CN102838663B - 定点突变和定点修饰的病毒膜蛋白、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G（VSV G）基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有光交联性质的非天然氨基酸DiZPK定点突变到VSV G的特定位点。在病毒与宿主细胞相互作用过程中，用365nm紫外光引发DiZPK的光交联反应，在VSV G与相互作用蛋白间形成共价键，避免了相互作用的解离，为病毒与宿主间蛋白相互作用的研究提供有力的手段。
Description
技术领域
发明涉及在水泡性口炎病毒的包膜蛋白G（VSV G）基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有光交联性质的非天然氨基酸DiZPK定点突变到VSV G的特定位点。在病毒与宿主细胞相互作用过程中，用365nm紫外光引发DiZPK的光交联反应，在VSV G与相互作用蛋白间形成共价键，避免了相互作用的解离，为病毒与宿主间蛋白相互作用的研究提供有力的手段。
背景技术
水泡性口炎病毒及其膜蛋白VSVG
水泡性口炎病毒（VSV）是弹状病毒科（Rhabdoviridae）的一种，其是单负链RNA包膜病毒，基因组大小在11,000-12,000个碱基；编码5个蛋白质分子:L蛋白，磷酸蛋白，M蛋白，N蛋白，G蛋白；这五种蛋白的组成VSV结构如图1所示。其中G蛋白（VSV G）被命名为Ⅲ型病毒融合蛋白，在病毒表面形成钉状三聚体结构，介导病毒与宿主细胞受体的识别和宿主细胞对病毒的内吞，以及病毒包膜与宿主细胞膜的融合，在VSV的感染过程中起到首要作用。VSV G（Indiana）共有495个氨基酸残基，其中N端的446个氨基酸残基在病毒膜外，该部分也是病毒抗体的识别区域。
编码VSVG基因的序列：
AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTGA（SEQ ID NO：1）
VSVG蛋白氨基酸序列
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK（SEQ ID NO：2）
病毒蛋白相互作用
病毒是人类面临的重大威胁之一，在病毒的进化过程中，不断产生基因的变异和蛋白的改变，产生新的病毒亚型，从而获得在动物和人之间传播的能力，进而可能引发严重全球性传染病。人类对病毒研究和抗病毒的实验从未停止，病毒与宿主间蛋白相互作用是抗病毒药物研究在重要靶点，目前，用于病毒与宿主间蛋白相互作用的研究方法大致有：cDNA文库技术；噬菌体展示技术;酵母双杂交技术；免疫沉淀和免疫共沉淀技术；病毒蛋白铺覆蛋白免疫印迹技术等。而以上的研究的蛋白间相互作用是以非共价键结合的形式存在的，例如盐键、疏水作用等，在蛋白质发挥生物功能，特别是在受体识别与信号传递过程中，蛋白质间的结合是弱结合并且动态变化的，因此用传统的蛋白间相互作用的研究方法，往往无法解决蛋白间瞬时作用和弱作用的难题，病毒与宿主间蛋白相互作用正是难题之一。
密码子扩展技术
Lei Wang等人开发了基因密码子扩展技术，实现了在活细胞内位点特异性地将非天然氨基酸插入到蛋白质分子中。基因密码子扩展技术体系中包含三个要素：氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS）、tRNA和非天然氨基酸（Unnatural Amino Acids,UAA），它们三者间是生物正交关系，即三者是一一对应关系，编码UAA的tRNA不能被内源性的aaRS识别，只能被引入的aaRS识别；aaRS也不能识别内源性的tRNA和氨基酸，只能识别引入的tRNA和UAA。引入的tRNA通过识别在目标蛋白基因上定点突变的TAG密码子，将非天然氨基酸插入到蛋白的特异位点上（见图2）。
发明内容
本课题针对传统的蛋白-蛋白相互研究方法无法有效地研究病毒与宿主间蛋白弱相互作用和瞬时相互作用这一难题，通过基因密码子扩展技术，将非天然氨基酸DiZPK定点引入到VSV G蛋白中，并实现了定点突变VSVG的细胞内表达，定点突变的非天然氨基酸DiZPK具有光交联特性，根据这一特性可以通过光交联技术将定点突变的VSVG蛋白上的非天然氨基酸与相互作用蛋白转化为共价键结合蛋白，之后通过分离纯化、质谱鉴定，获得潜在的与VSV G相互作用的蛋白。
简而言之，本发明提供了在VSVG蛋白上定点突变引入光敏感的非天然氨基酸，在细胞内表达突变后的VSVG后能够通过光照使所述突变蛋白与在细胞内的结合蛋白以共价键结合，为发现VSVG新的结合蛋白提供了有效手段。
具体地，本发明提供了下述技术方案：
在本发明的一个实施方案中，结合VSV G的蛋白晶体结构和蛋白的疏水性分析，在VSV G的膜外部分的24个不同的位点引入琥珀密码子TAG，通过定点突变的方式构建能够位点特异地编码光交联非天然氨基酸DiZPK的VSV G表达质粒。
在本发明另外一个实施方案中，在已构建的VSV G表达质粒的基础上，进一步在VSV G的C端加入Flag标签，为VSV G及光交联复合物的分离纯化提供亲和纯化手段。
在本发明的一个实施方案中，使定点突变的编码DiZPK的VSV G蛋白能够在293T细胞中高效表达，用VSV抗体和Flag抗体同时检测；发现编码DiZPK的VSV G蛋白的高效表达，为研究与VSV G相互作用蛋白奠定了基础。
在本发明另外一个实施方案中，通过在293T细胞中表达位点特异性编码DiZPK的VSV G蛋白，并通过紫外光照引发光交联反应，获得VSVG与相互作用蛋白间的共价交联产物，通过蛋白免疫印迹鉴定的多个位点可以光交联到蛋白。
在本发明的一个实施方案中，通过免疫沉淀分离纯化VSV G光交联产物，并进行LC-MS/MS检测。依据质谱结果检索到了多个蛋白分子，其中MAP4和Bip蛋白与VSV的生命周期相关，为进一步的研究提供了重要信息。
在本发明另外一个实施方案中，将基因密码子扩展技术运用到病毒包膜蛋白与宿主蛋白相互作用的研究中。
更为具体地，在本发明的一个技术方案中，通过基因密码子扩展技术成功地将DiZPK定点插入到VSV G的不同位置，用365nm紫外光引发光交联反应，通过对光交联产物的分离纯化，结合LC-MS/MS鉴定技术，发现4潜在的与VSV G蛋白能发生相互作用蛋白，包括Bip蛋白、MAP4蛋白、hnRNP U蛋白和NRP1蛋白，而此前已有研究表明Bip蛋白与VSV G相互作用，本发明中Bip蛋白发现，证明基因密码子技术用于蛋白相互作用的研究是可行的；由研究报道MAP4蛋白、hnRNP U蛋白和NRP1蛋白分别参与病毒的生命过程，然而对于三种蛋白在VSV病毒生命周期中的作用未见报道，值得探索。
更为具体地，本发明提供了下述技术方案：
1.定点突变的水泡性口炎病毒的VSV G蛋白，其在特定位点的1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为
所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的序列的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位中的1个位点。
2.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为DiZPK，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第I37位，Q42位，D121位，K172位，Y174位，D185位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，P362位氨基酸中的一个，
R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R3为
3.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为DiZPK，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第N20位，Y77位，Y116位，V161位氨基酸中的一个，
R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R4为
4.编码突变的VSV G蛋白的核酸分子，所述核酸分子与编码SEQIDNO：1的核酸分子SEQ ID NO：2的区别在于，其中编码SEQ IDＮO：1的第I 37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。
5.核酸载体，其可操作地连接有项目5的核酸分子。
6.项目5的核酸载体，其还可操作地连接有标签序列。
7.项目6的核酸载体，其中的标签序列是Flag标签序列。
8.宿主细胞，其中含有项目5－7中任一项的核酸载体。
9.项目8的宿主细胞，其中还含有表达甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNAPyl）的质粒。
10.项目8或9的宿主细胞，其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
11.定点修饰VSV G蛋白的方法，包括步骤：
（1）选择步骤：在VSV G蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；
（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的VSV G蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；
（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的VSV G蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；
（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒，
（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有DiZPK的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；
（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行VSV G蛋白活性检测，保留野生型VSV G蛋白80％以上活性的突变体设定为定点修饰候选物
12.使用项目1的定点突变VSV G蛋白的方法，其包括：
（1）在细胞内表达项目5－7的载体，使之在合适的条件下表达项目1的定点突变VSV G蛋白；
（2）所述细胞进行特定波长光照，使定点突变VSV G蛋白与胞内的结合蛋白共价结合。
13.项目12的使用权利要求1的定点突变VSV G蛋白的方法，其还包括：（3）分离并鉴定与定点突变VSV G蛋白共价结合的蛋白。
14.组合物或试剂盒，其中含有项目4的核酸分子或项目5-7中任一项的核酸载体。
15.项目4的核酸分子或者项目5-7中任一项的核酸载体在制备用于获得结合蛋白的制剂中的用途。
附图说明
图1表示水泡性口炎病毒（VSV）结构。上图是VSV模拟图，VSV呈子弹状，由来自宿主细胞的脂质双分子层包裹内层的核衣壳组成；VSV有5种主要蛋白质分子，其中N蛋白与RNA紧密结合；P蛋白与L蛋白组成病毒RNA聚合酶，位于病毒衣壳内；M蛋白是基质蛋白；G蛋白形式三聚体分布在病毒表面，参与病毒的粘附和受体的识别；下图为磷钨酸染色的VSV电镜照片。
图2是密码子扩展技术原理示意图。在自然的蛋白翻译体系中，当遇到终止密码子UAG时，翻译过程将停止；在加入正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA和非天然氨基酸的体系中，翻译过程遇到终止密码子UAG时，核糖体能够利用识别UAG密码子的特异的氨酰化tRNA，将非天然氨基酸位点特异性地标记到蛋白质分子中，获得非天然氨基酸位点特异性标记的蛋白质分子。
图3是不同位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白表达量检测；WT表示野生型VSVG；N20、I37、Q42、Y73、Y77、Y116、D121、V161、K172、K174、D185和K200分别表示在相应位置的氨基酸残基插入非天然氨基酸的VSVG，+UAA表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度为1mM;-UAA表示转染后6小时换液，培养基中不加入DIZPK。有图可知，这些位点中表达的有N20、I37、Q42、Y77、Y116、D121、V161、K172、K174、D185。
图4是不同位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白表达量检测；WT表示野生型VSVG；K242、R249、Y281、W288、G321、R 332、D334、I339、R342、G345、M246和P362分别表示在相应位置的氨基酸残基插入为非天然氨基酸的VSVG，+UAA表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度为1mM;－UAA表示转染后6小时换液，培养基中不加入DIZPK。有图可知，这些位点中表达的有K242、R249、R321、I339、R342、M346、P362。
图5是不同位点插入DiZPK的VSV G假病毒颗粒感染活性。
A不同位点插入非天然氨基酸的VSVG假病毒颗粒的感染活力检测；
横坐标中，HIV表示HIV假病毒颗粒；VSV表示野生型VSVG假病毒颗粒；N20、I37、Q42、Y73、Y77、Y116、D121、V161、K172、K174、D185、K200、K242、R249、Y281、W288、G321、R332、D334、I339、R342、G345、M346、P362表示相应位点插入非天然氨基酸的VSVG假病毒颗粒。表明：可标记位点为：N20、I37、Q42、Y77、Y116、D121、V161、K172、K174、D185、K242、R249、G321、I339、R342、G346、M362；不可标记位点为：Y73、K200、Y281、W288、R332、D334、G345。
B DiZPK修饰的VSV G假病毒颗粒示意图，DiZPK修饰在病毒包膜糖蛋白G上。
图6是Flag修饰的病毒膜蛋白的高效定点标记
其中各泳道分别表示293T表示转染时，不加入质粒，只加入等体积的转染试剂；VSVG77表示转染VSVG77表达质粒，表达Y77位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白；VSVG77-Flag表示转染VSV77-Flag表达质粒，表达C端修饰Flag的Y77位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白；DIZPK+表示转染后6小时换液，在培养基中加入DIZPK至终浓度为1mM；
DIZPK－表示转染后6小时换液，培养基中不加DIZPK。
图7是光交联蛋白复合物Western Blot检测
在A-E图中，WT表示野生型VSVG蛋白；N20、I37、Q42、Y77、Y116、D121、V161、K172、K174、D185、K242、R249、R321、I339、R342、M346和P362分别表示在相应位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白；UV+表示转染48小时后，将细胞用365nm紫外线在小于5cm的范围内照射10分钟，引发DIZPK的光交联反应；UV－表示细胞未进行紫外线照射处理；
图8是四个位点光交联产物条带的比较。图中20、77、116、161分别表示对应位点插入非天然氨基酸的VSVG蛋白。箭头所指处共用5个条带，至少分布于三个不同的分子量大小。由图可知，VSVG在这四个位点光交联到不同的产物。
图9是正交实验优化免疫沉淀条件实验结果。图中①-⑨对应相应的实验组编号；55k Da-72kDa间的条带为VSV G；43kDa-55kDa之间的为抗体的重链；抗体的轻链部分在电泳过程中超出了胶的下沿。
图10是：VSVG20光交联复合物IP产物的银染结果和蛋白免疫印迹结果。泳道20DIZPK+UV+表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前对细胞进行紫外线光照10分钟处理；20DIZPK+UV－表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前不进行紫外线光照处理。
图11是VSVG77光交联复合物IP产物的银染结果和蛋白免疫印迹结果。泳道77DIZPK+UV+表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前对细胞进行紫外线光照10分钟处理；77DIZPK+UV－表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前不进行紫外线光照处理。图12是VSVG116光交联复合物IP产物的考马斯亮蓝染结果。
图12泳道116DIZPK+UV+表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前对细胞进行紫外线光照10分钟处理；116DIZPK+UV－表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前不进行紫外线光照处理。
图13是：VSVG161光交联复合物IP产物的考马斯亮蓝结果。
泳道161DIZPK+UV+表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前对细胞进行紫外线光照10分钟处理；161DIZPK+UV－表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前不进行紫外线光照处理。
图14是VSVG77光交联复合物IP产物的考马斯亮蓝结果。
泳道77DIZPK+UV+表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前对细胞进行紫外线光照10分钟处理；77DI ZPK+UV－表示转染后6小时换液，培养基中加入DIZPK至终浓度1mM，提取蛋白前不进行紫外线光照处理。
下面具体对本发明用实施例进行阐述，其中所述实施例的范围不限定本发明的范围，任何与本发明的实施方案等价的变体都包括在本发明之中。
制备例:
非天然氨基酸DiZPK（Lys-diazirine）的合成和鉴定
非天然氨基酸DiZPK的化学合成反应式如下。
如上式所示，将原料1（5-羟基-2-戊酮）15mL与液氨40mL在-40℃下搅拌反应5h，之后降温至-60℃，缓慢滴加NH2OSO3H（20g）的甲醇溶液，加毕升至室温，反应过夜。滤除沉淀，向上清液中加入三乙胺，冰浴条件下缓慢加入I2，至反应液颜色变深，不再产生气泡为止。反应完全后蒸除溶剂，经乙醚萃取后干燥。蒸除乙醚，剩余液体减压蒸馏获得25.4g无色粘稠液体产物2。
将上述产物2用吡啶溶解，0℃搅拌下加入11g TsCl，反应过夜。待反应完全后将反应液倒入浓盐酸与冰水的混合液中，乙醚萃取，醚层分别用1N盐酸和1N NaOH洗涤。有机相干燥柱分得到11.8g无色粘稠液体产物3。
将上述产物3用DMF溶解，加入NaN3室温反应隔夜至反应完全，加入大量水，乙醚萃取。蒸除乙醚，剩余产物用THF:水(9:1)混溶，加入三苯基磷，室温反应。反应完后加1N HCl混匀，旋干THF，二氯甲烷把未反应的原料，PPh3和O=PPh3洗掉，液相加1N NaOH调pH到12，二氯甲烷萃取出4.0g产物4。
将5.2g原料5（Boc-Lys-OMe）与羰基二咪唑反应，制备出5.9g化合物6。之后化合物6与上述产物4（4.0g）偶联得到化合物7，最后经过两步脱保护，将Boc和甲酯脱除，得到目标4.5g产物8，即DiZPK。经谱学验证，结果为：
1H NMR(400MHz,D2O):δ3.10(1H,t,J=6.3Hz),2.96(4H,m),1.25(10H,m),0.90(3H,s);13C NMR(100MHz,D2O):183.63,160.66,56.00,39.80,39.30,34.49,30.84,29.20,26.75,23.92,22.43,18.80;HREIMS m/z 308.16937[M+1]+(calcd for C12H22N5NaO3,308.16931)，证明所得到的DiZPK结构正确。
实施例1：定点突变的水泡性口炎病毒包膜糖蛋白表达质粒的构建
（1）突变位点选择
根据VSV G蛋白的三维晶体结构和疏水性分析，发明人选择了24个位点，因为蛋白相互作用界面的最为重要的结构特点之一，界面上有一些关键性的残基在蛋白相互作用中起到比其它残基更为重要，其中的关键性氨基酸残基通常为：W、Y、I、D、P，本发明选择的突变位点中有4个Y残基、2个W残基，2个I残基，3个D残基，1个P残基。具体突变位点的信息如下，其中的氨基酸位置是指在SEQ ID NO：1所示的序列上的位置。
表1.突变位点
突变引物设计
为了定点突变所述的位点，设计了以下突变引物（同时可以用做测序引物）。
表2.设计引物列表
| SEQIDNO | 突变位点 | 引物方向 | 碱基序列 |
| 3 | 20 | For | CTGGAAAAATGTTCCTTCTTAGTACCATTATTGCCCGTCAAGC |
| 4 | Rev | GCTTGACGGGCAATAATGGTACTAAGAAGGAACATTTTTCCAG | |
| 5 | 37 | For | CAGATTTAAATTGGCATAATGACTTATAGGGCACAGCCTTACAAG |
| 6 | Rev | CTTGTAAGGCTGTGCCCTATAAGTCATTATGCCAATTTAAATCTG | |
| 7 | 42 | For | GACTTAATAGGCACAGCCTTA TAG GTCAAAATGCCCAAGAG |
| 8 | Rev | CTCTTGGGCATTTTGACCTATAAGGCTGTGCCTATTAAGTC | |
| 9 | 116 | For | CTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATAGGCAACTGTGACGGATGCC |
| 10 | Rev | GGCATCCGTCACA GTTGCCTATCCACA ACTTTGAGGAGGGAAG | |
| 11 | 121 | For | GTGGATATGCAACTGTGACGTAGGCCGAAGCAGTGATTGTCCAG |
| 12 | Rev | CTGGACAATCACTGCTTCGGCCTACGTCACAGTTGCATATCCAC |
| 13 | 161 | For | GCAGCAATTACATATGCCCCACTTAGCATAACTCTACAACCTGG |
| 14 | Rev | CCAGGTTGTAGAGTTATGCTAAGTGGGGCATATGTAATTGCTGC | |
| 15 | 172 | For | CCTGGCATTCTGACTATTAGGTCAAAGGGCTATGTGATTC |
| 16 | Rev | GAATCACATAGCCCTTTGACCTAATAGTCAGAATGCCAGG | |
| 17 | 174 | For | CAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCTAGGGGCTATGTGATTC |
| 18 | Rev | GAATCACATAGCCCCTAGACCTTATAGTCAGAATGCCAGGTTG | |
| 19 | 185 | For | CTAACCTCATTTCCATGTAGATCACCTTCTTCTCAGAGGAC |
| 20 | Rev | GTCCTCTGAGAAGAAGGTGATCTACATGGAAATGAGGTTAG | |
| 21 | 200 | For | GAGCTATCATCCCTGGGATAGGAGGGCACAGG |
| 22 | Rev | CCTGTGCCCTCCTATCCCAGGGATGATAGCTC | |
| 23 | 242 | For | CTGCAAAATGCAATACTGCTAGCATTGGGGAGTCAGAC |
| 24 | Rev | GTCTGACTCCCCAATGCTAGCAGTATTGCATTTTGCAG | |
| 25 | 246 | For | GGCTGATAAGGATCTCTTTTAGGCAGCCAGATTCC |
| 26 | Rev | GGAATCTGGCTGCCTAAAAGAGATCCTTATCAGCC | |
| 27 | 249 | For | GGATCTCTTTGCTGCAGCCTAGTTCCCTGAATGCCCAGAAGG |
| 28 | Rev | CCTTCTGGGCATTCAGGGAACTAGGCTGCAGCAAAGAGATCC | |
| 29 | 281 | For | GAGAGGATCTTGGATTAGTCCCTCTGCCAAGAAACC |
| 30 | Rev | GGTTTCTTGGCAGAGGGACTAATCCAAGATCCTCTC | |
| 31 | 288 | For | CTCTGCCAAGAAACCTAGAGCAAAATCAGAGCG |
| 32 | Rev | CGCTCTGATTTTGCTCTAGGTTTCTTGGCAGAG | |
| 33 | 321 | For | GAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATTAGACCCTAAAATAC |
| 34 | Rev | GTATTTTAGGGTCTAATTGATTATGGTGAAAGCAGGACCGGTTC | |
| 35 | 332 | For | CTTTGAGACCAGATACATCTAGGTCGATATTGCTGCTCCAATCC |
| 36 | Rev | GGATTGGAGCAGCAATATCGACCTAGATGTATCTGGTCTCAAAG | |
| 37 | 339 | For | CAGAGTCGATATTGCTGCTCCATAGCTCTCAAGAATGGTCGG |
| 38 | Rev | CCGACCATTCTTGAGAGCTATGGAGCAGCAATATCGACTCTG | |
| 39 | 342 | For | GACCAGATACATCAGAGTCTAGATTGCTGCTCCAATCCTCTC |
| 40 | Rev | GAGAGGATTGGAGCAGCAATCTAGACTCTGATGTATCTGGTC | |
| 41 | 345 | For | CCAATCCTCTCAAGAATGGTCTAGATGATCAGTGGAACTACCAC |
| 42 | Rev | GTGGTAGTTCCACTGATCATCTAGACCATTCTTGAGAGGATTGG | |
| 43 | 346 | For | CAATCCTCTCAAGAATGGTCGGATAGATCAGTGGAACTACCACAG |
| 44 | Rev | CTGTGGTAGTTCCACTGATCTATCCGACCATTCTTGAGAGGATTG | |
| 45 | 362 | For | GGGATGACTGGGCATAGTATGAAGACGTGGAAATTGGACC |
| 46 | Rev | GGTCCAATTTCCACGTCTTCATACTATGCCCAGTCATCCC |
VSVG表达质粒的获得
根据NCBI Gene Bank公布的VSVG基因序列，经全基因合成获得基因全长DNA片段，然后将其连接到pCMV真核表达载体（购自sigma-aldrich公司）中，获得pCMV-VSV-G表达质粒（GI:15072764）
定点突变
使用Stratagene公司的
Lightning Site-DirectedMutagenesis Kit，根据其使用说明，用前述pCMV-VSV-G表达质粒做为模板，使用表2突变引物，完成各突变，对于突变后获得的质粒，委托华大基因进行测序工作。测序结果表明，成功引入了各个突变，构建得到24个定点突变的质粒。分别命名为pCMV-VSVG-N20、pCMV-VSVG-I37、pCMV-VSVG-Q42、pCMV-VSVG-K63、pCMV-VSVG-F70、pCMV-VSVG-W72、pCMV-VSVG-Y73、pCMV-VSVG-Y77、pCMV-VSVG-Y116、pCMV-VSVG-D121、pCMV-VSVG-V161、pCMV-VSVG-K172、pCMV-VSVG-K174、pCMV-VSVG-D185、pCMV-VSVG-K200、pCMV-VSVG-K242、pCMV-VSVG-A246、pCMV-VSVG-R249、pCMV-VSVG-Y281、pCMV-VSVG-W288、pCMV-VSVG-G321、pCMV-VSVG-R332、pCMV-VSVG-D334、pCMV-VSVG-I339、pCMV-VSVG-R342、pCMV-VSVG-G345、pCMV-VSVG-M346、pCMV-VSVG-P362。
实施例2：Flag标签标记的水泡性口炎病毒包膜糖蛋白定点突变质粒的构建
flag标签是8氨基酸残基肽段，序列为：AspTyrLysAspAspAspAspLys（SEQ ID NO：47），为可溶性蛋白标签，是为免疫亲和色谱分析而设计的一种标签。通过Flag结合到固相上的蛋白可以通过非变性的方式洗脱下来，例如使用Flag小肽将结合蛋白洗脱。目前有商业化的Flag纯化方式，本发明为了便于后续定点突变蛋白的纯化或者捕获，首先根据实施例1在野生型VSV G的碱基序列上引入TAG密码子，然后在VSV G蛋白的C端加入Flag标签。具体步骤如下：
（1）扩增引物设计：
设计含有BamH I酶切位点和保护碱基的正反向引物；反向引物中Flag序列之后以TGA为终止密码子。
表3.扩增Flag片段引物
| Seq ID NO | 方向 | 序列 |
| 48 | For | CGGGATCCGCCATGAAGTGCCTTTTGTAC |
| 49 | Rev | CGGGATCCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC |
（2）PCR扩增
用表3的引物以pCMV-VSV-G表达质粒做为模板进行PCR反应，扩增VSV-G-Flag表达框，之后用Promega凝胶回收试剂盒回收扩增片段，测定回收DNA溶液的浓度。然后用BamH I酶切扩增片段和pCMV-VSV-G质粒。
（3）酶切产物回收：用1%琼脂糖凝胶（sigma）分离酶切片段和载体片段，用凝胶回收试剂盒（promega）回收1.5kbp的插入片段和4.8kbp的载体片段。对回收产物进行定量。
（4）载体片段去磷，连接：按照Rapid DNA Dephos & Ligation Kit使用说明进行载体去磷酸和连接，连接产物保存于-20℃。
（5）连接产物转化：将连接产物转化到DH5α感受态细胞。
（6）使用表4的引物进行菌落PCR验证转化连接Flag成功的质粒之后，将阳性菌落送华大基因测序。。
表4：菌体PCR使用的引物
| SEQ ID NO | 方向 | 序列 |
| 50 | For | AACCATGTTCATGCCTTC |
| 51 | Rev | ACCAGCCACCACCTTCTG |
结果：
菌落PCR结果：其中，VSV G77-Flag的3、6、10、12号样品为阳性；VSV GWT-Flag的5号样品为阳性。质粒测序结果：VSVG77－flag（含义是带有Flag的第77位突变的VSVG表达质粒）的10号样品测序正确；VSV GWT－flag（含义是带有Flag标签的野生型VSVG表达质粒）的5号样品测序正确。其它4个点K174、K242、R249、I339也构建了Flag标记的VSV G表达质粒。共得到关于野生型、G77、K174、K242、R249、I339共6个Flag融合突变体，分别命名为VSVGWT－flag、VSVG77－flag、VSVG174－flag、VSVG242－flag、VSVG249－flag、VSVG339－flag。
实施例3：非天然氨基酸DiZPK标记的VSV G蛋白的表达与检测
用转染试剂将实施例1和实施例2构建的特定位点突变的VSV G以及VSV-G-Flag表达质粒转染到293T细胞中，并检测DiZPK修饰的VSV G蛋白表达情况。具体步骤如下：
（1）突变质粒提取
将实施例1获得的含有所需质粒的菌种复苏，并在450mL含氨苄青霉素的LB培养基中37℃，220RPM培养，16小时。用Promega大提试剂盒提取质粒，并测定质粒浓度。
（2）辅助质粒的获得
从保藏地：中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）的含有质粒pACYC-tRNA/PylRS的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS（由北京大学化学院陈鹏教授馈赠）中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS（以下简称该质粒为辅助质粒），该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸DiZPK（又称DizPK）的tRNA和tRNA合成酶。
（3）共转染
将步骤1的突变VSV G质粒和步骤2的表达pACYC-tRNA/PylRS的辅助质粒共转染到HEK293T细胞（中国科学院北京基因研究所惠赠）中。具体步骤：转染前16-20小时，将HEK293T细胞以3x105个/孔接种到六孔板中。37℃，5%CO2培养。细胞覆盖率达60%左右时可以转染。每孔细胞的质粒及转染试剂用量如下表表5所示：
将质粒加入到Opti-MEM中，充分混匀，再加入转染试剂，充分混匀；室温静置15分钟；轻轻混匀质粒-转染试剂混合物，均匀地滴加到细胞培养基中，37℃，5%CO2培养。转染后6小时更换为含有1mM DizPK的培养基，便于在特定位点插入非天然氨基酸。
（4）蛋白提取与定量
换液后46小时，吸除培养基，用PBS缓冲液润洗细胞两次。加入含有1x Cocktail的RIPA细胞裂解液（C1053，普利莱，中国），在冰上裂解20分钟；用细胞刮刀收集细胞，4℃ 12.5k RPM离心15分钟；收集上清。采用BCA方法进行蛋白质定量,酶标仪测定A595，根据标准曲线计算出样品蛋白的浓度。
（5）蛋白质免疫印迹：根据定量结果，每个样品取50μg进行蛋白质免疫印迹检测。
其中一抗为Anti-VSV-G antibody（V5507，sigma，美国）；二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的Goat-anti-Mouse（ZB2305，中杉金桥，中国），Chemiluminescent HRP substrate（Millipore，美国），对于Flag标记的VSV-G蛋白，一抗为anti-Flag antibody。其余相同。
(6)DiZPK修饰的VSV G表达结果检测
本发明对选择的24个突变位点进行了系统性的蛋白质表达检验，得到如下的蛋白质免疫印迹结果，见图3，图4。
实验结果表明：在VSV G蛋白上，不同的标记位点表达VSV G的效率不同，其中能够较为高效表达的位点有：I37，Q42，Y77，Y116，D121，V161，Y174，K242，R249，I339，R342，M346；能表达但效率相对低的位点有：N20，K172，D185，P362；在实验中未检测到VSV G的位点有：Y73，K200，Y281，W288，G321，R332，D334，G345，见图5。
（7）Flag标记的VSV G表达结果检测
将构建的VSVG77－Flag表达质粒进行蛋白表达实验检测。结果如下，见图6：从Flag抗体曝光结果可知，VSVG77-Flag能够表达，同时表达Flag标记的VSV G能够被VSV G抗体识别。其余5个Flag标记蛋白也实现了成功表达。
实施例4：DizPK标记的VSV G与HEK293T胞内蛋白相互作用的研
究
通过在HEK293T细胞中表达DiZPK标记的VSV G蛋白一段时间后，进行紫外线UV365nm引发DiZPK的光交联反应，在DiZPK标记的VSV G与其相互作用蛋白间形成共价键，通过蛋白免疫印迹法检测形成的光交联复合物；通过免疫沉淀法分离纯化光交联复合物，并用LC-MS/MS方法鉴定该蛋白质。
（1）蛋白表达：按照下述表6进行实验分组
表6
注：表中VSVGmuta表示特异位点突变的VSVG蛋白表达质粒；VSVGwt表示野生型VSVG蛋白表达质粒；+DizPK表示在转染后6小时换液，培养基中加入DizPK至终浓度为1mM;－DizPK表示在转染后6小时换液，培养基中不加入DizPK；+UV365nm表示在提取蛋白质前用365nm紫外线照射细胞10分钟，引发DizPK的光交联反应；－UV365nm表示在提取蛋白质前不用365nm紫外线照射细胞。
（A）取细胞密度约90%的HEK293T细胞，消化，得到单细胞悬液。计数，以每皿3×106个细胞接种到直径为100mm培养皿中，37°C、5%CO2培养16-20小时。
（B）转染。按照实验分组情况表（表6）依次加入Opti-MEM和相应质粒，充分混匀，加入转染试剂并充分混匀，室温放置15分钟，加样，37℃、5%CO2培养。
（C）换液。转染后6小时将培养基换成新鲜的DMEM（10%FBS，丙酮酸钠，酚红），对应实验组的培养基中加入Di ZPK至终浓度为1mM，37℃、5%CO2培养48小时。
（2）紫外线UV365nm光照：
去除培养基，用PBS润洗细胞2遍，每孔细胞加入2mL无酚红DMEM（不含血清，含丙酮酸钠），37℃，5%CO2中培养1小时，除去胞外培养基中的DiZPK并减少胞内DiZPK的含量。对于接受光照组细胞，放置于冰上，用UV365nm照射。在365nm紫外光照射10分钟后，DiZPK的光交联反应充分完成。
（3）免疫沉淀(IP)纯化蛋白（共价交联到突变的VSVG的蛋白）
免疫沉淀的原理如下：
免疫沉淀依靠抗原抗体的特异性识别将目标蛋白从众多蛋白中分离出来。针对目标蛋白的抗体（单抗或多抗）能与目标蛋白形成抗原抗体复合物；这个复合物能与结合在凝胶珠子上的Protein A或ProteinG相结合；进而将抗体和目标蛋白从混合物中分离；通过洗涤，可以减少非特异蛋白的含量；最后通过煮样、进行SDS-PAGE分析样品。
这个过程中，洗涤的条件对于结果又很大的影响，在确定最佳实验条件前，实验者进行了正交实验，以优化实验条件。
正交实验设定4因素：抗体用量；抗原抗体作用时间；protein A/G用量；Protein A/G与抗原抗体复合物作用时间；每个因素设三个水平。根据正交实验设计表得到如下各实验组：
表7免疫沉淀条件优化正交实验设计
*每组均使用1300μg的细胞提取总蛋白。
根据以上正交实验获得的优化实验条件，实验者对不同位点修饰DiZPK的VSV G-DiZPK-protein进行了分离纯化。实验操作如下：
（A）取小于1mL体积的细胞总蛋白，加入到1.5mL EP管内，标记；加入70μlProtein A/G，放入4°C冰箱内，10RPM翻转过夜。
（B）取出EP管，4℃5000g离心5分钟，将上清转移到另一组标记好的EP管中；向上清中加入抗VSV-G抗体3.75μl/1000μg总蛋白；放入4℃冰箱内，10RPM翻转4小时。
（C）取出EP管，向每个样品中加入Protein A/G，28μl/1000μg总蛋白；放入4℃冰箱内，10RPM翻转4小时。
（D）取出EP管，放入4℃冰箱内，10RPM翻转4小时，取沉淀，将上清转移到另一组EP管中。
（E）清洗。调整RIPA中NaCl浓度至1M，并加入蛋白酶抑制剂Cocktail，获得清洗液。每次用500μL清洗液重悬珠子；放入4°C冰箱内，10RPM翻转1分钟；4°C5000g离心5分钟，小心吸除上清；重复操作5次。
（F）煮样。向得到的沉淀中加入50μL的1x蛋白上样缓冲液，100°C加热10分钟，离心，取上清。
（4）蛋白质免疫印迹：由于光交联产物的丰度较低，SDS-PAGE时每孔的蛋白上样质量为80μg，以便检测到光交联条带。根据蛋白免疫印迹检测到的VSV G-DiZPK-Protein复合物的结果，发明人选择了其中4个代表性位含突变点N20、Y77、Y116和V161的突变蛋白进行光交联产物的分离纯化和质谱鉴定工作。
（5）免疫沉淀产物进行SDS-PAGE分离，并银染显示蛋白条带。
SDS-PAGE电泳结束得到的胶进行银染，
固定：用超纯水清洗胶5分钟，并用固定液固定30分钟；固定完成后，用超纯水清洗3次，每次10分钟。
致敏：临用新配致敏液，致敏30分钟；洗胶3次，每次10分钟。
染色：在步骤3第二次洗膜时配制染色液，在暗室中振摇染色20分钟；洗胶1分钟。
显色：先用部分显色液洗去土黄色砂状物质，倒去液体；再加入显色液，显色到需要的程度，倒去显色液。
终止：迅速加入终止液作用10分钟。
清洗：用超纯水清洗30分钟。
（6）Flag纯化VSV G77＋Flag考马斯亮蓝染色
为了增加纯化的VSV G77＋Flag-DiZPK-Protein的质量，发明人采用Flag标签进行亲和纯化，并用Flag小肽竞争性地将VSV G77＋Flag及其交联复合物洗脱，进行SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色。
质谱鉴定光交联蛋白复合物条带
将银染得到的特异条带送到中国科学院生物物理所蛋白质中心进行蛋白质质谱鉴定。方法描述如下：
（1）蛋白酶解
将含有蛋白样品的条带准确地取出。每个胶条按照以下方式分别酶解。将条带切成小块，用200μl超纯水洗10分钟，重复一次；胶条用100%乙腈脱水10分钟，放入Speedvac(Labconco)真空浓缩干燥，不超过15分钟；用10mM,DTT in 25mM NH4HCO3在56°C还原45分钟，用40mM碘乙酰胺，25mM NH4HCO3在暗处室温下烷基化45分钟，接着用50%乙腈、25mM NH4HCO3洗胶粒2遍。真空浓缩干燥胶粒，并用优化的胰蛋白酶降解,每个条带用40ng胰蛋白酶，在25mM NH4HCO3中37°C酶解过夜。加入甲酸至1%终止酶解反应，得到的酶解溶液用于LC-MS/MS分析。
（2）电喷雾离子化-离子井质谱分析
LC-MS/MS是在ThermoFisher Finnigan Surveyor MS Pump PlusHPLC system和串联的ThermoFisher Finnigan LTQ线性离子井质谱仪上完成。酶解得到的肽段经过串联的两根分离柱300SB-C18,5 X 0.3mm,5μm particle(Agilent Technologies,Santa Clara CA)和C18,100μm i.d X 100mm,3μm particle(SunChrom,Germany)分离；结合在柱子上的肽段通过梯度洗脱（0-45%B in 55minutes,45-100%B in 10minutes,where B=80% Acetonitrile,0.1%formic acid）以500nL/min的流速从柱子上洗脱，并ESI的方式裂解后进入到线性离子井质谱仪中(ThermoFisher Corporation,San Jose,CA)。数据采集是从裂解粒子片段的全质谱扫描中选取丰度最高的5个离子，作为检测结果。
（3）数据检索
使用SEQUEST在NCBI的人类蛋白质数据库检索获得的质谱数据，得到的检索结果用Bioworks3.2MS进行过滤、分析。带电荷为+1、+2、+3的肽段，如果它们符合酶解特点，并且交叉相关系数分别为1.80、>2.5、>3.0，则该肽段被认为是有效肽段，其认为根据该肽段检索到的蛋白质分子是可信的。
光交联和免疫沉淀的实验结果
1：DizPK标记的VSV G光交联产物检测结果
发明人选择了实施例2和3中实验鉴定的能够表达VSV G的突变质粒进行此部分实验，实验方法如前所述。结果见图7，由图7可知：17个位点都能够捕获光交联条带，其中第N20位，Y77位，Y116位，V161位突变的VSVG蛋白捕获的光交联产物条带与野生型VSVG捕获的光交联产物条带不同，视为捕获到的特异的光交联复合物，这些复合物中存有VSVG蛋白潜在的新结合蛋白。
从以上数据看出，在多个位点编码DiZPK的VSV G都能够在365nm光照条件下获得光交联蛋白，其中不同位点光交联得到的蛋白复合的分子量大小不同。
发明人发现，光交联复合物的分子量大致分布在130kDa-200kDa，其中突变位点N20和V161在空间上与糖基化位点N163和N320相近，而病毒包膜蛋白与受体识别很可能与糖基化位置和糖基化水平有关。Y77突变的VSV G获得的光交联条带的位置比其他突变位点低，可能获得不同的VSV G-DiZPK-Protein复合物。Y116得到的光交联产物与其他位点有相似分子量大小，以Y116为例，鉴定光交联复合物的蛋白分子。因此对N20、Y77、Y116、V161将开展分离、纯化、鉴定实验。
为了说明N20、Y77、Y116、V161四个位点得到的光交联条带具有差异性，实验者将四个点的样品放在一起进行蛋白免疫印迹检测，结果如图8所示。
免疫沉淀条件优化结果
发明人将正交实验获得的样品经SDS-PAGE分离后，进行银染，因显示纯化样品中目标蛋白和杂蛋白的相对含量。银染的结果如表8和图9所示，用Quantity One分别对9个泳道的“泳道总灰度”，“VSV G条带灰度”和“抗体重链灰度”进行定量，并求出“VSV G条带灰度/泳道总灰度”、“抗体重链灰度/泳道总灰度”、“VSV G条带灰度／抗体重链灰度”三个参数：
表8.银染结果条带定量结果
表9.银染结果条带间关系
从实验数据可知，实验组2、4、5、8、9号获得的VSV G条带较深，获得的目的蛋白多，说明这几个实验组的条件更适于VSVG蛋白免疫沉淀。
表10免疫沉淀条件优化正交实验设计
结合各组使用的条件（如上表所示），第4、5组实验所用的抗体量是第2组的两倍，protein的用量分别为第2组的1倍和1.5倍，而灰度扫描的结果第四组合第五组的结果并没有增加相应的倍数。结合成本考虑，最终选定第2组实验条件作为后续免疫沉淀实验的条件。
免疫沉淀产物直接进行SDS-PAGE-银染结果
根据对VSV G-DiZPK-protein光交联复合物的蛋白免疫印迹结果，实验者选定了具有代表性的20、77、116、161这4个位点编码DiZPK的VSV G-DiZPK-Protein光交联复合物进行免疫沉淀、银染和蛋白免疫印迹检验。得到如下图10、图11、图12和图13所示，由图10可知，在VSVG20光交联产物中检测到2个光交联复合物条带。由图11可知，VSVG77光交联产物中检测到1个光交联复合物条带。由图12可知，在VSVG116光交联产物中检测到1个光交联复合物条带。由图13可知，在VSVG161光交联产物中检测到1个光交联复合物条带。
通过蛋白免疫印迹结果的佐证，可以排除银染结果中紫外光照组和未光照组中共有的非特异性条带。由此，在位点N20中发现两条光交联产物条带：分子量分别约为130kDa和200kDa；在位点Y77中，发现一条光交联产物条带，分子量约为略小于130kDa；在位点Y116中发现一条光交联产物条带，分子量约略大于130kDa；在位点V161中发现一条光交联产物条带，分子量约200kDa。经同组其他实验者平行操作获得相同的实验结果。于是将获得的光交联产物条带送中国科学院生物物理所进行质谱鉴定。
纯化VSVG77＋Flag及其复合物考马斯亮蓝结果如图14所示，由图14可知，增加上样量后，在Y77位点的产物中检测到分子量在80k Da、130k左右的两条带。
蛋白质质谱鉴定结果
将前述银染得到的特异条带作为实验组，在对照泳道的相应位置取出胶条作为对照组，进行LC-MS/MS检测。将实验结果分别在人源蛋白库和病毒蛋白库中进行检索，对比对照组和实验组的检索结果，扣除同时出现在两个组中的分子，找出可能的蛋白质分子。一部分病毒库的检索结果如下，表11
表11.光交联蛋白复合物质谱数据在病毒蛋白库中检索结果
说明:Score=(-10)*Log(P),其中P是检测到的肽段与蛋白库中的肽段随机匹配的概率。Score>45（P<0.05），说明被检测的蛋白与检索到的蛋白间有相同的序列。可能是同一蛋白。
质谱数据在病毒蛋白库中均能检索到VSV G蛋白，并且分值很高，可以确定送样条带中含有VSV-DiZPK-Protein复合物。例如含突变位点（如20位，77位，116位和161位）的VSVG蛋白属于Hit的一部分，根据上表达检索结果可以明确:获得的光交联蛋白复合物条带中有VSVG-DiZPK-Protien。
对于被捕获的蛋白分子，进一步根据获得的质谱数据进行人源蛋白库的检索，得到相关实验结果。
其中，第N20位获得的光交联蛋白复合物的质谱数据中检测到myosin-9[Homo sapiens]，它是非肌细胞型二型肌球蛋白重链A，是具有基本的可以结合肌动蛋白、且可以水解ATP供能的特征的蛋白；同微丝配合完成肌纤维的收缩过程；涉及到细胞运动、形态构成等很多重要功能；据报道myosin-9与病毒感染细胞后在细胞内的迁移有关（Lehmann,M.J.,2005）。这说明myosin-9蛋白可能也以同样的方式参与VSV在宿主细胞内的迁移，但myosin-9在VSV生命周期中具体的功能还未见报道，需要进一步的科学研究。从另一方面讲，本发明的突变蛋白确实可以钓取VSV生命周期中关键的结合蛋白；此外，鉴定出的蛋白还有RNA-binding protein 25[Homo sapiens]，但目前还不清楚其在VSV生命周期中的作用，这需要进一步的科学研究。
第Y77位获得的光交联蛋白复合物的质谱数据中检测到GRP78[Homo sapiens],它是定位于内质网的蛋白质分子，参与蛋白质的折叠和组装，可能参与到蛋白质在细胞内的运输和定位；有文献报道，GRP78与处于合成早期的VSVG蛋白有相互作用（Y Gaudin，Science，1994）;同时鉴定出的蛋白还有Neurochondrin isoform1[Homosapiens]，但目前还不清楚其具体的功能以及在VSV生命周期中的作用，这还需要进一步的科学实验研究。
第Y116位获得的光交联蛋白复合物中的质谱数据中检测到VSVG蛋白的信号；但在人源蛋白库中未检测到可信的蛋白质分子。结合已有的文献报道，VSVG蛋白的分子量约64kDa,同时VSVG在病毒包膜表面以聚合体的形式存在（Roche S.,Science 2006）;在本实验中第Y116获得的光交联蛋白质复合物的条带分子量大小（约130k Da）与VSVG蛋白的二聚体分子量大小相近。由此，我们推测第Y116位点获得的光交联蛋白复合物是VSVG蛋白的二聚体。这个数据进一步证实VSVG蛋白是通过第116位氨基酸附近的区域与另一分子VSVG结合形成聚合体。
第N161位获得的光交联蛋白，经质谱数据分析也是myosin-9[Homo sapiens]蛋白，与第20位获得光交联蛋白相同。这样经过两个不同位点调取到同一相互作用蛋白，这与第20位及第161位氨基酸在空间结构上距离相近有很大关系，这也进一步佐证我们这种调取VSVG结合蛋白方法的可靠性；此外，鉴定出的蛋白还有microtubule-associated protein 4（MAP4），但目前还不清楚其具体的功能及在VSV生命周期的作用，这需要进一步的科学研究。
总之，经过质谱检索数据发现一些已见报道和未见报道的VSVG结合蛋白质。这些VSVG相互作用蛋白可能参与VSV的生命周期，对它们的深入功能研究，将可以揭示VSV病毒复制、组装的详细机制，进而可以人为调控VSV的生命周期，使得VSV更能为人类健康服务。
Claims (15)
1.定点突变的水泡性口炎病毒的VSV G蛋白，其在特定位点的1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为
所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的序列的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位中的1个位点。
2.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-diazirine，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第I37位，Q42位，D121位，K172位，Y174位，D185位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，P362位，位氨基酸中的一个，
R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，
R3为
3.定点突变的VSV G蛋白，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为DiZPK，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第N20位，Y77位，Y116位，V161位氨基酸中的一个，
R1为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，
R4为
4.编码突变的VSV G蛋白的核酸分子，所述核酸分子与编码SEQ ID NO：1的核酸分子SEQ ID NO：2的区别在于，其中编码SEQIDＮO：1的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。
5.核酸载体，其可操作地连接有权利要求4的核酸分子。
6.权利要求5的核酸载体，其还可操作地连接有标签序列。
7.权利要求6的核酸载体，其中的标签序列是Flag标签序列。
8.宿主细胞，其中含有权利要求5－7中任一项的核酸载体。
9.权利要求8的宿主细胞，其中还含有表达甲烷球菌的tRNA和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的质粒。
10.权利要求8或9的宿主细胞，其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
11.定点修饰VSV G蛋白的方法，包括步骤：
（1）选择步骤：在VSV G蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；所述特定氨基酸位点选自：示于SEQ IDNO：1的序列的第I37位，Q42位，Y77位，Y116位，D121位，V161位，Y174位，K242位，R249位，I339位，R342位，M346位，N20位，K172位，D185位，P362位中的1个位点；
（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的VSV G蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；
（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的VSV G蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；
（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒，
（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有DiZPK的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；
（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行VSV G蛋白活性检测，保留野生型VSV G蛋白80％以上活性的突变体设定为定点修饰候选物。
12.使用权利要求1的定点突变VSV G蛋白的方法，其包括：
（1）在细胞内表达权利要求5－7的载体，使之在合适的条件下表达权利要求1的定点突变VSV G蛋白；
（2）所述细胞进行特定波长光照，使定点突变VSV G蛋白与胞内的结合蛋白共价结合。
13.权利要求12的使用权利要求1的定点突变VSV G蛋白的方法，其还包括：（3）分离并鉴定与定点突变VSV G蛋白共价结合的蛋白。
14.组合物或试剂盒，其中含有权利要求4的核酸分子或权利要求5-7中任一项的核酸载体。
15.权利要求4的核酸分子或者权利要求5-7中任一项的核酸载体在制备用于获得结合蛋白的制剂中的用途。
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