JPWO2009038195A1

JPWO2009038195A1 - 変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法

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Publication number: JPWO2009038195A1
Application number: JP2009533208A
Authority: JP
Inventors: 横山　茂之; 茂之横山; 健作坂本; 達男柳沢; 隆嗣小林
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2011-01-13
Anticipated expiration: 2028-09-19
Also published as: US8735093B2; AU2008301614A8; EP2192185A4; AU2008301614A1; CA2706889A1; BRPI0817212A2; CN101952428A; EP2192185B1; US20140322751A1; EP2192185A1; AU2008301614A2; US9133449B2; US20100267087A1; CN101952428B; WO2009038195A1; JP5590649B2; CA2706889C

Abstract

重原子、セレン、反応性官能基、蛍光基、クロスリンカー等、有用な官能基を有する非天然アミノ酸として好適なリジン誘導体、特にＮε−ベンジルオキシカルボニル−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）誘導体を所望のタンパク質に部位特異的に導入する方法を提供する。配列番号２に示したピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列においてピロリジン結合部位を構成する３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、及び３４８位のシステインから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された変異体酵素であって、当該アミノ酸置換が、３０６位のチロシンからグリシン又はアラニンへ、３０９位のロイシンからグリシン又はアラニンへ、及び３４８位のシステインからバリン、セリン又はアラニンへ、の置換である変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。

Description

［関連出願の記載］
本発明は、日本国特許出願：特願２００７−２４３５７４号（２００７年９月２０日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法に関する。より詳細には、メタノサルシナ属由来の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素とサプレッサーｔＲＮＡとを用いてＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体を部位特異的に目的タンパク質へ導入する方法に関する。

タンパク質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常のタンパク質合成に関わる２０種類以外のアミノ酸（非天然アミノ酸）で置換した、非天然アミノ酸組み込みタンパク質（アロタンパク質）は、タンパク質の構造・機能解析のための有効な手段となりうる。様々な生物種由来のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡペアを用いて、すでに３０種類以上のアロタンパク質が合成されている。最も歴史が長くかつ多くの有用な非天然アミノ酸導入に応用されている系は、チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）変異体とアンバーサプレッサー化されたｔＲＮＡ^Ｔｙｒとのペアである。この方法は、真正細菌と、古細菌及び真核生物との２つのグループにおけるａａＲＳが、それぞれのグループ内ではｔＲＮＡをアミノアシル化するが、他のグループのｔＲＮＡをアミノアシル化できない直交性(orthogonal)の関係にあることが鍵となっている。例えば、古細菌メタノカルドコッカス・ジャナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)のＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｔｙｒペアは大腸菌の系で、逆に大腸菌ＴｙｒＲＳとバチルス・ステアロサーモフィラスｔＲＮＡ^Ｔｙｒのペアは哺乳動物細胞の系で直交したペアとなるために、それらの系における遺伝暗号の拡張に使用することができる（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。

一方、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）及びアンバーサプレッサーｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、大腸菌細胞内で直交性を有するａａＲＳ／ｔＲＮＡペアとして機能する（例えば、非特許文献２参照）。さらに、このペアは、真核細胞内においても遺伝暗号の拡張に使用しうることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。ピロリジン(Pyrrolysine)は側鎖に嵩高いメチルピロリン部分を有するリジン誘導体である。野生型ＰｙｌＲＳは、大腸菌内でＮ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンをｔＲＮＡ^Ｐｙｌに結合させ得る（特許文献２参照）。また、野生型ＰｙｌＲＳと、ＡＴＰアナログ、ピロリジン、又はピロリジンアナログとの複合体のＸ線結晶構造が報告されている（非特許文献３、４及び９参照）。

国際公開第２００４／０７００２４号パンフレット特開２００７−３７４４５号公報 Sakamoto, K. et al., Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, pp.4692-4699. Blight S.K. et al., Nature, (2004) Vol. 431, pp.333-335. Yanagisawa, T. et al., Acta Cryst. (2006) F62, 1031-1033 Kavran, J.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2007) Vol. 104, pp. 11268-11273 Tsao, M.-L., Tian, F., Schultz, P. G. ChemBioChem Vol. 2005, Issue 6, pp. 2147-2149 Ohno, S. et al., J. Biochem. (Tokyo) Vol. 141, pp. 335-343 (2007) Mukai, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 371, pp. 818-822 (2008) Liu, W. et al., Nat. Methods. Vol. 4, pp. 239-244 (2007) Yanagisawa, T. et al., J. Mol. Biol. (2008) 378, 634-652

以上の特許文献１、２及び非特許文献１〜９の開示事項は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。以下に本発明による関連技術の分析を与える。
ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ系を用いてタンパク質の所望の位置にチロシンアナログを導入する方法は、芳香族環を有するチロシンアナログの固い構造から位相決定のための重原子含有アミノ酸の導入方法として有用である。一方、クロスリンカー、三重結合、二重結合などを有する反応性アミノ酸をタンパク質に導入し、当該タンパク質と細胞内で相互作用するターゲットを探すためには、導入される非天然アミノ酸の構造の柔軟性が必要である。このため、チロシンアナログよりもアミノ酸側鎖の構造が柔軟なリジン誘導体の方が優れていると考えられる。一般的に、リジン誘導体をタンパク質に導入するためには、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＬｙｓＲＳ）の基質特異性を改変する方法がある。しかしながら、ＬｙｓＲＳはリジンに対する認識が厳密であるため、様々な大きさ、形の官能基を有するリジン誘導体を部位特異的にタンパク質に導入することはこれまで困難であった。本発明は、重原子、セレン、反応性官能基、蛍光基、クロスリンカー等、有用な官能基を有する非天然アミノ酸として好適なリジン誘導体、特にＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）誘導体を所望のタンパク質に部位特異的に導入する方法を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、メタノサルシナ属由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素が、アミノ酸基質特異性が低く、ピロリジンだけでなく様々な疎水性官能基をもつリジン誘導体を活性化できる特異なａａＲＳであることを発見した。さらに、嵩高い側鎖構造を有するＺ−Ｌｙｓ誘導体を効率的にアミノアシル化しうる変異体ＰｙｌＲＳを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、第一の視点において、本発明は配列番号２に示したピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列において、ピロリジン結合部位を構成する３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、及び３４８位のシステインから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素を提供する。当該アミノ酸置換は、３０６位のチロシンからグリシン又はアラニンへ、３０９位のロイシンからグリシン又はアラニンへ、及び３４８位のシステインからバリン、セリン又はアラニンへの置換であることを特徴とする。好ましい実施形態において、前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素は、さらに３８４位のチロシンからフェニルアラニン若しくはヒスチジンへのアミノ酸置換を含むことを特徴とする。

１つの実施形態において、本発明の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素は前記３０６位、３０９位、３４８位及び３８４位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジンをアミノアシル化しうることを特徴とする。さらに異なる実施形態において、野生型ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２に示したアミノ酸配列の相同体であるメタノサルシナ属由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素において、前記相同体のアミノ酸配列と配列番号２に示したアミノ酸配列とをアライメントしたとき、配列番号２に示したアミノ酸配列の３０６位に対応するチロシンがアラニンに置換され、及び／又は３８４位に対応するチロシンがフェニルアラニンに置換されてなる変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素が提供される。

本発明の他の視点において、前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする単離されたＤＮＡ、並びにこれを含む発現ベクター及び形質転換体等が提供される。

さらに異なる視点において、本発明は非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法であって、（ａ）Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体を活性化しうるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下でＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、を前記Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする。前記Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体が、Ｎ^ε−オルト−ヨード−ベンジルオキシカルボニル−リジン、ベンジルオキシカルボニル−アミノエチル−セレノシステイン、Ｎ^ε−オルト−エチニル−ベンジルオキシカルボニル−リジン、Ｎ^ε−オルト−アジド−ベンジルオキシカルボニル−リジン、又はＮ^ε−オルト−ジアジリル−ベンジルオキシカルボニル−リジンであることが好ましい。

さらになお異なる視点において、本発明の非天然アミノ酸組み込みタンパク質合成キットは、（ａ）細胞抽出液と、（ｂ）Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体からなる非天然アミノ酸と、（ｃ）本発明の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素と、（ｄ）前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下でＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、を含むことを特徴とする。

本発明の変異体ＰｙｌＲＳは、嵩高い側鎖構造を有するＺ−Ｌｙｓ及びその誘導体に対する活性が増強されている。このため、大腸菌や動物細胞等の細胞内におけるタンパク質合成系において、効率よくＺ−Ｌｙｓ誘導体を所望のタンパク質に部位特異的に組み込むことができる。

Ｌ−ピロリジンの化学構造（Ａ）、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳのドメイン構造（Ｂ）、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌへのピロリジン結合反応をＰＡＧＥ及びメチレンブルー染色により検出した結果（Ｃ）、及びＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の全体構造（Ｄ）を示す。メタノサルシナ・マゼイＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）と、他のＰｙｌＲＳ及びＬｙｓＲＳとの立体構造に基づくアミノ酸配列のアライメントを示す。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の活性部位（図３Ｃ参照）とＬｙｓＲＳの活性部位（図３Ｄ参照）の比較。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の活性部位へ導入した変異がピロリジンのアミノアシル化反応に及ぼす影響を調べた結果。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の活性部位の拡大図。ＬｙｓＲＳの活性部位の拡大図。ピロリジンがアキシアル型の立体異性体の場合のＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の活性部位（図３Ｆ参照）とＬｙｓＲＳの活性部位（図３Ｄ参照）の比較。ピロリジンがアキシアル型の立体異性体の場合のＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の活性部位の拡大図。リジン誘導体の化学構造（Ａ）及びこれら誘導体のアミノアシル化反応を酸性尿素ＰＡＧＥで解析した結果（Ｂ）である。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）及びＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）（Ｙ３０６Ａ）活性部位へのＺ−Ｌｙｓの結合様式（Ａ、Ｂ）及び各種変異体ＰｙｌＲＳによるＺ−Ｌｙｓアミノアシル化反応を解析した結果（Ｃ）を示す。ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌを用いたアンバーサプレッションシステムの概略を説明する図である。大腸菌内におけるＢｏｃ−Ｌｙｓ及びＡｌｏｃ−Ｌｙｓ依存性アンバーサプレッションの結果合成されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。大腸菌内におけるＺ−Ｌｙｓ依存性アンバーサプレッションの結果合成されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。大腸菌内におけるアンバーサプレッションで合成されたＧＳＴの精製タンパク質を分析した結果である。精製ＧＳＴタンパク質をゲル内トリプシン消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより質量分析した結果である。メタノサルシナ・マゼイｔＲＮＡ^Ｐｙｌの推定２次構造である。種々のナンセンスコドンに対するアミノアシル化活性を調べた結果である。種々のＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体の化学構造及びＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）との結合様式を表した模式図である。Ｚ−Ｌｙｓ特異性の高い変異体酵素を用いて、大腸菌内で発現させたアンバーコドンを有するＧＳＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。 GSTのアンバー遺伝子を発現させた大腸菌から得られた粗抽出液をSDS-PAGEで分離してタンパク質を染色して得られたパターンである。 FITC-PP3の化学構造。蛍光修飾反応を2通りの方法で行ったGSTをSDS-PAGEで分離してUVライトで蛍光を検出した結果である。 lacZアンバー遺伝子からのLacZタンパク質の発現をLacZによる発色反応の相対強度で示した結果である。 Grb2遺伝子を発現させた動物細胞からの粗抽出液に蛍光修飾反応を行った後にSDS-PAGEで分離し蛍光検出器によって蛍光を検出した結果である。

［ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）］
本発明に係るピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、古細菌、特に、メタン生成古細菌から取得した野生型ＰｙｌＲＳを基に、種々の方法で変異を導入して作製することができる。野生型ＰｙｌＲＳとしては、例えば、メタン生成古細菌であるメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、及びメタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)等から取得することできるがこれらに限定されない。これらの古細菌を含む多くの細菌ゲノム塩基配列及びこれに基づくアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行って、他の相同なＰｙｌＲＳを取得することも可能である。典型的な例として、メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＭ３１１４１として、メタノサルシナ・バルケリ由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＬ４０８６７として、及びメタノサルシナ・アセチボランス由来のＰｙｌＲＳは、アクセッションＮｏ．ＡＡＭ０３６０８として登録されている。特に好ましくは、上記メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳであり、その遺伝子の塩基配列を配列番号１に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。これらメタノサルシナ属のＰｙｌＲＳ相同体の配列はよく保存されており、例えば、アミノ酸配列の相同性は、凡そ７０％以上である。これらの野生型ＰｙｌＲＳの立体構造を解析し、以下に詳細に説明する方法に従って本発明の変異体ＰｙｌＲＳを作製する。

［変異体ＰｙｌＲＳの作製］
本発明は、ＰｙｌＲＳの触媒活性ドメインの立体構造の解析及びランダム変異導入法に基づいて作製した変異体ＰｙｌＲＳを提供する。ＰｙｌＲＳ、基質アミノ酸（ピロリジン又はＢｏｃ−Ｌｙｓ）及びＡＴＰアナログであるＡＭＰＰＮＰとの複合体の結晶化及びそのＸ線構造解析の具体的な方法は、以下の実施例に記載したとおりである。メタノサルシナ・マゼイ由来のＰｙｌＲＳ活性ドメインとピロリジンとＡＭＰＰＮＰとの複合体結晶の単位格子パラメーターは、空間群がＰ６_４であり、単位格子がａ＝ｂ＝１０４．８８Å、ｃ＝７０．４３Å、α＝β＝９０及びγ＝１２０°である。ここで、単位格子とは、結晶の最も小さく単純な体積要素を意味し、空間群とは単位格子の対称性を意味する。ＰｙｌＲＳの触媒活性ドメインの結晶化及びＸ線構造解析方法については、すでに本発明者らにより報告されており（上掲の非特許文献３参照）、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

ＰｙｌＲＳのアミノ酸基質認識はリジン誘導体のεアミノ基に結合するカルボニル、及びその先に付加された疎水性官能基の存在が重要である。疎水性官能基が、ピロール環のようなある程度の大きさと嵩高さを持っていれば、野生型ＰｙｌＲＳはそのリジン誘導体を活性化することができる。しかし野生型ＰｙｌＲＳが活性化できるリジン誘導体の大きさには限界があり、例えばＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）のように大きな官能基を持つリジン誘導体はタンパク質へ導入することができない。本発明の変異体ＰｙｌＲＳによれば、野生型ＰｙｌＲＳでは活性の低いＺ−Ｌｙｓについても、効率良くタンパク質へ導入することができる。

このような変異体ＰｙｌＲＳとしては、配列番号２に示したピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列においてピロリジン結合部位を構成する３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、及び３４８位のシステインから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された変異体ＰｙｌＲＳである。当該アミノ酸置換は、配列番号２の３０６位のチロシンが、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン等の比較的小さな側鎖構造を有するアミノ酸へ置換されたものが好ましく、より好ましくはグリシン又はアラニンであり、最も好ましくはアラニンである。ＰｙｌＲＳの３０６位のアミノ酸残基は、基質結合部位を構成し、特に、Ｚ基のような嵩高い側鎖を有する基質の場合には基質が結合したときの立体障害を回避するために上記アミノ酸残基に置換されることが好ましいと考えられる。また、３０９位のロイシンがグリシン又はアラニンへ置換されてもよく、好ましくはアラニンへの置換である。この場合、同時に３４８位のシステインがバリン、セリン又はアラニンへ置換されることが好ましい。

さらに、配列番号２の３８４位のチロシンが、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はヒスチジン等へ置換されたものが好ましく、より好ましくはフェニルアラニン又はヒスチジンであり、最も好ましくはフェニルアラニンである。また、１３１位のグリシンがグルタミン酸に置換されていてもよい。これらのアミノ酸置換による活性増強効果については必ずしも明らかではないが、３８４位のアミノ酸残基は、基質アミノ酸の、特に主鎖部分と相互作用することが示されており（非特許文献４参照）、基質アミノ酸の種類に依存せずに触媒活性を増強する可能性がある。この３８４位のアミノ酸置換は、上記基質結合部位のアミノ酸置換と共存することが好ましく、３０６位若しくは３０９位のアミノ酸置換との二重変異体、又は３０９位及び３４８位のアミノ酸置換との三重変異体であることがさらに好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、３０６位及び３８４位のチロシンが、それぞれアラニン及びフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる変異体ＰｙｌＲＳが提供される。この変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ）は、Ｚ−Ｌｙｓのような嵩高い側鎖構造を有するリジン誘導体を効率よくアミノアシル化することができる。本明細書において「アミノアシル化しうる」又は「アミノアシル化活性」とは、リジン誘導体をサプレッサーｔＲＮＡに結合させてアミノアシルｔＲＮＡを合成する活性をいい、例えば、変異体酵素及びサプレッサーｔＲＮＡを精製し、インビトロにおいてＡＴＰ及びリジン誘導体の存在下に酵素反応を行うことによって生成するピロリジル−ｔＲＮＡ（Ｐｙｌ−ｔＲＮＡ）の量を測定することができる。

このような変異体を作製する方法としては、当業者に公知の種々の方法を用いることができ、例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡをＰＣＲにより増幅させて全長の変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡを取得し、これを大腸菌等の宿主細胞を用いて発現させることができる。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はギャップ二重鎖(Gapped duplex)法等の公知の部位特異的突然変異導入方法によって行うことができ、これらの手法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−ＫやＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を利用することができる。

さらに、本発明は、上記変異体ＰｙｌＲＳの有するアミノ酸配列において、３０６位、３０９位、３４８位及び３８４位以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつＺ−Ｌｙｓをアミノアシル化しうるタンパク質を含む。「１又は数個のアミノ酸」とは、全長アミノ酸残基数の多くとも５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。同様に、本発明の変異体ＰｙｌＲＳは、上記アミノ酸配列中の３０６位、３０９位、３４８位及び３８４位に所定の変異を有し、所望の活性を維持する限り、その他のアミノ酸残基については、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性を有するものも含まれる。

［非天然アミノ酸］
本発明に用いられる非天然アミノ酸としては、例えばＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）誘導体を用いることができる。Ｚ−Ｌｙｓ誘導体は、非天然のアミノ酸であり、リジン側鎖のアルキル部分がリンカーとして働くのでチロシンアナログに比べ柔軟性の高い反応性骨格をもつアミノ酸として適している。Ｚ基はペプチド合成の保護基として一般的に知られているが、ベンゾイル（Ｂｚ）基よりも可変性が高いうえ側鎖に酸素を含むため水溶性が比較的高く水溶液条件下でも扱いやすい。またＺ基は接触水素還元という温和な条件で脱保護できることから、クロスリンカー型Ｚ−Ｌｙｓ誘導体によって架橋化したタンパク質同士を安定な状態で分離すること、また反応性官能基を介してタンパク質に結合させた蛍光プローブなどを必要に応じてタンパク質から切り離すことができる。

野生型及び変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）の活性部位へのＺ−Ｌｙｓの結合モデルに基づいて、いくつかの好ましい化合物が得られる。Ｚ基のベンゼン環オルト位は活性部位の外側を向き立体障害を起こしにくいと予想されるため、比較的大きい官能基でも置換が可能である。例えば、オルト位にクロスリンカー（アジド、ジアジリン）、反応性官能基（アルキン）を含むＺ−Ｌｙｓ誘導体やアルキル側鎖に構造解析位相決定用原子（セレン）を含むＺ−Ｌｙｓ誘導体などを挙げることができ、変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）の基質結合部位と適合するようなＺ−Ｌｙｓ誘導体として、Ｎ^ε−オルト−ヨード−ベンジルオキシカルボニル−リジン、ベンジルオキシカルボニル−アミノエチル−セレノシステイン、Ｎ^ε−オルト−エチニル−ベンジルオキシカルボニル−リジン、Ｎ^ε−オルト−アジド−ベンジルオキシカルボニル−リジン、及びＮ^ε−オルト−ジアジリル−ベンジルオキシカルボニル−リジン等が挙げられる（図１２参照）。

［サプレッサーｔＲＮＡ］
上記ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記変異体ＰｙｌＲＳにのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない(orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真正細菌内又は哺乳動物細胞内で発現しなければならない。このようなｔＲＮＡとしては、古細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡが挙げられる。

ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）又はＵＧＡ（オパール）コドンを用いることが好ましい。また、ナンセンスコドンに代えて、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（以下「フレームシフトコドン」という。）を用いることもできる。

このようなｔＲＮＡは、例えば、上記古細菌ゲノムからｔＲＮＡ^Ｐｙｌに対応する遺伝子を取得し、これをそのまま、又は所望の変異を導入してインビトロ又はインビボで発現させて調製することができる。一例として、メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ｔＲＮＡは以下に示す塩基配列を有する。
ｔＲＮＡ^ｐｙｌ：5'-GGAAACCUGAUCAUGUAGAUCGAAUGGACUCUAAAUCCGUUCAGCCGGGUUAGAUUCCCGGGGUUUCCGCCA-3'（配列番号３）

［本発明の変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡ含む発現ベクター及び形質転換細胞］
本発明はまた、上記のようにして得られる変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡを包含する。好ましい実施形態において本発明のＤＮＡは、配列番号１で表される野生型ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡにおいて、３０６位及び３８４位のチロシンに対応するコドン（ＴＡＣ）及び（ＴＡＴ）がそれぞれアラニンに対応するコドン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧ）及びフェニルアラニンに対応するコドン（ＴＴＴ又はＴＴＣ）に置換されたＤＮＡが含まれる。さらに３０６番目のアミノ酸のコドンがグリシンに対応するコドン（ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ又はＧＧＧ）であり、３８４番目のアミノ酸のコドンがヒスチジンに対応するコドン（ＣＡＴ又はＣＡＣ）であってもよい。

また、本発明のＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、かつ３０６位及び３８４位のアミノ鎖のコドンがそれぞれアラニン及びフェニルアラニンに対応するコドンからなるＤＮＡを含む。さらに、上記ＤＮＡ対するＲＮＡ、例えば、上記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ等も含む。

また、上記ＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジンをアミノアシル化しうる変異体ＰｙｌＲＳをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣとは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる。）を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるためにホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。

本発明はまた、上記本発明のＤＮＡを連結(挿入)することにより、変異体ＰｙｌＲＳを発現することのできる発現ベクターを含む。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で上記変異体ＰｙｌＲＳを産生し得るようにベクターに組み込まれることが好ましい。そこで、本発明のベクターには、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）の他に、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

本発明の発現ベクターを用いて形質転換された形質転換細胞、好ましくは真正細菌や真核細胞も本発明に含まれる。ここで、真正細菌とは、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、真核細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。形質転換方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行うことができる。

［Ｚ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質の製造］
こうして得られた変異体ＰｙｌＲＳは、古細菌又は真核生物のサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて、インビトロ又はインビボでのＺ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質の製造に用いることができる。すなわち、（ａ）Ｚ−Ｌｙｓ誘導体に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下でＺ−Ｌｙｓ誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、をＺ−Ｌｙｓ誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とするＺ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質の製造方法が提供される。ここで、ＰｙｌＲＳやサプレッサーｔＲＮＡの合成系としては特に制限されることはなく、任意の発現系を用いることができる。例えば、無細胞タンパク質合成系や真正細菌細胞内におけるタンパク質合成系、或いは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞である。

無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。様々な生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。

大腸菌の抽出液としては、ズベイら(Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973))又はプラットら(Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。

Ｚ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質の合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となる所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｚ−Ｌｙｓ誘導体を含むアミノ酸、本発明の変異体ＰｙｌＲＳ、前記変異体ＰｙｌＲＳの存在下でＺ−Ｌｙｓ誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡ、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、アミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸に加えてホスホセリンを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。

変異体ＰｙｌＲＳを哺乳動物細胞内で発現させるためには、メタノサルシナ・マゼイ由来の野生型ＰｙｌＲＳ遺伝子に、Ｎ末端領域にヒスチジンタグ等が付加するようにしたＤＮＡ配列をＰＣＲ法を用いて増幅し、これを市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）等の発現ベクターのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで構築したプラスミドを哺乳動物細胞に導入すればよい。細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

一方、サプレッサーｔＲＮＡの発現方法としては、特に限定されることなく当業者に公知の方法に従って、大腸菌等の真正細菌内で、又は哺乳動物細胞等の真核細胞内で発現させることができる。例えば、大腸菌内における発現は、サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端にプロモーター配列を、３’末端にターミネーター配列を夫々連結する。真核細胞内でｔＲＮＡを転写するタイプＩＩプロモーターは、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの領域から成り立つ内部プロモーターであり、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ボックスＡのコンセンサス配列は、８位〜１９位のＴＲＧＣＮＮＡＧＹＮＧＧ（配列番号７）であり、ボックスＢのコンセンサス配列は、５２位〜６２位のＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ（配列番号８）である。従って、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラスのサプレッサーチロシンｔＲＮＡのように、そのコーディング配列内にボックスＡとボックスＢが存在している場合は、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができる。しかし、内部プロモーターを持たないサプレッサーｔＲＮＡの場合は、外部プロモーターを用いて真核細胞内で発現させることもできる。例えば、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に、真核生物のｔＲＮＡ核酸配列やＵ１又はＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子のプロモーター配列を結合させることによって動物細胞内で効果的に発現させうる。さらに、異なる実施形態として、Ｔ７ファージ由来のＴ７プロモーターを連結し、動物細胞内でＴ７ＲＮＡポリメラーゼと同時に発現させてもよい。

さらに、本発明は、（ａ）上記細胞抽出液と、（ｂ）Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体からなる非天然アミノ酸と、（ｃ）本発明に係る変異体ＰｙｌＲＳと、（ｄ）前記変異体ＰｙｌＲＳの存在下でＺ−Ｌｙｓ誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、を含むＺ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質合成キットを提供する。上記（ｂ）の非天然アミノ酸は、２０種類の天然のアミノ酸との混合物であってもよい。これらの構成要素は、使用しやすいように一定量ごと分注して、Ｚ−Ｌｙｓ誘導体組み込みタンパク質合成キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書やベクターＤＮＡ等を添付することができる。

［試料の調製と結晶化］
Ｌ−ピロリジン：Ｎ^６−［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イルカルボニル］−Ｌ−リジン（図１Ａ参照）は化学的に合成し、^１Ｈ−ＮＭＲにてその化学構造を確認した。種々のＬ−リジン誘導体は、ＢａｃｈｅｍＡＧ（スイス）から購入した。メタノサルシナ・マゼイ由来のｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、インビトロ転写により合成し、リソースＱカラムクロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社）にて精製した。

完全長のメタノサルシナ・マゼイ由来ＰｙｌＲＳは４５４個のアミノ酸残基からなる分子量５１ｋＤａのタンパク質である。この完全長ＰｙｌＲＳをコードする遺伝子を、メタノサルシナ・マゼイ、ＪＣＭ９３１４株のゲノムＤＮＡ（理研バイオリソースセンター）から以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、ベクタープラスミドｐＥＴ２８ｃ（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＳａｃＩ部位にクローン化した。これを大腸菌に導入して発現させたタンパク質は、Ｎ末端にｐＥＴ２８由来のＨｉｓタグコード領域（ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ）（配列番号４）が付加されている。

Ｎ末端側プライマー：5'-AGGGGTAACCATATGGATAAAAAACCACTAAACAC-3'（配列番号５）
Ｃ末端側プライマー：5'-ACATGGTCCAGAGCTCTTACAGGTTGGTAGAAATCCCGTT-3'（配列番号６）

一方、完全長のＰｙｌＲＳを大腸菌で発現させて結晶を調製したが、Ｘ線構造解析に適した結晶は得られなかったため、Ｎ末端から１８４個のアミノ酸が欠失したＰｙｌＲＳ（以下、これを「ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）」という。図１Ｂ参照。）を作製した。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）タンパク質は、Ｎ末端に付加した６個のヒスチジンタグとの融合タンパク質として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス−ＲＩＬ株（ストラタジジーン社）で発現させた。天然のＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）及びセレノメチオニンで標識したＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）タンパク質は、前述の非特許文献３に記載の方法で精製及び結晶化した。なお、より良い結晶を得るために、次のような、わずかに変更した結晶化条件を用いた。５ｍＭのピロリジン（又は３．４５ｍＭのＢｏｃ−Ｌｙｓ）及び５ｍＭのＡＭＰＰＮＰの存在下に、５％ＰＥＧ４０００（又はＰＥＧ３３５０）及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中において２０℃にて３分以内にＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の共結晶を取得した。

［データ採取］
Ｘ線結晶構造解析用データは、上述の非特許文献３に記載の方法により行い、ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）／ピロリジン／ＡＭＰＰＮＰ複合体結晶からの１．８Åデータセット、及びＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）／Ｂｏｃ−Ｌｙｓ／ＡＭＰＰＮＰ複合体結晶からの１．７９ÅデータセットをＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ４１ＸＵで収集した。

［構造解析］
ＭＡＤ法を用いて位相を決定した。７つのセレン置換部位のうち５つはＳｎＢを用いて局在化し、初期位相はＳＯＬＶＥにより計算した。初期位相は、続いてＲＥＳＯＬＶＥによる密度修飾で改善した。部分的なモデルはＲＥＳＯＬＶＥにより自動的に構築され、残りは主にプログラムＯで構築しＣＮＳで精密化した。立体構造モデルの質はＰＲＯＣＨＥＣＫで解析した。

［アミノアシル化アッセイ］
野生型ＰｙｌＲＳへの突然変異導入はＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異導入キット（ストラタジーン社）を用いて行った。完全長の変異体ＰｙｌＲＳを大腸菌で過剰発現させた後、ＨｉｓＴｒａｐカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて精製した。アミノアシル化反応は、３７℃にて１時間行った。アミノアシル化反応溶液は、２．８３μＭのメタノサルシナ・マゼイ由来精製ＰｙｌＲＳ（又は９μＭのＰｙｌＲＳ（ｃ２７０））、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＡＴＰ、４ｍＭのＤＴＴ、２．１１μＭのメタノサルシナ・マゼイ由来ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ転写物、及び１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した種々のアミノ酸濃縮溶液の適当量である。ｔＲＮＡのアミノアシル化の有無は、酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した。

［全体構造］
メタノサルシナ・マゼイのＰｙｌＲＳは４５４個のアミノ酸残基からなり、メタノサルシナ・バルケリのＰｙｌＲＳと相同性が高い（７４％の同一性）。ＰｙｌＲＳは、主に２つのドメインからなる。約２５０アミノ酸残基のＣ末端側ドメインは、クラス−ＩＩアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素と配列の相同性があるが、約１４０アミノ酸残基のＮ末端側ドメインは独特である（図１Ｂ参照）。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素様ドメインに対応するＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）は、ピロリジンでｔＲＮＡ^Ｐｙｌをエステル化しうる（図１Ｃ参照）。このＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の結晶が成長するためにはＡＴＰアナログの添加が必要であり、ＡＴＰがＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）に固く結合しその構造を安定化すると考えられる。

最初に、ＡＭＰＰＮＰと結合したＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の構造を、セレノメチオニン置換体を用いた多波長異常分散法（ＭＡＤ法）によって決定した。その立体構造は、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＬｙｓＲＳ）を含むクラスＩＩａａＲＳに特徴的であった。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の構造において、Ｎ末端から１９５〜２３７番目の残基は、２つのα−ヘリックス（α１及びα２）を形成し、２４１〜４３２番目の残基が触媒ドメインを構成した（図１Ｄ参照）。触媒ドメインは、伸長した７個のアンチパラレルβ−シート（β１、β５、β６、β７、β８、β９及びβ１０）とそれを取り囲むα−ヘリックスを有し、クラスＩＩａａＲＳに特徴的なトポロジーを示した。

図２は、メタノサルシナ・マゼイＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）と、他のＰｙｌＲＳ及びＬｙｓＲＳとの立体構造に基づくアミノ酸配列のアライメントを示した図である。配列は、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて整列させ、部分的に手動にて最適化した。ＰｙｌＲＳとＬｙｓＲＳとで高度に保存されているアミノ酸残基を枠で囲んだ。整列させた配列の上部には２次構造を模式的に示した。本発明に係る３０６位のチロシンと３８４位のチロシンのアミノ酸置換部位を矢印で示した。整列させた配列上部の数字はメタノサルシナ・マゼイＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）のアミノ酸残基の位置を示し、それらの下部の数字は大腸菌ＬｙｓＲＳのそれを示す。ＭｍＰｙｌＲＳｃはメタノサルシナ・マゼイＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）；ＭｂＰｙｌＲＳはメタノサルシナ・バルケリＰｙｌＲＳ（ＡＡＬ４０８６７）；ＭａＰｙｌＲＳはメタノサルシナ・アセチボランスＰｙｌＲＳ（ＡＡＭ０３６０８）；ＭｔＰｙｌＲＳはメタノサルシナ・サーモフィラＰｙｌＲＳ；ＤｈＰｙｌＲＳｃはデサルフィトバクテリウム・ハフニエンスＰｙｌＲＳ（ＡＡＵ９３５０７）；ＥｃＬｙｓＵは大腸菌ＬｙｓＲＳ（ＡＡＡ９７０２９）；ＭｍＬｙｓＲＳはメタノサルシナ・マゼイのクラスＩＩＬｙｓＲＳ（ＡＡＫ２９４０４）；ＨｓＬｙｓＲＳはヒトの細胞質ＬｙｓＲＳ（ＡＡＨ０４１３２）を表す。

［ピロリジン及びＡＴＰの認識］
次に、ピロリジン及びＡＭＰＰＮＰと複合体を形成したＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の結晶構造から、ＰｙｌＲＳのアミノ酸結合部位は正規のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のそれよりもはるかに大きいことが分かった。ピロリジン分子は、クラス−ＩＩアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素に特徴的な７個のアンチパラレルβ−シートの表面に結合していた。嵩高い４−メチル−ピロリン環は、Ａｌａ−３０２、Ｌｅｕ−３０５、Ｔｙｒ−３０６、Ｌｅｕ−３０９、Ｃｙｓ−３４８、Ｖａｌ−４０１、Ｌｅｕ−４０７、Ｉｌｅ−４１３及びＴｒｐ−４１７を含む主として疎水性の残基によって形成されるトンネルに収容されている（図３Ａ及び図３Ｃ参照）。Ａｓｎ−３４６側鎖のアミド部分は、基質アミノ酸の方に向いており２．８２Åの距離でピロリジンの側鎖カルボニル基と水素結合を形成し、その位置を固定している。なお、ピロリジンがアキシアル型の立体異性体の場合、Ａｓｎ−３４６側鎖のアミド部分とピロリジンの側鎖カルボニル基との間の距離は２．８１Åであった（図３Ｅ及び図３Ｆ参照）。また、Ａｓｎ３４６の側鎖のカルボニル基は水を介してピロリジンのα−アミノ基と間接的に水素結合している。高度に保存されたＡｒｇ−３３０のグアニジウム基は、ピロリジンのα−カルボニル基と水素結合している。Ａｓｎ−３４６及びＡｒｇ−３３０によるこれら３つの水素結合以外に他の水素結合は存在せず、ＰｙｌＲＳのこのようなアミノ酸認識様式は極めて特徴的である（図３Ｃ参照）。上記ピロリジンを収容するトンネルを形成する夫々のアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体ＰｙｌＲＳのアミノアシル化活性を測定すると、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３４６位のアスパラギン、４０１位のバリン及び４１７位のトリプトファンを夫々アラニンに置換した５つの変異体は著しく活性が低下していた（図３Ｂ参照）。

［ＰｙｌＲＳ活性部位とＬｙｓＲＳ活性部位との比較］
ＰｙｌＲＳの構造及び基質結合様式について、大腸菌のＬｙｓＲＳのそれらと比較した。大腸菌ＬｙｓＲＳの活性部位においては、高度に保存された残基（Ｇｌｕ−２４０、Ａｒｇ−２６２、Ｇｌｕ−２７８、Ｔｙｒ−２８０、Ａｓｎ−４２４、Ｐｈｅ−４２６及びＧｌｕ−４２８）が、Ｌ−Ｌｙｓの認識に関与している（図３Ｄ参照）。これらの残基に変異を導入するとＬｙｓＲＳの基質であるＬ−Ｌｙｓに対するＫｍ値が顕著に増大する。これに対し、メタノサルシナ・マゼイＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）では、Ａｒｇ−２６２が保存されているだけであり、その他の部位はより小さな、非荷電アミノ酸残基で占められている（夫々Ａｌａ−３０２、Ａｓｎ−３４６、Ｃｙｓ−３４８、Ｓｅｒ−３９９、Ｖａｌ−４０１及びＧｌｙ−４０３）。これらのアミノ酸置換によって、ＰｙｌＲＳのアミノ酸結合部位（トンネル）はＬｙｓＲＳにおけるＬ−Ｌｙｓ結合ポケットよりも８〜９Å深くなっている（図３Ａ参照）。上述したように、ピロリジンとＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）との間では３つの水素結合のみが形成されているのに対し、Ｌ−ＬｙｓとＬｙｓＲＳとの間には少なくとも７つの水素結合が形成されている。リジン部分と相互作用する水素結合が少ないことは、ＰｙｌＲＳがＬ−Ｌｙｓを基質として活性化することを困難にしている。実際、ＰｙｌＲＳは１ｍＭの濃度のピロリジンでｔＲＮＡ^Ｐｙｌを活性化するが、０．５Ｍの濃度でもリジンを含む２０種類の正規のアミノ酸を活性化することができない。興味深いことに、ＰｙｌＲＳによるピロリジンの認識は、リジンの側鎖に対応する部分が主鎖とメチルピロリンカルボニル部分との間のスペーサーとして働いている。疎水的な深いトンネルとリジン部分に対する弱い認識とがＰｙｌＲＳ及びＬｙｓＲＳの基質認識における大きな違いである。

［ＰｙｌＲＳによる非天然アミノ酸の活性化］
ＰｙｌＲＳの基質結合部位の立体構造から、ＰｙｌＲＳはピロリジン以外の非天然アミノ酸を活性化しうることが推測された。この仮説に基づいて、ＰｙｌＲＳが図４Ａに示した６種類のＮ^ε−リジン誘導体を活性化しうるかどうかを調べた。その結果を図４Ｂに示す。各レーンは、ＰｙｌＲＳの存在下、左から順に次のような条件でアミノアシル化反応を行ったものである。アミノ酸無添加；０．５ＭのＬｙｓ；１００ｍＭのＡｃ−Ｌｙｓ；１ｍＭのＢｏｃ−Ｌｙｓ；１ｍＭのＡｌｏｃ−Ｌｙｓ；１０ｍＭのＮｉｃ−Ｌｙｓ；７ｍＭのＮｍａ−Ｌｙｓ；３．５ｍＭのＺ−Ｌｙｓ；１ｍＭピロリジン；及びコントロールｔＲＮＡ^Ｐｙｌである。図４Ｂに示したように、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−リジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）及びアリルオキシカルボニル−リジン（Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ）については、１ｍＭの濃度においてピロリジンと同程度の効率で活性化した。さらに、効率は多少低下するが、野生型ＰｙｌＲＳは、Ｎ^ε−アセチル−Ｌ−リジン（Ａｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ^ε−ニコチニル−Ｌ−リジン（Ｎｉｃ−Ｌｙｓ）、Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（Ｚ−Ｌｙｓ）及び蛍光アミノ酸であるＮ^ε−（Ｎ−メチル−アントラニロイル）−Ｌ−リジン（Ｎｍａ−Ｌｙｓ）等のＮ^ε−修飾リジン誘導体でｔＲＮＡ^Ｐｙｌをエステル化することが分かった。一方、野生型ＰｙｌＲＳは、メチル、ジメチル、トリメチル、イソプロピル、ダンシル、ｏ，ｐ−ジニトロフェニル、ｐ−アジドベンゾイル、ビオチニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、及びｐ−トルエンスルホニル基でＮ^ε−連結したリジン誘導体を活性化することはできなかった。従って、ＰｙｌＲＳは、ある程度の嵩高さを有するＮ^ε−置換体を認識することが分かった。

先に作製した変異体ＰｙｌＲＳについて、Ｂｏｃ−Ｌｙｓを基質としてアミノアシル化活性を測定したところ、天然の基質であるピロリジンと同様に、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３４６位のアスパラギン、４０１位のバリン及び４１７位のトリプトファンを夫々アラニンに置換した５つの変異体は著しく活性が低下していた。興味深いことに、１つの変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）は、野生型ＰｙｌＲＳよりも極めて効率的にＺ−ＬｙｓでｔＲＮＡ^Ｐｙｌをエステル化することが分かった（図５Ｃ参照）。この３０６位のチロシンからアラニンへ置換される変異は、ＰｙｌＲＳの基質結合部位にベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基が収容されるための適切な空洞を生成するものと考えられる（図５Ａ及びＢ参照）。

［Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡ合成酵素の選択］
インビトロにおけるアミノアシル化アッセイの結果、野生型ＰｙｌＲＳはＢｏｃ−Ｌｙｓ等のリジン誘導体をアミノアシル化したにもかかわらず、大腸菌細胞内ではこれらの誘導体を効率的にタンパク質に組み込むことができなかった。そこで、インビボにおいてタンパク質へＢｏｃ−Ｌｙｓを効率的に組み込むことのできる変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）を以下のような方法にてスクリーニングした。

完全長のＰｙｌＲＳ遺伝子は、プラスミドｐＴＫ２−１において大腸菌ＴｙｒＲＳプロモーターとターミネーターの制御下で発現させた。このプラスミドｐＴＫ２−１は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４の誘導体であって、カナマイシン耐性遺伝子と大腸菌ｌｐｐプロモーターの制御下で１コピーのｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子を発現する。ＰｙｌＲＳ遺伝子は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＰＣＲ変異導入キット（ストラタジーン社）を用いて無作為に１ｋｂあたり３〜７個の割合で変異を導入し、元のプラスミドｐＴＫ２−１と連結してＰｙｌＲＳライブラリーを作製した。連結したベクターは大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピーテントセルに形質転換し、６×１０^７個のコロニー形成単位のライブラリーを取得した。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子もまた、プラスミドｐＴＫ２−１におけるｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下において大腸菌ＤＨ１０Ｂ中で発現させた。変異体ＰｙｌＲＳライブラリーは、最初に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須な位置に設けたアンバーストップコドンの抑制（サプレッション）に基づいて正の選択を行った。変異体ＰｙｌＲＳライブラリー及び野生型ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子で形質転換した細胞を１ｍＭのＢｏｃ−Ｌｙｓを含む培地中で生育させ、種々の濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存するものをスクリーニングした。生存細胞は、次にクロラムフェニコールの存在下かつＢｏｃ−Ｌｙｓの非存在下で生育させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓの非存在下では、選択された変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）を発現する細胞は２５μｇ／ｍｌ未満のクロラクフェニコール濃度でしか生存しないが、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ存在下では、１５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール濃度でも生存した。ＰｙｌＲＳ非存在下の大腸菌のＣＡＴ耐性能（＜１３μｇ／ｍｌ）と比較すると、これらの結果は選択された変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）はＢｏｃ−Ｌｙｓを受け入れるだけでなく、何れかの天然型アミノ酸もある程度アミノアシル化することを示す。

［大腸菌内におけるリジン誘導体依存性アンバーサプレッション］
大腸菌内においてアンバーサプレッション（アンバー変異抑制）が起こるか否かを確認するために、Ｎ末端から２５番目のチロシンコドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）に変異したグルタチオンＳ−トラスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子をｐＥＴ系プラスミドにクローン化した。一方、野生型及び種々の変異体ＰｙｌＲＳ遺伝子、並びにｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子をｐＡＣＹＸ系プラスミドにクローン化した（図６参照）。これら２つの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシンとアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にて一晩静置培養した。生育したコロニーをリジン誘導体の存在又は非存在下でカナマイシンとアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で培養して培地の吸光度が０．６になったとき最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。一晩培養して発現を誘導した後、大腸菌を回収して発現されたＧＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。その結果、夫々４ｍＭのＢｏｃ−Ｌｙｓ及びＡｌｏｃ−Ｌｙｓの存在下に変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）とｔＲＮＡ^Ｐｙｌとを発現させたときに２８ｋＤａのＧＳＴタンパク質の発現が認められた（図７参照）。５ｍＭのＺ−Ｌｙｓ存在下において、二重変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ／Ｙ３０６Ａ）とｔＲＮＡ^Ｐｙｌとを発現させたときにも完全長のＧＳＴタンパク質の産生が認められた（図８参照）。培養液１０ｍｌから回収した大腸菌に緩衝液Ａ（リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）１ｍｌを加えて超音波破砕し、遠心分離して得られた上清にグルタチオンアフィニティーカラム（ＧＳＴｒａｐ、アマシャムバイオサイエンス社）２００μｌを加え、４℃にて１時間攪拌後、緩衝液Ａで３回洗浄し、２０ｍＭグルタチオンを含む緩衝液ＡでＧＳＴタンパク質を溶出した。このようにして精製したＧＳＴの収率は培養液１Ｌあたり１〜２ｍｇのタンパク質であった（図９参照）。精製したＧＳＴタンパク質をトリプシン分解後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法にて解析した。トリプシン消化により生ずるペプチドＮＳＸＳＰＩＧＹＷＫ（Ｘは夫々Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ及びＺ−Ｌｙｓを表す）に対応する検出ピークはｍ／ｚ＝１３９２．７４、１３７６．７９及び１４２６．７０Ｄａであり、何れも理論値とよく一致し、野生型トリプシンペプチドＮＳＹＳＰＩＬＧＹＷＫ（ｍ／ｚ＝１３２７．７２Ｄａ）よりも夫々６５．０２、４９．０７及び９８．９８だけ大きかった（図１０参照）。図１０に示した質量スペクトルからの配列情報は、これらの非天然アミノ酸が部位特異的にＧＳＴタンパク質へ導入されたことを示す。

［ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）とｔＲＮＡとの結合様式］
ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）が、ｔＲＮＡのアミノアシル化活性を維持することは注目に値する（図１Ｃ参照）。これは、ｔＲＮＡ^ＰｙｌがＮ末端ドメインを欠失したＰｙｌＲＳに結合し得ることを示す。ｔＲＮＡ^Ａｓｐと複合体を形成した大腸菌アスパラギン酸−ｔＲＮＡ合成酵素の立体構造に、ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の触媒活性部位を重ね合わせ、ｔＲＮＡ^Ａｓｐを酵母のｔＲＮＡ^Ｐｈｅと置換したドッキングモデルを作成した。これによれば、ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）はｔＲＮＡのアクセプターステム及びＤ−アームと接触する。α１及びα２ヘリックスは、１つのｔＲＮＡプロトマーのＤ−アームに隣接し、ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）とＴ−アーム及びアンチコドンアームとの間には相互作用が認められなかった。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌの構造は、正規のｔＲＮＡ^Ｐｈｅと比べて著しく異なった特徴を示し、例えば図１１Ａに示したようにたった５塩基からなる小さなＤ−ループを有する。ＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）のＮ末端ヘリックスがＴ−アームの方向に向けて突き出していることから、メタノサルシナ・マゼイの完全長ＰｙｌＲＳは、ｔＲＮＡ^ＰｙｌのＴ−アームと接触しているかもしれない。さらに、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの配列を異なる配列に変えた変異体を作製したところ、これらの何れもＰｙｌＲＳの酵素活性に影響を与えなかったことから、ＰｙｌＲＳは、ｔＲＮＡのアンチコドンループとは相互作用せず、アンチコドンをほとんど認識する必要がないことが分かった（図１１Ｂ参照）。

［Ｚ−Ｌｙｓ特異的な変異体ＰｙｌＲＳのスクリーニング］
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ及びＡＭＰＰＮＰと複合体を形成したＰｙｌＲＳ（ｃ２７０）の立体構造に基づいて、Ｚ−Ｌｙｓ特異的な変異体ＰｙｌＲＳを以下の方法によりスクリーニングした。当該複合体の立体構造から、Ｂｏｃ−Ｌｙｓの側鎖と近接した位置にあるＰｙｌＲＳのアミノ酸残基を選択し、飽和突然変異誘発(saturation mutagenesis)を行った。大きなＺ−Ｌｙｓ基を認識するためには、ＰｙｌＲＳのアミノ酸認識ポケットの末端部が伸長及び拡張しなければならない。ＰｙｌＲＳとＢｏｃ−Ｌｙｓ複合体の構造において、Ｔｙｒ３０６、Ｌｅｕ３０９、Ｃｙｓ３４８及びＴｒｐ４１７がポケットの末端部を構成する。しかし、ＰｙｌＲＳのＴｒｐ４１７を他のアミノ酸に置換した場合には酵素活性が失われることから、残りの３つのアミノ酸残基のコドンをＮＮＫ（Ｎは４種類の任意の塩基を表し、ＫはＧ又はＴを表す。）で置換した変異体酵素のライブラリーを作製した（２．３×１０６個の独立した形質転換体を含む。）。

具体的には、Ｂｏｃ−Ｌｙｓに対するアミノアシル化活性の向上したＲ６１Ｋ、Ｇ１３１Ｅ及びＹ３８４Ｆ変異体ＰｙｌＲＳ遺伝子を、ｐＢＲ３２２複製開始点とカナマイシン耐性遺伝子とを含むプラスミドｐＢＲＱ１のｇｌｎＳプロモーターの制御下にクローン化した。このＰｙｌＲＳ遺伝子の３０６位、３０９位及び３４８位のコドン配列をＮＮＫ（Ｎは４種類の任意の塩基を表し、ＫはＧ又はＴを表す。）で無作為に置換したＤＮＡ断片を合成し、ＰＣＲによって増幅した。これらをオーバーラップＰＣＲ法にて組み立て、プラスミドｐＢＲＱ１のｇｌｎＳプロモーターの下流に挿入した。これらのプラスミドを、アンバー変異を有するＣＡＴ遺伝子（Ａｍ１１２）及びｌｐｐプロモーターの制御下にｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含むプラスミドを保持する大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入した。ポジティブ選択としては、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１ｍＭのＺ−Ｌｙｓを含むＬＢプレートで選択し、プラスミドＤＮＡを抽出及びアガロースゲル電気泳動で精製した。続いて、得られたプラスミドＤＮＡを、細菌毒素であるバルナーゼ(barnase)遺伝子翻訳領域の２位、４４位及び６５位にアンバーコドンを含み、ａｒａＣプロモーターにて制御されたＤＮＡを含むｐＡＣＹＣ１８４由来プラスミドを保持した大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入した。ネガティブ選択として、これらの細胞は０．０２％アラビノースを含むＬＢプレート上にてインキュベートした。ポジティブ選択を３回、及びネガティブ選択を２回繰り返した。

その結果、７５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールによるポジティブ選択によって、最終的に５つの異なる変異体が得られた。これらの５つの変異体のうち、Ｌ３０９Ａ及びＣ３４８Ｖの二重アミノ酸置換を有する酵素（以下、Ｚ−ＬｙｓＲＳと称する。）をもつ細胞は、アンバー抑制ＧＳＴを最も大量に発現し（１ｍＭのＺ−Ｌｙｓを含むＭ９ＧＭＭＬ培地中において６．９ｍｇ／Ｌ培地）、一方、Ｚ−Ｌｙｓ無添加の条件ではほとんど発現が認められなかった（図１３参照）。図１３は、実施例１で得られた変異体ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ）と、本実施例で得られたＺ−ＬｙｓＲＳとを用いて、２種類の非天然アミノ酸Ｚ−Ｌｙｓ又は２−クロロ−Ｚ−Ｌｙｓを添加してアンバー抑制された完全長ＧＳＴの発現を調べた結果である。図の上部は大腸菌粗抽出液について、下部は精製したＧＳＴ溶液について、それぞれ１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離、ＣＢＢ染色した結果である。それぞれの条件における収率（Ｍ９ＧＭＭＬ培地１ＬあたりのＧＳＴ発現量ｍｇ）を、ブラッドフォードの方法（バイオラッド社プロテインアッセイキット使用）に従って測定し、その結果を上下２つのゲルの間に示した。図中、Ｎ．Ｄ．は検出不可を示す。

精製したＧＳＴタンパク質をトリプシン分解後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法にて解析した結果、ＮＳＸＳＰＩＧＹＷＫ（ＸはＺ−Ｌｙｓ残基、ｍ／ｚ＝１４２６．７５Ｄａ）に対応するペプチドピークのみが検出され、その他のアミノ酸が組み込まれたペプチドのピークは検出されなかった。従って、本実施例で得られた変異体酵素Ｚ−ＬｙｓＲＳ（Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８Ｖ）は、Ｚ−Ｌｙｓに特異的であることが分かった。また、図１３に示したように、Ｚ−ＬｙｓＲＳは、Ｙ３０６ＡよりもＺ−Ｌｙｓの導入効率が高く、また、基質としての２−クロロ誘導体の取り込み量は反対に少ないことから、Ｚ−Ｌｙｓに対する特異性がより高いと考えられる。

［大腸菌におけるＮ^ε‐オルト‐アジド‐ベンジルオキシカルボニル−リジン（ＡｚＺＬｙｓ）のＧＳＴタンパク質への導入及び蛍光修飾反応］
Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆの二重アミノ酸置換を有するＰｙｌＲＳ変異体とｔＲＮＡ^Ｐｙｌを大腸菌で発現させるために、実施例１と同じプラスミドｐＴＫ２−１を使用した。このプラスミドを用いたＮ末端から２５番目にアンバーコドンを持つＧＳＴへのリジン誘導体の導入は、実施例１と同じ方法によって行った。更に、同じプラスミドを用いたＧＳＴのアンバー部位へのＡｚＺＬｙｓ［新成化学(大阪)から購入］の特異的導入も、実施例１と同じ方法によって行った。次いで、ＧＳＴのアンバー遺伝子を発現させた大腸菌から得られた粗抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、染色した。その結果、１ｍＭのＡｚＺＬｙｓ存在下（＋）の場合にのみ、完全長ＧＳＴの発現が検出された（そのバンドの位置は図１４に矢印ＧＳＴで示した）。なお、ＧＳＴの精製も実施例１と同じ方法で行った。

蛍光団とトリ・アリール・フォスフィンとのコンジュゲートと、精製された完全長ＧＳＴとは、Staudinger-Bertozzi反応によって連結した。コンジュゲートしてはＦＩＴＣとのコンジュゲート（以下ＦＩＴＣ−ＰＰ３という）（新成化学から購入）を用いた。図１５に、ＦＩＴＣ−ＰＰ３の化学構造を示す。連結反応は、２通りの反応条件、即ち、３７℃で１時間（１ｈｒ）及び４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）によって行った。次いで、これらのＧＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＵＶライトで蛍光を検出した。その結果、３７℃で１時間の反応条件の場合にのみ、蛍光修飾されたＧＳＴが認められた（そのバンドの位置は図１６に矢印ＧＳＴで示した）。Staudinger- Bertozzi反応については、上掲非特許文献５、６等参照。この結果は、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ）変異体を用いることにより、大腸菌内における所望の部位へのＡｚＺＬｙｓの特異的導入が可能であること、及び、導入されたＡｚＺＬｙｓとフォスフィンとの反応により、（任意の）タンパク質［ＧＳＴタンパク質］への蛍光団を含む任意の修飾基の導入が可能であることを示している。

［動物細胞におけるＡｚＺＬｙｓのＧｒｂ２タンパク質への導入及び蛍光修飾反応］
ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ）変異体とｔＲＮＡ^ＰｙｌをＨＥＫｃ−１８細胞で発現するために、上掲非特許文献７に記載されたシステムを用いた。同様に、該非特許文献７に記載されたｌａｃＺ遺伝子及びＧＲＢ２遺伝子のコード領域にアンバー・コドンを導入した変異遺伝子並びにそれらの発現システムを用いた。

まず、動物細胞においてＡｚＬｙｓをタンパク質に部位特異的に導入するために最適なＡｚＬｙｓの濃度を決定した。０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５及び０．５ｍＭのＡｚＺＬｙｓを含有する培地においてｌａｃＺアンバー遺伝子からのＬａｃＺタンパク質の発現を行い、ＬａｃＺによる発色反応によりＬａｃＺの発現量（相対値）を求めた。その結果、培地に添加したＡｚＺＬｙｓの濃度が０．０５ｍＭの場合に、最も効率よくＡｚＺＬｙｓがｌａｃＺのアンバー部位に取り込まれることが分かった（図１７）。図１７中のＷＴは、コード領域中にアンバーコドンを持っていない野生型（ＷＴ）のｌａｃＺの発現量（相対値）を示す。ＷＴの結果との比較により、ＡｚＺＬｙｓの濃度が０．０５ｍＭの場合のサプレッション効率は３０％程度であることがわかる。

ＧＲＢ２のアンバー遺伝子を発現させた動物細胞の粗抽出液に蛍光フォスフィン・コンジュゲート（ＦＩＴＣ−ＰＰ３）を添加して、Ｇｒｂ２タンパク質の蛍光標識をおこなった。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離を行い、蛍光検出器によって蛍光を検出した（図１８のレーン１〜３）。図１８中、ａａＲＳはＺＬｙｓＲＳの発現の有無（＋は発現有り）、Ｇｒｂ２はＧＲＢ２のアンバー遺伝子の発現の有無（Ａｍは発現有り）、ｔＲＮＡはｔＲＮＡ^Ｐｙｌの発現の有無（＋は発現有り）、及びａ．ａ．はＡｚＺＬｙｓの添加の有無（＋は添加）を示す。図１８から明らかなとおり、ａａＲＳ（＋）、Ｇｒｂ２（Ａｍ）、ｔＲＮＡ（＋）かつａ．ａ．（＋）の場合（レーン３）にのみ、蛍光で標識されたＧｒｂ２タンパク質が検出された（そのバンドの位置は矢印Ｇｒｂ２で示した）。なお、レーン１はＷＴのＧＲＢ２遺伝子を用いた場合の結果を示すが、図１８から明らかなとおり、蛍光標識されたバンドは現れなかった。対照として、ｐａｒａ‐アジドフェニルアラニン（以下ＡｚＦという）をＧｒｂ２タンパク質の同じ部位に導入した。ＡｚＦ特異的酵素（ＡｚＦＲＳ）を用いて動物細胞においてＡｚＦをアンバー部位に導入するために、上掲非特許文献８に記載されたシステムを用いた。図１８から明らかなとおり、ＡｚＦＲＳを用いてもＧｒｂ２は蛍光修飾されたが（レーン５；そのバンドの位置は矢印Ｇｒｂ２で示した）、同時に、ＡｚＦＲＳも蛍光修飾された（レーン５及び６；そのバンドの位置は矢印ＡｚＦＲＳで示した）。このため、蛍光の検出だけでは、Ｇｒｂ２とＡｚＦＲＳの区別することはできず、利便性が悪いことがわかる。

上記の結果は、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ）変異体を用いることにより、動物細胞内における所望の部位へのＡｚＺＬｙｓの特異的導入が可能であること、及び、導入されたＡｚＺＬｙｓとフォスフィンを反応させることにより、（任意の）タンパク質［ＧＳＴタンパク質］への、蛍光団を含む任意の修飾基の導入が可能であることを示している。上記の結果は、更に、この実施例で用いた本発明のシステムは、従来のＡｚＦＲＳを用いてＡｚＦをタンパク質に導入するシステムと比べて、修飾の選択性が優れていることを示している。

本発明の変異体ＰｙｌＲＳは、これまで不可能であったＺ−Ｌｙｓ誘導体のような非天然アミノ酸を部位特異的にタンパク質に導入することを可能とし、新しいアロタンパク質を合成するために有用である。本発明は、このような手段を提供することにより、タンパク質の構造と機能の解析を通じて、複雑な生命現象の理解を促進し、医薬、生命科学分野における産業にとって有用である。
本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。

Claims

配列番号２に示したピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列においてピロリジン結合部位を構成する３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、及び３４８位のシステインから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された変異体酵素であって、当該アミノ酸置換が、
３０６位のチロシンからグリシン又はアラニンへ、
３０９位のロイシンからグリシン又はアラニンへ、及び
３４８位のシステインからバリン、セリン又はアラニンへ、
の置換である変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
さらに３８４位のチロシンからフェニルアラニン若しくはヒスチジンへのアミノ酸置換を含む請求項１に記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
前記アミノ酸置換が、３０６位のチロシンからアラニンへ、及び３８４位のチロシンからフェニルアラニンへの二重置換を含む請求項２に記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
前記アミノ酸置換が、３０９位のロイシンからアラニンへ、及び３８４位のチロシンからフェニルアラニンへの二重置換を含む請求項２に記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
前記アミノ酸置換が、３０９位のロイシンからアラニンへ、３４８位のシステインからバリンへ、及び３８４位のチロシンからフェニルアラニンへの三重置換を含む請求項２に記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
請求項１〜５何れか記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素において、３０６位、３０９位、３４８位及び３８４位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジンをアミノアシル化しうることを特徴とする変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
野生型ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２に示したアミノ酸配列の相同体であるメタノサルシナ属由来のピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素において、前記相同体のアミノ酸配列と配列番号２に示したアミノ酸配列とをアライメントしたとき、配列番号２に示したアミノ酸配列の３０６位に対応するチロシンがアラニンに置換され、及び／又は３８４位に対応するチロシンがフェニルアラニンに置換されてなる変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素。
請求項１〜７何れか記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする単離されたＤＮＡ。
宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で請求項１〜７何れか記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素を産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、請求項８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
請求項９に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする真正細菌。
請求項９に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
請求項９に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする哺乳動物培養細胞。
（ａ）Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体を活性化しうるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｂ）前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下でＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、
（ｃ）所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を前記Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。
前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、請求項１〜５何れか記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素である請求項１３に記載の方法。
前記Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体が、Ｎ^ε−オルト−ヨード−ベンジルオキシカルボニル−リジン、ベンジルオキシカルボニル−アミノエチル−セレノシステイン、Ｎ^ε−オルト−エチニル−ベンジルオキシカルボニル−リジン、Ｎ^ε−オルト−アジド−ベンジルオキシカルボニル−リジン、又はＮ^ε−オルト−ジアジリル−ベンジルオキシカルボニル−リジンである請求項１３又は１４に記載の方法。
（ａ）細胞抽出液と、
（ｂ）Ｎ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体からなる非天然アミノ酸と、
（ｃ）請求項１〜７何れか記載の変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素と、
（ｄ）前記変異体ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素の存在下でＮ^ε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡと、を含む非天然アミノ酸組み込みタンパク質合成キット。