CN112986571B - 一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法 - Google Patents

一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法。具体通过遗传密码子拓展技术在蛋白序列中引入具有光交联性质的特定非天然氨基酸对Midkine进行标记，在特定的细胞生长阶段或不同处理的细胞模型中，采用标签抗体偶联的磁珠富集蛋白质相互作用复合物，同时结合蛋白免疫印迹实验和蛋白质组学，鉴定Midkine在机体内发挥功能过程中时空水平上的相互作用蛋白质，为后续围绕Midkine深入展开相关机制研究和其在疾病发生发展中的重要功能研究提供指导。

Description

一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及到生物化学与分子生物学技术以及色谱质谱联用分析技术，具体涉及蛋白序列的编辑与表达，蛋白质富集与色谱-质谱联用技术检测蛋白质的方法。
背景技术
生物分子之间的相互作用存在于细胞内一系列的生命过程中，其中广泛存在并备受关注的是蛋白质与蛋白质之间的相互作用。但并不是所有蛋白质之间的相互作用都是时间与空间上稳定的，比如一些分泌蛋白，在细胞内与细胞外基质之间来回穿梭，发挥功能的过程中肯定在不同的时间点与不同定位的蛋白质发生相互作用。如何鉴定出这类蛋白质在动态过程中相互作用蛋白对深入了解蛋白功能机制与调控具有重要意义。
目前鉴定蛋白质间相互作用的方法多数出发于经典的免疫沉淀法或者基于其他类型的亲和作用力来富集蛋白质相互作用复合物，并结合经典的凝胶电泳和免疫印迹法定性复合物中的新颖蛋白质。随着灵敏的定性和定量蛋白质组学方法的发展，鉴定蛋白质相互作用复合物在操作变得简单的同时达到结果的最丰富。而基因编辑手段的愈发成熟结合生物正交反应，让我们进行蛋白质序列的改造与蛋白质的特异标记时更加“随心所欲”。
Midkine(MK，中期因子)，作为一种新的肝素结合生长因子,在多种恶性肿瘤组织中高表达，很多研究表明其在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要作用，表现为可促进肿瘤细胞增殖、迁移和肿瘤血管生成，并影响肿瘤患者的预后，而在正常组织或癌旁组织中低表达甚至检测不到。值得注意的是，Midkine是一种可溶性细胞因子,在血液和其他体液，如尿液和脑脊液中非常明显检测到，这提示我们其在细胞内外穿梭过程中发挥着主要功能。相比Midkine在多种肿瘤中的作用而展开的蛋白-蛋白相互影响的研究，如何鉴定如Midkine这类分泌蛋白在机体内动态过程中的时空网络相互作用蛋白显得更有意义。
基于色谱-质谱联用技术的蛋白质组学，是对某一生物或细胞内所有大分子质量肽段进行定性和定量分析的新学科。这种蛋白质的灵敏检测手段为蛋白质相互作用的鉴定提供强有力的辅助。
发明内容
本发明涉及时空网络层面与Midkine相互作用蛋白质的鉴定，目的一是阐明利用生物正交反应结合基因编辑手段，可以达到目的蛋白质的特异标记并为后续的蛋白质相互作用复合物富集提供活性反应基团；目的二，为特殊类别蛋白如分泌蛋白与其他蛋白质相互作用的鉴定提供方法指导及这些分子间相互作用在癌症治疗、药物靶点鉴定、新药发现等临床转化应用中的重要作用提供基础。
实验结果表明，在DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut两组中，对比无紫外光照处理条件下，引入的光活性反应基团经过紫外光照处理可抓捕许多目标蛋白质周围的弱相互作用的蛋白，这对于蛋白质相互作用的富集是大大有利的。
一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法，包括如下步骤：Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut的DiZPK标记
1)通过基因编辑手段在绿色荧光蛋白GFP和目标蛋白Midkine序列中插入终止密码子并在蛋白序列C端添加Myc-His标签肽段。
2)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
3)在293T细胞中转染3-5μg氨酰tRNA酶质粒和3-5μg Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理300-1000μM非天然氨基酸DiZPK。
4)转染48-60h后吸去培养基,加入5-8ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭。
5)每个培养皿加入1-1.2ml NETN细胞裂解液，破碎细胞，提取蛋白并进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
6)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征蛋白表达结果。
胞内标记蛋白相互作用蛋白质复合物富集与鉴定
1)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
2)在293T细胞中分别同时转染3-5μg氨酰tRNA酶质粒和3-5μg Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理300-1000μM非天然氨基酸DiZPK。
3)转染8-10h后，吸去培养基,加入5-8ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基后，每个皿中加入2-3mlPBS并置于冰上，处理或者不处理10-15分钟的365nm UV光照。
4)吸去PBS，每个培养皿加入1-1.2ml配制的NETN细胞裂解液提取蛋白，离心去除沉淀，上清中加入10-20μl Myc抗体偶联的磁珠，低温过夜富集相互作用蛋白复合物，清洗磁珠复合物后，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
4)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果。
5)另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
Midkine重新返回胞内过程中相互作用蛋白质复合物富集与鉴定
1)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
2)在293T细胞中分别同时转染3-5μg氨酰tRNA酶质粒和3-5μg Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理300-1000μM非天然氨基酸DiZPK。接种20％-30％汇合度的97H细胞，用于后续培养及处理。
3)转染48-60h后，收集293T细胞培养基,经过0.45μm过滤后加入97H细胞中处理2-4h,吸去培养基，5-8ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基后，每个皿中加入2-3mlPBS并置于冰上，处理或者不处理10-15分钟的365nm UV光照。
4)吸去PBS，每个培养皿加入1-1.2ml配制的NETN细胞裂解液提取蛋白，离心去沉淀，上清中加入10-20μl Myc抗体偶联的磁珠，低温过夜相互作用蛋白复合物，清洗磁珠复合物，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
5)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果。
6)另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
本发明为后续围绕Midkine深入展开相关机制研究和其在疾病发生发展中的重要功能研究提供指导。
附图说明
图1为细胞在处理DiZPK后Myc-His-GFP-mut成功被标记表达绿色荧光；(A)293T细胞中转染氨酰tRNA酶质粒和Myc-His-GFP-mut质粒，未加入DiZPK时细胞未发出荧光；(B)293T细胞中转染氨酰tRNA酶质粒和Myc-His-GFP-mut质粒，加入DiZPK后细胞发出绿色荧光。
图2为Western Blot验证Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut的DiZPK标记；(A)293T细胞中转染氨酰tRNA酶质粒和Myc-His-GFP-mut质粒，处理或者不处理DiZPK以及紫外光照与否；(B)293T细胞中转染氨酰tRNA酶质粒和Myc-His-Midkine-mut质粒，处理或者不处理DiZPK以及紫外光照与否。
图3为Western Blot表征胞内标记蛋白相互作用蛋白质复合物条带；
图4为Western Blot表征Midkine重新返回胞内过程中相互作用蛋白质复合物条带。
具体实施方式
Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut的DiZPK标记
1)通过基因编辑手段在绿色荧光蛋白GFP和目标蛋白Midkine序列中插入终止密码子并在蛋白序列C端添加Myc-His标签肽段。
2)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
3)在293T细胞中转染5μg氨酰tRNA酶质粒和5μg Myc-His-GFP-mut或者5μgMyc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理500μM非天然氨基酸DiZPK。
4)转染48h后于荧光显微镜下观察Myc-His-GFP-mut是否成功被DiZPK标记并表达绿色荧光。吸去培养基,加入8ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭。
5)NETN细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂，每个培养皿中加入0.5ml裂解液，刮取细胞并转移混合物到1.5mlEP管中，放入DNA混合仪，于4℃
混合50min破碎细胞，4℃，13000g，离心15min后，每管样品取200μl上清作为细胞内全蛋白检测样品，并进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
6)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征标记蛋白表达结果。
胞内标记蛋白相互作用蛋白质复合物富集与鉴定
1)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
2)在293T细胞中分别同时转染5μg氨酰tRNA酶质粒和5μg Myc-His-GFP-mut或者5μg Myc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理500μM非天然氨基酸DiZPK。
3)转染8h后，吸去培养基,加入5ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基后，每个皿中加入2mlPBS并置于冰上，处理或者不处理15分钟的365nm UV光照。
4)吸去PBS，每个培养皿加入1ml配制的含有抑制剂的NETN细胞裂解液，如前所述操作提取蛋白。4℃，13000g，离心15min后，每管样品取50μl上清作为细胞内全蛋白检测样品，剩余上清中加入10μl Myc抗体偶联的磁珠，4℃过夜富集相互作用蛋白复合物。
5)磁力架上静置10s后弃上清，加入500μlTBS，放入DNA混合仪，室温混合20min清洗磁珠复合物，重复该清洗操作3次，至溶液OD值小于0.05后弃去清洗溶液，加入50μl配制的LDS loading buffer，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
4)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果。
5)另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
Midkine从胞外返回胞内过程中相互作用蛋白质复合物富集与鉴定
1)转染前一天接种40％-50％汇合度的HEK293T细胞于10cm细胞培养皿。
2)在293T细胞中分别同时转染5μg氨酰tRNA酶质粒和5μg Myc-His-GFP-mut或者5μgMyc-His-Midkine-mut质粒，细胞培养基中处理或者不处理500μM非天然氨基酸DiZPK。接种20％-30％汇合度的97H细胞，用于后续培养及处理。
3)转染48h后，收集293T细胞培养基,经过0.45μm过滤后加入97H细胞中处理2h,吸去培养基，5ml PBS(Hyclone，SH30256.01)洗去剩余培养基后，每个皿中加入2mlPBS并置于冰上，处理或者不处理15分钟的365nm UV光照。
4)吸去PBS，每个培养皿加入1ml配制的含有抑制剂的NETN细胞裂解液，如前所述操作提取蛋白。4℃，13000g，离心15min后，每管样品取50μl上清作为细胞内全蛋白检测样品，剩余上清中加入10μl Myc抗体偶联的磁珠，4℃过夜富集相互作用蛋白复合物。
5)磁力架上静置10s后弃上清，加入500μl TBS，放入DNA混合仪，室温混合20min清洗磁珠复合物，重复该清洗操作3次，至溶液OD值小于0.05后弃去清洗溶液，加入50μl配制的LDS loading buffer，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。
4)利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果。
5)另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
Western Blot实验验证蛋白表达与富集结果
1)标记蛋白的表达或者富集后相互作用蛋白质复合物，与LDS Loading buffer混合后在95℃加热10min使蛋白质变性。
2)将凝胶固定到电泳装置上后，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，加样。
2)连接好电源后用80V电压跑胶，当样品经过浓缩胶到达分离胶时，将电压增大到120V直至溴酚蓝接近凝胶末端然后结束电泳。
3)取出电泳好的凝胶，并切除外源及上层的积层胶。
4)转膜：将膜及4片滤纸剪成所需胶的大小。先将PVDF膜浸于甲醇中浸泡5分钟。按照顺序：正级-海绵+滤纸+膜+胶+滤纸+海绵-负极，将膜夹紧，每一层都要压平，防止产生气泡。
5)将组装好的夹子放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，放入冰盒，转子后加盖，并将电泳槽外围加入冰水混合物后放在磁力搅拌器上接通电源。
恒流250mA 2h。
6)将转好的膜放入TBST中洗涤5min，洗涤两次。
7)封闭：用TBST配置5％的脱脂牛奶并混匀，将PVDF膜浸泡在含5％脱脂牛奶的TBST中，室温摇晃封闭1h。
8)将膜放入TBST中洗涤，每次5min，洗涤三次，将PVDF膜放在抗体孵育盒中，再将用5％BSA稀释的一抗加入孵育盒中，4℃摇床过夜。
9)将PVDF膜取出，用TBST清洗3次，每次15min。
10)在膜上加上用TBST配置的5％脱脂牛奶稀释好的二抗，置于摇床上室温孵育2h。
11)将膜用TBST清洗3次，每次15min。
12)将发光液(TANON)按1:1的比例将A、B液混合。用镊子夹起PVDF膜的边缘，用吸水纸吸去膜边缘多余水，加发光液于膜上,曝光。
通过荧光显微镜下观察DiZPK的加入，使得Myc-His-GFP-mut成功被标记，细胞显现绿色荧光，说明遗传密码子拓展技术可将非天然氨基酸引入到目标肽链当中，达到蛋白质的特定标记，如图1所示，表现为细胞发出绿色荧光。
利用Western Blot分析转染氨酰tRNA酶质粒和Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut质粒时，再处理或者不处理非天然氨基酸DiZPK以及是否进行紫外照射等不同情况下的蛋白条带，结果显示紫外照射下，Myc-His-Midkine-mut富集组在110kD-130kD大小位置出现的蛋白条带与Myc-His-GFP-mut富集有明显差异，这个位置对应的蛋白质为Myc-His-Midkine-mut可能产生时空网络相互作用的蛋白质。

Claims (2)

1.一种鉴定Midkine时空网络相互作用蛋白质的方法，其特征在于：
1）通过遗传密码子拓展技术在Midkine蛋白序列中引入具有光交联性质的特定非天然氨基酸DiZPK；
2）DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut蛋白相互作用复合物富集；
3）DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut蛋白，富集标记蛋白在分泌到细胞外再重新返回细胞内过程中相互作用蛋白质；
4）通过比较Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut在处理或者不处理紫外照射两种条件下，富集出的蛋白质在样品之间的丰度差异，来鉴定Midkine蛋白经历短时间胞内活动，分泌到细胞外后再返回到细胞内这个过程时的时空网络相互作用蛋白质；初步结果显示分布在110kD-130kD大小之间的蛋白为Myc-His-Midkine-mut相互作用的蛋白质；
步骤1）通过遗传密码子拓展技术在Midkine蛋白序列中引入具有光交联性质的特定非天然氨基酸DiZPK，并结合蛋白免疫印迹实验验证突变后的蛋白质表达；包括以下步骤：
A、通过遗传密码子拓展技术在Midkine蛋白序列中引入具有光交联性质的特定非天然氨基酸DiZPK，得到突变后的蛋白质：
1)通过基因编辑手段在绿色荧光蛋白GFP和目标蛋白Midkine序列中分别插入终止密码子并在蛋白序列C端添加Myc-His标签肽段；
2)在二组培养在10-15mL培养基中的293T细胞中同时转染3-5μg氨酰tRNA酶质粒和3-5μg Myc-His-GFP-mut，在另二组培养在10-15mL培养基中的293T细胞中同时转染3-5μg氨酰tRNA酶质粒和3-5μg Myc-His-Midkine-mut质粒；
于一组转染Myc-His-GFP-mut的293T细胞的细胞培养基中添加终浓度300-1000μM 非天然氨基酸DiZPK；于一组转染Myc-His-GFP-mut的293T细胞的细胞培养基中不添加非天然氨基酸DiZPK；
于一组转染Myc-His-Midkine-mut的293T细胞的细胞培养基中添加终浓度300-1000μM非天然氨基酸DiZPK；于一组转染Myc-His-Midkine-mut的293T细胞的细胞培养基中不添加非天然氨基酸DiZPK；
3)转染48-60h后，荧光显微镜下观察添加非天然氨基酸DiZPK的一组中Myc-His-GFP-mut是否成功被DiZPK标记并表达绿色荧光；若表达绿色荧光，将四组培养于培养皿中的培养体系吸去培养基，得到表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞和未被DiZPK标记突变蛋白质的细胞，以及四组它们的培养基；
B、结合蛋白免疫印迹实验验证突变后的蛋白质表达：
于四组培养体系中分别加入5-8ml PBS洗去剩余培养基，吸走PBS，将装有细胞的细胞培养皿置于液氮中淬灭；
4)每个装有细胞的培养皿分别加入1-1.2ml配制的NETN细胞裂解液，提取蛋白并进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上；
5）分别利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征蛋白表达结果；
步骤2）DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut蛋白相互作用复合物富集，对二组表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞，5-15分钟的365nm UV光照，触发标记蛋白与其附近相互作用蛋白质发生光交联反应并形成共价结合的蛋白质相互作用复合物，通过Myc标签抗体偶联的磁珠富集该蛋白相互作用复合物，Western Blot验证蛋白富集结果，同时处理蛋白质组织学样品；包括以下步骤：
A、1）于二组表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞的培养体系中分别加入5-8ml PBS洗去剩余培养基后，每个皿中加入2-3mlPBS并置于冰上，10-15分钟的365nm UV光照处理；
2）四组培养体系分别吸去PBS，每个培养皿加入1-1.2 ml配制的NETN细胞裂解液提取蛋白，采用Myc抗体偶联的磁珠富集标记蛋白与相互作用蛋白复合物，得到二组被DiZPK标记突变蛋白质复合物和二组未被DiZPK标记突变蛋白质复合物；
B、Western Blot验证蛋白富集结果，同时处理蛋白质组织学样品
3）四组蛋白质复合物进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上；
4）利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果；
5）另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，即二组表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞，分别进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut蛋白，富集标记蛋白在分泌到细胞外再重新返回细胞内过程中相互作用蛋白质，具体过程：收集分泌到培养基中的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut标记蛋白后，处理内源不表达Midkine蛋白的相关细胞2-4h，适当时间的365nm UV光照触发标记蛋白与其附近相互作用蛋白质发生光交联反应并形成共价结合的蛋白质相互作用复合物，通过Myc标签抗体偶联的磁珠富集该蛋白相互作用复合物，Western Blot验证蛋白富集结果，同时处理蛋白质组织学样品；包括以下步骤：
1）将收集的四组293T细胞培养基, 分别加入97H细胞中处理2-4h， 吸去培养基，5-8mlPBS洗去剩余培养基后，每个皿中加入2-3mlPBS并置于0-4℃的冰上，对二组表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞培养基体系进行10-15分钟的365nm UV光照处理；未被DiZPK标记突变蛋白质的细胞培养基体系不处理；
2）吸去PBS，每个培养皿加入1-1.2 ml配制的NETN细胞裂解液提取蛋白，采用Myc抗体偶联的磁珠富集标记蛋白与相互作用蛋白复合物，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上；
3）利用His和Midkine特异抗体，通过Western Blot结合化学发光表征不同处理条件下的蛋白富集结果；
4）另外，DiZPK成功标记的Myc-His-GFP-mut或者Myc-His-Midkine-mut并处理紫外照射的两组样品，即二组表达被DiZPK标记突变蛋白质的细胞培养基培养的细胞，分别进行SDS-PAGE电泳后，切胶进行下一步的蛋白质组学检测。
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