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  9. 前記（ｓ１）工程の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）～（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
    （Ｄ１Ｈｓ）　配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｈｓ）　前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｈｓ）　前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  10. 下記（Ｓ１）～（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中のコラーゲンの測定方法。
    （Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３－ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
    （Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３－ヒドロキシプロリンの量を、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
    （Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３－ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３－ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程
  11. 前記コラーゲンが、コラーゲンIVである、請求項１０記載の測定方法。
  12. 下記（Ｒ１Ｔｌ）～（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
    （Ｒ１Ｔｌ）　配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｔｌ）　前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  13. 下記（Ｒ１Ａｂ）～（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
    （Ｒ１Ａｂ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ａｂ）　前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  14. 下記（Ｒ１Ｃｐ）～（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素。
    （Ｒ１Ｃｐ）　配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｃｐ）　前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  15. 下記（Ｄ１Ｔｌ）～（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素。
    （Ｄ１Ｔｌ）　配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｔｌ）　前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｔｌ）　前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  16. 下記（Ｄ１Ａｂ）～（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
    （Ｄ１Ａｂ）　配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ａｂ）　前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  17. 下記（Ｄ１Ｃｐ）～（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素。
    （Ｄ１Ｃｐ）　配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｃｐ）　前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｃｐ）　前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  18. ３－ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
    ３－ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、分析試薬。
  19. 前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、請求項１２記載のタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
  20. 前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、請求項１３記載のタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
  21. 前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、請求項１４記載のΔ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素である、請求項１８記載の分析試薬。
  22. 前記Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）～（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
    （Ｒ１Ｐｓ）　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｒ２Ｐｓ）　前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
    （Ｒ３Ｐｓ）　前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
  23. 前記３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１５記載の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
  24. 前記３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１６記載のタンパク質である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
  25. 前記３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１７記載の３－ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
  26. 前記３－ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）～（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
    （Ｄ１Ｈｓ）　配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｄ２Ｈｓ）　前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
    （Ｄ３Ｈｓ）　前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
  27. コラーゲンの測定試薬であって、
    請求項１８から２６のいずれか一項に記載の３－ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする、測定試薬。
  28. 下記（ｒ１Ｔｌ）～（ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子。
    （ｒ１Ｔｌ）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｒ２Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｒ３Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  29. 下記（ｒ１Ａｂ）～（ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
    （ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  30. 下記（ｒ１Ｃｐ）～（ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素遺伝子。
    （ｒ１Ｃｐ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｒ２Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｒ３Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  31. 下記（ｄ１Ｔｌ）～（ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
    （ｄ１Ｔｌ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ２Ｔｌ）前記（ｄ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｄ３Ｔｌ）前記（ｄ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  32. 下記（ｄ１Ａｂ）～（ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
    （ｄ１Ａｂ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ２Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｄ３Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  33. 下記（ｄ１Ｃｐ）～（ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
    （ｄ１Ｃｐ）配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ２Ｃｐ）前記（ｄ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｄ３Ｃｐ）前記（ｄ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３－ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
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