JPWO2009139365A1

JPWO2009139365A1 - シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリン製造方法

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Publication number: JPWO2009139365A1
Application number: JP2010511975A
Authority: JP
Inventors: 木野　邦器; 邦器木野; 良太郎原
Original assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Current assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Priority date: 2008-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-09-22
Anticipated expiration: 2029-05-12
Also published as: EP2290065A4; US20110091942A1; EP2840138A3; US8883459B2; EP2290065A1; US20130330786A1; EP2290065B1; JP5506668B2; US8541209B2; EP2840138B1; EP2840138A2; WO2009139365A1

Abstract

シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを経済的・効率的に製造する方法を開発すること。本発明は、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼを提供する。この酵素は、ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ又はアルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ由来の場合がある。本発明は前記酵素を用いてＬ−プロリンからシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法を提供する。本発明は、前記酵素をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、該ベクターを含む形質転換体とを提供する。

Description

本発明は、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ酵素と、該酵素を使用するシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法と、前記酵素をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、該組換えベクターを含む形質転換体とに関する。

ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、Ｌ−プロリンにヒドロキシル基が導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種である。ヒドロキシル基が導入される部位（３位又は４位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより４種類の異性体が存在する。ヒドロキシプロリンの異性体のうち、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、カルバペネム系抗生物質、消炎剤として利用されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン等の医薬品の合成中間原料として有用な物質である。

シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法としては、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体からシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体を有機合成する方法（特許文献１）が提案されているが、合成の原料であるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体自体が高価だという問題点を有する。ヘリコセラス属等の微生物を使用してＬ−プロリンからシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する方法（特許文献２及び３）も提案されているが、生成量が０．６５ｇ／Ｌと極めて低く、実用的ではない。
特開２００５−１１２７６１号公報特許第３００５０８５号公報特許第３００５０８６号公報

産業上有用なシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを経済的・効率的に製造する方法を開発する必要がある。

本発明は、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼを提供する。本発明のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼは、（（１）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１又は２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。

本発明はシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法を提供する。本発明のシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、本発明のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼと、Ｌ−プロリンとを用意するステップと、
（２）前記Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼを前記Ｌ−プロリンに対して作用させて、シス−４−ヒドロキシプロリンを得るステップとを含む。

本発明は、本発明のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。

本発明は、本発明の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。

本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。

本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。

本明細書では、ヒドロキシプロリン（以下、「Ｈｙｐ」という。）の異性体について、ヒドロキシル基が導入される部位（３位又は４位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより、トランス−３−Ｈｙｐ、シス−３−Ｈｙｐ、トランス−４−Ｈｙｐ、シス−４−Ｈｙｐとそれぞれ表す場合がある。

シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シス−４−Ｈｙｐ）の構造は化学式Ｉで表される。

本発明のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼは、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素タンパク質は、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のシス−４−Ｈｙｐの製造方法に使用される場合がある。本発明の酵素タンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記酵素タンパク質を発現する宿主生物、例えば本発明の形質転換体が生きた状態で本発明のシス−４−Ｈｙｐの製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のシス−４−Ｈｙｐの製造は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。あるいは、前記酵素タンパク質は、精製された状態で本発明のシス−４−Ｈｙｐの製造方法に使用されてもよい。

配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号３のヌクレオチド配列とは、それぞれ、ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉＭＡＦＦ３０３０９９由来のＢＡＢ５２６０５タンパク質のアミノ酸配列と、ＢＡＢ５２６０５タンパク質をコーディングする遺伝子のヌクレオチド配列とである。ＢＡＢ５２６０５タンパク質は、Ｌ−プロリンをシス−４−Ｈｙｐに変換する能力を有する。配列番号１のアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡＢ５２６０５として登録されている。配列番号３のヌクレオチド配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡ００００１２として登録されている。なお、ＢＡＢ５２６０５タンパク質はＧｅｎＢａｎｋではＬ−プロリン３−ヒドロキシラーゼとしてアノテーションされていたが、本発明の実施例で示すとおり、実はプロリンからシス−４−Ｈｙｐを生成するＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有し、Ｌ−プロリン３−ヒドロキシラーゼ活性は示さない。

配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号４のヌクレオチド配列とは、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ１０２１由来のＣＡＣ４７６８６タンパク質のアミノ酸配列と、ＣＡＣ４７６８６タンパク質をコーディングする遺伝子のヌクレオチド配列とである。ＣＡＣ４７６８６タンパク質は、Ｌ−プロリンをシス−４−Ｈｙｐに変換する能力を有する。配列番号２のアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号ＣＡＣ４７６８６として登録されている。配列番号４のアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＬ５９１７９２として登録されている。

本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。

本発明のタンパク質は、（１）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１又は２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。

本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。

本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＮ末端アミダーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。

本発明のタンパク質のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性は、本発明のタンパク質と、Ｌ−プロリンと、２−オキソグルタル酸と、２価鉄イオンと、Ｌ−アスコルビン酸とを含む反応液中で前記タンパク質をＬ−プロリンに対して作用させることにより生成したシス−４−Ｈｙｐを定量することにより評価される場合がある。

シス−４−Ｈｙｐの定量は、ＬＣ／ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により実施される場合がある。

本発明の製造方法のステップ（２）では、本発明の組成物とＬ−プロリンとに加えて、ｐＨ調整のための緩衝液成分を含む反応液を用いて実施される場合がある。好ましくは前記緩衝液成分としてＨＥＰＥＳが使用され、ｐＨは７．０〜７．５に調整される場合がある。好ましくは前記反応液は、本発明のタンパク質による水酸化反応に電子供与体として関与する２−オキソグルタル酸をさらに含む場合がある。前記反応液は、２価鉄イオン、Ｌ−アスコルビン酸等をさらに含む場合がある。

本発明の製造方法のステップ（２）において本発明の組成物をＬ−プロリンに対して作用させるために、反応液が所定の反応時間及び反応温度でインキュベーションされる。本発明の製造方法において、本発明の組成物、Ｌ−プロリン、２価鉄イオン、２−オキソグルタル酸等の反応液中における濃度か、反応液量か、反応時間か、反応温度か、その他の反応条件かは、シス−４−Ｈｙｐの目標とする製造量及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。

本発明の製造方法で取得されるシス−４−Ｈｙｐは、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収される場合がある。また、本発明の製造方法で取得されるシス−４−Ｈｙｐは、ＬＣ／ＭＳのような当業者に周知の分析技術を使用して生成量又は純度を評価される場合がある。

本明細書において「組換えベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、該所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。

本明細書において「ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ｄ（＋）プラスミドの場合がある。

本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。

本明細書において「形質転換体」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入され、該所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。

本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。

本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。組換えベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。

組換えプラスミドのマップ。水酸化反応試験についての反応停止とアミノ酸の誘導体化との手順を示す概念図。Ｌ−プロリン及びＨｙｐの４種類の異性体の標準試料についてＨＰＬＣ分析を行なった結果を示すグラフ。ＢＡＢ５２６０５タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液、Ｐｒｏ非添加反応液（陰性対照）及び２−ＯＧ非添加反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフ。ＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液、Ｐｒｏ非添加反応液（陰性対照）及び２−ＯＧ非添加反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフ。非発現反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフ。ＭＳ分析試料の調製の手順を示す概念図。ＢＡＢ５２６０５タンパク質、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液のＭＳ分析結果を示すグラフ。ＢＡＢ５２６０５タンパク質、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液中の反応生成物と、シス−４−Ｈｙｐの標準試料とのＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析により取得されたフラグメンテーションパターンを示すグラフ。

以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

１．タンパク質ＢＡＢ５２６０５、ＣＡＣ４７６８６をエンコードする遺伝子のクローニング、導入及び発現
１−１．方法
（遺伝子増幅の鋳型となる微生物染色体ＤＮＡの抽出）
ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉＭＡＦＦ３０３０９９は（独）農業生物資源ジーンバンクより、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ１０２１（ＮＢＲＣ１４７８２^Ｔ）は（独）製品評価技術基盤機構より入手し、これらの染色体ＤＮＡを遺伝子増幅の鋳型として使用した。

前記２種類の微生物を５ｍＬのＴＹ培地（０．５％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ、０．３％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．０４％ＣａＣｌ_２）中で、２８°Ｃ、３日間液体振とう培養を行なった。培養後遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって菌体を回収し、定法に従いそれぞれの微生物菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。

（目的の遺伝子の増幅）
表１に示す本発明の酵素をエンコードする遺伝子をそれぞれの微生物菌体の染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。前記ＰＣＲには、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。その反応条件は表２に示す。クローニング及び発現の条件を表３に示す。ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉＭＡＦＦ３０３０９９と、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ１０２１とを鋳型とするセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、配列番号５及び６と、配列番号７及び８とに示す。

（組換えプラスミドの取得）
ＰＣＲにより増幅した目的のＤＮＡをインサート用ＤＮＡとし、それぞれのインサート用ＤＮＡ１μｇとベクターであるｐＥＴ−２１ｄ（＋）１μｇとを、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用する３７°Ｃ、１６時間の反応により切断した。切断産物をＧＦＸＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥヘルスケア）で精製した後、それぞれのインサート用ＤＮＡとベクターとを、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（タカラ）を使用する１６°Ｃ、３時間の反応により連結した。ライゲーション産物を、塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ１０９株にヒートショック法により導入した。それぞれの組換えプラスミドを保持した大腸菌ＪＭ１０９株を、ＬＢ−Ａ寒天培地（１％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ、０．５％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１．５％ＢａｃｔｏＡｇａｒ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン）で３７°Ｃ、１６時間培養し、次いでＬＢ−Ａ液体培地（１％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ、０．５％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン）５ｍＬ中で３７°Ｃ、１６時間培養し、その後ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認した。作製した組換えプラスミドのプラスミドマップを図１に示す。

（目的の遺伝子の発現）
ＢＡＢ５２６０５タンパク質、ＣＡＣ４７６８６タンパク質のそれぞれをエンコードするＤＮＡの挿入が確認された組換えプラスミド（それぞれｐＥＢＡＢ５２６０５、ｐＥＣＡＣ４７６８６という。）を、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）にヒートショック法により導入し、表３に示す手順で発現させた。すなわち前記大腸菌をＬＢ−ＡＣ寒天培地（１％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ、０．５％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１．５％ＢａｃｔｏＡｇａｒ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）にて３７°Ｃで一晩培養した。生育したシングルコロニーをＬＢ−ＡＣ液体培地（１％ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ、０．５％ＢａｃｔｏＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）５ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで１６時間振とう培養を行なった。その後、前記液体培地１ｍＬを１００ｍＬの新鮮なＬＢ−ＡＣ液体培地に接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで振とう培養を行なった。Ｏ．Ｄ．_６６０＝０．５に達した時点で、終濃度が０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５°Ｃ、１００ｒｐｍで培養し遺伝子発現を誘導した。９時間後、培養菌体を遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）して回収し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁した。前記懸濁液を超音波破砕（３分間）した後、遠心分離（４°Ｃ、２００００×ｇ、３０分間）して上清（無細胞抽出液）を回収した。

１−２．結果
上述の抽出及び増幅操作により、ＢＡＢ５２６０５タンパク質及びＣＡＣ４７６８６タンパク質をエンコードする遺伝子のクローニングに成功した。上述の組換え操作等により、前記遺伝子を含む組換えプラスミドを作製することができた。得られた組換えプラスミドのプラスミドマップを図１に示す。前記組換えプラスミドの導入操作により、該組換えプラスミドを有する形質転換体を作製することができた。前記形質転換体による前記遺伝子の発現操作により、ＢＡＢ５２６０５タンパク質、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液をそれぞれ取得することができた。得られた無細胞抽出液を、以下の実験に使用した。

２．ＢＡＢ５２６０５タンパク質、ＣＡＣ４７６８６タンパク質によるＬ−プロリンの水酸化反応
２−１．方法
実施例１で得られたＢＡＢ５２６０５タンパク質又はＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液によるＬ−プロリンの水酸化反応をそれぞれ実施した。表４に示す組成の反応液（以下、「標準反応液」という。）を調整し、３０分間、３０°Ｃ、１７０ｒｐｍで攪拌しながら反応を行なった。また、陰性対照として、標準反応液からＬ−プロリンを除いた反応液（以下、「Ｐｒｏ非添加反応液」という。）と、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）を含まない反応液（以下、「２−ＯＧ非添加反応液」という。）と、ＢＡＢ５２６０５タンパク質又はＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液のかわりに前記タンパクを発現するベクターを含まない大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）の無細胞抽出液を含む反応液（以下、「非発現反応液」という。）とを調製し、標準反応液と同様に３０分間、３０°Ｃ、１７０ｒｐｍで攪拌しながら反応を行なった。反応後、図２の手順に従い反応停止と、マーフィー試薬（１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ）を使用して反応液中に含まれる全アミノ酸の誘導体化とを行なった。その後、０．４５μｍフィルターを用いて反応液をろ過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。ＨＰＬＣ分析の各種条件は表５Ａ及びＢに示す。また、生成物の分子量測定のために、ＢＡＢ５２６０５タンパク質又はＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液の質量分析（ＭＳ分析）を行った。図７の手順に従い、イオン交換カラム（ＷａｔｅｒｓＯａｓｉｓＨＬＢ６ｃｃＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＣａｒｔｒｉｄｇｅ）を用いて反応液中の物質を精製し、減圧乾固後メタノールに溶解し、ＭＳ分析試料とした。ＭＳ分析の条件を表６に示す。

２−２．結果
図３に、Ｌ−プロリンと、Ｈｙｐの４種類の異性体との標準試料についてＨＰＬＣ分析を行なった結果を示す。Ｈｙｐの異性体はいずれも分離された単一のピークとして検出されたため、ピーク物質の同定は保持時間により行なうこととした。

図４に、ＢＡＢ５２６０５タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液、Ｐｒｏ非添加反応液（陰性対照）及び２−ＯＧ非添加反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示す。標準反応液ではＬ−プロリンのピークの減少とシス−４−Ｈｙｐのピークの生成とが観察されたが、２−ＯＧ非添加反応液ではＬ−プロリンのピークしか観察されず、Ｐｒｏ非添加反応液ではいずれのピークも観察されなかった。

図５に、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液、Ｐｒｏ非添加反応液（陰性対照）及び２−ＯＧ非添加反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示す。ＢＡＢ５２６０５タンパク質についての図４の結果と同様に、標準反応液ではＰｒｏのピークの減少とシス−４−Ｈｙｐのピークの生成とが観察されたが、２−ＯＧ非添加反応液ではＰｒｏのピークしか観察されず、Ｐｒｏ非添加反応液ではいずれのピークも観察されなかった。（２−ＯＧ非添加反応液で観察された３３分台の小ピークはＰｒｏ非添加反応液でも観察されたことから基質でも生成物でもない、反応液にもともと含まれる物質についてのピークだと考えられる。）

図６に、非発現反応液（陰性対照）のＨＰＬＣ分析結果を示す。非発現反応液ではＬ−プロリンのピークしか観察されなかった。

図８に、ＢＡＢ５２６０５タンパク質（上段）及びＣＡＣ４７６８６タンパク質（下段）を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液のＭＳ分析結果を示す。それぞれの分析結果において、シス−４−Ｈｙｐの誘導体に相当するプロトン付加型イオン（ｍ／ｚ＝４２６．１）及びナトリウム付加型イオン（ｍ／ｚ＝４４８．１）が検出された。

図９に、ＢＡＢ５２６０５タンパク質（上段）及びＣＡＣ４７６８６タンパク質（中段）を含む無細胞抽出液で反応を行なった標準反応液中の反応生成物と、シス−４−Ｈｙｐの標準試料（下段）とのＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析により取得されたフラグメンテーションパターンを示す。それぞれの分析結果において共通のフラグメンテーションパターンが観察され、前記タンパク質を含む無細胞抽出液による反応生成物についてのＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメンテーションパターンがシス−４−Ｈｙｐの標準試料のパターンと同一であることを確認した。

これらの結果より、ＢＡＢ５２６０５又はＣＡＣ４７６８６タンパク質とＬ−プロリンとの存在下でシス−４−Ｈｙｐが生成されることから、前記タンパク質はいずれも、Ｌ−プロリンを位置選択的及び立体選択的に水酸化しシス−４−Ｈｙｐを生成する水酸化酵素であることが確認された。ＥｎｔｒｅｚＰｒｏｔｅｉｎ等のデータベースで公開されている推定タンパク質機能は、ＢＡＢ５２６０５タンパク質については「Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ」であり、ＣＡＣ４７６８６タンパク質については「ＰＵＴＡＴＩＶＥＬ−ＰＲＯＬＩＮＥ３−ＨＹＤＲＯＸＹＬＡＳＥＰＲＯＴＥＩＮ」であった。しかし、本実験の結果からは前記タンパク質の両方の機能がＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼであって、Ｌ−プロリン３−ヒドロキシラーゼ活性はないことが確認された。また、ＢＡＢ５２６０５又はＣＡＣ４７６８６タンパク質に触媒される反応では２−ＯＧの存在下でシス−４−Ｈｙｐが生成されることから、前記タンパク質はいずれも、２−ＯＧの存在下でＰｒｏの４位の炭素原子とそれに結合する水素原子との間に酸素原子を添加する２−ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼであることが確認された。

Claims

Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ。
（１）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１又は２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号３又は４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼ。
（１）請求項１又は２に記載のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼと、Ｌ−プロリンとを用意するステップと、
（２）前記Ｌ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼを前記Ｌ−プロリンに対して作用させて、シス−４−ヒドロキシプロリンを得るステップとを含むことを特徴とする、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法。
請求項１又は２に記載のＬ−プロリンシス−４−ヒドロキシラーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えベクター。
請求項４に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。