CN101535812A - 蛋白水解加工的质谱法分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于N－末端肽的同位素标记用于测定差异化蛋白水解加工的样品同时分析，其中同位素标记通过在酶促蛋白水解期间掺入¹⁸O来实现。

Description

蛋白水解加工的质谱法分析

技术领域

本发明涉及利用MS分析同时地在不同的样品中测定蛋白水解加工(proteolytic proceSsing)的工具和方法。

背景技术

蛋白酶起初被表征为与蛋白质分解代谢相关的非特异性降解酶。然而，通过某些蛋白质的高度特异性的裂解(cleavage)，越来越认识到的是，在所有活的有机体中蛋白水解作用(proteolysis)是实现生物过程的精确细胞控制的重要机制[Barrett(1998)，“Handbook of ProteolyticEnzymes”Academic Press，London]。这种高度特异性和限制性的底物裂解被称为蛋白水解加工。蛋白酶，通过它们催化不可逆水解反应的能力，通过控制合适的细胞内或细胞外定位，通过从细胞表面脱落(shedding)，通过蛋白酶和其他酶、细胞因子、激素或生长因子的活化或失活，通过受体激动剂(agonist)向拮抗剂(antagonist)的转变和通过暴露隐藏的新生蛋白(neoprotein)(即，蛋白水解裂解产物是具有不同于亲本蛋白质(parent protein)的作用的功能性蛋白)，来调节许多蛋白质的命运(fate)和活性。因此，通过加工生物活性分子，蛋白酶启动、调节和终止大量重要的细胞功能，从而直接控制关键的生物过程，例如DNA复制、细胞周期进展、细胞增殖、分化和迁移、形态发生(morphogenesis)和组织重建(tissue remodelling)、神经元长出(neuronal outgrowth)、止血、伤口愈合、免疫、血管生成和细胞凋亡(例如，在Sternlicht等。(2001)，Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.17，463-516中综述)。

考虑到蛋白酶对所有生命过程，包括细胞死亡的功能关联性，不难理解的是，这些酶的缺失或误导的时间和空间活性构成了一些病理学状况，例如癌症、关节炎、神经变性和心血管疾病的基础。此外，许多传染性微生物、病毒和寄生虫利用蛋白酶作为毒力因子(virulence factor)，动物毒液通常含有蛋白酶来进行组织破坏或逃避宿主反应。从而，许多蛋白酶或它们的底物(substrate)是制药工业中作为潜在药物靶标的重要的关注点。

由于蛋白水解酶的不断扩大的作用，对从细菌到人的各种生物体中存在许多蛋白酶的鉴定和功能表征方面产生越来越高的兴趣。几个大规模的基因组测序计划的接近完成提供了理解蛋白酶系统的复杂度的新的机会。人类基因组含有超过500个编码蛋白酶或蛋白酶样分子(protease-like molecule)的基因。

尽管对蛋白酶有着提高的认识，但是新近鉴定的蛋白酶的底物和体内作用是未知的，甚至对于已经良好表征的蛋白酶，它们的生物功能通常也是未完全了解的。急切地需要新的技术来鉴定在细胞、组织或生物体中表达并且具有活性的蛋白酶谱(protease repertoire)，以及鉴定每种蛋白酶的所有天然底物。

由于所有生物体中起作用的蛋白水解系统的不断增加的复杂性和重要性，以及在基因组和蛋白质组广度级别(genome-and proteome-widescales)上以它们作为整体分析系统的能力，需要引入新的术语来阐明这个领域中出现的概念。因而，McQuibban等.(2000)，Science289，1202-1206，首先创造了“降解组学(degradomics)”来定义在蛋白质组广度级别上的蛋白酶的底物谱。此外，该术语还被用于细胞、组织或生物体在特定时刻或状况下表达的蛋白酶的完整集合。降解组学的领域将利用新出现的、新的基因组和蛋白质组技术来构建以研究和定义两种类型的蛋白酶降解组(degradome)。

鉴定单个蛋白酶的底物降解组将便于我们了解它们的生理学和病理学作用，从而指向新的诊断生物标记物，以及新的药物靶点(drugtarget)。这种信息，与细胞的蛋白酶降解组的知识一起，将提高我们对蛋白酶在细胞环境中对于细胞功能和病理的生物学作用的理解。在组织广度级别上的类似的信息将在疾病的分子诊断上被证明有用，蛋白质水平对于疾病严重度或肿瘤等级的标定允许对患者进行更精确的预后预测(prognostic prediction)。

功能降解组学具有两个分支：第一个是基于单个蛋白酶的活性分布，第二个涉及目标底物的裂解的测定。因而，不同于定义特定蛋白酶的个体贡献，后者目的是将蛋白酶降解组作为引起底物裂解的系统来考虑。降解组学的领域有希望揭示新的蛋白酶和生理学底物，以及鉴定由蛋白水解加工所控制的新的和已知的调节途径。这些途径的调节可能在疾病状态是被破坏的，或者宿主蛋白酶可能被微生物利用用于感染，因而可以被治疗靶向(therapeutically targeted)。描述了不同的蛋白质组方法来研究蛋白水解加工。

Hancock等人(WO2006044666)分离了样品的低Mr肽级分并鉴定了其中的蛋白。对加工的蛋白本身没有获得信息，其保留在高Mr蛋白级分中。

McDonald等人((2005)Nat.Methods 2，955-957)描述了一种方法，其中来自蛋白质混合物的N-末端肽(N-terminal peptides)被分离并通过MS鉴定。这种方法成功鉴定了肝脏蛋白质中的新的裂解位点。在这种方法中，仅研究了一个样品，并且所有的肽，以及来自未加工的蛋白质的那些，都需要通过MS和序列测定来鉴定，以揭示最终的新的蛋白水解加工事件。

另一方面，Overall等人利用了一种方法，其中利用ICAT(Isotope-Coded Affinity Tag，同位素编码的亲和标签)标记物同时地分析两个样品[Overall and Dean(2006)Cancer Metastatis 25，69-75]。在这种方法中，半胱氨酸的硫醇基团(thiol group)用亲和力标签化的标记物来修饰，样品用胰蛋白酶消化，并分离标记的肽。以这种方式，检测了由于异常加工的蛋白质的降解或由于提高的脱落而具有不同的表达水平的蛋白质。然而这种方法没有对这些蛋白质中的裂解位点给出信息。

Fisher等人(US20060134723)描述了利用同位素标记和通过选择N-末端或C-末端肽来研究不同样品中的蛋白成熟(protein maturation)和加工的方法。

仍然需要容许有效分析样品中蛋白水解加工的分析方法。

发明内容

本发明提供了比较两种蛋白样品之间蛋白水解加工的方法，其基于选择性标记和N-末端肽的分离。选择性标记和N-末端肽的分离是通过蛋白质裂解与H₂ ¹⁸O同位素标记的组合，随后分离N-末端肽用于进一步分析来实现的。这种方法具有的优点是，与现有技术方法相比，操作步骤的数量被降低了，其中现有技术方法中同位素标记和蛋白质裂解在两个独立的步骤中进行。此外，昂贵同位素标记化合物被不太昂贵的H₂ ¹⁸O替代。通过组合蛋白质裂解和用H₂ ¹⁸O标记，被裂解的每个肽将自动地被标记，其提高了标记的效率。蛋白酶介导的(mediated)¹⁸O掺入具有另外的优势，它特异于C-末端并且不干扰存在的内部氨基酸Asp和Glu的官能羧基基团。

本发明进一步提供了多通道双标记方法(multiplex double labellingmethod)，其中蛋白酶介导的O¹⁸掺入和胺特异性同量异序(isobaric)标记被组合。在这些方法中，所述同量异序标记与蛋白质修饰步骤组合，通常其是作为两个独立的步骤实施。

本发明的特别的和优选的方面在附随的独立和从属权利要求中列出。从属权利要求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征组合，而不仅仅是如权利要求中明确阐述的那样。

本发明的第一个方面提供了用于比较两种或更多种不同蛋白质样品之间的蛋白水解加工的体外方法。根据本发明的这个方面的方法包括步骤(a)修饰所述样品中蛋白质的N-末端的胺和赖氨酸残基的胺，(b)将所述修饰的蛋白质裂解成肽并同时通过蛋白酶诱导的O或¹⁸O的掺入用O或¹⁸O标记每个样品，(c)从所获得的肽分离N-末端肽，和(e)使所述N-末端肽经受MS。根据本发明的这个方面的方法进一步包括步骤：集中(pooling)(d)在步骤(b)中获得的标记的样品或在步骤(c)中获得的分离的N-末端肽。在下一个步骤(f)中，根据步骤(e)中的MS分析选择相关的肽级分(peptide fractions)，并且这些相关的肽级分任选地被进一步分析(g)来鉴定其中的肽。

根据一个实施方式，所述方法包括，在步骤(c)之后，使分离的N-末端肽进行肽分离步骤的步骤。

在本发明的方法的特定的实施方式中，步骤(a)中的所述修饰是用包含胺反应性基团的不同的同量异序标记试剂对每种样品实施。在这些实施方式中，所述修饰步骤是差异化标记步骤(differential labellingstep)，借此不同的标记物被掺入到每种样品中。

在本发明方法的进一步的特定实施方式中，步骤(b)中的裂解用胰蛋白酶(trypsin)进行。

在本发明方法的特定实施方式中，N-末端肽的分离通过将亲和标签共价连接到内部和C-末端肽的N-末端并通过亲和层析(affinitychromatography)从所述样品中除去内部和C-末端肽来进行。

在这些方法的特定实施方式中，步骤(g)包括在MS/MS上分析鉴定的蛋白质样品。

在根据本发明的这个方面的方法的特定实施方式中，当使用两个样品时，步骤(f)中的选择步骤由以下组成：鉴定同位素标记的肽的峰之间的比低于0.5或高于1.5，更特别地低于0.1或高于10的那些峰。

在特定的实施方式中，本发明的方法被用于蛋白质样品，所述蛋白质样品中的一种或多种是来自肿瘤患者的样品。

本发明的第二方面涉及以上描述的方法在酶、蛋白质、裂解条件、疾病状态等等的表征中用于测定蛋白水解裂解位点的用途。

本发明的进一步的方面涉及以上描述的方法用于测定蛋白水解加工的下游效应(downstream effects)的用途。

本发明的再进一步的方面提供了进行本发明的方法的工具，更特别地，用于样品的差异化标记的试剂的试剂盒，其特征在于它们包含一组两种或更多种同量异序标记试剂和H₂ ¹⁸O。

在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于分离具有游离N-末端的多肽的装置。

在本发明的再进一步的方面中，提供了特别适合于执行在此描述的方法的设备。在本发明中提供的、用于利用同位素标记同时分析两种蛋白质样品的设备(100’)典型地包括两个样品源(101)、具有修饰试剂源(104’)的蛋白质修饰单元(103’)、用于进行利用¹⁶O或¹⁸O的蛋白酶介导的标记的标记和蛋白质裂解单元(105)和相应的标记物源(107)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)和数据分析单元(110)。

本发明的再进一步的方面提供了设备(100)，用于利用双标记的两种或更多种蛋白质样品的多通道分析，包含至少两个样品源(101)、具有至少两个标记试剂源(104)的标记单元(103)、用于进行利用¹⁶O或¹⁸O的蛋白酶介导的标记的标记和蛋白质裂解单元(105)和相应的标记物源(107)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)，和电路控制及数据分析单元(110)。

如上所述的设备的特定实施方式进一步包括样品制备单元(102)。

根据以下详细说明，连同附图，本发明的上述和其他特征、特点和优点将变得显而易见，其以举例方式说明了本发明的原理。给出这种描述仅是为了举例，而不是限制本发明的范围。以下引用的附图标记是指附图。

附图说明

图1显示了iTRAQ试剂(A)和用它标记的肽(B)的示范性的结构。根据本发明一个实施方式的同量异序标记试剂的详细结构由具有114到117Da的质量的报告基团、具有31到28Da的质量的平衡基团和胺特异性肽反应基团(NHS)组成。

图2说明了胰蛋白酶介导的向裂解的肽的C-末端氨基酸的两个羧基氧原子中掺入¹⁸O(E：酶)。

图3展现了根据本发明的特定的实施方式鉴定两个样品中不同地加工的蛋白质。(1)：蛋白变性；(2)：半胱氨酸的修饰；(3)伯胺的修饰；(4)：酶消化；(5)N-末端肽的分离；左侧画面显示了未体内加工的蛋白“A”。在裂解之后，蛋白“A”被裂解成N-末端肽(a)、内部肽(b)和C-末端肽(c)。在右侧画面中，样品中的蛋白A在氨基酸(z)处被体内加工成两个片段A′和A＂。在消化时，A′被裂解成N-末端(a)和内部/C-末端肽(b′)。A＂被裂解成N-末端肽(a′)和C-末端肽(c)。N-末端肽的选择分离了左侧画面中的肽(a)和右侧画面中的肽(a)和(a′)。

图4说明了根据本发明的特定的实施方式，利用使用18O同位素标记和胺特异性同量异序标记的双标记的多个样品的同时分析。1-8：样品；A-D同量异序标记物，16和18是同位素标记物。

图5根据本发明的一个特定的实施方式显示了利用双标记用于8个蛋白质样品的多通道分析的设备(100)，包括八个样品源(101)、样品制备单元(102)、具有相应的第一标记物源(104)的(第一)标记单元(103)、具有相应的第二标记物(H₂ ¹⁶O H₂ ¹⁸O)源(107)的裂解和(第二)标记单元(105)、N-末端肽分离单元(106)、包含两个连续连接的分离系统(1108)和(2108)的分离单元(108)、质谱仪单元(109)和与读出系统(111)连接的控制电路及数据分析单元(110)。

附图6根据本发明的一个特定的实施方式显示了利用同位素标记用于2个蛋白质样品的分析的设备(100’)，包括两个样品源(101)、样品制备单元(102)、具有修饰试剂源(104′)的蛋白修饰单元(103’)、具有相应的标记试剂(H₂ ¹⁶O和H₂ ¹⁸O)源(107)的裂解和标记单元(105)、N-末端肽分离单元(106)、包含两个连续连接的分离系统(1108)和(2108)的分离单元(108)、质谱仪单元(109)和与读出系统(111)连接的控制电路及数据分析单元(110)。

具体实施方式

在不同的图中，相同的附图标记是指相同的或类似的元件。

将针对特定的实施方式和参考某些附图描述本发明，但是本发明不受此限制，而仅由权利要求限定。权利要求的任何附图标记将不被看做是限制范围。描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明性的目的，某些元件的大小可以被夸大而没有按比例绘制。当术语“包括(包含)”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他元素或步骤。当涉及单名词时使用不定冠词或定冠词例如“a”、或“an”、“the”的地方，这包括该名词的复数，除非另有特别声明。

此外，在说明书中和在权利要求中，术语第一、第二、第三等等，是用于区分相似的要素，而不是必定描述次序或时间顺序。要理解的是，这样使用的术语在合适的状况下是可互换的，在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或说明的其他顺序来操作。

提供以下术语或定义仅仅是来帮助理解本发明。除非指定，否则这些定义不应当被认为具有小于本领域普通技术人员所理解范围的范围。

如在此使用的那样，术语“多肽”或“蛋白质”是指经由肽键连接的多个天然的或修饰的氨基酸。多肽的长度可以从2个到数千个氨基酸变化(因而该术语还包括通常称作寡肽的物质)。包括在这个范围内的是多肽，其包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸通过体内转译后修饰(posttranslationa1 modifications)例如糖基化、磷酸化(phosphorylation)等等被修饰，和/或包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸已经被蛋白质修饰剂(例如，烷基化剂和乙酰化剂)体外修饰。

在此使用的术语“多肽片段”或“肽”被用于指在蛋白质或多肽的酶裂解之后获得的氨基酸序列。多肽片段或肽不受大小或性质的限制。

术语“内部(internal)”、“N-末端”和“C-末端”当涉及肽时，在此使用是指肽在蛋白质或多肽中的相应位置。例如，在蛋白NH₂-X₁-K-X₂-R-X₃-K-X₄-COOH(其中X₁、X₂、X₃和X₄是没有赖氨酸(K)或精氨酸(R)的未确定长度的肽序列)的胰蛋白酶裂解中，N-末端肽是NH₂-X₁-K-COOH，内部肽是NH₂-X₂-R-COOH和NH₂-X₃-K-COOH，C-末端肽是NH₂-X₄-COOH。

术语“降解组”，当在此在细胞的降解组的上下文中使用时，是指由细胞、组织或生物体在特定时刻或状况下表达的蛋白酶的完整集合。该相同术语，当在此使用时，在蛋白酶的上下文中可以指细胞、组织或生物体中该蛋白酶的底物谱。

在此使用的术语“蛋白质裂解”涉及多肽中两个氨基酸之间的肽键的水解。在本发明的方法中，蛋白质裂解是以酶的方式进行的(performedenzymatically)。在生理过程的上下文中，还使用术语例如“酶水解”、“蛋白水解加工”和“蛋白成熟”。

在此使用的术语“碎裂(fragmentation)”是指一个或多个化学键的破坏和随后释放分子的一个或多个部分，如通过例如在质谱法(MS)中的碰撞诱导的解离(CID)所获得的。在某些实施方式中，所述键是肽键，但它不限于此。

在此使用的术语“标记物”是指化合物或分子，其可以共价连接到肽或多肽或掺入到肽或多肽中，并且根据它的特定性质，它是在质谱仪上可检测到的。标记物包括复合化学分子(composite chemicalmolecule)，其可以通过标记试剂中存在的蛋白/肽反应基团共价结合到肽或多肽。标记物还包括单个原子(例如，同位素)，其通过化学和/或酶促反应被掺入到感兴趣的肽或多肽中。虽然术语标记物是按照广义来使用，但是可以区分结合到蛋白质或肽的标记物分子和标记试剂(更具体地是指在与肽或蛋白质结合之前包含标记物的化合物，包含用于结合在蛋白质或肽上的反应基团)。本发明设想了不同类型的标记物，例如下文定义的同位素和同量异序标记物的使用。关于同位素或同量异序标记物(或标记试剂)在此使用的术语“标记物的组”，是指两种或更多种不同的标记物或标记试剂，其可以在一个实验中同时使用来标记不同的样品，即，其具有相同的化学结构但可以基于质量在MS或MS/MS中区分。

在此使用的术语“同位素标记物”是指一组分子，其具有基本上相同的结构并且在电泳和层析中具有同样的行为方式，但是在一个或多个原子方面具有不同以在质量上产生差异，其可以用作标记物(的部分)。不同的同位素标记物组分之间的质量差异通过用相同原子的同位素替换原子来保证。各自用包含标记物组分的标记物标记的相同的肽可以在MS中相互区分，其中所述标记物组分具有相同的或基本上相同的化学式，但是基于相同原子的不同同位素(在数量上或类型上)的存在而在质量上不同。

在此使用的术语“同位素O标记物”是指包含一个或多个不同的¹⁸O原子的标记物。在一个样品或一组样品中掺入一个或多个¹⁸O，在另一个样品或可选的一组样品中掺入一个或多个氧或¹⁶O(在此通常称为O)的组合使用，导致了这些样品的同位素标记。同位素O标记物在酶促蛋白水解作用期间作为肽的C-末端中O的替代物被掺入，导致了包含C-末端O的那些肽和包含C-末端¹⁸O的那些肽之间在MS上质量的差异。因而，用同位素O标记物差异化标记的相同的肽如此可以基于质量的差异在MS上被区分。

在此使用的术语“同量异序标记物”是指一组标记物，其具有相同的结构和相同的质量，其碎裂时对于该组的所有同量异序标记物都释放具有相同结构的特定碎片，由于在所述同量异序标记物内同位素的差异化分布，在该组中在单独的同量异序标记物之间所述特定碎片在质量上不同。同量异序标记物一般包含报告基团(RG)，其是相对小的碎片，以及平衡基团(BG)。一组同量异序标记物的“组合质量”是指该组同量异序标记物的报告基团和平衡基团的总质量。

术语“报告基团(RG)”是指同量异序标记物的在碰撞诱导解离(CID)时产生强的标志离子(signature ion)的部分。在报告基团释放时产生的典型碎片被用于测定相应的同量异序标记的多肽。一般地，碎片离子在MS谱的低质量区域出现，在此一般不存在其他碎片离子。

在此使用的术语“平衡基团(BG)”是指这样的同量异序标记物的部分，其含有某些补偿数量的同位素以确保所述报告基团和平衡基团的组合质量对于一个组的不同同量异序标记物是恒定的。在CID时平衡基团可以从标记物释放或可以不从标记物释放。

在此使用的术语“蛋白质/肽反应基团”(PRG)是指化合物上的化学官能，其能够与蛋白质或肽的氨基酸上的官能团反应，引起这种化合物与氨基酸的结合(非共价的或共价的)。一般地，标记试剂包含PRG，借此在PRG与肽或蛋白上的官能团相互作用时，标记物结合到肽或蛋白上。

在此使用的术语“官能团”是指氨基酸上的化学官能，其可以用于与化合物结合(一般地，共价结合)。官能团可以存在于氨基酸的侧链上，或者存在于多肽或肽的N-末端或C-末端上。该术语涵盖天然存在于肽或多肽上的官能团和通过例如使用蛋白修饰试剂的化学反应导入的那些。

本发明的方法容许在质谱水平上在两种或更多种样品中精确比较蛋白水解加工事件，借此，需要分析在这些样品中产生的最小数量的肽而不损失有价值的数据。蛋白质裂解和N-末端肽选择的组合将分析限制到其中原始样品的每种多肽通过一种N-末端肽来代表的集中的样品。

本发明涉及检测两种或更多种样品之间蛋白水解中的差异的方法。一般地，所述样品将是哺乳动物来源的。然而，其他生物体可以被用于研究蛋白水解加工，通过例如在模型生物体如斑马鱼(zebrafish)、Drosophila、C.elegans、S.pombe或S.cerevisiae中灭活或过表达蛋白酶和蛋白酶抑制物的基因。在特定的实施方式中，所述样品是组织样品或来自组织样品的培养的细胞。在其他实施方式中，所述样品是体液，例如血液(例如，血浆或血清)、唾液、尿液、乳头吸出物、导管灌洗液(ductal lavage)、汗或汗水、肿瘤渗出物(tumor exudates)、关节液(例如，滑液)、炎症液体(inflammation fluid)、泪液、精液和阴道分泌物(vaginal secretions)。

在特定的实施方式中，样品是哺乳动物来源的样品，其已经与来自蛇、蝎子等等的毒物接触。

在进一步的特定实施方式中，样品是哺乳动物来源的样品，其中转染了编码活性蛋白酶、灭活蛋白酶、活性蛋白酶抑制剂或灭活蛋白酶抑制剂的基因。

在下面通常将提及“样品”，从而是指特定来源的未纯化的或经纯化的包含蛋白质的材料。根据本发明这种样品可以包含一种或多种蛋白质。为了简化描述，一般地将提及样品中的“蛋白质”。这不是意图将本发明的方法限制到一种蛋白质样品(one-protein samples)的分析上。相反地，本发明设想利用本发明的方法用于复杂样品的分析，从而可以在一个分析中比较每种样品中不同蛋白质的存在和蛋白水解加工。

本发明的方法和工具涉及蛋白质样品的分析。如以上所指出的，在此使用的术语“样品”不是意图必然地包括或排除在实施本发明的方法之前进行的任何加工步骤。样品可以是粗的未加工的样品、提取的蛋白质级分、纯化的蛋白质级分等等。

根据一个实施方式，所述蛋白质样品通过丰度蛋白质(abundantproteins)的免疫耗竭(immunodepletion)来预先加工。

样品的制备取决于所研究的生物体、组织或器官而不同，但是标准过程通常是可获得的并且是专家已知的。对于哺乳动物和人类蛋白质样品，其涵盖了培养的细胞、激光微解剖的细胞、身体组织、体液或其他感兴趣的相关样品的分离。对于样品中蛋白质的分级，细胞裂解是细胞分级和蛋白质纯化中的第一步骤。许多技术可用于破坏细胞，包括基于物理的、酶的和洗涤剂的方法。历史上，物理裂解是选择用于细胞破坏的方法(匀质化、渗透裂解、超声细胞破坏)；然而，它通常需要昂贵的、笨重的设备，并且由于设备中的可变性而涉及有时难以重复的方案(例如，松散装配的与紧密装配的匀质化钵锤的对比)。近年来，基于洗涤剂的裂解由于容易使用、低成本和高效的方案而变得非常受欢迎。

哺乳动物细胞具有质膜，一种形成分隔细胞内含物和细胞外环境的屏障的蛋白-脂质双分子层(protein-lipid bilayer)。构成质膜的脂质是两亲性的，具有亲水性和疏水性部分，其自发地缔合来形成闭合的双分子片层。膜蛋白包埋在所述脂质双分子层中，通过跨越疏水核心的一个或多个结构域(domains)保持就位。此外，外周蛋白(peripheral protein)通过与整合膜蛋白(integral membrane protein)或与极性脂质头部基团的相互作用来结合双分子层的内部或外部表面。脂质和蛋白质内容物的性质根据细胞类型而变化。明显地，选择用于破坏细胞的技术，无论是基于物理的还是基于洗涤剂的，都必需考虑被检查的细胞或组织的来源，以及在破坏它们的外层方面的固有的容易度或难度。此外，所述方法必需与要加工的材料的数量和预期的下游应用相适合。

在特定的实施方式中，蛋白质提取还包括来源于不同区室的细胞蛋白质(例如，细胞外蛋白、膜蛋白、细胞胞浆蛋白(cytosolic proteins)、核蛋白(nuclear proteins)、线粒体蛋白(mitochondrial proteins))的预分级。其他预分级方法根据物理性质例如等电点、电荷和分子量来分离蛋白质。

根据一个特定的实施方式，利用合适的试剂(例如，盐酸胍盐(guanidinium chloride)、尿素、酸(例如，0.1％ trifluoric acid)、碱(例如，50％吡啶)和离子或非离子洗涤剂)在标记或裂解之前预处理所述样品，以便使蛋白质变性以实现对试剂或蛋白酶的优化接触(optimised access)。

取决于在本发明方法的不同实施方式中使用的试剂，可以设想通过硫醇反应性试剂减少(reduce)和修饰蛋白质中的半胱氨酸残基。特异性地修饰半胱氨酸的广泛使用的试剂是碘乙酰胺或乙烯基吡啶。

本发明的第一方面提供了同时分析两种或更多种样品中的蛋白质裂解事件的方法。本发明的方法包括以下步骤：样品中存在的蛋白质的伯胺的修饰，蛋白质的裂解和产生的肽的C-末端的同时标记、N-末端肽的分离、N-末端肽的纯化，以及最终的肽的差异化MS分析。

因而，本发明的方法包括这样的步骤，借助该步骤，样品中存在的蛋白质的N-末端处的伯胺以及在蛋白质中的赖氨酸的侧链处的胺被修饰。这通过用具有胺特异性蛋白质反应基团的化合物接触样品来确保。这种试剂可以以可逆的或不可逆的方式结合到胺，从而使得所述胺基团对于胺反应性试剂是不可及的。这个步骤是重要的，因为在可以如下文详述的那样进行根据胺基团的N-末端肽的选择之前，蛋白质中的所有伯胺都需要被修饰。作为样品中蛋白质的游离胺基团的修饰的结果，样品将仅含有N-末端被占据的肽，其是作为体外修饰(如上所述)的结果或是由于在体外修饰步骤之前它们在样品中作为封闭的N-末端存在。

在一个实施方式中，单独地进行伯胺的修饰以除去样品中蛋白质中的这些官能团。在这方面适合的修饰试剂是胺反应试剂，例如以下描述的那些。

胺反应试剂包括氨基甲酸酯(carbamates)(包括甲基、乙基、叔丁基(例如，Boc)和9-芴基甲基氨基甲酸酯(例如，Fmoc)酰胺)、环状酰亚胺(cyclic imide)衍生物、N-烷基和N-芳基胺、亚胺衍生物、和烯胺衍生物。其他的胺反应性试剂是乙酸酐、二-叔丁基二碳酸酯(di-tert-butyl dicarbonate)(即，Boc酸酐)或9-芴基甲氧羰基试剂(即，Fmoc试剂)，其在与反应性游离胺反应时产生9-芴基甲氧基氨基甲酸酯(9-fluorenylniethoxy carbamate)。适合的Fmoc试剂的实例包括Fmoc-Cl、Fmoc-N₃、Fmoc-O-苯并三唑-1-基)、Fmoc-O-琥珀酰亚胺基(succinimidyl)和Fmoc-OC₆F₅。

根据一个特定的实施方式，本发明的方法中修饰氨基末端的步骤包括在修饰N-末端之前用试剂选择性修饰赖氨酸残基。赖氨酸可以用O-甲基异脲或O-甲基咪唑和其化学衍生物(例如，取代的O-甲基咪唑)来修饰。这些试剂选择性地与赖氨酸残基反应，不影响游离的N-末端氨基，除了具有N-末端甘氨酸的多肽之外。

这些赖氨酸修饰剂中的某一些阻止由赖氨酸特异性蛋白酶例如胰蛋白酶引起的酶裂解，其可能是有意义的，以限制酶裂解步骤中蛋白质的裂解。

在本发明的方法的特定的实施方式中，修饰样品中的蛋白质上存在的伯胺的步骤与标记步骤组合；根据这个实施方式，伯胺的修饰被利用来确保在肽的N-末端处掺入另一标记物。因而，与蛋白酶诱导的标记步骤相组合，通过伯胺的修饰进行的标记导致了样品中(至少某些)肽的双标记。

最特别地，在本发明的情境中适合于标记肽的标记物是同量异序标记物(例如由Ross等((2004)Mol.Cell.Proteomics 3，1154-1169所描述的和在WO2004070352中描述的那些)。

同量异序标记的概念在附图1中举例说明。同量异序标记试剂包含在此定义的报告基团(RG)、平衡基团(BG)和蛋白/肽反应基团(PRG)。在附图1中说明的实施方式中，完整同量异序标记试剂由基于N-甲基哌嗪的报告基团、其是羰基的质量平衡基团、以及其是胺反应性基团的蛋白/肽反应基团(其是NHS酯)组成。虽然报告基团的质量对于组内的每个同量异序标记物是特定的，但是不同的同量异序标记物的报告基团和平衡基团的总质量保持恒定。根据一个特定的实施方式，如附图1A中标明的，通过利用使用¹³C、¹⁵N和¹⁸O原子的差异化同位素富集(enrichment)来确保这一点。商业上可获得的、附图1中描绘的同量异序标记物容许在胺基团处导入四种不同的标记物。

鉴于不同的同量异序试剂的相同的结构，环中富集的中心(centres)的数量和位置对于层析或MS行为没有影响。在这种标记试剂的胺特异性反应基团与肽中的胺官能团(N-末端或赖氨酸的胺基团)反应时，标记物变得经由酰胺键连接到所述肽。当经历例如MS/MS分析中的CID时，这些酰胺键以与主链肽键类似的方式碎裂。在附图1中提供的实施例中，平衡(羰基)部分在酰胺键的碎裂之后丢失了(中性丢失)，而电荷被报告基团碎片保持。括号中的数字表明分子的每个部分中富集的中心的数量。

附图3的B部分说明了用于实现包含四种不同报告基团质量的四种同量异序标记试剂的报告和平衡基团内的同位素分布的差异。各自用同量异序标记试剂组中的不同成员标记的相同肽的混合物在MS中表现为单一的、不可分辨的前体离子(相同的m/z)。在CID之后，四种报告基团离子表现为不同的质量(114-117Da)。所有其他的序列信息性碎片离子(b-、y-，等等)保持同量异序，并且它们的单独离子电流信号(信号强度)是加和的。对于在N-末端和赖氨酸侧链都被标记的那些胰蛋白酶肽(tryptic peptides)以及由于使用胰蛋白酶的不完全裂解导致的含有内部赖氨酸残基的那些肽，也是这种情况。

因而本发明的双标记方法容许在MS/MS分析中鉴定差异化标记的肽的相对浓度，因为它可以从相应的报告离子的相对强度推导出来。与ICAT和类似的质量差异标记策略不同，因而定量是在MS/MS阶段而不是在MS中进行。

通过肽的伯胺进行的标记靶向N-末端和肽中存在的内部赖氨酸的胺。根据一个实施方式，本发明的双标记方法不包含标记步骤之前的内部胺基团的修饰步骤，从而通过伯胺的同量异序标记使得蛋白质的N-末端和赖氨酸侧链都被修饰。包含赖氨酸残基的N-末端肽因而将携带超过一个同量异序标记物。

做为选择，本发明设想双标记方法，其中，在标记步骤之前，样品被预处理，从而赖氨酸被修饰，例如，用例如O-甲基异脲的成分预处理。如上所述，O-甲基异脲不与N-末端胺反应，除了在N-末端具有甘氨酸的多肽之外。此后，不同的样品中剩余的游离N-末端用胺反应性同量异序标记物差异化地标记。同量异序标记试剂将不与具有封闭的(或预先修饰的)N-末端的蛋白质反应。封闭的N-末端可以是天然发生的封闭的N-末端，或可以在样品加工(例如，使用尿素)期间产生。最常见的修饰，N-乙酰化，可以用酶(酰基肽水解酶)或通过化学方法(醇解脱乙酰基化(alcoholytic deacetylation))除去。另一方面，仅标记游离N-末端得到了样品复杂度的额外的降低，并且可以具有有益的性质。因而，取决于分析的类型和样品，设想这样的方法，其包含将封闭的N-末端解封闭和/或除去N-末端修饰的步骤，或者其中N-末端标记对样品本身进行(N-terminal labelling is performed on the sample as such)。

本发明的方法特征在于，它们包括这样的步骤，借助该步骤，样品中的蛋白质在一个单一步骤中被酶裂解和同时被同位素标记。实际上，已经确定的是，在MS分析中常规地进行的酶裂解步骤和标记步骤可以被组合来进一步使多通道分析合理化。

根据一个特定的实施方式，酶裂解步骤通过在存在水(H₂ ¹⁶O)或H₂ ¹⁸O的情况下用胰蛋白酶处理样品来进行。胰蛋白酶介导的¹⁸O掺入的细节例如在Heller等人(2003)J.Am.Soc.Mass Spectrom.14(7)，704-718中给出。在用胰蛋白酶进行酶裂解时，两个O原子被掺入新产生的肽的C-末端中。因而，在用胰蛋白酶进行酶裂解时，在存在H₂ ¹⁸O的情况下，两个18O原子被掺入新产生的肽的C-末端中(参见附图2)。当然，不包含C-末端赖氨酸或精氨酸的蛋白质将产生不具有掺入的¹⁸O原子的C-末端肽，从而所述样品中不是所有的C-末端肽都被同位素地标记。然而这对于本发明的方法并不重要，因为最后仅仅分析蛋白质的N-末端肽。

通过本发明方法的组合的裂解和标记步骤，通过差异化地导入两个¹⁸O或两个O，产生的肽变为以同位素方式被标记，具有4的质量差，而没有向肽连接额外的基团。

根据可选择的实施方式，使用除胰蛋白酶之外的酶，例如Lys-C或Glu-C。

根据又一个实施方式，裂解蛋白质的步骤利用肽基-Lys金属内肽酶(Peptidyl-Lys metal loendopeptidase，Lys-N)进行。用Lys-N裂解导致在产生的肽中仅掺入一个¹⁸O原子，其导致标记的和未标记的物种之间为2的质量差。这具有好处：这个酶不产生由将一个或两个¹⁸O原子掺入肽中所导致的同位素标记的肽的混合物。Asp-N和糜蛋白酶(chymotrypsin)也在裂解时掺入单个¹⁸O(Schnolzer等人(1996)Electrophoresis 17，945-953)。

应注意的是，本发明方法中使用的酶介导的同位素标记是特异于裂解的肽的新产生的C-末端的。Asp和Glu的羧基基团并不被修饰。因而与现有技术的方法相反，不需要在同位素标记之前在另外的方法步骤中修饰Asp和Glu的官能团。

本发明的方法包括各自在存在H₂O或H₂ ¹⁸O的情况下裂解至少两种不同的样品的步骤。在本发明的方法设想更高程度的多通道化时，例如通过利用使用如上所述的同量异序标记物的额外标记，将选择用于用¹⁸O或O标记的样品，使得在每种样品中的肽上提供同量异序标记物与¹⁸O或O的独特组合，来容许区分来源于不同样品中的蛋白质的肽。

这在附图4中说明。利用四种不同的(商业上可获得的)iTRAQ标记物，四种样品的两个组可以用单独的iTRAQ标记物来标记。四种样品的每个组可以在裂解之前集中，此后在裂解期间用¹⁸O标记四种样品的一个组，而在存在水的情况下裂解另一个组。这样，进行了8种不同样品的差异化标记，其可以作为一个集中的样品来分析。近来，商业上可获得的iTRAQ标记试剂的组已经增加到8个，使得容许甚至更大的多通道化。

作为本发明的N-末端封闭步骤和组合的裂解和标记步骤的结果，样品中存在的蛋白质的所有N-末端肽都将包含O或¹⁸O同位素。此外，所有的内部和C-末端肽具有游离的N-末端，而所有的N-末端肽具有修饰的N-末端，因为它在样品中本身就被封闭或是修饰(并任选地标记)步骤的结果。

本发明的方法进一步包括分离步骤，其中样品中蛋白质的内部和C-末端肽被从裂解的蛋白质的N-末端肽中除去。虽然可以单独地处理不同的样品，但是一般地，分析的所有样品在分离N-末端肽的步骤之前被集中。

根据一个实施方式，内部和C-末端肽，包含游离N-末端，与特异于伯胺的基质结合或反应。关于这点的实例是在磁性珠、琼脂糖(sepharose)或琼脂糖树脂(agarose resin)等等上提供的Ni²⁺-螯合的NTA(次氮基三乙酸)材料。

根据另一个实施方式，内部和C-末端肽的N-末端与亲和标签反应。亲和标签的实例包括：

-d-生物素或基于结构上修饰的生物素的试剂，包括d-亚氨基生物素，

-1，2-二醇，例如1，2-二羟基乙烷(HO-CH₂-CH₂-OH)，和其他1，2-二羟基烷烃，包括环状烷烃的那些，例如，1，2-二羟基环己烷，其结合到烷基或芳基硼酸或硼酸酯，例如，苯基-B(OH)₂或己基-B(O乙基)₂(例如，经由烷基或芳基基团与支持物例如琼脂糖连接)

-结合麦芽糖结合蛋白的麦芽糖；或其他的糖/糖结合蛋白对，或更一般地，服从上述的亲和标签标准的任何配体/配体结合蛋白对。

-半抗原，例如，二硝基苯基基团，其结合相应的抗半抗原抗体，例如，抗二硝基苯基-IgG；

-结合过渡金属的配体，例如，寡聚组氨酸(所谓的6His-标签)将结合Ni(II)，在特定的实施方式中过渡金属CR以树脂结合的螯合过渡金属的形式使用，例如，次氮基三乙酸螯合的Ni(II)或亚氨基二乙酸螯合的Ni(II)；

-结合谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽。

在本发明方法的特定的实施方式中，弃去内部和C-末端肽，不用于进一步的分析。因而，在这些实施方式中，不需要这些肽与基质的可逆结合，或不需要可以用替换配体而从亲和基质释放的亲和标签，或不需要具有标签和肽之间的可裂解连接物的亲和标签。然而如果考虑内部和C-末端肽的回收，则任选地使用可逆结合、替换配体或可裂解的亲和标签。

在特定的实施方式中，用于从肽样品中除去内部和C-末端肽的亲和标签是生物素。用于将生物素结合到胺基团的试剂是商业上可获得的，包括例如琥珀酰亚胺基(succinimidyl)D-生物素、6-((生物素基(biotinoyl))氨基)己酸，琥珀酰亚胺基酯和6-((6-((生物素基)氨基)己酰基)氨基)己酸，琥珀酰亚胺基酯。生物素亲和标签化的肽经由常规的抗生物素蛋白(avidin-)-或链霉亲和素(streptavidin)亲和层析结合在柱上或珠上。使用说明可以在例如来自Pierce(Rockville，IL)的技术资料单中找到。

在以上描述的分离方法中，N-末端肽将不结合，作为非结合级分被回收，并因而被间接地选择性分离而用于进一步的分析。

本发明的方法提供差异化标记的样品的同时分析，来改善这些样品之间比较的精确性。因而，本发明的方法包括集中不同的样品用于分析的步骤。如以上所指出的，差异化标记的和裂解的蛋白质样品可以在N-末端肽的选择性分离之前被集中。做为选择，N-末端肽的选择性分离对单独的(或部分集中的)样品进行，并且在这个阶段集中N-末端肽的不同级分。

本发明的方法进一步包括一个或多个分离步骤，其一般在N-末端肽的分离或者(如果合适)在不同的N-末端肽级分的集中之后进行。根据本发明，关于同位素O标记和可选择的同量异序标记这两者，差异化标记的性质是使得所述标记物的化学结构是相同的。因而，在每个差异化标记的样品上存在的标记物的化学结构是相同的，从而在被不同地单标记或双标记的相同的肽之间，将不会在(多维)层析技术中在性质上产生显著差异。因而，具有相同的氨基酸序列的标记的肽将具有相同的行为，并将保持在相同的级分中。

容许将复杂的肽样品分离成多个级分的适合的分离技术是技术人员已知的，并且包括但不限于等电聚焦(isoelectric focusing)、离子交换层析、反相HPLC、亲和层析，等等。例如SDS PAGE、2维凝胶电泳、尺寸排阻色谱的技术不太适合于一般具有有限长度的N-末端肽，其是在早先的方法步骤中被分离的。

对于从例如蛋白水解消化获得的肽样品，2D LC方法更适合用于分离，并且自动化和处理量是显著更好的。已经描述了通过液相层析分离肽消化物的几种技术，包括反相(RP)-HPLC，和多维液相色谱。毛细管电泳(CE)也是适合于肽的分离的方法。

2D-LC一般利用离子交换柱(通常，强阳离子交换，SCX)，在线(on-line)连接着反相柱，以一系列的循环来运行。在每个循环中，在离子交换柱中盐浓度被提高，以根据肽的离子电荷将它们洗脱到反相系统中。在此，肽根据疏水性被分离，通过例如CH₃CN梯度。

许多参数影响分辨能力和随后影响可以被LC-MS显示的蛋白质数量。通常，设置第一维分离技术(SCX)和第二维RP-HPLC分离方法之间的“在线”结构用于样品分级。离子交换层析可以利用不断提高的盐浓度通过分步洗脱来进行，或通过盐梯度来进行。一般地，SCX在存在例如最高达30％乙腈的情况下进行，以最小化SCX层析期间的疏水性相互作用。在例如于C18柱上的反相层析之前，除去有机溶剂例如乙腈，或通过例如蒸发来显著降低。

本发明的方法进一步包含鉴定肽的步骤，对于所述肽在不同的样品中已经发生差异化加工。该鉴定步骤通过检测样品中肽的差异化质量(在MS或MS/MS中)和测定其序列来确保。肽的序列可以根据所鉴定的肽的MS/MS分析中产生的信息来重构。因而，本发明的方法包括在MS和MS/MS中分析包含双标记的肽的肽或肽级分的步骤。

以下描述了在MS和MS/MS中获得的信息如何可以用于获得关于样品中蛋白质的差异化蛋白水解加工的信息。

如在此详述的，已经从差异化同位素标记的样品的集中库中分离出的N-末端肽在质谱仪上产生的谱，原则上含有具有2或4的特征质量差(取决于所使用的酶)的一对峰，这是两个样品或两组样品的同位素标记(¹⁶O对¹⁸O)的结果。当仅涉及两个样品时，由于在被分析的两个样品中与该N-末端肽对应的蛋白质的蛋白水解加工或差异化表达(作为蛋白水解加工的直接或间接结果)，可以仅存在一个峰。这在下文中详述。

MS谱中肽的同位素之一的缺失可以具有不同的原因。

首先，它可以由两个样品中蛋白质的差异化体内加工所引起。当发生差异化加工时，取决于加工的性质在MS上产生峰的肽将会不同。表1例示了对理论肽的不同选项。提供了未加工的对照蛋白质(参见下文的表1中(1))、在N-末端肽中被加工的蛋白质(即，用胰蛋白酶在N-末端裂解，参见表1中(2))、在也是胰蛋白酶的裂解位点的氨基酸处被加工的蛋白质(参见表1中(3))以及在用胰蛋白酶裂解时落入内部肽的位置上被加工的蛋白质(参见表1(4))所产生的N-末端肽。在这个实施例中，未加工的对照蛋白在存在水的情况下被裂解，而包含(2)、(3)或(4)的实验样品在存在H₂ ¹⁸O的情况下用胰蛋白酶裂解。

表1：来自不被加工的(1)或在蛋白质中不同位置被加工的(2、3、4)蛋白质的N-末端肽的鉴定。加工的位置相对于通过胰蛋白酶裂解产生的肽来限定，即，在N-末端肽之内(A)、在内部肽之内(B)或(C)，或在C-末端肽之内(D)。T₁、T₂和T₃对应于分开这些肽的胰蛋白酶裂解点(Lys或Arg)。Y和Z是胰蛋白酶肽之内假定的蛋白水解体内加工位点。#：N-末端修饰。¹⁶O和¹⁸O：分别用普通水和H₂ ¹⁸O的同位素标记。当加工发生在氨基酸Y或Z时；产生的肽的C-末端不作为胰蛋白酶裂解的结果产生，不掺入¹⁸O。类似地，蛋白质的C-末端不由胰蛋白酶裂解产生并因而不掺入¹⁸O同位素。作为加工的结果，肽A和B被分别分裂成A′和A＂，以及B′和B＂。A：在不同条件下出现的肽的列表；B：在相应于(A)的条件的不同样品集中时在MS上产生的峰，每个列表示与同位素肽相应的峰的区域。

A

 

条件	相应的蛋白/肽
		(1)修饰的未加工的蛋白	#NH2--(A)Y—T1--(B)Z--T2--(C)--T3--(D)--COOH
裂解的和标记的肽(16O)	#NH2--(A)Y—T1 16ONH2--(B)Z--T2 16ONH2--(C)--T3 16ONH2--(D)—COOH
		分离的N-末端肽	#NH2--(A)Y—T1 16O
(2)在Y处被加工的修饰的蛋白	#H2-(A′)Y#NH2-A＂-T1--(B)Z--T2--(C)—T3--(D)--COOH
		裂解的和标记的蛋白(18O)	#NH2-(A′)Y#H2-(A＂)-T1 18ONH2--(B)Z--T2 18ONH2--(C)--T3 18ONH2--(D)—COOH
分离的N-末端肽	#NH2-(A′)Y#NH2-(A＂)-T1 18O
		(3)在T1处被加工的修饰的蛋白	#NH2--(A)Y—T1#NH2--(B)Z--T2--(C)--T3--(D)--COOH
裂解的和标记的肽(18O)	#NH2--(A)Y—T1 18O#NH2--(B)Z--T2 18ONH2--(C)--T3 18ONH2--(D)—COOH
		分离的N-末端肽	#NH2--(A)Y—T1 18O#NH2--(B)Z--T2 18O
(4)在Z处被加工的修饰的蛋白	#NH2--(A)Y—T1--(B′)Z#NH2-B＂-T2--(C)--T3--(D)--COOH
		裂解的和标记的肽(18O)	#NH2--(A)Y—T1 18ONH2--(B′)Z#NH2-B＂-T2 18ONH2--(C)--T3 18ONH2--(D)—COOH

 

分离的N-末端肽

#NH2--(A)Y—T1 18O#NH2-B＂-T2 18O

B

以下简要地解说表1中列举的不同情况。

在第一种情况中，蛋白质在一个样品中不被加工(参见表1中(1))但是在另一个样品中(参见表1中(2))在位置(Y)，用于裂解/标记步骤的第一可裂解氨基酸T₁的N-末端，被体内加工。在集中和层析之后产生的单一MS信号可相应于完整蛋白的N-末端肽(A)、或相应于来自(A)之内的加工的N-末端(A′)或新产生的N-末端(A＂)。肽A′将不被同位素标记，因为它的C-末端是通过加工而不是通过在存在H₂ ¹⁸O的情况下裂解产生的(从而假定Y不是胰蛋白酶的裂解位点)。

注意的是，如在(2)中说明的，在加工之后由(A)的加工产生的肽(A′)实际上仍然存在的几率是低的，最特别地是当所述加工是氨肽酶或二肽酶或另一种酶的结果时，其中所述另一种酶N-末端地裂解下5或10个氨基酸或更短的肽。

在第二种情况中，蛋白质在一个样品中不被加工(1)，在另一个样品中在位置T₁被加工(参见表1中(3))，T₁也是裂解/标记步骤的可裂解的氨基酸。在这种情况下加工的肽A也将被同位素标记，在集中和层析之后，肽(A)将在MS谱中以它的两种同位素形式出现。在MS谱中注意到的单个峰相应于加工的蛋白质的新的N-末端肽B。

在第三种情况中，蛋白质在一个样品中不被加工(1)，在另一个样品中在内部肽(B)中在位置Z被加工(参见表1中(4)和附图3)。肽(B)的加工的部分，肽(B′)相当于C-末端肽，在分离N-末端肽的步骤期间被丢弃。

将会在集中和层析之后出现的单一MS信号相应于加工的蛋白的N-末端肽(B＂)。

表1说明了靠近蛋白的N-末端的内部肽中的体内加工。然而所述加工在许多蛋白质中也可在远离N-末端处发生。例如，Van Willebrand因子被Furin的加工发生在具有2813个氨基酸的蛋白质的位置763处。

理论上，尽管如此，在两个样品之间被不同地加工的每种蛋白应当在MS中显示N-末端肽，来自未加工的蛋白，或者来自作为蛋白加工的结果产生的新的N-末端。新的N-末端肽的序列鉴定还将揭示蛋白中加工的位点。裂解位点周围的氨基酸序列可包含被某些蛋白酶识别的基序(motif)。这样，可以获得关于引起裂解的蛋白酶(的类型)的信息。

做为选择，蛋白水解加工可以导致加工的蛋白质的降解，从而在这个样品中对于加工的蛋白质根本不能回收N-末端肽。在MS中将出现未加工的蛋白的N-末端的单一峰。在这种情况下，分析表明了加工中的差异，但是不显示加工发生在蛋白质中的哪个位置。

第三种可能性是，样品之一中N-末端肽的缺失是由加工的下游效应引起的。举例来说，蛋白质的低效加工可以导致途径(pathway)中有缺陷的信号转导(deficient signalling)，以及随后导致由该途径控制的基因的转录和翻译的降低或缺失。

当分析未知的蛋白时，不能排除的是，仅一种N-末端肽的存在是由样品之一中N-末端肽内的突变引起，或由导致选择性ATG(alternativeATG)(正常的起始基因(initiator gene)的下游或上游)的利用的选择性剪接(alternative splicing)引起。在这些情况中，不同的N-末端肽存在于两种样品中，其将作为不同的级分在层析期间洗脱，因而通过MS不会在一个级分中被分析。

做为选择，与另一个(或对照)样品的N-末端肽相比，一个样品的蛋白质的N-末端肽可以以更低或更高的量存在。在这种情况下，该差异可以通过由于不同加工导致的稳定性方面的差异、脱落的差异、或由于如上解释的蛋白水解加工的下游效应导致的基因表达中的差异来解释。

仅使用两个样品，其中一个用¹⁸O标记，具有某些优点。经受纯化的肽的库含有样品中所有蛋白质的N-末端肽。然后在MS之前，不同的蛋白质和肽被分离到级分中。然而，这些蛋白质中，大量的是没有被加工或者在两个样品中以相同的方式被加工。这些(未加工的)蛋白质的所有的N-末端肽将在MS上作为具有大约相同强度的两个峰出现，对于进一步的分析可以被忽略。然而，当所述方法的目的是证实特定蛋白的已知的加工时，可以专门地分析那些峰，所述峰对应于加工的蛋白的整体的预测N-末端肽的质量。只有两个峰(相应于差异化同位素标记的肽)在MS上强度方面具有显著差异(同位素标记的肽的峰之间的比低于0.5或高于1.5)，或其中两个峰中的一个缺失(或实际上缺失，即，同位素标记的肽的峰之间的比低于0.1或高于10，或甚至低于0.05或高于20)的那些肽级分，才指示肽的差异加工，并因而对进一步的分析是感兴趣的。因而，本发明的特定的实施方式涵盖同时分析两个样品的方法，其中，在裂解和用同位素标记物伴随标记之后，样品被集中，分离N-末端肽，通过MS分开并分析，MS中相关肽的选择由鉴定同位素标记的肽的峰之间的比低于0.5或高于1.5的那些峰组成。

当进行双标记(即，同量异序标记物和同位素O标记物的组合)以容许超过两种样品的组合分析时，MS分析将仅区分同位素标记的蛋白质的两个组，这些组的每一个都包含来自用同量异序标记物差异化标记的样品的蛋白质。因而，在MS中观察到仅一个与一种同位素相应的峰几率将更小(因为它将需要在所有用该同位素标记的样品中都实施该蛋白质的加工)。尽管如此，MS中产生的两个峰之间相对强度的差异是缺少一种同位素形式的肽之一或以更低浓度存在的事实的指示。另一方面，在较大量的集中样品的MS分析中，相等强度的两种同位素肽的存在不意味着在任何样品中没有发生相关蛋白质的加工，因为MS峰只提供用相同同位素标记的不同肽的累积强度。个体差异可能被其他样品补偿，或如果对于每种同位素样品都被类似地影响，则可能未能被注意到。通过实验的设计，更特别是通过对每种样品的同位素标记物的选择，可以在一定程度上避免这种现象。例如，当已知蛋白酶与癌症相联系时，一种同位素被用于标记来自受影响患者的样品以及其中转染了过表达该蛋白酶的构建体(construct)的健康细胞的细胞培养物。另一种同位素被用于标记来自健康人的组织以及其中转染了具有该蛋白酶的无活性形式的构建体的健康细胞的细胞培养物作为对照。通过这种设计，当发生不同的蛋白水解加工时，MS中的差异将更可能被观察到。

当进行双标记时，相应于不同同位素标记的样品的MS上的不同的峰，各自在MS/MS上被进一步分析，来进一步区分差异化同量异序标记的肽。在MS/MS中，将产生通过CID产生的不同报告基团的谱。碎裂肽的其他适合的方法包括CAD(碰撞激活解离(collisionally activateddissociation))、ETD(电子传递解离(electron transfer dissociation))、ECD(电子俘获解离(electron capture dissociation))、IRMPD(红外线多光子解离(infrared multiphoton dissociation))和BIRD(黑体红外线辐射离解(blackbody infrared radiative dissociation))。

与特定肽的报告基团相应的峰的缺失或浓度差异也可以是肽所来源的样品中不同的加工、不同的稳定性和不同的下游效应的指示，如上面解释的那样。

就此来说，应注意的是，来自封闭的N-末端的N-末端肽将不在它的N-末端被同量异序标记物标记，并在酶介导的¹⁸O掺入时将仅仅带有同位素标记物。差异化同位素标记的肽在MS期间被分离。然而，在随后的MS/MS将不会鉴定出报告基团。

蛋白质裂解模式方面的变化的分析在将改变的蛋白水解与疾病相联系时是有价值的。举例来说，在临床分析中，任何特定类型的蛋白水解裂解，例如，通过天冬氨酸、半胱氨酸、金属、丝氨酸/苏氨酸或其他类型的蛋白酶，都可以如在此描述的那样通过用质谱法鉴定N-末端肽测定，并且可以跟踪所观察的裂解模式随着时间的任何改变。

本发明的方法适合于鉴定生物标记物、监视对特定的蛋白酶抑制物的治疗反应、在临床前研究中挑选和筛选药物候选物、在临床药物开发中选择患者和他们的反应、设计特定蛋白酶的肽抑制剂、鉴定新的蛋白酶以及获得关于疾病病因学机制的知识。所述方法也可以用于检测由于遗传突变导致的异常的蛋白表达或功能，所述遗传突变可能导致蛋白水解降解和随后的肽产生。

做为选择，本发明的方法被用于研究样品中选定蛋白酶，例如，金属蛋白酶的底物组。在此，用蛋白酶培养血浆或细胞提取物，并测定水解作用的位点。这种信息容许寻找特定疾病中的相同的模式，以及利用样品中相关的肽面板的观察来显示该蛋白酶在该疾病中是增量调节(upregulated)的。此外，关于降解组的肽的信息可以用于考察患病样品的病理学：通过测定组织中或流体中的裂解模式，然后利用该信息来鉴定蛋白酶。做为选择，本发明的方法被用于鉴定在特定的疾病或状况中被增量或减量调节的一组蛋白酶。

本发明提供了用于不同样品中N-末端肽的同时鉴定(通过MS/MS)和/或定量(通过MS或MS/MS)的工具和方法。更特别地，本发明的方法涉及利用差异性同位素标记和任选的另外的同量异序标记，在MS和MS/MS中鉴定来自不同样品的蛋白水解加工的蛋白质。因而，用于实施本发明的方法的设备包括一个或多个质谱仪。

通过频谱测定法的质量测量是通过将被分析物电离(ionisation)成气相来进行。典型的质谱仪由3个组件构成，从感兴趣的分子产生离子的离子源、测定电离的分子的质荷比(m/z)的质量分析器、以及对每个单独的m/z值记录并计数离子的数量的检测器。MS谱中的每个特征由两个值定义，m/z以及对离子数量的测量，所述离子达到仪器的检测器。

频谱仪中用于质量分析的蛋白或肽的电离通常通过电喷雾电离(ESI)或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)来进行。

在ESI过程期间，被分析物被直接电离出溶液中，因而ESI常常直接连接到液体层析分离工具(例如，反相HPLC)上，通过添加小有机分子，MALDI通过激光脉冲将与小有机分子如苯丙烯酸混合的干燥样品蒸发，所述小有机分子吸收激光能量来使得该过程更为有效。MALDI-MS通常被用于分析相对简单的肽混合物，而整合的液相色谱MS系统(LC-MS)对于复杂样品的分析是优选的。

质量分析器是质谱仪的关键组件；重要的参数是敏感性、分辨率和质量精确性。当前在蛋白质组学中使用五种基本类型的质量分析器。这些包括离子阱、飞行时间(TOF)、四极(quadrupole)、Orbitrap和傅里叶变换离子回旋加速(FTICR-MS)分析器。串联的MS或MS/MS可以以时间(in time)(离子阱)和以位置(in place)(所有杂化仪器，例如LTQ-FTICR、LTQ-Orbitrap、Q-TOF、TOF-TOF、三级四极(triple quad)和杂化三级四极/线性离子陷阱(QTRAP))进行。

本发明的方法进一步包括一个或多个肽分离步骤。因而，适合于进行本发明的方法的设备任选地含有或连接到一个或多个适合的分离仪器，例如电泳仪器、层析仪器，例如但不限于毛细管电泳(CE)仪器、反相(RP)-HPLC仪器，和/或2维液相色谱仪器，等等。

根据一个实施方式，本发明的设备(附图5)适用于利用同位素标记的两种蛋白质样品的分析(100’)，包括两个样品源(101)、具有修饰试剂源(104’)的蛋白质修饰单元(103′)、具有相应的¹⁸O和¹⁶O源(107)的裂解和标记单元(105)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)以及与读出系统(111)连接的控制电路和数据分析单元(110)。在特定的实施方式中，分离单元(108)包含两个连续连接的分离系统(1108)和(2108)，其中，例如，(1108)是阳离子交换层析系统，分离系统(2108)一般是HPLC反相系统。质谱仪元件(109)可以是MS仪，但一般是MS/MS仪，其分离同位素形式并且其中可以进行从头开始的肽测序。MS/MS分析可以利用2个原理上不同的仪器来进行。在第一种类型的仪器中，其中实施MS/MS分析的离子阱是其中进行MS的同一离子阱，但是MS/MS是以时间进行(阱被填充，除了感兴趣的离子之外所有离子被喷出，实施CID，并扫描碎片离子。第二种类型的仪器，杂化仪器(三级四极、q-tof、ltq-ftms、ltq-orbitrap)以位置分开MS/MS，例如亲本选择在第一质量分析器中进行而碎片在第二质量分析器中扫描。根据这个实施方式的设备可以进一步包含许多可选元件，例如样品制备单元(102)，在其中发生例如样品溶解(lysis)和免疫耗竭。任选地，包括另外的修饰单元，具有相应的修饰试剂源，其容许如在此描述的那样内部赖氨酸胺官能团的修饰。该修饰单元设置成使得样品的修饰在蛋白质裂解之前发生。

提供本发明设备(100)的进一步的实施方式用于利用双标记的蛋白质样品多通道分析(附图5)，包括至少两个样品源(101)、具有相应的第一标记物源(104)的第一标记单元(103)、具有相应的第二标记物源(107)的裂解单元和第二标记单元(105)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)以及与读出系统(111)连接的控制电路和数据分析单元(110)。在特定的实施方式中，分离单元(108)包含两个连续连接的分离系统(1108)和(2108)，其中，例如，(1108)是阳离子交换层析系统，分离系统(2108)一般是HPLC反相系统。质谱仪元件(109)是如上所述的MS/MS仪，其中在本发明的双标记方法中，另外地，差异化地检测经CID产生的同量异序标记物的报告基团。这种设备可以进一步包含许多可选元件，例如样品制备单元(102)，在其中发生例如样品溶解和免疫耗竭。类似于以上描述的设备，包括另外的用于赖氨酸的胺官能团的修饰的修饰单元。

因而本发明的另一个方面提供试剂和包含这些试剂的试剂盒的组合，其适合于进行本发明的方法。

根据一个实施方式，所述试剂包括一组两种或更多种同量异序标记物和H₂ ¹⁸O。

任选地，提供了试剂盒，其包括适合的试剂和装置，其任选地是一次性的，用于进行分离N-末端肽的步骤。后面的装置任选地包含一次性的固相色谱装置，其容许有效地从单独的或集中的样品除去C-末端肽和内部肽。

体现本发明的方法、系统、设备和试剂盒的其他方案对于本领域技术人员是显而易见的。

要理解的是，虽然对于根据本发明的设备已经在此讨论了优选的实施方式、特定的结构和配置以及材料，但是可以进行形式和细节上的各种变化或修改而不背离本发明的范围和精神。

实施例

实施例1：N-末端肽的同位素标记

用乙酸酸酐在N-末端和在赖氨酸上修饰两种蛋白质样品(1和2)。一种样品在存在普通水(16)的情况下用胰蛋白酶消化。另一种样品在存在具有重¹⁸O同位素的水(18)的情况下用胰蛋白酶消化。

集中两个样品的肽。用生物素修饰在内部和C-末端肽上的新产生的N-末端并通过抗生物素蛋白亲和层析来分离。

N-末端肽经历离子交换层析和反相层析。通过MS分析每一个肽级分，其中分离具有¹⁶O同位素和¹⁸O同位素的肽。计算两个峰的比。通过MS/MS测定肽的序列。将序列与序列数据库比较来确定最终的蛋白水解加工。

实施例2：N-末端肽的同量异序/同位素双标记。

8个样品(1到8)在样品中蛋白质的N-末端上用4种不同的同量异序标记物(A到D)标记(如附图4中描绘的那样)。集中标记的样品1到4和5到6。一个库(样品1到4)用胰蛋白酶在存在普通水(16)的情况下消化。另一个库(样品5到6)在存在具有重¹⁸O同位素的水(18)的情况下用胰蛋白酶消化。

用生物素修饰肽，通过抗生物素蛋白亲和层析分离内部肽和C-末端肽。

所有双标记的样品的N-末端肽被集中，进行离子交换层析和反相层析。通过MS分析每一个肽级分，其中分离具有¹⁶O同位素和¹⁸O同位素的肽。随后通过MS/MS分析每种同位素，其中不同的同量异序形式释放报告基团并且其中测定肽的序列。由单独的报告基团和同位素计算不同的肽的相对浓度。

Claims (16)

1.一种用于研究两种或更多种不同样品之间蛋白水解加工中的差异的体外方法，包含步骤：

a)修饰所述样品中蛋白质的N-末端的和赖氨酸的胺，

b)将所述修饰的蛋白质裂解成肽并同时用O或¹⁸O标记每个样品，

c)分离N-末端肽，

d)集中步骤(b)之后标记的样品，或集中步骤(c)的分离的N-末端肽，

e)使所述N-末端肽经历MS，

f)选择相关的肽级分进行进一步的分析，和

g)鉴定由蛋白水解加工产生的肽。

2.权利要求1的方法，其在步骤(d)之后，进一步包括步骤：

-对所述分离的N-末端肽实施肽分离步骤。

3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中用包含胺反应基团的不同的同量异序标记试剂对每种样品进行所述修饰。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中的裂解用胰蛋白酶进行。

5.根据权利要求1的方法，其中N-末端肽的分离通过将亲和标签共价连接到内部和C-末端肽的N-末端、并通过亲和层析从所述样品除去内部和C-末端肽来进行。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(g)包含在MS/MS上分析鉴定的蛋白质样品。

7.根据权利要求1的方法，其中，当使用两个样品时，步骤(f)中的选择步骤由鉴定同位素标记的肽的峰之间的比低于0.5或高于1.5的那些峰组成。

8.根据权利要求1的方法，其中，当使用两个样品时，步骤(f)中的选择步骤由鉴定同位素标记的肽的峰之间的比低于0.1或高于10的那些峰组成。

9.权利要求1的方法用于测定蛋白水解裂解位点的用途。

10.权利要求1的方法用于测定蛋白水解加工的下游效应的用途。

11.根据权利要求1的方法，其中一种或多种所述蛋白质样品是来自肿瘤患者的身体样品。

12.试剂的试剂盒，包含一组两种或更多种同量异序标记试剂和H₂ ¹⁸O。

13.根据权利要求12的试剂盒，进一步包含用于分离具有游离N-末端的多肽的装置。

14.一种利用同位素标记用于分析两种蛋白质样品的设备(100’)，包含两个样品源(101)、具有修饰试剂源(104′)的蛋白质修饰单元(103′)、标记和蛋白质裂解单元(105)和相应的标记物源(107)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)和数据分析单元(110)。

15.一种利用双标记用于蛋白质样品多通道分析的设备(100)，包含至少两个样品源(101)、具有至少两个标记试剂源(104)的标记单元(103)、标记和蛋白质裂解单元(105)和相应的标记物源(107)、N-末端肽分离单元(106)、分离单元(108)、质谱仪单元(109)和数据分析单元(110)。

16.根据权利要求14或15的设备，进一步包含样品制备单元(102)。

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