JP5506668B2 - シス−4−ヒドロキシ−l−プロリン製造方法 - Google Patents
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Description
(2)前記L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼを前記L−プロリンに対して作用させて、シス−4−ヒドロキシプロリンを得るステップとを含む。
1−1.方法
(遺伝子増幅の鋳型となる微生物染色体DNAの抽出)
ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチMesorhizobium loti MAFF303099は(独)農業生物資源ジーンバンクより、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチSinorhizobium meliloti 1021(NBRC 14782T)は(独)製品評価技術基盤機構より入手し、これらの染色体DNAを遺伝子増幅の鋳型として使用した。
表1に示す本発明の酵素をエンコードする遺伝子をそれぞれの微生物菌体の染色体DNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。前記PCRには、Expand High Fidelity PCR System(Roche)を使用した。その反応条件は表2に示す。クローニング及び発現の条件を表3に示す。ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチMesorhizobium loti MAFF303099と、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチSinorhizobium meliloti 1021とを鋳型とするセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、配列番号5及び6と、配列番号7及び8とに示す。
PCRにより増幅した目的のDNAをインサート用DNAとし、それぞれのインサート用DNA1μgとベクターであるpET−21d(+)1μgとを、制限酵素NcoI及びHindIIIを使用する37°C、16時間の反応により切断した。切断産物をGFX PCR Purification Kit(GEヘルスケア)で精製した後、それぞれのインサート用DNAとベクターとを、DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(タカラ)を使用する16°C、3時間の反応により連結した。ライゲーション産物を、塩化カルシウム処理した大腸菌JM109株にヒートショック法により導入した。それぞれの組換えプラスミドを保持した大腸菌JM109株を、LB−A寒天培地(1% Bacto Trypton、0.5% Bacto Yeast extract、1% NaCl、1.5% Bacto Agar、100μg/mL アンピシリン)で37°C、16時間培養し、次いでLB−A液体培地(1% Bacto Trypton、0.5% Bacto Yeast extract、1% NaCl、100μg/mL アンピシリン)5mL中で37°C、16時間培養し、その後QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を使用してプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの内部塩基配列をDNAシークエンサーにて解析し、所望のDNAが挿入されていることを確認した。作製した組換えプラスミドのプラスミドマップを図1に示す。
BAB52605タンパク質、CAC47686タンパク質のそれぞれをエンコードするDNAの挿入が確認された組換えプラスミド(それぞれpEBAB52605、pECAC47686という。)を、塩化カルシウム処理した大腸菌Rosetta2(DE3)にヒートショック法により導入し、表3に示す手順で発現させた。すなわち前記大腸菌をLB−AC寒天培地(1% Bacto Trypton、0.5% Bacto Yeast extract、1% NaCl、1.5% Bacto Agar、100μg/mL アンピシリン、34μg/mL クロラムフェニコール)にて37°Cで一晩培養した。生育したシングルコロニーをLB−AC液体培地(1% Bacto Trypton、0.5% Bacto Yeast extract、1% NaCl、100μg/mL アンピシリン、34μg/mL クロラムフェニコール)5mLに接種し、37°C、200rpmで16時間振とう培養を行なった。その後、前記液体培地1mLを100mLの新鮮なLB−AC液体培地に接種し、37°C、200rpmで振とう培養を行なった。O.D.660=0.5に達した時点で、終濃度が0.1mMとなるようにイソプロピル−β−d−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、25°C、100rpmで培養し遺伝子発現を誘導した。9時間後、培養菌体を遠心分離(4°C、5000×g、10分間)して回収し、20mM HEPES・NaOH緩衝液(pH7.5)5mLに懸濁した。前記懸濁液を超音波破砕(3分間)した後、遠心分離(4°C、20000×g、30分間)して上清(無細胞抽出液)を回収した。
上述の抽出及び増幅操作により、BAB52605タンパク質及びCAC47686タンパク質をエンコードする遺伝子のクローニングに成功した。上述の組換え操作等により、前記遺伝子を含む組換えプラスミドを作製することができた。得られた組換えプラスミドのプラスミドマップを図1に示す。前記組換えプラスミドの導入操作により、該組換えプラスミドを有する形質転換体を作製することができた。前記形質転換体による前記遺伝子の発現操作により、BAB52605タンパク質、CAC47686タンパク質を含む無細胞抽出液をそれぞれ取得することができた。得られた無細胞抽出液を、以下の実験に使用した。
2−1.方法
実施例1で得られたBAB52605タンパク質又はCAC47686タンパク質を含む無細胞抽出液によるL−プロリンの水酸化反応をそれぞれ実施した。表4に示す組成の反応液(以下、「標準反応液」という。)を調整し、30分間、30°C、170rpmで攪拌しながら反応を行なった。また、陰性対照として、標準反応液からL−プロリンを除いた反応液(以下、「Pro非添加反応液」という。)と、2−オキソグルタル酸(2−OG)を含まない反応液(以下、「2−OG非添加反応液」という。)と、BAB52605タンパク質又はCAC47686タンパク質を含む無細胞抽出液のかわりに前記タンパクを発現するベクターを含まない大腸菌Rosetta2(DE3)の無細胞抽出液を含む反応液(以下、「非発現反応液」という。)とを調製し、標準反応液と同様に30分間、30°C、170rpmで攪拌しながら反応を行なった。反応後、図2の手順に従い反応停止と、マーフィー試薬(1−fluoro−2,4−dinitrophenyl−5−L−leucinamide)を使用して反応液中に含まれる全アミノ酸の誘導体化とを行なった。その後、0.45μmフィルターを用いて反応液をろ過し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に供した。HPLC分析の各種条件は表5A及びBに示す。また、生成物の分子量測定のために、BAB52605タンパク質又はCAC47686タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液の質量分析(MS分析)を行った。図7の手順に従い、イオン交換カラム(Waters Oasis HLB 6cc Extraction Cartridge)を用いて反応液中の物質を精製し、減圧乾固後メタノールに溶解し、MS分析試料とした。MS分析の条件を表6に示す。
図3に、L−プロリンと、Hypの4種類の異性体との標準試料についてHPLC分析を行なった結果を示す。Hypの異性体はいずれも分離された単一のピークとして検出されたため、ピーク物質の同定は保持時間により行なうこととした。
Claims (3)
- (1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
(2)配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
(3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
(4)特異的結合タグペプチドが前記(1)ないし(3)のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも1種類のタンパク質を含むことを特徴とする、L−プロリンからシス−4−ヒドロキシ−L−プロリンを製造するための組成物。 - (A)(1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質と、(2)配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、(3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、(4)特異的結合タグペプチドが前記(1)ないし(3)のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも1種類のタンパク質と、L−プロリンとを用意するステップと、
(B)前記少なくとも1種類のタンパク質を前記L−プロリンに対して作用させて、シス−4−ヒドロキシプロリンを得るステップとを含むことを特徴とする、シス−4−ヒドロキシ−L−プロリンの製造方法。 - 以下の(1)〜(4)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にシス−4−ヒドロキシ−L−プロリンを生成、蓄積させ、該培養物中からシス−4−ヒドロキシ−L−プロリンを採取することを特徴とする、シス−4−ヒドロキシ−L−プロリンの製造方法:
(1)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(2)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3)配列番号3又は4で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および
(4)配列番号3又は4で表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−プロリン シス−4−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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