RU2009120481A

RU2009120481A - Анализ протеолитического расщепления с помощью масс-спектрометрии

Info

Publication number: RU2009120481A
Application number: RU2009120481/15A
Authority: RU
Inventors: Ральф ХОФФМАНН (NL); Ральф ХОФФМАНН
Original assignee: Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl); Конинклейке Филипс Электроникс Н.В.
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2007-10-22
Publication date: 2010-12-10
Also published as: JP2010508503A; US20100075356A1; EP2082236A1; WO2008053398A1; EP1918713A1; CN101535812A; BRPI0718088A2

Abstract

1. Способ для исследования различий в протеолитическом расщеплении двух или более различных образцов in vitro, включающий в себя стадии: ! a) модификации амина на N-конце и в лизине в белках из указанных образцов, ! b) расщепления модифицированных белков на пептиды с одновременным мечением каждого из образцов с помощью или O или 18O, ! c) выделения N-концевых пептидов, ! d) объединения меченых образцов после стадии (b) или выделенных N-концевых пептидов из стадии (c), ! e) исследования N-концевых пептидов в МС, ! f) отбора значимых пептидных фракций для дальнейшего анализа, и ! g) идентификации пептидов, образовавшихся при протеолитическом расщеплении. ! 2. Способ по п.1, который после стадии (d) дополнительно содержит стадию, на которой выделенные N-концевые пептиды подвергают разделению. ! 3. Способ по п.1, где на стадии (a) модификацию каждого образца выполняют с помощью различных реактивов для изобарического мечения, содержащих взаимодействующую с амином группу. ! 4. Способ по п.1, где расщепление на стадии (b) выполняют с помощью трипсина. ! 5. Способ по п.1, где выделение N-концевых пептидов выполняют посредством ковалентного связывания аффинной метки с N-концом внутренних и C-концевых пептидов и удаления внутренних и C-концевых пептидов из образцов с помощью аффинной хроматографии. ! 6. Способ по п.1, где стадия (g) содержит анализ идентифицированных белковых образцов в МС/МС. ! 7. Способ по п.1, где, при использовании двух образцов, стадия отбора на стадии (f) состоит из идентификации тех пиков, для которых отношение пиков изотопно меченых пептидов составляет менее 0,5 или более 1,5. ! 8. Способ по п.1, где, при использовании двух образцов, стадия отбо�

Claims

1. Способ для исследования различий в протеолитическом расщеплении двух или более различных образцов in vitro, включающий в себя стадии:

a) модификации амина на N-конце и в лизине в белках из указанных образцов,

b) расщепления модифицированных белков на пептиды с одновременным мечением каждого из образцов с помощью или O или ¹⁸O,

c) выделения N-концевых пептидов,

d) объединения меченых образцов после стадии (b) или выделенных N-концевых пептидов из стадии (c),

e) исследования N-концевых пептидов в МС,

f) отбора значимых пептидных фракций для дальнейшего анализа, и

g) идентификации пептидов, образовавшихся при протеолитическом расщеплении.

2. Способ по п.1, который после стадии (d) дополнительно содержит стадию, на которой выделенные N-концевые пептиды подвергают разделению.

3. Способ по п.1, где на стадии (a) модификацию каждого образца выполняют с помощью различных реактивов для изобарического мечения, содержащих взаимодействующую с амином группу.

4. Способ по п.1, где расщепление на стадии (b) выполняют с помощью трипсина.

5. Способ по п.1, где выделение N-концевых пептидов выполняют посредством ковалентного связывания аффинной метки с N-концом внутренних и C-концевых пептидов и удаления внутренних и C-концевых пептидов из образцов с помощью аффинной хроматографии.

6. Способ по п.1, где стадия (g) содержит анализ идентифицированных белковых образцов в МС/МС.

7. Способ по п.1, где, при использовании двух образцов, стадия отбора на стадии (f) состоит из идентификации тех пиков, для которых отношение пиков изотопно меченых пептидов составляет менее 0,5 или более 1,5.

8. Способ по п.1, где, при использовании двух образцов, стадия отбора на стадии (f) состоит из идентификации тех пиков, для которых отношение пиков изотопно меченых пептидов составляет менее 0,1 или более 10.

9. Применение способа п.1 для определения сайтов протеолитического расщепления.

10. Применение способа по п.1 для определения даунстрим-эффектов протеолитического расщепления.

11. Способ по п.1, где один или более белковых образцов представляют собой образцы тканей пациентов со злокачественной опухолью.

12. Набор реактивов, содержащий набор из двух или более реактивов для изобарического мечения и H₂ ¹⁸O.

13. Набор по п.12, дополнительно содержащий средства для выделения полипептидов со свободным N-концом.

14. Устройство (100') для анализа двух белковых образцов с использованием изотопного мечения, включающее два источника образцов (101), прибор для модификации белка (103') с источником модифицирующего реактива (104'), прибор для мечения и расщепления белка (105) и соответствующие источники меток (107), прибор для выделения N-концевого пептида (106), прибор для разделения (108), прибор для масс-спектрометрии (109) и прибор для анализа данных (110).

15. Устройство (100) для сложного анализа белковых образцов с использованием двойного мечения, включающее, по крайней мере, два источника образцов (101), прибор для мечения (103) с, по крайней мере, двумя источниками меченых реактивов (104), прибор для мечения и расщепления белка (105) и соответствующие источники меток (107), прибор для выделения N-концевого пептида (106), прибор для разделения (108), прибор для масс-спектрометрии (109) и прибор для анализа данных (110).

16. Устройство по п.14 или 15, дополнительно включающее прибор для подготовки образца (102).