JP2014027921A - Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いるｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素 - Google Patents

Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いるｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素 Download PDF

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Abstract

【課題】簡便なＬ−ヒドロキシプロリンの分析を可能とする新たな分析方法の提供を目的とする。
【解決手段】下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程により、被検試料中のＬ−ヒドロキシプロリンを分析する。
（ｓ１）Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素により、被検試料中のＬ―ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに異性化する異性化工程。
（ｓ２）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素により、前記工程（ｓ１）において得られたＤ−ヒドロキシプロリンを脱水素化する脱水素工程。
（ｓ３）前記工程（ｓ２）の脱水素反応を分析する分析工程。
【選択図】図１

Description

本発明は、酵素を用いたＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いるＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する新規タンパク質に関する。
近年、健康および美容の観点から、食品および化粧品等の分野において、コラーゲンを豊富に含む製品の開発が盛んになっている。このような理由から、コラーゲンを含有する製品、生体由来の組織等について、コラーゲンの定性分析および定量分析は、重要視されている。
試料中のコラーゲンの分析方法としては、コラーゲンに含まれるＬ−ヒドロキシプロリンの含有量を測定することによって、間接的にコラーゲンを測定する方法が一般的である。コラーゲンは、一般的なタンパク質、すなわち非コラーゲンタンパク質を構成する基本アミノ酸には該当しないＬ−ヒドロキシプロリンを、全アミノ酸の約１０％という高い割合で含有している。このため、試料におけるＬ−ヒドロキシプロリンを分析すれば、間接的に、前記試料におけるコラーゲンの分析が可能である。そして、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定は、ＨＰＬＣ分析が汎用されている（特許文献１）。具体的な方法としては、まず、試料に前処理を施し、コラーゲンの分解によりＬ−ヒドロキシプロリンを遊離させる。前処理済みの試料をＨＰＬＣに供し、Ｌ−ヒドロキシプロリンのピーク面積からＬ−ヒドロキシプロリン量を算出する。そして、前記算出値と、コラーゲン１分子あたりのＬ−ヒドロキシプロリン量とから、前記試料のコラーゲン量を求めることができる。
しかしながら、ＨＰＬＣ分析の場合、Ｌ−ヒドロキシプロリンを、基本アミノ酸であるＬ−プロリンから分離しなければならず、また、Ｌ−ヒドロキシプロリンは２級アミンであることから、特殊な展開溶媒で開環する必要がある。また、ＨＰＬＣ分析は、高額な分析カラムおよび機器が必要であり、分析に時間を要するという問題がある。
また、Ｌ−ヒドロキシプロリンは、前述のようなコラーゲンの分析だけでなく、それ自体が、多くのヒト疾患の診断マーカーとなっているため、より簡便な分析方法の開発が望まれている。
特許公表２０１０−５０４５３３
そこで、本発明は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする新たな分析方法、それを用いたコラーゲンの測定方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法は、被検試料中のＬ−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素により、被検試料中のＬ―ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに異性化する異性化工程。
（ｓ２）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたＤ−ヒドロキシプロリンを脱水素化する脱水素工程。
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の脱水素反応を分析する分析工程。
本発明者は、鋭意研究の結果、Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析方法として、酵素を用いる新たな方法を見出した。具体的には、まず、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素によって、Ｌ−ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに変換し、さらに、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素によって、Ｄ−ヒドロキシプロリンの脱水素反応を行う。そして、この脱水素反応を分析することで、酵素的にＬ−ヒドロキシプロリンの分析が可能となるとの知見を得て、本発明を完成するに到った。本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって簡便にＬ−ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によってＬ−ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、食品、美容および医療等の分野において、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明の実施例Ａ２において、Ｄ−ＨｙｐＤＨのザイモグラムアッセイの結果を示す写真である。 図２は、本発明の実施例Ａ２において、Ｄ−ＨｙｐＤＨのコファクターを分析したＵＶ可視吸収スペクトルである。 図３は、本発明の実施例Ａ２において、Ｄ−ＨｙｐＤＨのＨＰＬＣの結果である。 図４は、本発明の実施例Ａ３において、Ｄ−ＨｙｐＤＨによる反応生成物を分析したＨＰＬＣの結果である。 図５は、本発明の実施例Ａ４において、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａおよびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無細胞抽出液のＬ−ＨｙｐＥ活性およびＤ−ＨｙｐＤＨ活性を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例Ａ５において、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａおよびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの無細胞抽出液のザイモグラムアッセイの結果を示す写真である。 図７は、本発明の実施例Ａ６において、Ｄ−ＨｙｐＤＨとＬ−ＨｙｐＥとを併用したＬ−ヒドロキシプロリンの定量を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例Ｂ１において、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｄ−ＨｙｐＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 図９は、本発明の実施例Ｂ３において、Ｄ−ＨｙｐＤＨのコファクターを分析したＵＶ可視吸収スペクトルである。 図１０は、本発明の実施例Ｂ３において、Ｄ−ＨｙｐＤＨのＨＰＬＣの結果である。 図１１は、本発明の実施例Ｂ３において、Ｄ−ＨｙｐＤＨの熱安定性の結果である。 図１２は、本発明の実施例Ｂ３において、Ｄ−ＨｙｐＤＨの基質特異性を示すグラフである。 図１３は、本発明の実施例Ｂ４において、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｌ−ＨｙｐＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 図１４は、本発明の実施例Ｂ５において、Ｄ−ＨｙｐＤＨとＬ−ＨｙｐＥとを併用したＬ−ヒドロキシプロリンの定量を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例Ｂ６において、ｐＨを変えた時のＤ−ＨｙｐＤＨの活性を示すグラフである。 図１６は、本発明の実施例Ｂ７において、Ｄ−ＨｙｐＤＨの添加するタイミングを変えた時のＤ−ＨｙｐＤＨの活性を示すグラフである。 図１７は、比較例Ｂ１において、Ｄ−アミノ酸酸化酵素の添加するタイミングを変えた時のＤ−ＨｙｐＤＨの活性を示すグラフである。 図１８は、本発明の実施例Ｂ８において、Ｄ−ＨｙｐＤＨを用いて作製した検量線を示すグラフである。
＜Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析方法＞
本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法は、前述のように、被検試料中のＬ−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素により、被検試料中のＬ―ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに異性化する異性化工程。
（ｓ２）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたＤ−ヒドロキシプロリンを脱水素化する脱水素工程。
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の脱水素反応を分析する分析工程。
本発明において、以下、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素を、Ｌ−ＨｙｐＥ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を、Ｄ−ＨｙｐＤＨともいう。
本発明において、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの異性化反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属由来等あげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ等があげられる。また、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属は、例えば、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｓｐ．３８３等があげられる。また、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅがあげられ、具体例として、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＡＴＣＣ２９１４５があげられる。
前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素は、例えば、以下のようなものが例示できる。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＬ-ヒドロキシプロリン異性化酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＰＡ１２６８で登録されているアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質があげられ、また、論文（PLoS ONE 2007, 2, e885）を参照できる。また、Ｂ．ｓｐ．３８３由来のＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ.Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｂ１８９４で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｌ−ＨｙｐＥ（配列番号１０）
MQRIRIIDSHTGGEPTRLVIGGFPDLGQGDMAERRRLLGERHDAWRAACILEPRGSDVLVGALLCAPVDPEACAGVIFFNNSGYLGMCGHGTIGLVASLAHLGRIGPGVHRIETPVGEVEATLHEDGSVSVRNVPAYRYRRQVSVEVPGIGRVSGDIAWGGNWFFLVAGHGQRLAGDNLDALTAYTVAVQQALDDQDIRGEDGGAIDHIELFADDPHADSRNFVLCPGKAYDRSPCGTGTSAKLACLAADGKLLPGQPWRQASVIGSQFEGRYEWLDGQPGGPIVPTIRGRAHVSAEATLLLADDDPFAWGIRR
前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素の酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３０℃、ｐＨ８.０の条件下、１分間に１μｍｏｌのＤ−ヒドロキシプロリンを生成する酵素量と定義できる。
Ｌ−ヒドロキシプロリンは、例えば、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（以下、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンともいう）およびトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（以下、トランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンともいう）があげられる。本発明において、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素は、例えば、シス型とトランス型のいずれを基質としてもよく、両方を基質としてもよい。例えば、生体内におけるＬ−ヒドロキシプロリンを分析する場合、前記Ｌ−ヒドロキシプロリンはシス型であるため、シス型を基質とするＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素が好ましい。
本発明において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、Ｄ−ヒドロキシプロリンの脱水素反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属由来があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等があげられる。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、具体例として、ＰＡＯ１株（例えば、Bater, A. J., Venables, W. A., and Thomas, S. (1977) Arch. Microbiol. 112, 287-289、Manoharan, H. T. (1980) J. Biosci. 2, 107-120参照）等があげられ、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａは、具体例として、ＫＴ２４２２株（例えば、Gryder, R. M., and Adams, E. (1969) J. Bacteriol. 97, 292-306参照）等があげられる。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属由来は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｃｅ等があげられる。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｃｅは、具体例として、ＡＴＣＣ２９１４５株等があげられる。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、本発明の新規タンパク質を使用できる。本発明の新規タンパク質については、後述する。
前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の酵素活性は、特に制限されず、例えば、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、３０℃、ｐＨ９.０の条件下、１分間に１μｍｏｌのΔ１−ピロリン−４−ヒドロキシ−２−カルボン酸を生成する酵素量と定義できる。
Ｄ−ヒドロキシプロリンは、例えば、シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン（以下、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンともいう）およびトランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン（以下、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンともいう）があげられる。本発明において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、シス型とトランス型のいずれを基質としてもよく、両方を基質としてもよい。例えば、生体内におけるＬ−ヒドロキシプロリンを分析する場合、前記Ｌ−ヒドロキシプロリンのシス型およびトランス型は、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素（Ｌ−ＨｙｐＥ）によってＤ−ヒドロキシプロリンのトランス型およびシス型にそれぞれ変換される。このため、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、シス型のＤ−ヒドロキシプロリンを基質とするＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が好ましい。
前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素およびＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、粗酵素（非精製酵素）、部分的に精製した部分精製酵素、および、単一に精製した精製酵素のいずれでもよく、好ましくは精製酵素である。
前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が固体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の分析方法に供することが好ましい。また、前記被検試料がタンパク質を含み、前記タンパク質におけるＬ−ヒドロキシプロリンを分析する場合は、例えば、前記タンパク質を分解して前記Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離する前処理を施すことが好ましい。前記Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離する前処理の方法は、特に制限されず、例えば、タンパク質の加水分解処理があげられる。
前記（ｓ１）工程は、前述のように、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素により、被検試料中のＬ―ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに異性化する工程である。前記（ｓ１）工程は、例えば、前記被検試料と前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素との接触により行うことができる。前記接触方法は、特に制限されず、例えば、酵素を用いる一般的な手段が採用でき、具体例として、前記被検試料と前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素とを含む反応系が使用できる。前記反応系において、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、例えば、プレート、容器等の基板、ビーズ、フィルター等、公知の担体が使用できる。前記反応系は、例えば、反応液である。
前記（ｓ１）工程において、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素の使用量は、特に制限されず、例えば、前記被検試料１ｍｌに対して、単位Ｕの場合、０．１〜５０Ｕが好ましく、より好ましくは０．５〜２０Ｕであり、さらに好ましくは１〜１０Ｕであり、また、タンパク質量の場合、０．１〜２５μｇが好ましく、より好ましくは０．５〜１０μｇであり、さらに好ましくは１〜５μｇである。また、例えば、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素の量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
前記（ｓ１）工程において、異性化反応の条件は、特に制限されず、例えば、使用する前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、２５〜３５℃が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃であり、さらに好ましくは３０〜３１℃である。反応時間は、例えば、０.５〜１０分が好ましく、より好ましくは０.５〜５分であり、さらに好ましくは０.５〜１分である。前記反応系のｐＨは、例えば、７．５〜１０．０が好ましく、より好ましくは８．０〜９．５であり、さらに好ましくは８．５〜９．０である。
前記反応系は、前記被検試料および前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素の他に、例えば、溶媒、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素に対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。
つぎに、前記（ｓ２）工程は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたＤ−ヒドロキシプロリンを脱水素化する工程である。前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程で得られたＤ−ヒドロキシプロリンと前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素との接触により行うことができる。本発明において、前記（ｓ１）工程および前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程の後に、前記（ｓ２）工程を行ってもよいし、前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行ってもよい。
前記（ｓ１）工程を行った後に前記（ｓ２）工程を行う場合、前記Ｄ−ヒドロキシプロリンと前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素との接触は、例えば、前記（ｓ１）工程で異性化反応を行った後の前記反応系を、そのまま前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素と接触させてもよいし、前記反応系に処理を施したものを前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素と接触させてもよい。後者の場合、前記処理は、特に制限されず、例えば、前記反応系の濃縮処理、前記反応系からの前記Ｄ−ヒドロキシプロリンの単離処理等でもよい。前記濃縮処理を行った場合、前記反応系の濃縮物と前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素とを接触させればよく、また、前記単離処理を行った場合、単離した前記Ｄ−ヒドロキシプロリンを前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素と接触させればよい。また、前述のように、前記（ｓ１）工程において固定化した前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素を使用した場合、例えば、前記反応系について、液体画分と固形画分とを分離し、前記（ｓ２）工程において、前記液体画分を、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素と接触させることが好ましい。本発明においては、操作が簡便であることから、例えば、前記（ｓ１）工程後の前記反応系または前記反応系の前記液体画分と、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素とを接触させることが好ましい。
前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行う場合、例えば、前記被検試料と前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素と前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素とを含む反応系を用いて、前記反応系中で、Ｌ−ヒドロキシプロリンからＤ−ヒドロキシプロリンへの異性化と、前記Ｄ−ヒドロキシプロリンの脱水素化を行うことができる。
前記反応系において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、前述と同様である。
前記（ｓ２）工程において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の使用量は、特に制限されず、例えば、前記（ｓ１）工程における前記被検試料１ｍｌに対して、単位Ｕの場合、０．１〜５０Ｕが好ましく、より好ましくは０．５〜２０Ｕであり、さらに好ましくは１〜１０Ｕであり、また、タンパク質量の場合、０．１〜２５μｇが好ましく、より好ましくは０．５〜１０μｇであり、さらに好ましくは１〜５μｇである。また、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
前記（ｓ２）工程において、脱水素反応の条件は、特に制限されず、使用する前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、２５〜３５℃が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃であり、さらに好ましくは３０〜３１℃である。反応時間は、例えば、０.５〜１０分が好ましく、より好ましくは０.５〜５分であり、さらに好ましくは０.５〜１分である。反応ｐＨは、例えば、８.０〜９．７５が好ましく、より好ましくは８.５〜９．７５であり、さらに好ましくは９.０〜９．７５である。
前記反応系は、前記Ｄ−ヒドロキシプロリンおよび前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の他に、例えば、溶媒、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の前記還元剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。前記イオン性化合物は、例えば、二価イオンを遊離する化合物等があげられ、前記二価イオンとしては、例えば、マグネシウム等があげられる。
そして、前記（ｓ３）工程は、前記（ｓ２）の脱水素酵素反応を分析する工程である。本発明において、前記分析は、例えば、定性分析、定量分析および半定量分析のいずれでもよい。
前記脱水素酵素反応の分析は、例えば、前記反応により生じるシグナルの検出により行うことができる。前記シグナルは、例えば、前記脱水素酵素反応によりシグナルを生じる基質、または、前記脱水素酵素反応によりシグナルが消失または減少する基質等を併用することが好ましい。
前記基質の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記（ｓ１）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（ｓ２）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（Ｓ２）工程の後であり前記（Ｓ３）工程の前に、前記反応系が基質を含んでもよい。
前記（ｓ３）工程において、前記脱水素酵素反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的分析および電気的分析のいずれでもよい。
光学的分析の場合、例えば、前記脱水素酵素反応によって生じる光学的シグナルを測定する方法があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色、発光もしくは蛍光等のシグナルがあげられ、前記光学的シグナルの測定は、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等の測定により行うことができる。前記（ｓ３）工程において光学的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における脱水素酵素反応において、例えば、前記脱水素酵素反応によって、発色、発光もしくは蛍光を発する基質、発色、発光もしくは蛍光が消失または減少する基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の脱水素酵素反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリンに依存した光学的シグナルの測定を行うことができる。
また、電気的分析の場合、例えば、前記脱水素酵素反応によって生じる電子の授受を、電気的シグナルとして測定する方法があげられる。前記電気的シグナルの測定は、例えば、電流等の電気シグナルの強度を測定する方法があげられる。前記（ｓ３）工程において電気的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における脱水素酵素反応において、例えば、前記脱水素酵素反応によって、電子の授受が可能な基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の脱水素酵素反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Ｄ−ヒドロキシプロリンに依存した電気的シグナルの測定を行うことができる。
前記基質は、特に制限されず、例えば、電子受容体が好ましく、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２，６−ジクロロインドフェノール、フェリシアニド、チロクロムＣ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等があげられ、中でも、ＩＮＴ、ＮＢＴが好ましい。前記基質は、例えば、前記電子受容体と電子輸送中間体とを併用することが好ましく、前記電子輸送中間体は、例えば、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）があげられる。前記電子受容体と前記電子輸送中間体との組合せは、例えば、ＰＭＳとＩＮＴの組合せ、ＰＭＳとＮＢＴの組合せ等が好ましい。
電子受容体として、例えば、ＩＮＴまたはＮＢＴを使用した場合、以下のようなメカニズムによりＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を測定できる。ＩＮＴおよびＮＢＴは、テトラゾリウム塩であり、還元によりホルマザン色素が生成する。このため、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性により、Ｄ-ヒドロキシプロリンが脱水素化され、ＩＮＴまたはＮＢＴが還元されると、ＩＮＴまたはＮＢＴから前記ホルマザン色素が生成される。そこで、前記ホルマザン色素の吸光度を測定することによって、Ｄ−ヒドロキシプロリンの還元、つまり、Ｄ-ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を測定できる。
前記基質の添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記（ｓ２）工程において前記基質が前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素と共存していることが好ましい。また、前記（ｓ２）工程において、前記（ｓ１）工程における反応系を使用する場合、例えば、前記（ｓ１）工程において、その反応系が前記基質を含有してもよい。
本発明は、さらに、下記（ｓ４）工程を有してもよい。
（ｓ４）既知量のＬ−ヒドロキシプロリンを含む標準試料のＬ−ヒドロキシプロリン量と、前記標準試料に対する前記（ｓ１）〜（ｓ３）工程の実行により得られる分析結果との相関関係に基づいて、前記（ｓ３）工程における前記被検試料の分析結果から、前記被検試料中のＤ−ヒドロキシプロリン量を算出する算出工程
本発明において、各工程の順序は、特に制限されず、例えば、以下のような順序が例示できる。各工程を実行する順序は、例えば、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素および／または前記Ｄ−ヒドロシプロリン脱水素酵素による脱水素反応における基質の添加のタイミングによって、適宜、調節できる。
１： （ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）の順序で、処理を行う
２： （ｓ１）および（ｓ２）を並行して行った後、（ｓ３）を行う
３： （ｓ１）を行った後、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
４： （ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
本発明の分析方法について、以下に、光学的分析の一例を示すが、例示であって、本発明は、この方法には制限されない。
まず、被検試料、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン、および、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素に対する基質を含む反応液ｓ１を調製する。前記反応液ｓ１について、例えば、１ｍｌあたりの組成を以下に示す。前記基質は、例えば、ＩＮＴまたはＮＢＴとＰＭＳとの組み合わせがあげられる。
（反応液ｓ１の組成：１ｍｌあたり）
Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素 １〜５μｇまたは１〜１０Ｕ
緩衝液 ５０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ
基質（ＩＮＴまたはＮＢＴ） ０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＭＳ ０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ ９〜９．５
被検試料 １００〜５００μｌ
前記反応液ｓ１をインキュベートして、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素による異性化反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、温度３０〜３５℃、時間０〜１０分間、３〜１０分間である。
つぎに、前記反応液ｓ１に、さらに、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を添加して、脱水素反応の反応液ｓ２を調製する。前記反応液ｓ２について、１ｍｌあたりの前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の濃度は、例えば、１〜５μｇまたは１〜１０Ｕである。なお、本例では、前記反応液ｓ１にＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素に対する基質（ＩＮＴまたはＮＢＴ、およびＰＭＳ）を添加したが、例えば、これらを、前記反応液ｓ１への添加に代えて、前記反応液ｓ２の調製において添加してもよい。
前記反応液ｓ２をインキュベートして、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素による脱水素反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、温度３０〜３５℃、時間０．５〜２分間、０．５〜１分間である。
そして、前記反応液ｓ２について、吸光度測定を行う。前記吸光度の測定波長は、例えば、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の基質の種類に応じて適宜決定でき、具体例として、ＰＭＳおよびＩＮＴを使用した場合、４９０ｎｍがあげられ、ＰＭＳとＮＢＴを使用した場合、５３０ｎｍがあげられる。
他方、既知濃度のＬ−ヒドロキシプロリンを含む複数の標準試料を使用し、同様の条件で、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素による異性化反応および前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素による脱水素反応を行い、吸光度を測定する。そして、前記各標準試料の濃度と、これらに対応する吸光度との相関関係を求める。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。そして、前記被検試料に関する吸光度の測定結果と前記相関関係とから、前記被検試料におけるＬ−ヒドロキシプロリン量を算出する。このように、例えば、前記相関関係を利用することによって、前記被検試料におけるＬ−ヒドロキシプロリンの量を定量できる。
また、本発明の分析方法は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の種類に応じて、例えば、Ｌ−ヒドロキシプロリンの中でも、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを特異的に分析することもできる。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに極めて高い基質特異性を示し且つトランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに極めて低い基質特異性を示すタンパク質（ｃｉｓ）を使用することが好ましい。
他方、トランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを特異的に分析する場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、前記タンパク質（ｃｉｓ）と、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンとトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンの両方に同程度の高い基質特異性を示すタンパク質（ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ）の２種類を使用することが好ましい。この場合、各タンパク質をそれぞれ別個に使用して、前記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を行う。そして、さらに（ｓ５）工程として、前記タンパク質（ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ）を用いた分析結果から、前記タンパク質（ｃｉｓ）を用いた分析結果を差し引くことで、間接的に、トランス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを分析できる。
＜コラーゲンの測定方法＞
本発明のコラーゲンの測定方法は、前述のように、被検試料中のコラーゲンの測定方法であって、下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離したＬ−ヒドロキシプロリンの量を、本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対するＬ−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定したＬ−ヒドロキシプロリン量からコラーゲン量を算出する算出工程
前述のように、被検試料におけるコラーゲンの分析は、被検試料におけるＬ−ヒドロキシプロリンの分析によって、間接的に行うことができる。このため、前述の本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法に利用すれば、従来のＨＰＬＣ法とは異なり、酵素反応を行うのみで、簡便に前記Ｌ−ヒドロキシプロリンを分析し、その分析結果から、間接的に前記被検試料におけるコラーゲンを測定できる。
本発明は、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法により前記被検試料中のＬ−ヒドロキシプロリンを測定することが特徴であって、その他の工程およびその他の条件は、何ら制限されない。
前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、コラーゲンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が個体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の測定方法に供することが好ましい。前記被検試料の具体例としては、例えば、食品、化粧品、医薬品、生体由来の組織等があげられる。
前記（Ｓ１）工程は、被検試料中のコラーゲンから、Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程である。前記コラーゲンから前記Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、前記コラーゲンの加水分解処理があげられる。前記加水分解処理は、例えば、前記被検試料を、酸性条件および加熱条件で処理することにより行える。前記酸性条件への調整は、例えば、前記被検試料への酸の添加により行える。前記酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸等が使用できる。
前記加水分解処理後の処理液は、次工程である前記（Ｓ２）工程に使用できる。前記処理液は、例えば、酸性条件であることから、前記（Ｓ２）工程に適したｐＨに調整しておくことが好ましい。前記ｐＨの調整は、例えば、アルカリ、緩衝液等が使用できる。前記ｐＨは、特に制限されず、前記（Ｓ２）工程、すなわち、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法における前記（ｓ１）工程で示したｐＨがあげられる。
つぎに、前記（Ｓ２）工程は、前記（Ｓ１）工程で遊離したＬ−ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する工程である。前記（Ｓ２）工程は、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法の記載を援用できる。
続いて、前記（Ｓ３）工程は、予め求めた前記コラーゲンに対するＬ−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定したＬ−ヒドロキシプロリン量からコラーゲン量を算出する工程である。
前記コラーゲンに対するＬ−ヒドロキシプロリンの割合係数は、例えば、公知の割合係数があげられる。また、前記割合係数は、例えば、既知量のコラーゲンを含む標準試料のコラーゲン量と、前記標準試料に対する前記（Ｓ１）および（Ｓ２）工程の実行により得られるＬ−ヒドロキシプロリンの量との相関関係であってもよい。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。
＜Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素＞
本発明の新規タンパク質は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、下記βサブユニット（Ｂ１）を含む新規タンパク質（Ｐａ）、下記サブユニット（Ｂ２）を含む新規タンパク質（Ｐｐ）および下記βサブユニット（Ｂ３）を含む新規タンパク質（Ａｂ）があげられる。前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法およびコラーゲンの測定方法には、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、本発明の新規タンパク質を使用することが特に好ましい。
（１）タンパク質（Ｐａ）
本発明の新規タンパク質（Ｐａ）は、下記βサブユニット（Ｂ１）を含むタンパク質である。
（Ｂ１）下記（Ｂ１−１）、（Ｂ１−２）または（Ｂ１−３）のβサブユニット
（Ｂ１−１）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ１−２）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
（Ｂ１−３）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
前記新規タンパク質（Ｐａ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、以下、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ）ともいう。
前記（Ｂ１−１）における配列番号７のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｂ１−１）のタンパク質は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
（Ｂ１−１）βサブユニット：配列番号７
MNAEVIVVGAGIVGSACAHELARRGLDVLVLDSRRGGATAVGMGHLVAMDDNPAELALSDYSTQAWRAWAAELPEDCAYRGCGTLWLAADASELAEAERKRQALQAAGVACRMLGAARLYALEPALRPGLAGALEVSGDGILYAPNAARWLLDQAGPRLRRLYAEVSEVDGSRLRLADGRWLSAEALVLANGIHAGELCAELPIRPKKGHLLITDRYPGTLRHQLVELGYVSSAHASSGTSVAFNAQPRPTGQVFLGSSRQFDTLDPQVEGPVLARMLRRALDYLPGLAGLNAIRAWTGFRAATPDGLPLLGEHPAQPGLWLAVGHEGLGVTTAPGSARLLAAQLFGETPPLDPTPYLPQRFLSSSGSARP
前記（Ｂ１−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ１−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記（Ｂ１−３）において、「同一性」は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ１−３）の「同一性」は、前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記βサブユニット（Ｂ１）は、単独でも、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を示すことから、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１）のみからなるタンパク質でもよいし、前記βサブユニット（Ｂ１）の他に、さらに他のサブユニットを含んでもよい。
前者の場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１）のみからなるホモ１量体〜４量体であり、好ましくはホモ１量体〜２量体である。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）が前記βサブユニットを２分子以上含む場合、各サブユニットが会合していることが好ましい。
また、後者の場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有していればよく、前記βサブユニット（Ｂ１）以外のサブユニットの種類および個数は制限されない。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、ヘテロ３量体〜６量体であり、好ましくはヘテロ３量体〜１２量体である。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）が２分子以上のサブユニットを含む場合、各サブユニットが会合していることが好ましい。
前記後者の場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有していれば、さらに、下記αサブユニット（Ｅ１）および下記γサブユニット（Ｆ１）の少なくとも一方を含んでもよい。
（Ｅ１）下記（Ｅ１−１）、（Ｅ１−２）または（Ｅ１−３）のαサブユニット
（Ｅ１−１）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ１−２）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ１−３）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
（Ｆ１）下記（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）または（Ｆ１−３）のγサブユニット
（Ｆ１−１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ１−２）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ１−３）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
前記（Ｅ１−１）における配列番号３のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｅ１−１）のタンパク質は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
（Ｅ１−１）αサブユニット：配列番号３
MSADYDLLIVGAGPAGLAAALAAAPSGARIALVDDNPAAGGQIWRDGPRASLPPRAHQMRQRLAGQANVEHFPATRVVACGPGRRLLLEDPQRGWQVGYRRLVLCTGARELLLPFPGWTLPGVTGAGGLQALAKGGLPLAGQRLVVAGSGPLLLASAASASQCGARLLRVAEQAPARTLAAFAVRLPRWPGKLWQAAGLFARSYRADSYVLAALGEERLEAVRLREGGRVREIACERLACGFGLVPNVQLGQALGYRLDGPALAVDEWQAGSLPDHYAAGECTGFGGSELALVEGAIAGHAAVDERDAARRLWPRRRRWQGFADTLARHFALRAELRQLAEADTLVCRCEDVPLAALAGHAGWTEAKLHSRCGMGACQGRICGSAAQFLFGWTPPAPRPPFSPARLETLARWQGDAG
前記（Ｅ１−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記αサブユニット（Ｅ１−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｅ１−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｅ１−３）において、「同一性」は、例えば、前記αサブユニット（Ｅ１−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｅ１−３）の「同一性」は、前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（Ｆ１−１）における配列番号５のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｆ１−１）のタンパク質は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
（Ｆ１−１）γサブユニット：配列番号５
MIELFIDRRPLRVAVGTSVAAALALGGDGCSRSAVGGGRRAPFCGMGACQECRVLIDGRRRLACQTVCQSGMRVETQA
前記（Ｆ１−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記γサブユニット（Ｆ１−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ１−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｆ１−３）において、「同一性」は、例えば、前記γサブユニット（Ｆ１−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ１−３）の「同一性」は、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）が、前記βサブユニット（Ｂ１）以外のサブユニットを含む場合、例えば、前記αサブユニット（Ｅ１）および前記γサブユニット（Ｆ１）のいずれか一方でもよいが、両方を含むことが好ましい。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）１分子における、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットの個数の比［α：β：γ］は、例えば、［α１〜４］：［β１〜４］：［γ１〜４］であり、好ましくは、α４β４γ４の１２量体である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）が、前述のように、前記βサブユニット（Ｂ１）と、前記αサブユニット（Ｅ１）および前記γサブユニット（Ｆ１）の少なくとも一方を含む場合、下記（Ｐａ１）〜（Ｐａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることが好ましい。
（Ｐａ１）下記（Ｂ１−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ１−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ１−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
（Ｂ１−１） 配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ１−１） 配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ１−１） 配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐａ２）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｐａ３）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
前記（Ｐａ１）における前記（Ｂ１−１）、前記（Ｅ１−１）および前記（Ｆ１−１）は、前述の通りである。例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の天然Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、前記（Ｐａ１）であり、具体的には、前記（Ｂ１−１）のβサブユニット、前記（Ｅ１−１）のαサブユニットおよび前記（Ｆ１−１）のγサブユニットが会合したα４β４γ４の１２量体である。
前記（Ｐａ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐａ２）のタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ２）において、前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ｐａ１）のアミノ酸配列でもよいし、これを構成するいずれかのサブユニットのアミノ酸配列でもよい。前記（Ｐａ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記（Ｐａ２）のアミノ酸配列は、例えば、前記（Ｂ１−１）のβサブユニット（配列番号７）、前記（Ｅ１−１）のαサブユニット（配列番号３）および前記（Ｆ１−１）のγサブユニット（配列番号５）のいずれか１つのアミノ酸配列、いずれか２つのアミノ酸配列、または３つのアミノ酸配列において、前記１もしくは数個の欠失、置換、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列となってもよい（以下、同様）。
前記（Ｐａ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｐａ３）のタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ３）において、前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ｐａ１）のアミノ酸配列でもよいし、これを構成するいずれかのサブユニットのアミノ酸配列でもよい。前記（Ｐａ３）の「同一性」は、前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記（Ｐａ３）のアミノ酸配列は、例えば、前記（Ｂ１−１）のβサブユニット（配列番号７）、前記（Ｅ１−１）のαサブユニット（配列番号３）および前記（Ｆ１−１）のγサブユニット（配列番号５）のいずれか１つのアミノ酸配列、いずれか２つのアミノ酸配列、または３つのアミノ酸配列が、前記同一性を示すアミノ酸配列となってもよい（以下、同様）。
本発明の新規タンパク質（Ｐａ）は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とする脱水素酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、Ｄ−プロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐａ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．１ｍＭ以下である。
（２）タンパク質（Ｐｐ）
本発明の新規タンパク質（Ｐｐ）は、下記サブユニット（Ｂ２）を含むタンパク質である。
（Ｂ２）下記（Ｂ２−１）、（Ｂ２−２）または（Ｂ２−３）のサブユニット
（Ｂ２−１）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ２−２）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ｂ２−３）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
前記新規タンパク質（Ｐｐ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、以下、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ）ともいう。
前記（Ｂ２−１）における配列番号９のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｂ２−１）のタンパク質は、例えば、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａから得ることができる。
（Ｂ２−１）サブユニット：配列番号９
MVETAETDIAVVGAGIVGVACALQLARQGHRVTLVDRQAPGLGASFGNAGHLATEQVFPIADLSILKRLPRMLLDPMGPLRLDWKYLPKAMPWFTRLLLNLRPAPFQRSVAGIRTLNEGSLGAWQRLLGSIGRSELFQEDGSLLVFEKPESRQALEALRTRMQQQAVPVDFWSAETVREAAPQLSPSLLGGLFFPRTGHFIDPYRVVCELFEAAKASGVRFVQAQVDGGQLHSAGVSLASDQGMLNARQVLVSCGAHSAKLTAALTGKRVPLDTERGYHLMLPGEHQRLPFAVTSLERKFIMTPMAEGLRLAGTVEFAGLQAPPSMQRAWQLHRLSKGLFRHDLSVEGATPWMGFRPSLPDSLPVIDRVCDGRVLLAFGHQHLGLTQAAVTAEWVGRLAEQTGGPEMGAYRLNRF
前記（Ｂ２−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記サブユニット（Ｂ２−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ２−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｂ２−３）において、「同一性」は、例えば、前記サブユニット（Ｂ２−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ２−３）の「同一性」は、前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記サブユニット（Ｂ２）は、単独でも、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を示すことから、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）は、例えば、前記サブユニット（Ｂ２）のみからなるタンパク質でもよいし、前記βサブユニット（Ｂ２）の他に、さらに他のサブユニットを含んでもよい。好ましくは前者であり、前者の場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）は、例えば、前記サブユニット（Ｂ２）のみからなるホモ１量体〜４量体であり、好ましくはホモ１量体〜２量体である。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）が前記サブユニット（Ｂ２）を２分子以上含む場合、各サブユニットが会合していることが好ましい。
本発明の新規タンパク質（Ｐｐ）は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とする脱水素酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、Ｄ−プロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ｐｐ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．１ｍＭ以下である。
（３）タンパク質（Ａｂ）
本発明の新規タンパク質（Ａｂ）は、前述のように、下記βサブユニット（Ｂ３）を含むタンパク質である。
（Ｂ３）下記（Ｂ３−１）、（Ｂ３−２）または（Ｂ３−３）のβサブユニット
（Ｂ３−１）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ３−２）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
（Ｂ３−３）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
前記新規タンパク質（Ａｂ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、以下、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ）ともいう。
前記（Ｂ３−１）における配列番号１７のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｂ３−１）のタンパク質は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（Ｂ３−１）βサブユニット：配列番号１７
MSDTKTDVVVIGAGIVGAACAHELAQRGLRVLVVDDASGGATGAGMGHLVAMDDNAAELALSHYSIELWRALSGEMPEGCAYRNCGTLWLAADAHEMDLARAKQAALAAHGVAGELIDAATLARLEPMLRTGLGGVLKIPGDAILYAPVTANWLLQRAPRITLRRDRAVAVDGPSVTLASGDTLRAERVVVANGVAARALLPELPLRPKKGHLLITDRYPGQVSHQLVELGYAASAHASDGTSVAFNVQPRPTGQLLIGSSRQFDTEDAQVEPPVLARMLRRAVGYLPGLADLNGIRAWTGFRSASPDGLPLLGEHPARPGVWLAVGHEGLGVTTAPGSARLVAALMAGERPPIDIKPYLPGRFLSASLVAGALT*
前記（Ｂ３−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ３−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ３−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｂ３−３）において、「同一性」は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ３−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｂ３−３）の「同一性」は、前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記βサブユニット（Ｂ３）は、単独でも、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を示すことから、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ３）のみからなるタンパク質（Ｂ）でもよい。
この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ３）のみからなるホモ１量体〜４量体であり、好ましくはホモ１量体〜２量体である。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が前記βサブユニットを２分子以上含む場合、各サブユニットが会合していることが好ましい。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が前記βサブユニット（Ｂ３）のみからなるタンパク質の場合、例えば、複数のサブユニットからなる酵素と比較して、より容易な合成が可能であり低分子量であり、酵素の生産コストをより低減できる。
また、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、前記βサブユニット（Ｂ３）の他に、さらに他のサブユニットを含んでもよい。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有しいていればよく、前記βサブユニット（Ｂ３）以外のサブユニットの種類および個数は制限されない。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、ヘテロ３量体〜１２量体であり、好ましくはヘテロ６量体〜１２量体である。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が前記サブユニットを２分子以上含む場合、各サブユニットが会合していることが好ましい。
前記後者の場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有していれば、さらに、下記αサブユニット（Ｅ３）および下記γサブユニット（Ｆ３）の少なくとも一方を含んでもよい。
（Ｅ３）下記（Ｅ３−１）、（Ｅ３−２）または（Ｅ３−３）のαサブユニット
（Ｅ３−１）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ３−２）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ３−３）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
（Ｆ３）下記（Ｆ３−１）、（Ｆ３−２）または（Ｆ３−３）のγサブユニット
（Ｆ３−１）配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ３−２）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ３−３）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
前記（Ｅ３−１）における配列番号１９のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｅ３−１）のタンパク質は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（Ｅ３−１）αサブユニット：配列番号１９
MKQERLSVDVAIVGAGPAGLSAARAAARGGATVAIVDDNPRAGGQIWRQRAAAAPPPAAAERLAVLRQPNVTHLAATRIVAETQPGTLLLEDDERGLLLDFRTLILCCGARELLLPFPGWTLPGVTGAGGLQALIKYGLDVRGQRTVIAGSGPLLLASAATARQAGARVSHVLEQAAWCDVAGFGAGLWRWPSKLAQAAKLVTAAYRPDAHVVEAFGDTRLERVRIRQGDREFDVDCDRLACGFGLVPNTVLPSHLGCRIDNGAVAVDVHQRTSRDGVFAAGECTGVGGSELAMVEGEIAGLAATGQTAPLAALVAQRAHWQAFADAVRARFAIREPIRRLARADTLLCRCEDVRFDAVAQAPGWTAAKLQSRCGMGACQGRVCGAAAQALFGWTPPVPRTPLVPARVGTLMLDGTASCDGA*
前記（Ｅ３−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記αサブユニット（Ｅ３−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｅ３−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｅ３−３）において、「同一性」は、例えば、前記αサブユニット（Ｅ３−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｅ３−３）の「同一性」は、前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（Ｆ３−１）における配列番号２１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｆ３−１）のタンパク質は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
（Ｆ３−１）γサブユニット：配列番号２１
MIIHLDGRALTVADGATVAAAVAASGDDTTRVSCTGAARAPFCGMGICQECRMTIDGRRRLACQTLCRDGMQVERTR*
前記（Ｆ３−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記γサブユニット（Ｆ３−２）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ３−２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｆ３−３）において、「同一性」は、例えば、前記αサブユニット（Ｆ３−３）を含むタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ３−３）の「同一性」は、前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が、前記βサブユニット（Ｂ３）以外のサブユニットを含む場合、例えば、前記αサブユニット（Ｅ３）および前記γサブユニット（Ｆ３）のいずれか一方でもよいが、好ましくは、前記αサブユニット（Ｅ３）を含むタンパク質（ＢＥ）および前記αサブユニット（Ｅ３）と前記γサブユニット（Ｆ３）の両方を含むタンパク質（ＢＥＦ）が好ましい。この場合、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）１分子における、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットの個数の比［α：β：γ］は、例えば、［α１〜４］：［β１〜４］：［γ１〜４］であり、好ましくは、α４β４γ４の１２量体である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が、前述のように、前記βサブユニット（Ｂ３）、前記αサブユニット（Ｅ３）および前記γサブユニット（Ｆ３）を含むタンパク質（ＢＥＦ）の場合、下記（Ａｂ１）〜（Ａｂ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることが好ましい。
（Ａｂ１）下記（Ｂ３−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ３−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ３−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
（Ｂ３−１） 配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ３−１） 配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｆ３−１） 配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａｂ２）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（Ａｂ３）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
前記（Ａｂ１）における前記（Ｂ３−１）、前記（Ｅ３−１）および前記（Ｆ３−１）は、前述の通りである。例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の天然Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、前記（Ａｂ１）であり、具体的には、前記（Ｂ３−１）のβサブユニット、前記（Ｅ３−１）のαサブユニットおよび前記（Ｆ３−１）のγサブユニットが会合したα４β４γ４の１２量体である。
前記（Ａｂ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ａｂ２）のタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ２）において、前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ａｂ１）のアミノ酸配列でもよいし、これを構成するいずれかのサブユニットのアミノ酸配列でもよい。前記（Ａｂ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記（Ａｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、前記（Ｂ３−１）のβサブユニット（配列番号１７）、前記（Ｅ３−１）のαサブユニット（配列番号１９）および前記（Ｆ３−１）のγサブユニット（配列番号２１）のいずれか１つのアミノ酸配列、いずれか２つのアミノ酸配列、または３つのアミノ酸配列において、前記１もしくは数個の欠失、置換、挿入および／または付加を有するアミノ酸配列となってもよい（以下、同様）。
前記（Ａｂ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ａｂ３）のタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ３）において、前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ａｂ１）のアミノ酸配列でもよいし、これを構成するいずれかのサブユニットのアミノ酸配列でもよい。前記（Ａｂ３）の「同一性」は、前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記（Ａｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、前記（Ｂ３−１）のβサブユニット（配列番号１７）、前記（Ｅ３−１）のαサブユニット（配列番号１９）および前記（Ｆ３−１）のγサブユニット（配列番号２１）のいずれか１つのアミノ酸配列、いずれか２つのアミノ酸配列、または３つのアミノ酸配列が、前記同一性を示すアミノ酸配列となってもよい（以下、同様）。
本発明の新規タンパク質（Ａｂ）は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とする脱水素酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、Ｄ−プロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が５０％以下であることが好ましく、より好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３５％以下である。
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは２ｍＭ以下である。
具体例として、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が、サブユニットとして前記βサブユニット（Ｂ３）のみを有するタンパク質（Ｂ）である場合の化学特性を以下に例示する。シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質として相対活性が１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が３％以下であることが好ましく、より好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
前記タンパク質（Ｂ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは２ｍＭ以下である。
前記タンパク質（Ｂ）の熱安定性は、例えば、１５〜３５℃であり、好ましくは１５〜３０℃である。前記熱安定性は、所定温度、ｐＨ８、１０分の条件で、前記タンパク質（Ｂ）を保存した後、保存前の前記タンパク質（Ｂ）の活性を１００％とした場合に、５０％以上の残存活性を示す温度である。この場合、活性測定の条件は、例えば、３０℃、ｐＨ８とする（以下、同様）。
また、具体例として、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が、サブユニットとして前記βサブユニット（Ｂ３）および前記αサブユニット（Ｅ３）のみを有するタンパク質（ＢＥ）である場合の化学特性を以下に例示する。シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質として相対活性が５０％以下であることが好ましく、より好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下であり、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１５％以下であり、さらに好ましくは１０％以下である。
前記タンパク質（ＢＥ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、０．５ｍＭ以下であり、好ましくは０．３ｍＭ以下である。
また、具体例として、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）が、サブユニットとして前記βサブユニット（Ｂ３）、前記αサブユニット（Ｅ３）および前記γサブユニット（Ｆ３）を有するタンパク質（ＢＥＦ）である場合の化学特性を以下に例示する。シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質として相対活性が１５０％以下であることが好ましく、より好ましくは１４０％以下であり、さらに好ましくは１３０％以下であり、Ｄ−プロリンを基質とした相対活性が５０％以下であることが好ましく、より好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下である。
前記タンパク質（ＢＥＦ）は、例えば、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、０．３ｍＭ以下であり、好ましくは０．１ｍＭ以下である。
前記タンパク質（ＢＥＦ）の熱安定性は、例えば、１５〜５５℃であり、好ましくは１５〜５０℃である。
前述のように、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）の中でも、例えば、前記タンパク質（Ｂ）は、相対的に、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに極めて高い基質特異性を示すが、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンには、極めて低い基質特異性しか示さない。また、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素（Ａｂ）の中でも、例えば、前記タンパク質（ＢＥＦ）は、相対的に、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンとトランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに同程度に高い基質特異性を示す。このため、例えば、前記タンパク質（Ｂ）は、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリン分析方法においてＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として例示した前記タンパク質（ｃｉｓ）として使用することができ、また、前記タンパク質（ＢＥＦ）は、前記本発明ののＬ−ヒドロキシプロリン分析方法においてＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として例示したタンパク質（ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ）として使用することができる。
＜Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素遺伝子＞
本発明の新規遺伝子は、前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、前記βサブユニット（Ｂ１）を含むタンパク質（Ｐａ）、前記サブユニット（Ｂ２）を含むタンパク質（Ｐｐ）または前記βサブユニット（Ｂ３）を含むタンパク質（Ａｂ）をコードするポリヌクレオチドがあげられる。本発明の遺伝子は、例えば、前述のような本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
（１）遺伝子（Ｐａ）
本発明の新規遺伝子（Ｐａ）は、前記βサブユニット（Ｂ１）をコードするポリヌクレオチド（ｂ１）を含み、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）は、例えば、下記（ｂ１−１）〜（ｂ１−７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである。
（ｂ１−１）配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ１−２）前記（ｂ１−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１−３）前記（ｂ１−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１−４）前記（ｂ１−１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１−５）前記（ｂ１−１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１−６）前記（ｂ１−１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１−７）前記（ｂ１−１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列番号６の塩基配列は、以下の通りである。配列番号６の塩基配列は、前記βサブユニット（Ｂ１−１）のコード配列である。配列番号６のポリヌクレオチド（ｂ１−１）は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
βサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号６）
GTGAACGCCGAGGTCATCGTGGTCGGCGCCGGCATCGTCGGCAGCGCCTGCGCCCATGAACTGGCGCGTCGCGGCCTCGACGTACTGGTGCTGGACAGCCGCCGCGGCGGTGCCACCGCGGTGGGCATGGGCCATCTGGTGGCGATGGACGACAACCCGGCCGAACTGGCCCTCAGCGACTACTCGACCCAGGCCTGGCGCGCCTGGGCGGCGGAGTTGCCGGAGGATTGCGCCTATCGCGGCTGTGGCACCCTCTGGCTGGCCGCCGATGCCAGCGAACTCGCCGAGGCCGAACGCAAGCGCCAGGCGCTGCAAGCCGCCGGCGTTGCCTGCCGGATGCTTGGCGCCGCGCGCCTGTACGCCCTCGAACCGGCCCTGCGGCCGGGCCTGGCCGGCGCCCTGGAGGTGTCCGGCGACGGCATCCTCTACGCGCCCAACGCCGCGCGCTGGCTGCTCGACCAGGCCGGGCCGCGCCTGCGACGGCTGTACGCCGAAGTCAGCGAAGTGGACGGCAGCCGCCTGCGCCTGGCCGACGGCCGCTGGCTGAGCGCCGAGGCGCTGGTGCTGGCCAACGGCATCCATGCCGGCGAGCTGTGCGCGGAGCTGCCGATCCGCCCGAAGAAAGGCCACCTGCTGATCACCGACCGCTATCCCGGCACCCTCCGCCATCAACTGGTGGAACTCGGCTATGTCAGCAGCGCCCATGCCAGCAGCGGTACCTCGGTAGCCTTCAACGCCCAGCCGCGCCCCACCGGGCAGGTCTTCCTCGGCTCCTCGCGGCAGTTCGACACGCTCGACCCGCAGGTGGAAGGCCCGGTGCTGGCGCGCATGCTGCGGCGTGCCCTGGACTACCTGCCGGGGCTCGCCGGCCTCAATGCGATCCGTGCCTGGACCGGCTTCCGCGCCGCCACTCCGGACGGCCTGCCGCTGCTCGGCGAGCACCCGGCGCAGCCGGGCCTGTGGCTGGCGGTCGGCCACGAGGGCCTGGGCGTGACCACCGCGCCGGGCAGCGCGCGCCTGCTCGCCGCCCAGTTGTTCGGCGAAACGCCGCCGCTGGATCCCACGCCTTATCTGCCGCAACGCTTCCTCTCCAGCTCCGGGAGTGCCCGGCCATGA
前記（ｂ１−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ１−２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ１−２）の「１もしくは数個」は、前記（ｂ１−１）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
前記（ｂ１−３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ１−３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ１−３）の同一性は、前記（ｂ１−１）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（ｂ１−４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｂ１−１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。「ハイブリダイズ」および「ストリンジェントな条件」は、前述の記載を援用できる。
前記（ｂ１−５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｂ１−５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｂ１−５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（Ｂ１−１）のタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、配列番号７のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
前記（ｂ１−６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ１−６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ１−６）の「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（ｂ１−７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｂ１−７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ１−７）の同一性は、前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本発明の新規遺伝子（Ｐａ）は、前述のように、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）を含んでいればよく、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）のみからなる遺伝子でもよいし、さらに、前記βサブユニット（Ｂ１）以外のタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子でもよい。
後者の場合、前記βサブユニット以外のタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記αサブユニット（Ｅ１）をコードするポリヌクレオチド（ｅ１）および前記γサブユニット（Ｆ１）をコードするポリヌクレオチド（ｆ１）の少なくとも一方があげられる。すなわち、本発明の新規遺伝子（Ｐａ）は、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ１）を含んでもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｆ１）を含んでもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｅ１）および（ｆ１）の両方を含んでもよい。本発明の新規遺伝子（Ｐａ）が、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ１）および（ｆ１）の少なくとも一方を含む場合、前記ポリヌクレオチドの順序は、特に制限されず、例えば、５’側から、αサブユニット、γサブユニット、βサブユニットの順である。本発明の新規遺伝子（Ｐａ）において、各ポリヌクレオチドは、コドンの読み枠が前記各サブユニットのアミノ酸配列となればよい。
前記ポリヌクレオチド（ｅ１）および（ｆ１）は、例えば、下記（ｅ１−１）および（ｆ１−１）がそれぞれ例示できる。
（ｅ１−１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ１−１）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
配列番号２および４は、それぞれ以下の通りである。配列番号２のポリヌクレオチド（ｅ１−１）および配列番号４のポリヌクレオチド（ｆ１−１）は、ぞれぞれ、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
αサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号２）
ATGAGCGCCGACTACGACCTGCTGATCGTCGGTGCCGGCCCCGCCGGCCTGGCCGCAGCGCTGGCCGCCGCGCCGAGCGGCGCGCGCATCGCCCTGGTCGACGACAACCCGGCCGCCGGCGGACAGATCTGGCGCGACGGCCCGCGTGCCAGCCTGCCGCCGCGTGCCCATCAGATGCGCCAACGCCTGGCCGGGCAGGCCAATGTCGAGCACTTCCCGGCGACCCGGGTGGTCGCCTGCGGTCCCGGCAGGCGCCTGTTGCTGGAAGACCCGCAACGTGGCTGGCAGGTCGGCTACCGACGCCTGGTCCTCTGCACCGGCGCCCGCGAACTGCTGCTGCCTTTTCCCGGCTGGACCCTCCCCGGCGTCACCGGCGCCGGCGGCCTGCAGGCGTTGGCCAAGGGCGGCCTGCCACTGGCCGGCCAGCGCCTGGTGGTGGCTGGCTCCGGCCCGCTGCTGCTGGCCAGCGCCGCCAGCGCCAGCCAGTGCGGGGCGCGCCTGCTGCGCGTCGCCGAACAGGCGCCGGCGAGAACCCTGGCCGCCTTCGCCGTACGCCTCCCGCGCTGGCCCGGCAAGCTGTGGCAGGCCGCCGGCCTGTTCGCCCGTAGCTACCGCGCCGACAGCTACGTGCTCGCCGCCCTCGGCGAGGAGCGCCTGGAAGCCGTGCGCCTGCGCGAAGGCGGTCGGGTCCGCGAGATCGCCTGCGAACGCCTGGCCTGCGGCTTCGGCCTGGTGCCCAACGTGCAACTCGGCCAGGCCCTCGGCTATCGCCTCGACGGCCCGGCGCTCGCCGTCGACGAATGGCAGGCCGGCAGCCTGCCCGACCACTACGCCGCCGGCGAATGCACCGGCTTCGGCGGCAGCGAACTGGCCCTGGTGGAAGGCGCCATCGCCGGCCATGCCGCCGTCGACGAGCGCGACGCGGCTCGCCGCCTGTGGCCACGACGGCGACGCTGGCAGGGCTTCGCCGACACCCTGGCGCGACACTTCGCCCTGCGTGCCGAACTGCGTCAACTGGCGGAGGCGGATACCCTGGTCTGCCGTTGCGAAGACGTCCCCTTGGCCGCGCTGGCCGGGCATGCCGGCTGGACCGAGGCCAAGCTGCACAGCCGTTGCGGCATGGGCGCCTGCCAGGGGCGGATATGCGGCAGCGCCGCGCAATTCCTGTTCGGCTGGACGCCTCCGGCGCCGCGTCCGCCGTTCAGCCCGGCGCGCCTGGAGACCCTGGCCCGCTGGCAGGGCGACGCCGGCTAG
γサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号４）
ATGATCGAACTGTTCATCGACCGGCGTCCGCTGCGGGTCGCCGTCGGTACCAGCGTGGCGGCCGCCCTCGCCCTCGGCGGCGACGGCTGCTCCCGCAGCGCGGTCGGCGGCGGGCGGCGCGCGCCGTTCTGCGGCATGGGCGCGTGCCAGGAATGCCGGGTATTGATCGACGGTCGGCGACGCCTGGCCTGCCAGACCGTCTGCCAATCCGGCATGCGCGTGGAGACCCAGGCATGA
本発明の新規遺伝子（Ｐａ）が、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ１）および前記ポリヌクレオチド（ｆ１）の少なくとも一方を有する場合、例えば、以下の例があげられる。すなわち、本発明の新規遺伝子（Ｐａ）は、例えば、下記（Ｐａ１’）〜（Ｐａ７’）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドでもよい。
（Ｐａ１’）配列番号６の塩基配列と、配列番号２および４の少なくとも一方の塩基配列とを含むポリヌクレオチド
（Ｐａ２’）前記（Ｐａ１’）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｐａ３’）前記（Ｐａ１’）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｐａ４’）前記（Ｐａ１’）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｐａ５’）前記（Ｐａ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｐａ６’）前記（Ｐａ１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｐａ７’）前記（Ｐａ１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
前記ポリヌクレオチド（Ｐａ１’）は、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１−１）、前記αサブユニット（Ｅ１−１）および前記γサブユニット（Ｆ１−１）をコードする各ポリヌクレオチド（ｂ１−１）、（ｅ１−１）および（ｆ１−１）からなるポリヌクレオチドが例示できる。具体例として、配列番号１の塩基からなるポリヌクレオチドがあげられる。
配列番号１の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１の塩基配列において、１〜１９５６番目の領域のポリヌクレオチド（ｅ１−１）が、αサブユニットのコード配列（配列番号２）であり、１９５３〜１６４９番目の領域のポリヌクレオチド（ｆ１−１）が、γサブユニットのコード配列（配列番号４）であり、１６４６〜２５９９番目の領域のポリヌクレオチド（ｂ１−１）が、βサブユニットのコード配列（配列番号６）であり、下線部の塩基ＡＴＧＡは、サブユニット間でオーバーラップしている。配列番号１のポリヌクレオチドは、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得ることができる。
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｄ−ＨｙｐＤＨのポリヌクレオチド（配列番号１）
GTGAACGCCGAGGTCATCGTGGTCGGCGCCGGCATCGTCGGCAGCGCCTGCGCCCATGAACTGGCGCGTCGCGGCCTCGACGTACTGGTGCTGGACAGCCGCCGCGGCGGTGCCACCGCGGTGGGCATGGGCCATCTGGTGGCGATGGACGACAACCCGGCCGAACTGGCCCTCAGCGACTACTCGACCCAGGCCTGGCGCGCCTGGGCGGCGGAGTTGCCGGAGGATTGCGCCTATCGCGGCTGTGGCACCCTCTGGCTGGCCGCCGATGCCAGCGAACTCGCCGAGGCCGAACGCAAGCGCCAGGCGCTGCAAGCCGCCGGCGTTGCCTGCCGGATGCTTGGCGCCGCGCGCCTGTACGCCCTCGAACCGGCCCTGCGGCCGGGCCTGGCCGGCGCCCTGGAGGTGTCCGGCGACGGCATCCTCTACGCGCCCAACGCCGCGCGCTGGCTGCTCGACCAGGCCGGGCCGCGCCTGCGACGGCTGTACGCCGAAGTCAGCGAAGTGGACGGCAGCCGCCTGCGCCTGGCCGACGGCCGCTGGCTGAGCGCCGAGGCGCTGGTGCTGGCCAACGGCATCCATGCCGGCGAGCTGTGCGCGGAGCTGCCGATCCGCCCGAAGAAAGGCCACCTGCTGATCACCGACCGCTATCCCGGCACCCTCCGCCATCAACTGGTGGAACTCGGCTATGTCAGCAGCGCCCATGCCAGCAGCGGTACCTCGGTAGCCTTCAACGCCCAGCCGCGCCCCACCGGGCAGGTCTTCCTCGGCTCCTCGCGGCAGTTCGACACGCTCGACCCGCAGGTGGAAGGCCCGGTGCTGGCGCGCATGCTGCGGCGTGCCCTGGACTACCTGCCGGGGCTCGCCGGCCTCAATGCGATCCGTGCCTGGACCGGCTTCCGCGCCGCCACTCCGGACGGCCTGCCGCTGCTCGGCGAGCACCCGGCGCAGCCGGGCCTGTGGCTGGCGGTCGGCCACGAGGGCCTGGGCGTGACCACCGCGCCGGGCAGCGCGCGCCTGCTCGCCGCCCAGTTGTTCGGCGAAACGCCGCCGCTGGATCCCACGCCTTATCTGCCGCAACGCTTCCTCTCCAGCTCCGGGAGTGCCCGGCCATGATCGAACTGTTCATCGACCGGCGTCCGCTGCGGGTCGCCGTCGGTACCAGCGTGGCGGCCGCCCTCGCCCTCGGCGGCGACGGCTGCTCCCGCAGCGCGGTCGGCGGCGGGCGGCGCGCGCCGTTCTGCGGCATGGGCGCGTGCCAGGAATGCCGGGTATTGATCGACGGTCGGCGACGCCTGGCCTGCCAGACCGTCTGCCAATCCGGCATGCGCGTGGAGACCCAGGCATGAGCGCCGACTACGACCTGCTGATCGTCGGTGCCGGCCCCGCCGGCCTGGCCGCAGCGCTGGCCGCCGCGCCGAGCGGCGCGCGCATCGCCCTGGTCGACGACAACCCGGCCGCCGGCGGACAGATCTGGCGCGACGGCCCGCGTGCCAGCCTGCCGCCGCGTGCCCATCAGATGCGCCAACGCCTGGCCGGGCAGGCCAATGTCGAGCACTTCCCGGCGACCCGGGTGGTCGCCTGCGGTCCCGGCAGGCGCCTGTTGCTGGAAGACCCGCAACGTGGCTGGCAGGTCGGCTACCGACGCCTGGTCCTCTGCACCGGCGCCCGCGAACTGCTGCTGCCTTTTCCCGGCTGGACCCTCCCCGGCGTCACCGGCGCCGGCGGCCTGCAGGCGTTGGCCAAGGGCGGCCTGCCACTGGCCGGCCAGCGCCTGGTGGTGGCTGGCTCCGGCCCGCTGCTGCTGGCCAGCGCCGCCAGCGCCAGCCAGTGCGGGGCGCGCCTGCTGCGCGTCGCCGAACAGGCGCCGGCGAGAACCCTGGCCGCCTTCGCCGTACGCCTCCCGCGCTGGCCCGGCAAGCTGTGGCAGGCCGCCGGCCTGTTCGCCCGTAGCTACCGCGCCGACAGCTACGTGCTCGCCGCCCTCGGCGAGGAGCGCCTGGAAGCCGTGCGCCTGCGCGAAGGCGGTCGGGTCCGCGAGATCGCCTGCGAACGCCTGGCCTGCGGCTTCGGCCTGGTGCCCAACGTGCAACTCGGCCAGGCCCTCGGCTATCGCCTCGACGGCCCGGCGCTCGCCGTCGACGAATGGCAGGCCGGCAGCCTGCCCGACCACTACGCCGCCGGCGAATGCACCGGCTTCGGCGGCAGCGAACTGGCCCTGGTGGAAGGCGCCATCGCCGGCCATGCCGCCGTCGACGAGCGCGACGCGGCTCGCCGCCTGTGGCCACGACGGCGACGCTGGCAGGGCTTCGCCGACACCCTGGCGCGACACTTCGCCCTGCGTGCCGAACTGCGTCAACTGGCGGAGGCGGATACCCTGGTCTGCCGTTGCGAAGACGTCCCCTTGGCCGCGCTGGCCGGGCATGCCGGCTGGACCGAGGCCAAGCTGCACAGCCGTTGCGGCATGGGCGCCTGCCAGGGGCGGATATGCGGCAGCGCCGCGCAATTCCTGTTCGGCTGGACGCCTCCGGCGCCGCGTCCGCCGTTCAGCCCGGCGCGCCTGGAGACCCTGGCCCGCTGGCAGGGCGACGCCGGCTAG
前記ポリヌクレオチド（Ｐａ１’）は、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ１−１）の他に、任意で、配列番号１における他の領域を他の領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。
前記（Ｐａ２’）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐａ２’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ２’）において、前記（Ｐａ１’）の塩基配列は、前記（Ｐａ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。前記（Ｐａ２’）の「１もしくは数個」は、前記（Ｐａ１’）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
前記（Ｐａ３’）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｐａ３’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ３’）において、前記（Ｐａ１’）の塩基配列は、前記（Ｐａ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。前記（Ｐａ３’）の同一性は、前記（Ｐａ１’）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（Ｐａ４’）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（Ｐａ１’）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記（Ｐａ４’）において、前記（Ｐａ１’）の塩基配列は、前記（Ｐａ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。「ハイブリダイズ」および「ストリンジェントな条件」は、前述の記載を援用できる。
前記（Ｐａ５’）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（Ｐａ５’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（Ｐａ５’）の塩基配列は、例えば、前記（Ｐａ１）のタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、配列番号６、２および４のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
前記（Ｐａ６’）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐａ６’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ６’）の「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐａ１）のタンパク質のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ｐａ７’）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（Ｐａ７’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐａ７’）の同一性は、前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
（２）遺伝子（Ｐｐ）
本発明の新規遺伝子（Ｐｐ）は、前記サブユニット（Ｂ２）をコードするポリヌクレオチド（ｂ２）を含み、前記ポリヌクレオチド（ｂ２）は、例えば、下記（ｂ２−１）〜（ｂ２−７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである。
（ｂ２−１）配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２−２）前記（ｂ２−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ２−３）前記（ｂ２−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ２−４）前記（ｂ２−１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ２−５）前記（ｂ２−１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ２−６）前記（ｂ２−１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ２−７）前記（ｂ２−１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列番号８の塩基配列は、以下の通りである。配列番号８の塩基配列は、前記サブユニット（Ｂ２−１）のコード配列ある。配列番号８のヌクレオチド（ｂ２−１）は、例えば、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａから得ることができる。
Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ由来Ｄ−ＨｙｐＤＨのポリヌクレオチド（配列番号８）
ATGGTCGAAACCGCTGAAACCGATATCGCCGTGGTGGGCGCCGGCATTGTCGGCGTCGCCTGTGCCCTGCAACTGGCCCGCCAGGGCCATCGGGTAACGCTGGTCGACCGCCAGGCGCCCGGCCTGGGCGCGTCCTTCGGCAATGCCGGGCACCTGGCAACCGAGCAAGTATTCCCGATTGCCGACCTGTCGATCCTCAAGCGCCTGCCTCGCATGCTGCTCGACCCGATGGGCCCGCTGCGCCTGGACTGGAAGTACCTGCCCAAGGCCATGCCGTGGTTCACCCGGCTGCTGCTCAACCTGCGCCCGGCGCCGTTCCAGCGCAGCGTGGCGGGCATCCGCACGCTGAACGAAGGCAGCCTGGGCGCCTGGCAACGGCTGTTGGGCTCGATCGGGCGCAGCGAGTTGTTTCAAGAGGATGGTTCGTTGCTGGTGTTCGAGAAGCCTGAGTCACGCCAGGCGCTGGAGGCGTTGCGCACACGCATGCAACAGCAGGCGGTGCCGGTGGACTTCTGGTCGGCCGAAACCGTGCGCGAAGCGGCGCCGCAACTCAGCCCATCACTGTTAGGCGGGCTGTTCTTCCCGCGCACCGGGCACTTCATCGACCCTTATCGGGTGGTGTGCGAATTGTTCGAAGCGGCCAAGGCCAGCGGGGTGCGCTTTGTCCAGGCGCAGGTCGATGGCGGGCAGTTACACAGTGCCGGCGTGAGCCTTGCCAGCGACCAAGGCATGCTCAATGCCCGCCAGGTGCTTGTCAGCTGTGGCGCCCATTCTGCAAAACTGACTGCCGCGCTGACAGGCAAGCGGGTGCCGCTGGATACCGAACGCGGCTACCACCTGATGTTGCCGGGTGAGCACCAGCGCCTGCCGTTTGCAGTCACCTCGCTTGAGCGCAAGTTCATCATGACACCCATGGCCGAAGGCTTGCGCCTGGCGGGCACAGTGGAGTTTGCCGGGCTGCAGGCACCGCCGAGCATGCAGCGGGCGTGGCAGTTGCACCGGTTGAGCAAGGGGTTGTTCCGGCACGACTTGAGCGTCGAAGGGGCAACGCCGTGGATGGGTTTCAGGCCTTCGTTACCGGACTCATTGCCCGTGATCGACAGGGTGTGCGATGGGCGGGTGCTGTTGGCGTTTGGGCATCAGCACCTGGGGTTGACCCAGGCGGCGGTGACGGCGGAATGGGTGGGGCGGTTGGCTGAGCAGACTGGTGGGCCTGAGATGGGCGCATACCGACTGAACCGGTTTTAG
本発明の新規遺伝子（Ｐｐ）は、前述のように、前記ポリヌクレオチド（ｂ２）を含んでいればよく、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ２）のみからなる遺伝子でもよい。
前記（ｂ２−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ２−２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ２−２）の「１もしくは数個」は、前記（ｂ２−１）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
前記（ｂ２−３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ２−３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ２−３）の同一性は、前記（ｂ２−１）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（ｂ２−４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｂ２−１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。「ハイブリダイズ」および「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述の記載を援用できる。
前記（ｂ２−５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｂ２−５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｂ２−５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（Ｂ２−１）のタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、配列番号９のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
前記（ｂ２−６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ２−６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ２−６）の「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（ｂ２−７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｂ２−７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ２−７）の同一性は、前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
（３）遺伝子（Ａｂ）
本発明の新規遺伝子（Ａｂ）は、前記βサブユニット（Ｂ３）をコードするポリヌクレオチド（ｂ３）を含み、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）は、例えば、下記（ｂ３−１）〜（ｂ３−７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである。
（ｂ３−１）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ３−２）前記（ｂ３−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３−３）前記（ｂ３−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３−４）前記（ｂ３−１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３−５）前記（ｂ３−１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３−６）前記（ｂ３−１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３−７）前記（ｂ３−１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
配列番号１６は、以下の通りである。配列番号１６の塩基配列は、前記βサブユニット（Ｂ３−１）のコード配列である。配列番号１６のポリヌクレオチド（ｂ３−１）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
βサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号１６）
GTGAGCGACACGAAGACGGATGTCGTCGTGATCGGCGCCGGCATCGTCGGCGCGGCGTGCGCGCACGAACTCGCGCAGCGCGGGCTGCGCGTGCTCGTCGTCGACGACGCGAGCGGCGGGGCAACCGGCGCGGGCATGGGGCACCTCGTCGCGATGGACGACAACGCGGCCGAACTCGCGCTCAGCCATTACTCGATCGAACTGTGGCGCGCGCTGAGCGGCGAGATGCCCGAAGGGTGCGCGTACCGCAACTGCGGCACGCTATGGCTCGCCGCCGATGCGCACGAAATGGATCTGGCGCGCGCGAAGCAGGCGGCGCTGGCCGCGCATGGCGTGGCCGGCGAACTGATCGACGCGGCGACGCTCGCTCGACTGGAGCCGATGCTGCGCACGGGCCTGGGCGGTGTACTGAAGATTCCCGGCGACGCGATCCTCTATGCACCCGTCACCGCGAACTGGCTGCTGCAGCGCGCGCCGCGCATCACGTTGCGGCGCGACCGGGCCGTCGCGGTCGACGGCCCGAGCGTGACGCTCGCGAGCGGCGACACGCTGCGCGCGGAGCGGGTGGTGGTCGCGAACGGCGTTGCCGCGCGCGCGCTGCTGCCCGAGCTGCCGCTGCGCCCGAAAAAGGGCCATCTGCTGATTACCGACCGCTATCCGGGCCAGGTGTCGCACCAGCTCGTCGAGCTGGGTTACGCCGCGAGCGCGCATGCGAGCGACGGCACGTCGGTCGCGTTCAACGTGCAGCCGCGGCCGACCGGCCAGTTGCTGATCGGTTCGTCGCGCCAGTTCGACACCGAGGATGCACAGGTCGAACCGCCCGTGCTCGCGCGCATGCTGCGCCGCGCGGTGGGTTATCTGCCGGGCCTGGCCGACCTGAACGGCATCCGCGCATGGACGGGGTTCCGTTCCGCGAGCCCCGACGGGCTGCCGCTGCTCGGCGAGCATCCGGCGCGGCCGGGCGTGTGGCTCGCAGTCGGGCACGAAGGGCTCGGCGTGACGACCGCGCCGGGCAGCGCGCGGCTCGTCGCTGCGCTGATGGCCGGCGAACGGCCGCCCATCGATATCAAACCTTATTTGCCGGGACGCTTCCTGAGCGCGTCCCTCGTAGCCGGAGCGCTGACATGA
前記（ｂ３−２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ３−２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ３−２）の「１もしくは数個」は、前記（ｂ３−１）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
前記（ｂ３−３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ３−３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ３−３）の同一性は、前記（ｂ３−１）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（ｂ３−４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｂ３−１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。「ハイブリダイズ」および「ストリンジェントな条件」は、前述の記載を援用できる。
前記（ｂ３−５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｂ３−５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｂ３−５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記（Ｂ３−１）のタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１７のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
前記（ｂ３−６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ３−６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ３−６）の「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（ｂ３−７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｂ３−７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ３−７）の同一性は、前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本発明の新規遺伝子（Ａｂ）は、前述のように、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）を含んでいればよく、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）のみからなる遺伝子でもよいし、さらに、前記βサブユニット（Ｂ３）以外のタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子でもよい。
後者の場合、前記βサブユニット以外のタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、前記αサブユニット（Ｅ３）をコードするポリヌクレオチド（ｅ３）および前記γサブユニット（Ｆ３）をコードするポリヌクレオチド（ｆ３）の少なくとも一方があげられる。すなわち、本発明の新規遺伝子（Ａｂ）は、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）を含んでもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｆ３）を含んでもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）および（ｆ３）の両方を含んでもよい。本発明の新規遺伝子（Ａｂ）が、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）および（ｆ３）の少なくとも一方を含む場合、前記ポリヌクレオチドの順序は、特に制限されず、例えば、５’側から、β-γ-αの順である。本発明の新規遺伝子（Ａｂ）において、各ポリヌクレオチドは、コドンの読み枠が前記各サブユニットのアミノ酸配列となればよい。
前記ポリヌクレオチド（ｅ３）および（ｆ３）は、例えば、下記（ｅ３−１）および（ｆ３−１）がそれぞれ例示できる。
（ｅ３−１）配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ３−１）配列番号２０の塩基配列からなるポリヌクレオチド
配列番号１８および２０は、それぞれ以下の通りである。配列番号１８のポリヌクレオチド（ｅ３−１）および配列番号２０のポリヌクレオチド（ｆ３−１）は、ぞれぞれ、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
αサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号１８）
ATGAAACAGGAACGACTGAGCGTCGACGTCGCGATCGTCGGCGCGGGGCCGGCCGGGCTGTCGGCCGCACGGGCCGCCGCGCGCGGCGGTGCGACGGTTGCGATCGTCGACGACAACCCGCGCGCTGGCGGGCAGATCTGGCGGCAACGCGCAGCGGCTGCGCCGCCGCCGGCCGCCGCCGAGCGGCTCGCGGTGTTGCGGCAGCCGAACGTCACGCATCTCGCGGCGACGCGCATCGTCGCCGAAACGCAGCCGGGCACGCTGCTGCTCGAGGACGACGAACGCGGGCTGCTGCTCGACTTCCGCACGCTGATTCTCTGCTGCGGCGCGCGCGAGCTGCTGCTGCCGTTTCCAGGCTGGACGCTGCCGGGTGTCACCGGTGCGGGCGGCTTGCAGGCGTTGATCAAGTACGGCCTCGACGTGCGCGGGCAGCGCACGGTGATCGCGGGCAGCGGGCCGCTGCTGCTGGCGAGCGCGGCGACGGCCCGTCAGGCCGGCGCACGCGTGTCGCACGTGCTCGAACAGGCCGCATGGTGCGACGTGGCCGGTTTCGGGGCGGGGCTGTGGCGCTGGCCGTCGAAGCTCGCGCAGGCCGCGAAGCTCGTCACCGCCGCCTATCGGCCCGATGCGCATGTCGTCGAAGCGTTCGGCGACACGCGGCTCGAACGCGTGCGGATTCGTCAGGGCGATCGCGAGTTCGACGTCGATTGCGACCGGCTCGCGTGCGGCTTCGGCCTCGTGCCGAACACCGTGTTGCCGAGCCATCTCGGCTGCCGGATCGACAACGGCGCGGTGGCGGTCGATGTGCACCAGCGGACGAGCCGTGACGGGGTTTTCGCGGCGGGCGAGTGTACGGGCGTCGGCGGCAGCGAACTGGCGATGGTCGAAGGCGAAATCGCCGGTTTGGCGGCGACAGGGCAGACGGCGCCGCTGGCTGCGCTCGTCGCGCAGCGGGCGCACTGGCAGGCGTTTGCCGATGCCGTACGCGCGCGCTTTGCGATCCGCGAGCCGATCCGCCGGCTCGCGCGGGCCGACACGTTGCTGTGCCGTTGCGAGGACGTGCGTTTCGATGCCGTCGCGCAAGCGCCGGGCTGGACGGCCGCGAAACTGCAGTCACGCTGCGGGATGGGCGCGTGCCAGGGCCGCGTGTGCGGCGCAGCCGCGCAGGCGCTGTTCGGCTGGACCCCGCCGGTGCCGCGCACGCCGCTCGTGCCCGCACGGGTCGGCACGCTGATGCTGGACGGCACGGCATCCTGCGACGGCGCGTGA
γサブユニットのポリヌクレオチド（配列番号２０）
ATGATCATTCATCTGGACGGCCGCGCGCTGACGGTGGCCGACGGCGCGACCGTCGCGGCCGCGGTCGCGGCGAGCGGCGACGACACGACGCGCGTGTCGTGCACGGGTGCGGCGCGTGCGCCGTTTTGCGGGATGGGCATCTGCCAGGAGTGCAGGATGACGATCGACGGTCGCCGCCGGCTGGCCTGCCAGACGCTGTGCCGCGACGGGATGCAGGTGGAGCGCACGCGATGA
本発明の新規遺伝子（Ａｂ）が、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）の他に、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）および前記ポリヌクレオチド（ｆ３）の少なくとも一方を有する場合、例えば、以下の例があげられる。すなわち、本発明の新規遺伝子（Ａｂ）は、例えば、下記（Ａｂ１’）〜（Ａｂ７’）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドでもよい。
（Ａｂ１’）配列番号１６の塩基配列と、配列番号１８および２０少なくとも一方の塩基配列とを含むポリヌクレオチド
（Ａｂ２’）前記（Ａｂ１’）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ａｂ３’）前記（Ａｂ１’）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ａｂ４’）前記（Ａｂ１’）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列を含み、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ａｂ５’）前記（Ａｂ１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ａｂ６’）前記（Ａｂ１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ａｂ７’）前記（Ａｂ１）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
前記（Ａｂ２’）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ａｂ２’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ２’）において、前記（Ａｂ１’）の塩基配列は、前記（Ａｂ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。前記（Ａｂ２’）の「１もしくは数個」は、前記（Ａｂ１’）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
前記（Ａｂ３’）において、「同一性」は、例えば、前記（Ａｂ３’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ３’）において、前記（Ａｂ１’）の塩基配列は、前記（Ａｂ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。前記（Ａｂ３’）の同一性は、前記（Ａｂ１’）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
前記（Ａｂ４’）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（Ａｂ１’）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記（Ａｂ４’）において、前記（Ａｂ１’）の塩基配列は、前記（Ａｂ１’）全長の塩基配列でもよいし、これを構成するいずれかの配列番号の塩基配列でもよい。「ハイブリダイズ」および「ストリンジェントな条件」は、前述の記載を援用できる。
前記（Ａｂ５’）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（Ａｂ５’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（Ａｂ５’）の塩基配列は、例えば、前記（Ａｂ１）のタンパク質のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１７、１９および２１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
前記（Ａｂ６’）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ａｂ６’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ６’）の「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ａｂ１）のタンパク質のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記（Ａｂ７’）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（Ａｂ７’）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ａｂ７’）の同一性は、前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
本発明の新規遺伝子（Ａｂ）は、例えば、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）と、任意で、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）および前記ポリヌクレオチド（ｆ３）の少なくとも一方とを、独立して有するポリヌクレオチドのセットでもよい。
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
＜Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を容易に製造できる。
前記発現ベクターは、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドがコードするＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を発現可能なように、前記ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は何ら制限されない。
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクターが好ましく、ｐＱＥ−８０ＬベクターおよびｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
前記発現ベクターが前記遺伝子（Ｐａ）を有する場合、前記遺伝子（Ｐａ）として、例えば、前記βサブユニット（Ｂ１）をコードするポリヌクレオチド（ｂ１）のみが挿入されてもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｂ１）の他に、さらに前記αサブユニット（Ｅ１）をコードするポリヌクレオチド（ｅ１）および前記γサブユニット（Ｆ１）をコードするポリヌクレオチド（ｆ１）のいずれか一方または両方が挿入されてもよい。後者の場合、前記発現ベクターにおいて、各ポリヌクレオチドは、それぞれ別個に発現制御を受けてもよいし、少なくとも２つのポリヌクレオチドが同じ発現制御を受けてもよいし、３つのポリヌクレオチドが同じ発現制御を受けてもよい。
また、前記発現ベクターは、異なるポリヌクレオチドが導入された２つ以上の発現ベクターのセットでもよい。この場合、前記発現ベクターは、例えば、前記遺伝子（Ｐａ）として前記ポリヌクレオチド（ｂ１）を有する発現ベクター（Ｂ１）、前記ポリヌクレオチド（ｅ１）を有する発現ベクター（Ｅ１）および前記ポリヌクレオチド（ｆ１）を有する発現ベクター（Ｆ１）があげられる。前記発現ベクターの組み合わせは、前記発現ベクター（ｂ１）を含んでいればよく、例えば、以下の組み合わせが例示でき、好ましくは組み合わせＢＥおよびＢＥＦであり、より好ましくは組み合わせＢＥＦである。
ＢＥ：発現ベクター（Ｂ１）と発現ベクター（Ｅ１）との組み合わせ
ＢＦ：発現ベクター（Ｂ１）と発現ベクター（Ｆ１）との組み合わせ
ＢＥＦ：発現ベクター（Ｂ１）と発現ベクター（Ｅ１）と発現ベクター（Ｆ１）との組み合わせ
前記発現ベクターが前記遺伝子（Ｐｐ）を有する場合、前記遺伝子（Ｐｐ）として、例えば、前記サブユニット（Ｂ２）をコードするポリヌクレオチド（ｂ２）が挿入されていればよい。
前記発現ベクターが前記遺伝子（Ａｂ）を有する場合、前記遺伝子（Ａｂ）として、例えば、前記βサブユニット（Ｂ３）をコードするポリヌクレオチド（ｂ３）のみが挿入されてもよいし、前記ポリヌクレオチド（ｂ３）の他に、さらに前記αサブユニット（Ｅ３）をコードするポリヌクレオチド（ｅ３）および前記γサブユニット（Ｆ３）をコードするポリヌクレオチド（ｆ３）のいずれか一方または両方が挿入されてもよい。後者の場合、前記発現ベクターにおいて、各ポリヌクレオチドは、それぞれ別個に発現制御を受けてもよいし、少なくとも２つのポリヌクレオチドが同じ発現制御を受けてもよいし、３つのポリヌクレオチドが同じ発現制御を受けてもよい。
また、前記発現ベクターは、異なるポリヌクレオチドが導入された２つ以上の発現ベクターのセットでもよい。この場合、前記発現ベクターは、例えば、前記遺伝子（Ａｂ）として前記ポリヌクレオチド（ｂ３）を有する発現ベクター（Ｂ３）、前記ポリヌクレオチド（ｅ３）を有する発現ベクター（Ｅ３）および前記ポリヌクレオチド（ｆ３）を有する発現ベクター（Ｆ３）があげられる。前記発現ベクターの組み合わせは、前記発現ベクター（Ｂ３）を含んでいればよく、例えば、以下の組み合わせが例示でき、好ましくは組み合わせＢＥおよびＢＥＦであり、より好ましくは組み合わせＢＥＦである。
ＢＥ：発現ベクター（Ｂ３）と発現ベクター（Ｅ３）との組み合わせ
ＢＦ：発現ベクター（Ｂ３）と発現ベクター（Ｆ３）との組み合わせ
ＢＥＦ：発現ベクター（Ｂ３）と発現ベクター（Ｅ３）と発現ベクター（Ｆ３）との組み合わせ
＜Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の製造方法＞
本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造できる。具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドを発現させる工程を有する。これによって、前記本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を製造できる。
前記ポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。前記ポリヌクレオチドを、例えば、前述のように、複数の前記発現ベクターを使用して発現させる場合、前記各発現ベクターにおけるポリヌクレオチドを共発現させることが好ましい。前記発現ベクターの組み合わせは、例えば、前述の通りである。
前記ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
前者の場合、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記ポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を合成できる。
前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
後者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
本発明の製造方法は、例えば、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の精製工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用でき、そのｐＨは、例えば、８〜９が好ましい。前記溶媒は、例えば、さらに、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含むことが好ましい。本発明の製造方法により得られてＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、例えば、そのまま粗酵素（非精製酵素）として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製酵素として使用してもよいし、単一に精製した精製酵素として使用してもよい。
＜Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析試薬＞
本発明の分析用キットは、Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素およびＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を含むことを特徴とする。
本発明の分析試薬によれば、前記本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの分析方法を、より簡便に行うことができる。本発明の分析試薬は、前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素および前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。前記Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素および前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、前述の通りであって、前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素は、特に、前記本発明の新規タンパク質（Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素）であることが好ましい。
本発明の分析試薬は、例えば、さらに、前記本発明の分析方法において使用できる成分を備えてもよい。前記成分は、例えば、前述のような、緩衝液、基質等があげられる。前記基質は、特に制限されず、例えば、ＰＭＳ、ＩＮＴ、ＮＢＴ等があげられ、ＰＭＳとＩＮＴの組合せ、ＰＭＳとＮＢＴの組合せを含むことが好ましい。
本発明の分析試薬は、例えば、１つの容器に各成分が収容されてもよいし、複数の容器に各成分が別個に収容されてもよい。後者の場合、本発明の分析試薬は、例えば、分析用キットともいう。本発明の分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。また、本発明の分析方法において、前記（ｄ）工程における「相関関係」を準備するための、前記Ｌ−ヒドロキシプロリンの標準試料を備えてもよい。
＜コラーゲンの測定試薬＞
本発明の測定試薬は、コラーゲンの測定試薬であって、Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析試薬を含み、前記分析試薬が、前記本発明の分析試薬であることを特徴とする。
本発明の測定試薬を用いれば、前記本発明のコラーゲンの測定方法を、より簡便に行うことができる。本発明の測定試薬は、前記本発明の分析試薬を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。本発明の測定試薬は、例えば、測定用キットともいう。本発明の測定用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
［実施例Ａ１］
本例では、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓ．ｐｕｔｉｄａから、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素遺伝子を単離し、前記単離した遺伝子からＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を合成した。
（１）発現用ベクターの構築
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＡＯ１株（以下、「Ｐａ」ともいう）のゲノムＤＮＡおよびＰｓ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４２２株（以下、「Ｐｐ」ともいう）のゲノムＤＮＡを単離した。そして、ＰＣＲによって、ＰａのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１の塩基配列からなるｃＤＮＡを増幅し、ＰｐのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８の塩基配列からなるｃＤＮＡを増幅した。この際、増幅するｃＤＮＡの開始コドンの５’側および終止コドンの３’側に、ＰａではＳａｃＩとＨｉｎｄIII、ＰｐではＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIの認識配列を導入するためのプライマーセットを使用した。下記配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
（Ｐａ用プライマーセット）
ＰａＬｈｐＢＥＦ−Ｆ（配列番号１１）
5’-ccggagctcAACGCCGAGGTCATCGTGGTCGGCGCCGG-3’
ＰａＬｈｐＢＥＦ−Ｒ（配列番号１２）
5’-gaaagcttCTAGCCGGCGTCGCCCTGCCAGCGGGCCAGGG-3’
（Ｐｐ用プライマーセット）
ＰｐＬｈｐＢ−Ｆ（配列番号１３）
5’-ccatggatccGTCGAAACCGCTGAAACCGATATCGCCGTGGTGG-3’
ＰｐＬｈｐＢ−Ｒ（配列番号１４）
5’-aattaagcttCTAAAACCGGTTCAGTCGGTATGCGCCCATCTC-3’
得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、発現タンパク質のＮ末端に（Ｈｉｓ）６タグを付加するｐＱＥ−８０Ｌベクター（Ｑｉａｇｅｎ）のＳａｃＩ−ＨｉｎｄIIIあるいはＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに連結した。前記Ｐａ由来のＤＮＡ断片を挿入したベクターをｐＱＥ／ＰａＬｈｐＢＥＦ、前記Ｐｐ由来のＤＮＡ断片を挿入したベクターをｐＱＥ／ＰｐＬｈｐＢとした。
ｐＵＣＰ２６のＢａｍＨＩサイトに、ｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のカナマイシン耐性カセットを挿入して、ｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター（Kobayashi, Y., Ohtsu, I., Fujimura, M., and Fukumori, F. (2011) Environ. Microbiol. 13, 2007-2017）を作製した。そして、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ由来のＡｈｐＣ遺伝子のプロモーターおよび部分的オープンリーディングフレームを増幅させ、これを、前記ｐＵＣＰ２６ＫｍのＳａｌＩサイトに挿入して、ｐＵＣＰ２６ＫｍＡｈｐＣｐを調製した。他方、前記ｐＱＥ／ＰａＬｈｐＢＥＦおよび前記ｐＱＥ／ＰｐＬｈｐＢを鋳型として、（Ｈｉｓ）６タグのコード配列からｔ０転写ターミネーター領域までを、ＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、前記ｐＵＣＰ２６ＫｍＡｈｐＣｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩに連結した。前記ｐＱＥ／ＰａＬｈｐＢＥＦからのＰＣＲ産物を挿入したベクターを、ｐＵＣＰ／ＰａＬｈｐＢＥＦ、前記ｐＱＥ／ＰｐＬｈｐＢからのＰＣＲ産物を挿入したベクターを、ｐＵＣＰ／ＰｐＬｈｐＢとした。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２ＴＯＬ−ｏｘｙＲ株に、前記ｐＵＣＰ／ＰｐＬｈｐＢおよび前記ｐＵＣＰ／ＰａＬｈｐＢＥＦを、それぞれヒートショック法により形質導入した。本菌株は、ＡｈｐＣ遺伝子の転写抑制因子であるＯｘｙＲに変異を有し、ＡｈｐＣ遺伝子は、構成的大量発現するため、ＡｈｐＣプロモーターにつないだＰｐＬｈｐＢ遺伝子およびＰａＬｈｐＢＥＦ遺伝子も、大量発現させることが可能となる。得られた形質転換体を、５０ｍｇ／Ｌ リファンピシンおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ カナマイシンを含有するＬＢ培地を用いて、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を集菌し、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、超音波破砕した。そして、遠心分離によって上清（無細胞抽出液）を回収して、下記条件のカラムクロマトグラフィーに供して、リコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ｐＵＣＰ／ＰａＬｈｐＢＥＦを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「ＰａＬｈｐＢＥＦ」、前記ｐＵＣＰ／ＰｐＬｈｐＢを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「ＰｐＬｈｐＢ」とした。前記ＰａＬｈｐＢＥＦおよび前記ＰｐＬｈｐＢをそれぞれネイティブＰＡＧＥに供したところ、シングルバンドが確認され、単一に精製されていることが確認できた。
（カラムクロマトグラフィー）
カラム：Ni-NTA Superflow column（Qiagen)
装置：BioAssist eZ system（TOSOH)
洗浄用緩衝液：２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍｍｏｌ イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）
溶出用緩衝液：２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および２５０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）
そして、カラムクロマトグラフィーから得られた溶出画分を回収し、フィルター（商品名Centriplus YM-30、Millipore）を用いた限外ろ過により、濃縮を行い、２ｍｍｏｌ ＭｇＣｌ２および５０％ グリセロールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）で透析し、−３５℃で保存した。これをリコンビナントタンパク質ＰａＬｈｐＢＥＦおよびＰｐＬｈｐＢのサンプルとした。前記ＰａＬｈｐＢＥＦサンプルは、オレンジ−ブラウン色であり、前記ＰｐＬｈｐＢサンプルは、フラボタンパク質のような明るい黄色であった。
（３）ゲルろ過による分子量
得られた前記サンプルについて、ＨＰＬＣシステムを用いた、下記条件のゲルろ過カラムによって分子量を確認した。その結果、前記ＰａＬｈｐＢＥＦの分子量は、約３６０ｋＤａであった。
（ゲルろ過カラムクロマトグラフィー）
カラム：TSKgel G3000SWXL column（ＴＯＳＯＨ）
緩衝液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）
流速：１ｍｌ／ｍｌ
分子量マーカー：High molecular weight gelfiltration calibration kit（GE Healthcare)
（４）リコンビナントタンパク質のサブユニット構造
また、前記サンプルについて、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、前記ＰａＬｈｐＢＥＦサンプルは、４４ｋＤａのαサブユニット、約８ｋＤａのγサブユニット、約３９ｋＤａのβサブユニットのバンドが確認され、ＰａＬｈｐＢＥＦは、３つのサブユニットからなるタンパク質であることが確認された。αサブユニットの分子量４４ｋＤａは、ＰａＬｈｐＥの理論値４４０５５．０６Ｄａ、γサブユニットの分子量約８ｋＤａは、ＰａＬｈｐＦの理論値８１８４．５５Ｄａ、βサブユニットの分子量約３９ｋＤａは、ＰａＬｈｐＢの理論値４１１３３．３９Ｄａと近似していた。他方、前記ＰｐＬｈｐＢサンプルは、約４７ｋＤａのシングルバンドが確認され、ＰｐＬｈｐＢは、１つのサブユニットからなるタンパク質であることが確認された。この分子量は、ＰｐＬｈｐＢの理論値４６８５６．４９Ｄａと近似していた。
さらに、前記ゲルからのバンドの断片を切り出し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオトレイトールと、５６℃で４５分間インキュベートした。そして、前記ゲル中のタンパク質を、５５ｍｍｏｌ／Ｌ ヨードアセトアミドと、室温で４５分反応させ、さらに、トリプシン（プロメガ）で消化させた。得られた消化物を、陽イオン・モードで、液体クロマトグラフィー エレクトロスプレー イオン化 タンデム質量分析計（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）（商品名LCQ Fleet（登録商標）LC-ESI-MSnシステム、ThermoFisher Scientific）にアプライした。データは、ＭＳ／ＭＳスキャンモードのデータ設定で集め、ＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（ThermoFisher Scientific）により分析した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの結果、前記αサブユニットがＰａＬｈｐＥ、γサブユニットがＰａＬｈｐＦ、βサブユニットがＰａＬｈｐＢに対応することが確認できた。
また、NIH ImageJ Ver. 1.45s ソフトウェアを用いて、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥのピークエリアのイメージスキャニングによりサブユニット比を確認したところ、α：β：γは、１：１：１であった。
［実施例Ａ２］
本例では、前記実施例Ａ１で精製した前記ＰａＬｈｐＢＥＦおよび前記ＰｐＬｈｐＢについて、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を確認した。以下、前記ＰａＬｈｐＢＥＦを「Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ」、前記ＰｐＬｈｐＢを「Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ」ともいう。
（１）ザイモグラムアッセイ
前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨついて、ザイモグラムアッセイを行った。
まず、４℃の条件下、１０％（ｗ／ｖ）ゲルの未変性ＰＡＧＥにより、前記各サンプル１０μｇを分離した。そして、前記ゲルを、下記組成の染色液１０ｍｌに、室温で１５分間浸漬した。脱水素酵素活性は、前記ゲルにおける赤色のバンドの出現によって確認した。前記染色液において前記基質は、Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリン、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを使用した。
（染色液の組成）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＮＴ
０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ 基質
これらの結果を、図１に示す。図１は、未変性ＰＡＧＥを用いたザイモグラムアッセイの結果であり、図１（Ａ）が前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの結果、図１（Ｂ）が前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの結果であり、Ｌａｎｅ１がＬ−プロリン、Ｌａｎｅ２がＤ−プロリン、Ｌａｎｅ３がＬ−ヒドロキシプロリン、Ｌａｎｅ４がＤ−ヒドロキシプロリンの結果である。図１（Ａ）および（Ｂ）のいずれにおいても、基質Ｄ−ヒドロキシプロリンを用いた系において、強いバンドが確認された。この結果から、前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、Ｄ−ヒドロキシプロリンの脱水素反応を触媒するＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素であることが確認できた。
（２）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素のアッセイ
反応液は、全量１ｍＬとし、下記組成とした。そして、１００ｍｍｏｌ／Ｌの基質を１００μｌ添加することによって、下記組成の反応液を調整し、反応を開始した。反応条件は、温度３０℃、反応時間１分とした。
（反応液組成）
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ 電子受容体ＩＮＴ
０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ 電子輸送中間体ＰＭＳ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ 基質（シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）
そして、前記反応液について、波長４９０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。前記吸光度の測定は、分光光度計（商品名シマズUV-1800分光光度計、島津GLC）を用いて測定した。ＩＮＴのモル吸光係数（ε）は、４９０ｎｍで、１５.０ｍＭ−１ｃｍ−１であり、ＰＭＳのモル吸光係数（ε）は、５３０ｎｍで、３６．０ｍＭ−１ｃｍ−１）とした。そして、前記反応条件において、比活性（Ｕ／ｍｇ タンパク質）を算出した。
これらの結果を、後述する表１に示す。前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの比活性は、２１．１±０．７Ｕ／ｍｇ タンパク質であった。そして、前記反応液のｐＨを変化させて同様の反応を行った結果、至適ｐＨは、９．０〜９．７５の範囲であり、この範囲で最大活性を示した。また、前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの比活性は、６．４１±０．３０Ｕ／ｍｇであった。そして、前記反応液のｐＨを変化させて同様の反応を行った結果、至適ｐＨは、９．０〜９．７５の範囲であり、この範囲で最大活性を示した。
また、前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨを、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、−３５℃で６ヶ月間保存した結果、保存時の比活性を１００％として、約８０％以上の残存活性を示した。この結果から、非常に安定性が高く、例えば、試薬やキットに適していることがわかった。
（３）速度パラメータ
前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨについて、基質特異性および電子受容体の特異性を確認した。脱水素酵素活性のアッセイは、使用する基質および電子受容体を変化させた以外は、特に示さない限り、前記（２）のアッセイと同様とした。
前記基質は、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−プロリン、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンおよびＬ−プロリンを使用し、前記電子受容体は、ＩＮＴとＰＭＳとの組合せ、ＮＢＴとＰＭＳとの組合せを使用した。
これらの結果を、下記表１に示す。なお、いずれの酵素も、Ｌ−ヒドロキシプロリンおよびＬ−プロリンに対する活性は確認されなかったため、割愛した。また、下記表において、ａ〜ｆは、以下の通りである。
ａ：前記（２）のアッセイ
ｂ：０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲である９種のＤ−ヒドロキシプロリン溶液を使用
ｃ：０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲である８種または１０種のＤ−プロリン溶液を使用
ｄ：０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲である７種のＤ−ヒドロキシプロリン溶液を使用
ｅ：１ｍｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲である６種または７種のＤ−プロリン溶液を使用
ｆ：０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲である７種のＤ−ヒドロキシプロリン溶液を使用
前記表１に示すように、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＰｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、ＰＭＳ−ＩＮＴの系およびＰＭＳ−ＮＢＴの系いずれにおいても、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するｋｃａｔ／Ｋｍが、Ｄ−プロリンに対するｋｃａｔ／Ｋｍよりも顕著に高い値を示し、且つ、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍが、Ｄ−プロリンに対するＫｍよりも顕著に低い値を示した。特に、ＰＭＳ−ＩＮＴの系の場合、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＰｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するｋｃａｔ／Ｋｍが、Ｄ−プロリンに対するｋｃａｔ／Ｋｍの約１９０倍および約１１０倍の値を示し、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＫｍが、Ｄ−プロリンに対するＫｍの約１／７８および約１／２４の値を示した。これらの結果から、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＰｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して極めて優れた特異性を示すことがわかった。
（４）コファクターの確認
（４−１）ＵＶ可視吸収スペクトル
前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ（５ｍｇ／ｍｌ）および前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ（５ｍｇ／ｍｌ）について、ＵＶ可視吸収スペクトルを確認した。これらの結果を、図２に示す。図２は、吸収スペクトルであり、横軸は、波長を示し、縦軸は、吸光度を示し、Ｐｐは、Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ、Ｐａは、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの結果をそれぞれ示す。図２に示すように、Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、３５４−３６０ｎｍと４５４−４５６ｎｍで、２つのはっきりした吸収ピークが確認され、典型的なフラビンタンパク質と推測された。他方、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、３５３ｎｍ、４０９ｎｍおよび４４９−４５３ｎｍで最大吸収を示した。
（４−２）ＨＰＬＣ
前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨを、Ｈ２Ｏで透析した。前記透析後の酵素液を熱処理して、コファクターを遊離させ、遠心分離によって沈殿物を除去した。回収した上清をＨＰＬＣに供して、コファクターを確認した。
（ＨＰＬＣ）
カラム：TSKgel OD-80Tmカラム（4.6×150mm、東ソー）
流速：１ｍｌ／ｍｌ
平衡緩衝液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）
上清アプライ後の平衡化時間：１０分間
溶出緩衝液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）／メタノール濃度０〜７０％のグラジェント
溶出時間：３０分間
検出波長：２６０ｎｍ
この結果を、図３のグラフに示す。図３は、リテンションタイム（分）と検出強度（ｍＡＵ）を示すグラフであり、上段が、コファクターの標準物質、中段が、Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨ、下段が、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨの結果を示す。図３に示すように、Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、コファクターとしてＦＡＤを含み、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、コファクターとしてＦＡＤおよびＦＭＮを含むことが確認された。
また、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、１モルあたり、ＦＡＤ約８モル、ＦＭＳ約４モル、鉄７．８モルが存在することが確認された。４次構造はα4β4γ4と考えられることから、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨは、αβγヘテロ三量体において、２分子のＦＡＤ、１分子のＦＭＮ、および１分子の［２Ｆｅ−２Ｓ］−鉄硫黄クラスターを含み、αサブユニットとβサブユニットに１分子ずつＦＡＤが結合し、αサブユニットとβサブユニットとの界面に１分子のＦＭＮが結合していると推測される。
［実施例Ａ３］
本例では、前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨによる反応生成物の同定を行った。
２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ９．０）に、精製した５０ｍｇの前記Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨまたは前記Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨを添加し、この混合物を、暗室において、３０℃で一晩反応させた。そして、前記混合物に活性炭を添加して、残存するＰＭＳを吸着させ、フィルターで濾過した。濾過溶液を、Ｄｏｗｅｘ １×２ Ｃｌ− ｆｏｒｍ(100-200メッシュ）の樹脂カラムに供し、吸着物を０−１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌのグラディエント勾配で溶出させた。そして、回収した各フラクション１２５μｌに、ｎ−プロパノール中に、５％（ｗ／ｖ）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを含むｎ−プロパノール溶液５００μlを添加し、さらに、３Ｎ Ｈ２ＳＯ４ １.２５ｍｌを添加し、振とうしながら、７０℃で５分間インキュベートした。この混合液について、波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。そして、吸収を示すフラクションを活性フラクションとし、これをＮａＯＨでｐＨ１１に調整し、凍結乾燥した。
前記凍結乾燥した活性フラクションについて、ＮＭＲにより反応生成物を特定した。Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨによる反応生成物の結果を図４に示す。図４は、ＮＭＲのスペクトルであり、上段が、Ｄ−ヒドロキシプロリン、中段が、反応生成物、下段が、ピロール−２−カルボン酸である。また、図４の各段において、左側のパネルが、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルであり、右側のパネルが、１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。図４に示すように、前記反応生成物は、ピロール−２−カルボン酸塩のスペクトラムと非常に近似した。そして、前記反応は、アルカリ条件下（ｐＨ９．０）で行われていることから、反応生成物は、Ｐｙｒ４Ｈ２Ｃと推測された。なお、Ｐｐ／Ｄ−ＨｙｐＤＨによる反応生成物の結果も、Ｐａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨと同様の結果であった。
［実施例Ａ４］
本例では、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＡＯ１株およびＰｓ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４２２株を培養して、無細胞抽出液を調製し、Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＬ−ＨｙｐＥの活性を測定した。
前記２株について、それぞれ、好気条件下、３０℃で振とう培養を行った。培地は、１Ｌあたり、１０ｇ トリプトン、５ｇ イーストエクストラクトおよび５ｇ ＮａＣｌを含むＬＢ培地、または、１Ｌあたり、０．８ｇ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、２ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００２ｇ ＦｅＳＯ４、０．０８０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび２ｇ 炭素源を含む最小培地（ｐＨ６．８）を使用した。前記炭素源は、グルコース（Ｇｌｕ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−ｐｒｏ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−ｐｒｏ）、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｌ−Ｈｙｐ）またはシス−Ｄ−ヒドロキシプロリン（Ｄ−Ｈｙｐ）を使用した。そして、遠心分離（30,000×ｇ、20分）により培養細胞を回収し、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉs−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁して、超音波破砕した。そして、前記懸濁液を遠心分離して上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。なお、Ｄ−ＨｙｐＤＨの安定化のため、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌには、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した。
そして、前記各培地を使用して調製した無細胞抽出液について、Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＬ−ＨｙｐＥの活性を確認した。Ｄ−ＨｙｐＤＨの活性は、実施例Ａ２（２）と同様に行った。また、Ｌ−ＨｙｐＥの活性は、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに代えて、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを使用した以外は、前記実施例Ａ２（２）におけるＤ−ＨｙｐＤＨのアッセイ方法と同様に行った。
これらの結果を、図５に示す。図５は、各培地を使用したＰｐ由来無細胞抽出液およびＰａ由来無細胞抽出液のＤ−ＨｙｐＤＨの比活性およびＬ−ＨｙｐＥの比活性を示すグラフである。
図５に示すように、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａは、炭素源としてＬ−ヒドロキプロリンまたはＤ−ヒドロキシプロリンを使用した場合、Ｄ−ＨｙｐＤＨ活性およびＬ−ＨｙｐＤＨ活性が確認された。また、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、炭素源としてＬ−ヒドロキプロリンをまたはＤ−ヒドロキシプロリンを使用した場合、Ｄ−ＨｙｐＤＨ活性が確認され、Ｌ−ヒドロキシプロリンを使用した場合、Ｌ−ＨｙｐＤＨ活性が確認された。
また、前記無細胞抽出液を用いて、前記実施例Ａ２（１）と同様にしてザイモグラムアッセイを行った。これらの結果を、図６に示す。図６は、未変性ＰＡＧＥを用いたザイモグラムアッセイの結果であり、上段が、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａの結果、下段が、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結果である。図６に示すように、炭素源としてＬ−ヒドロキプロリンまたはＤ−ヒドロキシプロリンを使用した場合、いずれの株由来の無細胞抽出液も、Ｄ−ＨｙｐＤＨ活性を示すことが確認できた。
［実施例Ａ５］
本例では、Ｌ―ＨｙｐＥおよびＤ−ＨｙｐＤＨを使用して、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定を行った。
Ｌ−ＨｙｐＥとして、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＡＴＣＣ２９１４５由来の精製酵素を使用した。このアミノ酸配列は、配列番号１５で表わされる。また、Ｄ−ＨｙｐＤＨとして、前記実施例Ａ１で調製したＰａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨを使用した。
Ｌ−ＨｙｐＥ（配列番号１５）
MKRIQIIDSHTGGEPTRLVVSGFPALGSGTMAERRDVLAREHDRYRTACILEPRGSDVLVGALLCEPVSPEAAAGVIFFNNSGYLGMCGHGTIGVVRTLHHMGRIAPGVHRIETPVGTVEATLHDDLSVSVRNVPAYRHAKGVALDVPGYGPVKGDIAWGGNWFFLISDHGQHVAGDNVAALTAYASAVREGLERAGITGANGGEIDHIELFADDPEHDSRSFVLCPGLAYDRSPCGTGTSAKLACLAADGKLAPGAVWRQASVIGSVFQASYEQADVGIVPTIRGSAHLSAEATLLIEEDDPFGWGIAP
反応液の組成を以下に示す。まず、下記組成において、Ｄ−ＨｙｐＤＨおよび基質を含まない反応試薬を、３０℃に保持した反応セルに入れてから、前記基質（Ｌ−ヒドロキシプロリン）を添加して、Ｌ−ＨｙｐＥの反応を開始した。そして、前記基質の添加から５分間インキュベートした後、さらに、Ｄ−ＨｙｐＤＨを添加して、３０℃で、経時的に波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液においてＬ−ヒドロキシプロリンの最終濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとした。
（反応液組成：全量１ｍｌ）
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＮＴ
０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳ
５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
１０ｕｎｉｔｓ／Ｌ Ｌ−ＨｙｐＥ
１０ｕｎｉｔｓ／Ｌ Ｄ−ＨｙｐＤＨ
所定濃度 Ｌ−ヒドロキシプロリン
図７（Ａ）に、吸光度測定の結果を示し、図７（Ｂ）に、ラインウェーバー・バークプロットを示す。図７（Ａ）において、各プロットに示す数値は、Ｌ−ヒドロキシプロリン濃度である。図７の結果かれ、Ｄ−ＨｙｐＤＨおよびＬ−Ｄ−ＨｙｐＥを併用することによって、Ｌ−ヒドロキシプロリンを定量できることがわかった。
［実施例Ｂ１］
本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅからＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素遺伝子を単離し、前記単離した遺伝子からＤ−ヒドロキシルプロリン脱水素酵素を合成した。
（１）発現用ベクターの構築
Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓe ＡＴＣＣ２９１４５株（以下、「Ａｂ」ともいう）のゲノムＤＮＡを単離した。そして、ＰＣＲによって、ＡｂのゲノムＤＮＡを鋳型として、βサブユニットである配列番号１６（ＡｂＬｈｐＢ ｃＤＮＡ）、αサブユニットである配列番号１９（ＡｂＬｈｐＥ ｃＤＮＡ）およびγサブユニットである配列番号２１（ＡｂＬｈｐＦ ｃＤＮＡ）の塩基配列からなるｃＤＮＡを増幅した。この際、増幅する前記各ｃＤＮＡの前記開始コドンの５’側および終始コドンの３’側に、制限酵素の認識部位を導入するためのプライマーセットを使用した。前記５’側と３’側の制限酵素の認識部位は、それぞれ、ＡｂＬｈｐＢ ｃＤＮＡについて、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII、ＡｂＬｈｐＥ ｃＤＮＡについて、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩ、ＡｂＬｈｐＦについて、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIとした。以下にプライマーセットを示す。各プライマーの配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
（ＡｂＬｈｐＢ用プライマーセット）
ＡｂＬｈｐＢ−Ｆ（配列番号２２）
５’−ccatggatccgAGCGACACGAAGACGGATGTCGTCGTGATCGGCG−３’
ＡｂＬｈｐＢ−Ｒ（配列番号２３）
５’−aattaagctTCATGTCAGCGCTCCGGCTACGAGGGACGC−３’
（ＡｂＬｈｐＥ用プライマーセット）
ＡｂＬｈｐＥ−Ｆ（配列番号２４）
５’−ccatggatccgAAACAGGAACGACTGAGCGTCGACGTCGCGATCG−３’
ＡｂＬｈｐＥ−Ｒ（配列番号２５）
５’−aattaagctTCACGCGCCGTCGCAGGATGCCGTGCCGTCCAGC−３’
（ＡｂＬｈｐＦ用プライマーセット）
ＡｂＬｈｐＦ−Ｆ（配列番号２６）
５’−ccatggatccgATCATTCATCTGGACGGCCGCGCGCTGACGGTGG−３’
ＡｂＬｈｐＦ−Ｒ（配列番号２７）
５’−ttggctgcagTCATCGCGTGCGCTCCACCTGCATCCCGTCGCG−３’
得られたＰＣＲ産物を、前記プライマーセットによって導入した認識部位に対する制限酵素で消化し、ベクターの同じ制限酵素部位に連結した。具体的には、前記ＡｂＬｈｐＢ ｃＤＮＡを、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに、ＡｂＬｈｐＥ ｃＤＮＡを、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩとＰｓｔＩサイトに、ＡｂＬｈｐＦ ｃＤＮＡを、カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに連結した。ＡｂＬｈｐＢを挿入したベクターを、ｐＡＣＹＣ／ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＥのＤＮＡ断片を挿入したベクターを、ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥ、ＡｂＬｈｐＦのＤＮＡ断片を挿入したベクターを、ｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦとした。なお、前記ベクターは、いずれも発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチドであるヒスチジンタグを付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ｐＡＣＹＣ／ＡｂＬｈｐＢ、前記ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥおよび前記ｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦを、単独、２種類の組み合わせまたは３種類の組み合わせで、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、導入したベクターの抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含有するＬＢ培地を用いて、３７℃でＯＤ６００＝０．６程度になるまで培養した。前記培地における前記抗生物質濃度は、それぞれ、２０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、３０ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコールまたは５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンとした。前記培養後、さらに、１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを前記培養液に添加し、６時間培養した。培養した菌体を集菌し、前記実施例Ａ１と同様にして、超音波破砕し、遠心分離後、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例Ａ１と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、リコンビナントタンパク質を精製し、各リコンビナントタンパク質のサンプルとした。
前記ｐＡＣＹＣ／ＡｂＬｈｐＢ、前記ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥまたは前記ｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、それぞれ「ＡｂＬｈｐＢ」、「ＡｂＬｈｐＥ」および「ＡｂＬｈｐＦ」とし、前記ｐＡＣＹＣ／ＡｂＬｈｐＢと前記ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥまたはｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦ、前記ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥと前記ｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、それぞれ「ＡｂＬｈｐＢＥ」、「ＡｂＬｈｐＢＦ」および「ＡｂＬｈｐＥＦ」とし、前記ｐＡＣＹＣ／ＡｂＬｈｐＢ、前記ｐＥＴ／ＡｂＬｈｐＥおよび前記ｐＣＯＬＡ／ＡｂＬｈｐＦを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＡｂＬｈｐＢＥＦ」とした。
（３）ゲルろ過によるリコンビナントタンパク質の発現の確認
リコンビナントタンパク質のサンプルについて、前記実施例Ａ１（３）と同様にして、ゲルろ過を行った。その結果、いずれのタンパク質も一本のバンドが確認された。この結果から、２種類または３種類の発現ベクターを導入した形質転換体において、前記βサンプルユニットと前記αサブユニットもしくは前記γサブユニットとが会合して、または、前記βサブユニットと前記αサブユニットと前記γサブユニットとが会合して、１分子のタンパク質を形成していることがわかった。
なお、前記ＡｂＬｈｐＢの発現量は、培地１Ｌあたり６．５ｍｇ／Ｌであり、ＡｂＬｈｐＢＥＦの発現量は、培地１Ｌあたり３ｍｇ／ｍＬであった。
（４）リコンビナントタンパク質のサブユニットの確認
前記各無細胞抽出物のサンプルについて、１０−２０％のグラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより、前記ＡｂＬｈｐＢ、前記ＡｂＬｈｐＥおよび前記ＡｂＬｈｐＥを検出した。その結果、各無細胞抽出液サンプルにおいて、各発現ベクターに由来するリコンビナントタンパク質に該当するバンドが確認された。具体的には、導入した発現ベクターに由来して、４７ｋＤａ付近にβサブユニットのバンド、４１ｋＤａ付近にαサブユニットのバンド、７ｋＤａ付近にγサブユニットのバンドが確認された。
また、前記リコンビナントタンパク質は、１０−２０％のグラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図８に示す。図８は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図８において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＥ、ＡｂＬｈｐＢＥ、ＡｂＬｈｐＢＥＦのリコンビナントタンパク質の結果である。
また、図８に示すように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによっても同様に、各無細胞抽出液サンプルから精製されたリコンビナントタンパク質について、約４１ＫＤａ付近にβサブユニットのバンド、約４７ＫＤａ付近にαサブユニットのバンド、約７ＫＤａ付近にγサブユニットのバンドが確認された。これらのバンドの分子量は、βサブユニットの理論値４０５５０．９９Ｄａ、αサブユニットの理論値４５５３５．５８Ｄａ、γサブユニットの理論値９６１２．８４Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記各種発現ベクターの組み合わせにおいて、目的のリコンビナントタンパク質が発現され、且つ、精製されていることが確認された。
［実施例Ｂ２］
本例では、前記実施例Ｂ１で精製したリコンビナントタンパク質ＡｂＬｈｐＢＥＦについて、脱水素酵素活性および基質特異性を確認した。脱水素酵素活性のアッセイは、下記表２に列挙する基質を使用した以外は、前記実施例Ａ２（２）と同様にして行った。そして、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する比活性を１００％として、その他の基質に対する相対活性を算出した。これらの結果を下記表２に示す。
その結果、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する活性を１００％とした場合、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンに対して有意な活性を示したが、その他の基質に対しては、いずれも相対活性０．５％以下であり、実質的に活性を示さなかった。また、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、Ｄ−プロリンに対しても活性を示すものの、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびトランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して、極めて高い相対活性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＢＥＦが、Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して、極めて高い基質特異性を示すことがわかった。
［実施例Ｂ３］
本例では、前記実施例Ｂ１で精製したリコンビナントタンパク質ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦについて、各種特性を確認した。
（１）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性
前記リコンビナントタンパク質について、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を確認した。脱水素酵素活性のアッセイは、前記実施例Ａ２（２）と同様にして行い、各リコンビナントタンパク質の比活性を算出した。その結果、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質とする比活性は、ＡｂＬｈｐＢが２．６９ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡｂＬｈｐＢＥが２．９０ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡｂＬｈｐＢＥＦが２．９８ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この結果から、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦのいずれもが、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有することが確認できた。
（２）コファクター
前記リコンビナントタンパク質について、コファクターの確認を行った。
（２−１）目視観察
前記リコンビナントタンパク質の色を目視確認した結果、ＡｂＬｈｐＢは、フラボタンパク質のような明るい黄色であり、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦは、オレンジ〜ブラウンであった。
（２−２）ＵＶ可視吸収スペクトル
前記リコンビナントタンパク質について、前記実施例Ａ２（４−１）と同様にしてＵＶ可視吸収スペクトルを確認した。これらの結果を、図９に示す。図９は、吸収スペクトルの結果を示す。図９において、横軸は、波長を示し、縦軸は、吸光度を示し、左から、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥ、ＡｂＬｈｐＢＥＦの結果をそれぞれ示す。図９に示すように、前記ＡｂＬｈｐＢ、前記ＡｂＬｈｐＢＥおよび前記ＡｂＬｈｐＢＥＦは、いずれも３５４−３６０ｎｍと４５４−４５６ｎｍで、２つのはっきりした吸収ピーク（矢印）が確認され、典型的なフラビンタンパク質と推測された。
（２−３）ＨＰＬＣ
前記リコンビナントタンパク質について、前記実施例Ａ２（４−２）と同様に処理し、ＨＰＬＣによりコファクターを確認した。この結果を図１０に示す。図１０は、リテンションタイム（分）と検出強度（ｍＡＵ）を示すグラフであり、上から、コファクターの標準物質、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥ、ＡｂＬｈｐＢＥＦの結果を示す。図１０に示すように、ＡｂＬｈｐＢは、１モルあたりＦＡＤ約１モルを含み、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦは、１モルあたりＦＡＤ約２モルおよびＦＭＮ約１モルを含むことが確認された。また、この結果から、ＡｂＬｈｐＢは、１分子のＦＡＤと、ＡｂＬｈｐＢＥは、２分子のＦＡＤと１分子のＦＭＮと結合していると推測された。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、前記実施例Ａ２（４−２）におけるＰａ／Ｄ−ＨｙｐＤＨと同様に、４次構造がα4β4γ4のαβγヘテロ三量体であり、２分子のＦＡＤ、１分子のＦＭＮ、および１分子の［２Ｆｅ−２Ｓ］−鉄硫黄クラスターを含み、αサブユニットとβサブユニットに１分子ずつＦＡＤが結合し、αサブユニットとβサブユニットとの界面に１分子のＦＭＮが結合していると推測される。また、ＦＭＮの結合には、γサブユニットは不要と推測される。
（３）熱安定性
前記リコンビナントタンパク質について、熱安定性を確認した。まず、前記リコンビナントタンパク質を、５０ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析し、グリセロールを除去した。つぎに、前記リコンビナントタンパク質を、所定温度（１５〜６５℃）で１０分間熱処理した後、直ちに氷上へ移して失活を停止させ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を測定した。脱水素酵素活性のアッセイは、前記実施例Ａ２（２）と同様にして行った。そして、熱処理していない前記各リコンビナントタンパク質の比活性を１００％として、前記熱処理後の各リコンビナントタンパク質の相対活性（％）を残存活性として算出した。
これらの結果を図１１に示す。図１１は、熱処理後の前記リコンビナントタンパク質の残存活性を示したグラフである。図１１において、横軸は、熱処理の温度を示し、縦軸は、相対活性（％）を示し、Ｂは、ＡｂＬｈｐＢ、ＢＥＦは、ＡｂＬｈｐＢＥＦの結果をそれぞれ示す。図１１に示すように、ＡｂＬｈｐＢは、３０℃までの熱処理で失活が観察されなかった。ＡｂＬｈｐＢＥＦは、さらに、５０℃までの熱処理で失活が観察されなかった。これの結果から、ＡｂＬｈｐＢおよびＡｂＬｈｐＢＥＦのいずれも、十分な熱安定性を示し、Ｌ−ヒドロキシプロリンのアッセイに適していることがわかった。また、γサブユニットは、熱安定性につながる構造安定化に寄与していると推測される。
（４）基質特異性
前記リコンビナントタンパク質について、基質特異性を確認した。脱水素酵素活性のアッセイは、基質として、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンを使用した以外は、前記実施例Ａ２（２）と同様にして行った。そして、前記各リコンビナントタンパク質について、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する比活性を１００％として、その他の基質に対する相対活性（％）を算出した。
これらの結果を、図１２に示す。図１２は、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦの基質特異性を示すグラフである。図１２において、縦軸は、相対活性を示し、横軸は、前記リコンビナントタンパク質の種類であり、Ｂは、ＡｂＬｈｐＢ、ＢＥは、ＡｂＬｈｐＢＥ、ＢＥＦは、ＡｂＬｈｐＢＥＦを示す。また、各リコンビナントタンパク質のバーは、左から、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンに対する結果を示す。
図１２に示すように、ＡｂＬｈｐＢは、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して極めて高い活性を示したのに対し、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンに対する相対活性は２．９％および０．９５％であり、ほとんど活性を示さなかった。また、ＡｂＬｈｐＢＥは、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して高い活性を示し、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンに対して弱い活性を示し、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびトランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対して高い活性を示し、Ｄ−プロリンに対して弱い活性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦのいずれであっても、Ｄ−プロリンによる影響を回避して、Ｄ−ヒドロキシプロリンを特異的に分析できることがわかった。中でもＡｂＬｈｐＢによれば、Ｄ−ヒドロキシプロリンのうち特にシス−Ｄ−ヒドロキシプロリンを特異的に分析できることがわかった。また、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、シス型とトランス型のＤ−ヒドロキシプロリンに同程度に高い活性を示したことから、例えば、シス型に特異的なＡｂＬｈｐＢと組み合わせることによって、前述のように、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンの特異的な分析も可能となる。
（５）速度パラメーター
前記リコンビナントタンパク質について、基質特異性および電子受容体の特異性を確認した。脱水素酵素活性のアッセイは、基質として、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＤ−プロリンを使用した以外は、前記実施例Ａ２（２）および（３）と同様にして行った。
前記表３に示すように、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦのいずれも、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＶｍａｘ／Ｋｍが、トランス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対するＶｍａｘ／ＫｍおよびＤ−ヒドロキシプロリンに対するＶｍａｘ／Ｋｍより高かった。これらのことから、ＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥ、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、いずれも、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が高いことがわかった。
［実施例Ｂ４］
本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓeからＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素遺伝子を単離し、前記単離した遺伝子からＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素を合成した。
（１）発現用ベクターの構築
Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓe ＡＴＣＣ２９１４５株（以下、「Ａｂ」ともいう）のゲノムＤＮＡを単離した。そして、ＰＣＲによって、ＡｂのゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例Ａ５におけるＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素（配列番号１５）のコード遺伝子である配列番号２８の塩基配列からなるｃＤＮＡ（ＡｂＬｈｐＡ ｃＤＮＡ）を増幅した。この際、増幅する前記ｃＤＮＡの前記開始コドンの５’側および終始コドンの３’側に、制限酵素の認識部位を導入するためのプライマーセットを使用した。前記５’側と３’側の制限酵素の認識部位は、それぞれ、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIとした。以下にプライマーセットを示す。各プライマーの配列において、制限酵素の認識配列を下線で示した。
ＡｂＬｈｐＡ ｃＤＮＡ（配列番号２８）
ATGAAGCGCATCCAGATCATCGATTCGCATACGGGCGGCGAACCCACTCGGCTCGTCGTGTCCGGTTTCCCCGCGCTCGGCAGCGGCACGATGGCCGAGCGCCGCGACGTGCTCGCGCGCGAGCACGACCGCTACCGCACCGCCTGCATTCTCGAACCGCGCGGCAGCGACGTGCTGGTCGGCGCGCTGCTGTGCGAACCCGTGTCGCCTGAGGCGGCGGCCGGCGTGATCTTCTTCAACAATAGCGGCTATCTCGGGATGTGCGGGCACGGCACGATCGGCGTCGTGCGCACGCTGCACCATATGGGGCGCATCGCGCCCGGCGTGCACCGGATCGAAACACCCGTCGGCACCGTCGAGGCGACGCTGCACGACGACCTGTCGGTCAGCGTGCGCAACGTGCCCGCGTATCGCCATGCGAAGGGCGTCGCGCTCGACGTGCCGGGTTACGGCCCCGTGAAGGGCGACATCGCGTGGGGCGGCAACTGGTTCTTCCTGATTAGCGACCACGGGCAGCACGTTGCCGGCGACAACGTTGCGGCACTCACCGCGTATGCGTCGGCCGTGCGCGAAGGACTCGAACGCGCGGGCATCACCGGCGCGAACGGCGGCGAGATCGATCATATCGAGCTGTTCGCCGACGATCCCGAACACGACAGCCGCAGCTTCGTGCTGTGCCCGGGCCTCGCGTACGACCGTTCGCCGTGCGGCACCGGCACGAGCGCGAAGCTCGCGTGCCTCGCGGCCGACGGCAAGCTCGCGCCGGGCGCCGTATGGCGGCAGGCGAGCGTGATCGGCAGCGTGTTCCAGGCGAGCTACGAGCAGGCCGACGTCGGCATCGTGCCGACGATCCGCGGCAGCGCGCACCTGAGCGCGGAAGCGACGCTGCTGATCGAGGAAGACGATCCATTCGGCTGGGGTATTGCGCCGTGA
（ＡｂＬｈｐＡ用プライマーセット）
ＡｂＬｈｐＡ−Ｆ（配列番号２９）
５’−accatggatccAAGCGCATCCAGATCATCGATTCGCATACGGG−３’
ＡｂＬｈｐＡ−Ｒ（配列番号３０）
５’−taattaagctTCACGGCGCAATACCCCAGCCGAATGGATCGTC−３’
得られたＰＣＲ産物を、前記プライマーセットによって導入した認識部位に対する制限酵素で消化し、ベクターｐＱＥ−８０Ｌの同じ制限酵素部位に連結した。なお、前記ｐＱＥ−８０Ｌは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチドであるヒスチジンタグを付加するように設計されている。
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＤＨ５α株に、前記発現ベクターを、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、導入したベクターの抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質アンピシリンを含有するＬＢ培地を用いて、３７℃でＯＤ６００＝０．６程度になるまで培養した。前記培地におけるアンピシリン濃度は、５０ｍｇ／Ｌとした。前記培養後、さらに、１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを前記培養液に添加し、６時間培養した。培養した菌体を集菌し、前記実施例Ａ１と同様にして、超音波破砕し、遠心分離後、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例Ａ１と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、リコンビナントタンパク質を精製し、各リコンビナントタンパク質のサンプルとした。前記発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥ」とした。
（３）リコンビナントタンパク質の分子量
前記Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥを、前記実施例Ａ１（４）と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図１３に示す。図１３は、写真の左側が、マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、マーカー、Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥの結果である。図１３に示すように、前記ＡｂＬｈｐＡについて、約３７ｋＤａに単一のバンドが確認された。これは、Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥの分子量の理論値３３ｋＤａと近似していた。また、前記Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥについて、前記実施例Ａ４と同様にして、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを基質として比活性を確認した結果、１．４４ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化活性が確認できた。
［実施例Ｂ５］
本例では、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素として、前記実施例Ｂ４のＡｂ／Ｌ−ＨｙｐＥ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、前記実施例Ｂ１のＡｂＬｈｐＢおよびＡｂＬｈｐＢＥＦを使用し、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定を行った。アッセイの手順は、前記実施例Ａ５と同様とした。
具体的には、分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記組成の反応試薬を添加し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加し、５分間インキュベートした。そして、前記反応セルに、所定量のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を添加することにより反応を開始した。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加量は、ＡｂＬｈｐＢを１３．５μｇ（比活性２．６９ｕｎｉｔ／ｍｇ）、ＡｂＬｈｐＢＥＦを１２μｇ（比活性２．９８ｕｎｉｔ／ｍｇ）とした。
これらの結果を図１４に示す。図１４は、Ｌ−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示す。図１４に示すように、ＡｂＬｈｐＢおよびＡｂＬｈｐＢＥＦのいずれを使用した場合でも、同程度の直線性が得られた。
［実施例Ｂ６］
本例では、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定におけるｐＨの影響を確認した。アッセイは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨを、ｐＨ８とｐＨ９に設定した以外は、前記実施例Ｂ５と同様にして行った。
これらの結果を、図１５に示す。図１５は、Ｌ−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示し、左のグラフが、ＡｂＬｈｐＢＥＦを用いた結果であり、右のグラフが、ＡｂＬｈｐＢを用いた結果である。図１５に示すように、ｐＨ８およびｐＨ９のいずれの条件で反応を行った場合も、ＡｂＬｈｐＢＥＦおよびＡｂＬｈｐＢのいずれも、同程度の吸光度が得られた。この結果から、Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥとＡｂＬｈｐＢまたはＡｂＬｈｐＢＥＦとを用いる場合、ｐＨ８および９の間で影響はないことがわかった。
［実施例Ｂ７］
Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析においては、Ｌ−ヒドロキシプロリンを基質として、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素によりＤ−ヒドロキシプロリンが生成され、Ｄ−ヒドロキシプロリンを基質として、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が反応します。そこで、本例では、Ｌ−ヒドロキシプロリンとＬ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素との混合後における、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加のタイミングによる影響を確認した。
Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素として、前記実施例Ｂ４のＡｂ／Ｌ−ＨｙｐＥ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、前記実施例Ａ１のＰａＬｈｐＢＥＦ、前記実施例Ｂ１のＡｂＬｈｐＢ、ＡｂＬｈｐＢＥおよびＡｂＬｈｐＢＥＦを使用した。
まず、分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。前記反応セルに、前記実施例Ｂ５と同じ組成の反応試薬を添加し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン １００μＬを添加し、所定時間（０、１、２、５、１０分）インキュベートした。そして、前記反応セルに、所定量のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を添加することにより反応を開始した。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加量は、ＡｂＬｈｐＢを１３．５μｇ、ＡｂＬｈｐＢＥＦを１２μｇ、ＰａＬｈｐＢＥＦを１３μｇとした。
これらの結果を、図１６に示す。図１６は、Ｌ−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示し、左上がＡｂＬｈｐＢ、右上がＡｂＬｈｐＢＥ、左下がＡｂＬｈｐＢＥＦ、右下がＰａＬｈｐＢＥＦを用いた結果である。図１６の各グラフにおいて、プロットの横に記載した時間は、前記反応試薬中のＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥと基質（Ｌ−ヒドロキシプロリン）とを混合してから、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を添加するまでのインキュベート時間（０、１、２、５、１０分）である。
図１６に示すように、いずれのＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を使用した場合でも、インキュベート時間にかかわらず、経時的に吸光度の増加が見られた。この結果から、インキュベート時間にかかわらず、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定が可能であることがわかった。中でも、ＡｂＬｈｐＢＥＦは、前記インキュベート時間が短い場合、例えば、０分であっても、十分な吸光度の増加が確認され、優れた直線性を示した。この結果から、特に、ＡｂＬｈｐＢＥＦによれば、インキュベート時間をさらに短縮しても、例えば、インキュベート０時間であっても、Ｌ−ヒドロキシプロリンを精度よく測定できることがわかった。
［比較例Ｂ１］
Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素に代えて、市販のＤ−アミノ酸酸化酵素を用いて、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定を行った。
前記Ｄ−ヒドロキシプロリンに代えて、ブタ腎臓由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Sigma-Aldrich）１０μｇを用いた以外は、実施例Ｂ７と同様にして測定を行った。この結果を、図１７に示す。図１７は、Ｌ−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示し、プロットの横に記載した時間は、前記反応試薬中のＬ−ヒドロキシプロリン異性化酵素Ａｂ／Ｌ−ＨｙｐＥと基質（Ｌ−ヒドロキシプロリン）とを混合してから、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を添加するまでのインキュベート時間（０、１、２、５、１０分）である。図１７に示すように、市販のＤ−アミノ酸オキシダーゼを使用した場合、１０分のインキュベートであっても、６０秒の反応で吸光度０．１４程度に達するのみであった。このため、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによっては、信頼できるＬ−ヒドロキシプロリンの測定が困難であることがわかった。
［実施例Ｂ８］
本例では、Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素として、前記実施例Ｂ４のＡｂ／Ｌ−ＨｙｐＥ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、前記実施例Ｂ１のＡｂＬｈｐＢおよびＡｂＬｈｐＢＥＦを使用し、Ｌ−ヒドロキシプロリンの測定の検量線を作成し、さらに、Ｌ−ヒドロキシプロリンの定量を行った。
（１）検量線の作成
まず、分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。前記反応セルに、前記実施例Ｂ５と同じ組成の反応試薬を添加し、１００μＬの基質シス−Ｌ−ヒドロキシプロリンを添加し、所定時間インキュベートした。前記基質は、反応終了時の反応液における終濃度が、所定濃度（０．０２、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）に設定した。そして、前記反応セルに、所定量のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を添加することにより反応を開始した。Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素の添加量は、ＡｂＬｈｐＢを１３．５μｇ、ＡｂＬｈｐＢＥＦを１２μｇとした。また、前記インキュベート時間は、ＡｂＬｈｐＢＥＦは０秒、ＡｂＬｈｐＢは５分とした。得られた測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロット（検量線）を作成した。
これらの結果を、図１８に示す。図１８において、横軸は、基質濃度の逆数（１／Ｓ）を示し、縦軸は、反応速度の逆数（１／Ｖ）を示す。図１８において、左のグラフは、ＡｂＬｈｐＢＥＦを用いた検量線であり、右のグラフは、ＡｂＬｈｐＢを用いた検量線であり、各グラフ内の関数は、相関関数を示し、Ｒ２は、相関係数を示す。図１８に示すように、ＡｂＬｈｐＢＥＦを用いた場合、基質濃度０．００４〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が得られ、ＡｂＬｈｐＢを用いた場合、基質濃度０．０４〜１ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が作成できた。これらの結果から、本発明のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を使用することで、広い濃度範囲について、Ｌ−ヒドロキシプロリンの精度に優れる定量が可能であることがわかった。
（２）Ｌ−ヒドロキシプロリンの定量
１００ｍｍｏｌ／Ｌのシス−Ｌ−ヒドロキシプロリン標準液を、任意に希釈した希釈サンプル１−６を調製した。そして、前記基質１００μＬに代えて前記サンプル１−６を各１００μＬ使用した以外は、前記（１）と同様にして、反応を行い、吸光度を測定した。前記反応には、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素として、ＡｂＬｈｐＢＥＦおよびＡｂＬｈｐＢをそれぞれ使用した。そして、測定した吸光度と前記（１）の検量線とから、Ｌ−ヒドロキシプロリンの濃度を決定した。他方、前記サンプル１〜６のＬ−ヒドロキシプロリンの濃度を、ＨＰＬＣ（日立高速アミノ酸分析計L-8900、日立ハイテク）により決定した。
酵素を用いた酵素法において検量線から求めたＬ−ヒドロキシプロリン濃度と、ＨＰＬＣにより測定した濃度とを、表５に示す。表５に示すように、ＡｂＬｈｐＢおよびＡｂＬｈｐＢＥＦを使用すれば、酵素法によって、０．１０〜７ｍｍｏｌ／Ｌの広範囲にわたるＬ−ヒドロキシプロリン濃度を、ＨＰＬＣと同程度の精度で測定できることがわかった。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１２年６月２９日に出願された日本出願特願２０１２−１４７９３４を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
以上のように、本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって、簡便にＬ−ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によってＬ−ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、食品、美容および医療等の分野において、極めて有用な技術といえる。

Claims (22)

  1. 下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする被検試料中のＬ−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
    （ｓ１）Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素により、被検試料中のＬ―ヒドロキシプロリンをＤ−ヒドロキシプロリンに異性化する異性化工程。
    （ｓ２）Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたＤ−ヒドロキシプロリンを脱水素化する脱水素工程。
    （ｓ３）前記（ｓ２）工程の脱水素反応を分析する分析工程。
  2. 前記（ｓ２）工程のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が、下記βサブユニット（Ｂ１）を含むタンパク質（Ｐａ）である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｂ１） 下記（Ｂ１−１）、（Ｂ１−２）または（Ｂ１−３）のβサブユニット
    （Ｂ１−１） 配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ１−２） 前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
    （Ｂ１−３） 前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
  3. 前記タンパク質（Ｐａ）が、さらに、下記αサブユニット（Ｅ１）および下記γサブユニット（Ｆ１）の少なくとも一方を含み、且つ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項２記載の分析方法。
    （Ｅ１）下記（Ｅ１−１）、（Ｅ１−２）または（Ｅ１−３）のαサブユニット
    （Ｅ１−１）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−２）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−３）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
    （Ｆ１）下記（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）または（Ｆ１−３）のγサブユニット
    （Ｆ１−１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−２）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−３）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
  4. 前記タンパク質（Ｐａ）が、下記（Ｐａ１）〜（Ｐａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項２または３記載の分析方法。
    （Ｐａ１）下記（Ｂ１−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ１−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ１−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
    （Ｂ１−１） 配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−１） 配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−１） 配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｐａ２）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｐａ３）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  5. 前記（ｓ２）工程のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が、下記サブユニット（Ｂ２）を含むタンパク質（Ｐｐ）である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｂ２）下記（Ｂ２−１）、（Ｂ２−２）または（Ｂ２−３）のサブユニット
    （Ｂ２−１）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ２−２）前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｂ２−３）前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  6. 前記（ｓ２）工程のＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が、下記βサブユニット（Ｂ３）を含むタンパク質（Ａｂ）である、請求項１記載の分析方法。
    （Ｂ３）下記（Ｂ３−１）、（Ｂ３−２）または（Ｂ３−３）のβサブユニット
    （Ｂ３−１）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ３−２）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
    （Ｂ３−３）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
  7. 前記タンパク質（Ａｂ）が、さらに、下記αサブユニット（Ｅ３）および下記γサブユニット（Ｆ３）の少なくとも一方を含み、且つ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項６記載の分析方法。
    （Ｅ３）下記（Ｅ３−１）、（Ｅ３−２）または（Ｅ３−３）のαサブユニット
    （Ｅ３−１）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−２）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−３）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
    （Ｆ３）下記（Ｆ３−１）、（Ｆ３−２）または（Ｆ３−３）のγサブユニット
    （Ｆ３−１）配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−２）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−３）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
  8. 前記タンパク質（Ａｂ）が、下記（Ａｂ１）〜（Ａｂ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項６または７記載の分析方法。
    （Ａｂ１）下記（Ｂ３−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ３−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ３−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
    （Ｂ３−１） 配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−１） 配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−１） 配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ａｂ２）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ａｂ３）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  9. 下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする被検試料中のコラーゲンの測定方法。
    （Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、Ｌ−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
    （Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離したＬ−ヒドロキシプロリンの量を、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
    （Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対するＬ−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定したＬ−ヒドロキシプロリン量からコラーゲン量を算出する算出工程
  10. 下記βサブユニット（Ｂ１）を含むことを特徴とするタンパク質。
    （Ｂ１）下記（Ｂ１−１）、（Ｂ１−２）または（Ｂ１−３）のβサブユニット
    （Ｂ１−１）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ１−２）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
    （Ｂ１−３）前記（Ｂ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
  11. さらに、下記αサブユニット（Ｅ１）および下記γサブユニット（Ｆ１）の少なくとも一方を含み、且つ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する、請求項１０記載のタンパク質。
    （Ｅ１）下記（Ｅ１−１）、（Ｅ１−２）または（Ｅ１−３）のαサブユニット
    （Ｅ１−１）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−２）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−３）前記（Ｅ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
    （Ｆ１）下記（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）または（Ｆ１−３）のγサブユニット
    （Ｆ１−１）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−２）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−３）前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
  12. 下記（Ｐａ１）〜（Ｐａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１０または１１記載のタンパク質。
    （Ｐａ１）下記（Ｂ１−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ１−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ１−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
    （Ｂ１−１） 配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ１−１） 配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ１−１） 配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｐａ２）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｐａ３）前記（Ｐａ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  13. 下記サブユニット（Ｂ２）を含むことを特徴とするタンパク質。
    （Ｂ２）下記（Ｂ２−１）、（Ｂ２−２）または（Ｂ２−３）のサブユニット
    （Ｂ２−１）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ２−２）前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｂ２−３）前記（Ｂ２−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  14. 下記βサブユニット（Ｂ３）を含むことを特徴とするタンパク質。
    （Ｂ３）下記（Ｂ３−１）、（Ｂ３−２）または（Ｂ２−３）のβサブユニット
    （Ｂ３−１）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ３−２）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
    （Ｂ３−３）前記（Ｂ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質
  15. さらに、下記αサブユニット（Ｅ３）および下記γサブユニット（Ｆ３）の少なくとも一方を含み、且つ、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有する、請求項１４記載のタンパク質。
    （Ｅ３）下記（Ｅ３−１）、（Ｅ３−２）または（Ｅ３−３）のαサブユニット
    （Ｅ３−１）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−２）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−３）前記（Ｅ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するタンパク質
    （Ｆ３）下記（Ｆ３−１）、（Ｆ３−２）または（Ｆ３−３）のγサブユニット
    （Ｆ３−１）配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−２）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−３）前記（Ｆ３−１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
  16. 下記（Ａｂ１）〜（Ａｂ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１４または１５記載のタンパク質。
    （Ａｂ１）下記（Ｂ３−１）のβサブユニットと、下記（Ｅ３−１）のαサブユニットおよび下記（Ｆ３−１）のγサブユニットの少なくとも一方のサブユニットとからなるタンパク質
    （Ｂ３−１） 配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｅ３−１） 配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｆ３−１） 配列番号２１のアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ａｂ２）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
    （Ａｂ３）前記（Ａｂ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  17. Ｌ−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
    Ｌ−ヒドロキシプロリン異性化酵素およびＤ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素を含むことを特徴とする分析試薬。
  18. 前記Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素が、請求項１０から１６のいずれか一項に記載のタンパク質である、請求項１７記載の分析試薬。
  19. コラーゲンの測定試薬測定用キットであって、
    請求項１７または１８記載のＬ−ヒドロキシプロリンの分析用キットを含むことを特徴とする測定試薬。
  20. 下記（ｂ１−１）〜（ｂ１−３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド（ｂ１）からなることを特徴とする遺伝子。
    （ｂ１−１）配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ１−２）前記（ｂ１−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ１−３）前記（ｂ１−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  21. 下記（ｂ２−１）〜（ｂ２−３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド（ｂ２）からなることを特徴とする遺伝子。
    （ｂ２−１）配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ２−２）前記（ｂ２−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ２−３）前記（ｂ２−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  22. 下記（ｂ３−１）〜（ｂ３−３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド（ｂ３）からなることを特徴とする遺伝子。
    （ｂ３−１）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ３−２）前記（ｂ３−１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ３−３）前記（ｂ３−１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｄ−ヒドロキシプロリン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
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