CN104039328B - 对蛋白酶体抑制剂的反应的生物标记 - Google Patents

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Abstract

本文揭示与对蛋白酶体抑制剂治疗的敏感性相关的标记。在肿瘤细胞中的RAS基因是野生型时观察到敏感性。本文进一步提供组合物和方法评价标记基因的标记以预测使用蛋白酶体抑制剂治疗患有实体肿瘤(例如肺肿瘤或结肠肿瘤)的患者的结果。

Description

对蛋白酶体抑制剂的反应的生物标记
相关申请案
本申请案主张对2011年11月11日申请的美国临时专利申请案第61/558,474号和2012年11月2日申请的美国临时专利申请案第61/721,818号的优先权。前述申请案的全部内容是以引用方式并入本文中。
序列表
本申请案含有与本文一起以电子可读格式提交的序列表。电子序列表文件是在2012年11月8日创建，名为“sequencelisting.txt”且大小为26.4kb(27,099字节)。电子sequence listing.txt文件中的序列表的全部内容是通过这种引用方式并入本文中。
背景技术
在细胞的基因型或表型以出现不受正常组织环境限制的不受控生长的方式改变时，所述细胞变为癌细胞。一或多种基因突变、扩增、缺失、过表达或过低表达。染色体部分可丢失或从一个位置移动到另一个位置。一些癌症具有借之改变基因型或表型的特征模式。
多种基因具有与癌症相关的突变。一些基因具有多个可发生突变的位点。多种癌症在一个以上基因中具有突变和/或具有一或多个基因的错义表达。基因突变可促进肿瘤进展、肿瘤生长速率或肿瘤是否将转移。一些突变可影响肿瘤细胞是否将对疗法有反应。
多种药剂可治疗癌症。血液和骨髓癌症通常是用类固醇/糖皮质激素、酰亚胺、蛋白酶体抑制剂和烷化剂来治疗。其它组织的癌症通常是用烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、微管抑制剂、血管发生抑制剂或其它药剂来治疗。一些患者对一种疗法的反应优于另一疗法，表明患者可能遵循多种治疗途径来实现有效治疗。遵循最终证实对患者无效的疗法可能会使所述患者丧失在治疗计划早期的宝贵时间。许多患者无法承受治疗方案中的试错选择的时间。合宜且准确的治疗决策可有效管理疾病。
发明内容
本发明涉及通过测量本文所提供标记的至少一个特征对实体肿瘤的治疗进行预后和计划。标记是在来自人类癌细胞异种移植物的实体肿瘤样品中通过将其特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)与宿主动物使用蛋白酶体抑制疗法的后续治疗的结果相关联来鉴别。标记预测在用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗患者后是否将得到有利结果(例如，良好反应和/或长进展时间和/或长期存活)。包含肿瘤细胞以确定遗传标记的存在、数量或变化的测试样品鉴别预期对用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)治疗会具有有利结果且其疾病可通过标准治疗或较不积极的治疗来管理的具体患者，以及那些预期对所述治疗具有不利结果且可能需要蛋白酶体抑制剂的替代性治疗、使用所述蛋白酶体抑制剂的治疗组合和/或更积极治疗以确保有利结果和/或顺利管理疾病的患者。
在一个方面中，本发明提供可用于确定标记特征(例如数量、存在或变化)的试剂盒。在另一个方面中，本发明提供用于确定预后和治疗或疾病管理策略的方法。在这些方面中，测量包含肿瘤细胞的样品中标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)。在一个实施例中，肿瘤是实体肿瘤，例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌。
在各个实施例中，测量本文中阐述的特征，例如对应于具有一或多个突变(例如体细胞突变)的标记基因的标记DNA的大小、序列、组成、活性或数量；标记RNA的大小、序列、组成或数量和/或标记蛋白质的大小、序列、组成、活性或数量。形成预后或治疗或疾病管理策略的有用信息是在分析揭露关于标记基因的信息(例如基因是否突变，突变的身份和/或突变基因的RNA或蛋白质数量是否指示过表达或过低表达)时获得。在一个实施例中，确定用于蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸，例如硼替佐米(bortezomib，)或柠檬酸伊克昔佐米(ixazomib citrate，MLN9708))疗法的策略。
可用于测试以供确定非血液肿瘤(即实体肿瘤)预后或治疗或疾病管理策略(例如使用蛋白酶体抑制剂)的标记基因是v-Ki-ras2克斯坦(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)。标记基因包括突变或改变，所述突变或改变在标记DNA中的存在或其对(例如)标记RNA和/或蛋白质特征(例如，数量、大小、序列、活性或组成)的效应可提供用于确定预后或治疗或疾病管理的信息。在一些实施例中，可用作标记基因的基因或其突变体或修饰形式与(例如)包含肿瘤细胞的样品中不同于正常DNA、RNA和/或蛋白质的一或多个标记(例如DNA、RNA和/或蛋白质)的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)相关。本文中阐述此基因(称作“标记基因”)的修饰的实例，其突变可提供所述信息。
在一些实施例中，可用于测试以供确定非血液肿瘤(即实体肿瘤)的预后或治疗或疾病管理策略(例如使用蛋白酶体抑制剂)的标记基因是葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)。
本发明标记基因的突变可提供关于在用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗后的结果的信息。通过检查肿瘤中一或多个经鉴别标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，可能确定预期哪一种治疗剂、药剂组合、投药和/或投与方案可在治疗后提供有利结果。通过检查癌症中一或多种经鉴别标记或标记组的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，也可能确定预期哪一种治疗剂、药剂组合、投药和/或投与方案不太可能在治疗后提供有利结果。通过检查一或多种经鉴别标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，由此可能消除无效或不适当的治疗剂或方案。重要的是，可基于不同患者作出这些确定。因此，可确定具体治疗方案是否可能有益于具体患者或具体患者类型和/或是否应开始或避免、继续、中断或改变具体方案。
本发明涉及鉴别和/或选择预期在投与治疗方案(例如包含蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的治疗方案)后显示有利结果的癌症患者的方法。另外提供鉴别预期在投与所述治疗方案后具有不利结果的患者的方法。这些方法通常包括测量、确定、接收、储存或传送关于患者肿瘤中(例如，患者癌细胞、例如非血液癌细胞(例如实体肿瘤细胞)中)一或多个标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)或标记基因的突变的信息，任选地将其与参考标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)作比较；且在另一实施例中，包括鉴别或建议来自样品的结果是否对应于治疗方案(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的有利结果。
另外提供的方法包括治疗方法，其进一步包括相应地开始(beginning)、继续或开始(commencing)疗法的步骤，其中标记基因中突变的存在或患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者对疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)显示有利结果。另外，所述方法包括治疗方法，其进一步包括相应地停止、中断、改变或中止疗法的步骤，其中标记基因中突变的存在或患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者与(例如)接受相同治疗方案的鉴别为具有有利结果的患者相比，对治疗(例如使用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))方案显示不利结果。在另一个方面中，提供用于分析尚未经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))治疗的患者和基于本文所述标记基因中突变的存在或一或多种患者标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)鉴别并预测治疗结果的方法。所述方法可包括未经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法)治疗，经疗法(例如蛋白酶体抑制剂)治疗，经肽基硼酸或肽基环氧酮疗法与一或多种其它疗法的组合治疗，经蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法的替代性疗法治疗，或经疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制剂))的更积极的投药和/或投与方案(例如与鉴别为对标准蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法具有有利结果的患者的投药和/或投与方案相比)治疗。因此，本发明提供的方法可消除疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的无效或不适当的使用。
其它方法包括用于确定药剂的活性、药剂的效能或鉴别新治疗剂或组合的方法。所述方法包括用于基于药剂影响本发明标记基因中的突变的存在或标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)的能力来鉴别可用作(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)用于治疗癌症(例如非血液癌症，即实体肿瘤癌症(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌))的药剂的方法。在一些实施例中，以指示癌症患者的有利结果的方式减少或增加所提供标记基因中突变的存在或标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量，即，在细胞群中，所述抑制剂分别选择抵抗包含突变特征的细胞或选择支持包含突变或特征的细胞)的抑制剂会是癌症的候选药剂。在另一实施例中，能降低包含指示不利结果的标记的肿瘤细胞的活力的药剂会是癌症的候选药剂。
本发明还涉及用治疗方案(例如单独的或与另一药剂组合的蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案，所述另一药剂是例如化学治疗剂，例如糖皮质激素剂、微管抑制剂、烷化剂、激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂)治疗癌症患者的方法，所述方法包括以下步骤：选择其标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者对所述治疗方案具有有利结果的所述患者用于治疗，和用所述疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法)治疗所述患者。在一些实施例中，所述方法可包括以下步骤：选择其标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示预期患者具有有利结果的患者，和投与除了蛋白酶体抑制剂疗法以外的显示与所述蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法类似的预期无进展存活时间的疗法。
治疗癌症患者的其它方法包括选择在用癌症疗法(例如，蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法)治疗后不可能经历有利结果的患者。所述方法可进一步包括以下步骤中的一或多者：与鉴别为对标准疗法具有有利结果的患者的剂量或投药时间表相比，投与较高剂量或增加投药时间表的疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮))；投与除了蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法以外的癌症疗法；投与蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮药剂)与另一药剂(例如化学治疗剂，例如糖皮质激素剂、微管抑制剂、烷化剂、激酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂)的组合。另外提供用于选择患有侵袭性疾病的患者，预期其显示更快进展时间或短期存活。
其它方法包括用于通过考察指示癌症疗法(例如蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案)的结果的患者标记的数量和对是否应进行支付作出决定或建议来评估是否治疗癌症(例如非血液癌症，即实体肿瘤癌症(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌))或支付其治疗的方法。
本文所提到的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献的全部内容都是以引用方式并入。
将从下文详细说明、图式和权利要求书中了解本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1.KRAS的突变状态与肿瘤异种移植物对MLN2238的敏感性的关联。
图2.MLN2238在代表性异种移植物中与媒剂对照相比的抗肿瘤活性。A.PHTX132Lu原代NSCLC异种移植物(野生型KRAS)，B.HCT-116异种移植物(突变体KRAS)。
图3.MLN2238在同基因SW48细胞系的异种移植物中的抗肿瘤活性。A.SW48异种移植物(野生型KRAS)，B.SW48-KrasG13D异种移植物(重组突变KRAS-G13D)，C.SW48-KrasG12V异种移植物(重组突变KRAS-G12V)。
图4.来自KRAS野生型和突变体细胞的GLUT4蛋白质的西方墨点法(Westernblot)。图4A，在活体外生长的细胞中的GLUT4水平；图4B，在肿瘤异种移植物中的GLUT4水平。
具体实施方式
疗法在癌症患者中的一个持续不断的问题是对疗法的反应的个体差异。尽管成功癌症疗法的研发不断向前进展，但只有一亚组的患者对任何具体疗法都有反应。由于多种可用癌症疗法的治疗指数和毒性潜能狭窄，所述差异性反应可能会使患者经历不必要的、无效的且甚至可能有害的治疗方案。如果所设计疗法可经优化以治疗个别患者，那么可减少或甚至消除所述状况。此外，定向设计的疗法可提供更集中的总体上成功的患者疗法。因此，业内需要鉴别预期在投与具体癌症疗法时会具有有利结果的具体癌症患者，以及使用更积极的和/或替代性癌症疗法(例如先前投与患者的癌症疗法的替代性疗法)可具有有利结果的具体癌症患者。因此，提供对将受益于具体癌症抑制疗法的癌症患者(例如包括非血液癌症患者，例如患有实体肿瘤(例如，非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)的患者)以及将受益于更积极的和/或替代性癌症抑制疗法(例如患者已接受的癌症疗法的替代性疗法)的癌症患者的诊断、分期、预后和监测会是有益的，由此获得适当预防性措施。
本发明部分基于以下认识：标记基因的突变可能与包含突变基因的细胞对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)的敏感性相关。在一些实施例中，大鼠肉瘤(RAS)信号传导路径中涉及标记基因，例如其突变使得能活化所述路径的基因。RAS是致癌GTP酶，其结合GTP的活性状态活化肿瘤发生中涉及的路径(例如，促细胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联)。蛋白质(包括肿瘤抑制因子)促进RAS结合的GTP水解为GDP以使RAS失活，并由此限制从RAS癌基因信号传导。此检查点中涉及的基因中(在RAS上游的癌基因(例如，p210BCR-ABL或erbB)中，在RAS癌基因(例如，HRAS、KRAS或NRAS)中，在RAS相关肿瘤抑制因子(神经纤维瘤1(NF1))中，和/或在GTP酶活化蛋白(例如，RASGAP)中)的突变可使得能活化RAS信号传导路径。对蛋白酶体抑制剂的敏感性的标记基因编码的蛋白质可为RAS蛋白质。KRAS是标记基因的实例。在RAS蛋白质(例如NRAS、HRAS和KRAS)的结合GTP的状态中，发生RAS信号传导，且在结合GDP的状态中，取消信号传导。突变RAS蛋白质可延长其处于结合GTP的状态的时间，且所得信号传导路径活化可导致具有突变基因的细胞增殖。标记基因可展现一或多个突变(例如体细胞突变)，其存在可影响所编码基因产物的表达或活性。在一些实施例中，可在肿瘤细胞或肿瘤的标记基因中存在一个以上突变。在其它实施例中，可在一或多个其它基因中具有突变(包括可导致肿瘤发生的突变)的细胞中存在标记基因突变，但其它突变基因可并非本文所认为的标记基因。在一些实施例中，突变是活化性突变。在其它实施例中，突变影响标记基因的表达。在其它实施例中，突变可改变所编码基因产物与细胞结合配偶体的相互作用。
在一个方面中，本发明提供用于确定是否用蛋白酶体抑制剂治疗患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤的患者的方法，所述方法包含以下步骤：a)测量包含肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中一个标记基因是v-Ki-ras2克斯坦大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)；b)鉴别步骤a)中测量的所述至少一个特征是否提供关于用所述蛋白酶体抑制剂治疗的结果的信息；和c)如果信息性特征指示所述肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定要用所述蛋白酶体抑制剂治疗所述患者。在一些实施例中，所述方法包含，如果信息性特征指示肿瘤细胞包含野生型KRAS或在密码子146处具有突变的KRAS，那么确定要用蛋白酶体抑制剂治疗患者。在一些实施例中，用于确定是否要用蛋白酶体抑制剂治疗的方法是在活体外执行。
在另一方面中，本发明提供用于确定是否要继续患者的实体肿瘤的蛋白酶体抑制剂治疗的方法，其包含：a)用蛋白酶体抑制剂治疗实体肿瘤患者；b)从所述患者获得包含肿瘤细胞的样品；c)测量所述样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是KRAS；d)将c)中测量的结果与参考作比较；和e)如果所述比较指示所述样品中的所述实体肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定要继续用所述蛋白酶体抑制剂治疗；其中所述患者患有选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤。在一些实施例中，所述方法包含，如果比较指示实体肿瘤细胞包含野生型KRAS或在密码子146处具有突变的KRAS，那么确定要继续用蛋白酶体抑制剂治疗患者。在一些实施例中，用于确定是否要继续用蛋白酶体抑制剂治疗的方法是在活体外执行。
在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含用于添加到包含肿瘤细胞的样品中的稳定剂和用于测量样品中至少一个标记的至少一个特征的试剂，其中所述测量的结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS。
在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含至少两种用于测量样品中至少两个标记的至少一个特征的试剂，其中测量结果指示在至少一个标记基因中是否存在突变，其中至少一个标记基因是KRAS且其中所述样品包含实体肿瘤细胞，其中所述实体肿瘤细胞选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组。
在另一方面中，本发明提供用于预测实体肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性的方法，其包含：a)评价所述细胞是否表达突变KRAS；和b)预测所述细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性，其中突变KRAS的表达预测对蛋白酶体抑制剂的敏感性不良，其中所述实体肿瘤细胞选自由肺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞组成的群组。在一个实施例中，突变KRAS不具有突变密码子146。
在另一方面中，本发明提供用于治疗患有包含野生型KRAS状态的实体肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的蛋白酶体抑制剂的步骤，其中所述实体肿瘤选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组。在一个实施例中，实体肿瘤包含野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
在另一方面中，本发明提供蛋白酶体抑制剂的用途，其用于制造用于治疗选自由肺肿瘤和结肠肿瘤组成的群组的实体肿瘤的医药，其中所述实体肿瘤具有野生型KRAS。在一个实施例中，实体肿瘤具有野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
在另一方面中，本发明提供蛋白酶体抑制剂的用途，其用于治疗患者的肺肿瘤或结肠肿瘤，其肺肿瘤或结肠肿瘤具有野生型KRAS。在一个实施例中，肿瘤具有野生型KRAS或具有突变密码子146的KRAS。
在另一方面中，本发明提供用于鉴别适用于治疗非血液癌症患者的蛋白酶体抑制剂的方法，其包含：a)使在至少一个标记基因中包含至少一个突变的异种移植物中的肿瘤细胞与测试蛋白酶体抑制剂接触，其中至少一个标记基因是KRAS；b)评价所述测试蛋白酶体抑制剂对所述细胞的活力的效应；和c)如果所述测试蛋白酶体抑制剂降低所述细胞的活力，那么确定其适用于治疗非血液癌症患者。在一个实施例中，突变不在KRAS的密码子146处。
在另一方面中，本发明提供用于支付使用蛋白酶体抑制剂的癌症治疗的方法，其包含：a)记录在来自患者的包含实体肿瘤细胞的样品中KRAS是否突变，其中所述患者患有肺癌或结肠癌，和b)如果KRAS是野生型，那么授权支付所述蛋白酶体抑制剂治疗。在一个实施例中，所述方法包含，如果KRAS是野生型或在密码子146处突变，那么授权支付。
鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗无反应的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自患者的包含肿瘤细胞的样品中至少一种KRAS突变的存在或不存在，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中至少一种KRAS突变的存在指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂无反应。在一个实施例中，突变不在密码子146处。
在另一方面中，本发明提供鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗具有有利结果的非血液癌症患者的方法，其包含确定在来自患者的包含肿瘤细胞的样品中至少一种KRAS突变的存在或不存在，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中野生型KRAS或在密码子146中的突变的存在指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂有反应。
在一些实施例中，突变是通过在肿瘤细胞中或在从所述肿瘤细胞制备的提取物中测量与KRAS标记基因相关的标记的特征来鉴别。在一些实施例中，所述方法包含确定肿瘤细胞KRAS序列。
本发明的另一实施例是基于在其对蛋白酶体抑制剂的敏感性或抗性与RAS标记基因的突变状态相关的肿瘤细胞或肿瘤中鉴别另一标记基因(葡萄糖转运蛋白，例如GLUT4)。在一个实施例中，在肿瘤细胞或肿瘤中葡萄糖转运蛋白(例如GLUT4)的特征(例如组成、活性或数量，例如表达)可与KRAS标记基因的突变状态或特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)相关联。在一些实施例中，与对蛋白酶体抑制剂的敏感性相关的葡萄糖转运蛋白标记特征是数量。在一些实施例中，葡萄糖转运蛋白标记(例如mRNA或蛋白质)具有在其RAS标记基因具有突变状态的肿瘤细胞中低或正常表达的信息性特征数量，此指示在用蛋白酶体抑制剂治疗肿瘤后的有利结果。在一些实施例中，葡萄糖转运蛋白标记(例如mRNA或蛋白质)具有在具有野生型KRAS的表达的信息性特征的肿瘤细胞中低或正常表达的信息性特征。在一个实施例中，本发明方法包括鉴别KRAS突变状态和测量GLUT4的表达的步骤。在一些实施例中，预测其肿瘤(例如实体肿瘤)包含野生型KRAS和低或正常GLUT4表达的患者具有用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的有利结果。在另一实施例中，预测其肿瘤(例如实体肿瘤)包含突变体KRAS和高的、高于正常的或高于参考水平的GLUT4表达的患者具有用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的不利结果。
可使用标记基因中的突变或标记特征的鉴别和/或测量来确定是否可预期使用(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法的肿瘤治疗的有利结果，或(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制剂)的替代性疗法和/或使用所述蛋白酶体抑制剂的更积极的疗法是否可增强反应。举例来说，可使用本文提供的组合物和方法来确定是否预期患者对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗剂投药或投与方案具有有利结果。基于所述鉴别，本发明提供(但不限于)：1)用于确定蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗方案是否将有效实现有利结果和/或管理癌症的方法和组合物；2)用于监测蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)疗法(单独的或呈药剂组合)以及投药和投与用于治疗肿瘤的有效性的方法和组合物；3)用于治疗肿瘤的包含(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮抑制)治疗方案的方法和组合物；4)用于鉴别有效治疗特定患者的肿瘤的特定治疗剂和治疗剂组合以及投药和投与方案的方法和组合物；和5)用于鉴别疾病管理策略的方法和组合物。
蛋白酶体抑制代表癌症治疗的重要策略。蛋白酶体是存于所有细胞中的多酶复合物，其在细胞周期调节中所涉及的蛋白质降解中发挥作用。举例来说，金(King)等人(科学(Science)274:1652-1659(1996))证实，泛素-蛋白酶体路径在调节细胞周期、肿瘤生长和转移中具有必要作用。多种关键调节蛋白质(包括p53、细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶p21和p27KIP1)在细胞周期期间通过泛素-蛋白酶体路径暂时降解。细胞经细胞周期进展和进行有丝分裂需要这些蛋白质的有序降解。此外，转录调节需要泛素-蛋白酶体路径。保罗贝拉(Palombella)等人(国际专利申请公开案第WO95/25533号)教示，转录因子NF-κB的活化受蛋白酶体介导的抑制剂蛋白IκB的降解的调节。继而，NF-κB在免疫和炎症反应中所涉及基因的调节中具有中心作用。举例来说，里德(Read)等人(免疫(Immunity)2:493-506(1995))证实，细胞粘附分子(例如E-选择蛋白、ICAM-1和VCAM-1)的表达需要泛素-蛋白酶体路径。其它发现进一步支持蛋白酶体抑制在癌症疗法中的作用，如泽特(Zetter)(癌生物学研究文辑(Seminars in Cancer Biology)4:219-229(1993))发现，细胞粘附分子在活体内通过引导肿瘤细胞粘附并外渗到脉管系统和从所述脉管系统粘附并外渗到体内远端组织位点来参与肿瘤转移和血管发生。此外，贝格(Beg)和巴尔的摩(Baltimore)(科学274:782(1996))发现，NF-κB是抗细胞凋亡因子，且抑制NF-κB活化使细胞对环境胁迫和细胞毒性剂更敏感。硼替佐米是业内首见的(first-in-class)肽基硼酸蛋白酶体抑制剂。
如本文所用术语“蛋白酶体”是指亚细胞复合物，其通过降解细胞不再需要的蛋白质或缺陷蛋白质来参与蛋白质内稳态，且其通过用泛素或泛素类蛋白质加标签来确定降解靶。蛋白酶体包含具有介导蛋白质降解的蛋白酶的核心复合物。
如本文所用术语“蛋白酶体抑制剂”是指在活体外或活体内直接抑制20S或26S蛋白酶体的酶活性的任何物质。蛋白酶体抑制剂、其药理学性质和在治疗疾病(包括肿瘤性疾病和炎症性疾病)中的用途综述于鲁格里(Ruggeri)等人(2009)药理学进展(Adv.Pharmacol.)57:91-135中。在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂是肽基硼酸。适用于本发明方法中的肽基硼酸蛋白酶体抑制剂的实例揭示于以下文献中：阿当斯(Adams)等人，美国专利第5,780,454(1998)号、第6,066,730(2000)号、第6,083,903(2000)号、第6,297,217(2001)号、第6,465,433(2002)号、第6,548,668(2003)号、第6,617,317(2003)号和第6,747,150(2004)号，所述每一文献是全文以引用方式并入本文中，包括其中所揭示的所有化合物和化学式。在一些实施例中，肽基硼酸蛋白酶体抑制剂选自由以下组成的群组：N(4吗啉)羰基-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N(8喹啉)磺酰基-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N(吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸和N(4吗啉)羰基-[O-(2-吡啶基甲基)]-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂是N(吡嗪)羰基-L-苯基丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(硼替佐米；曾称为MLN341或PS-341)。在另一实施例中，蛋白酶体抑制剂揭示于美国专利第7,442,830号中，例如[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸(MLN2238)或其硼酸酯，例如其柠檬酸酯，例如如PCT公开案第WO2009154737号中所揭示(柠檬酸伊克昔佐米，MLN9708)。可经口投与的柠檬酸伊克昔佐米(例如MLN9708)在多种血液和实体肿瘤异种移植模型中具有抗肿瘤活性(库珀曼(Kupperman)等人(2010)癌症研究(Cancer Res.)70:1970-1980)。MLN9708是柠檬酸酯，其在暴露于水溶液或血浆后快速水解为活性形式MLN2238。在另一实施例中，肽硼酸揭示于美国专利第7,915,236号中，例如[(1R)-1-[[(2S,3R)-3-羟基-2-[(6-苯基-吡啶-2-羰基)氨基]-1-氧代-丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸(德兰佐米(delanzomib))。每一上述专利公开案的全部内容是以引用方式并入本文中。
肽基硼酸蛋白酶体抑制剂的其它实例揭示于弗莱明(Fleming)和李(Li)，国际专利公开案WO2010/036357和WO2011/123502中，两个专利都是全文以引用方式并入本文中，包括其中所揭示的所有化合物和化学式。
在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂的特征在于式(I)化合物：
或其医药上可接受的盐或医药组合物或硼酸酸酐，其中：
Z1和Z2各自独立地为羟基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；或Z1和Z2一起形成从硼酸络合剂衍生的部分。
如本文所用术语“硼酸”是指含有-B(OH)2部分的化学化合物。在一些实施例中，硼酸化合物可通过使硼酸部分脱水形成寡聚酸酐。举例来说，斯奈德(Snyder)等人，美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)80:3611(1958)报道寡聚芳基硼酸。
如本文所用术语“硼酸酸酐”是指通过组合两个或更多个硼酸化合物分子且失去一或多个水分子来形成的化学化合物。在与水混合时，硼酸酸酐化合物发生水合以释放游离硼酸化合物。在各个实施例中，硼酸酸酐可包含两个、三个、四个或更多个硼酸单元，且可具有环状或直链构型。本发明肽硼酸化合物的寡聚硼酸酸酐的非限制性实例阐释如下：
在上文刚阐释的式(1)和(2)中，变量n是0到约10的整数，优选为0、1、2、3或4。在一些实施例中，硼酸酸酐化合物包含式(2)环状三聚体(“硼氧烃三聚物(boroxine)”)，其中n为1。变量W具有式(3)：
在一些实施例中，至少80％的存于硼酸酸酐化合物中的硼酸以单一寡聚酸酐形式存在。在一些实施例中，至少85％、90％、95％或99％的存于硼酸酸酐化合物中的硼酸以单一寡聚酸酐形式存在。在某些优选实施例中，硼酸酸酐化合物是由具有式(3)的硼氧烃三聚物组成或基本上由其组成。
硼酸酸酐化合物优选地可通过暴露于脱水条件中从相应硼酸制备，所述脱水条件包括(但不限于)重结晶、冻干、暴露于热和/或暴露于干燥剂。适宜重结晶溶剂的非限制性实例包括乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、醚、乙腈、乙醇和其混合物。
在一些实施例中，Z1和Z2一起形成从硼酸络合剂衍生的部分，如以下文献中所揭示：奥尔哈瓦(Olhava)和丹卡(Danca)，美国专利第7,442,830号、第7,867,662号和第8,003,819号，其都是全文以引用方式并入本文中。出于本发明的目的，术语“硼酸络合剂”是指任何具有至少两个可各自与硼形成共价键的官能团的化合物。适宜官能团的非限制性实例包括氨基、羟基和羧基。在一些实施例中，至少一个官能团是羟基。术语“从硼酸络合剂衍生的部分”是指通过从硼酸络合剂的两个官能团移除氢原子形成的部分。
如本文所用术语“硼酸酯(boronate ester)”和“硼酸酯(boronic ester)”可互换使用且是指含有–B(Z1)(Z2)部分的化学化合物，其中Z1或Z2中的至少一者是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；或Z1和Z2一起形成从具有至少一个羟基的硼酸络合剂衍生的部分。
在一些实施例中，Z1和Z2各自为羟基且式(I)化合物的特征在于式(II)：
或其医药上可接受的盐或医药组合物或硼酸酸酐。
式(II)化合物[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸(MLN2238)揭示于奥尔哈瓦和丹卡，美国专利第7,442,830号中，其是全文以引用方式并入本文中。
在一些其它实施例中，Z1和Z2一起形成从在链或环中具有至少两个由至少两个连接原子隔开的羟基的化合物衍生的部分，所述链或环包含碳原子和任选地可为N、S或O的杂原子，其中在每一情形中附接到硼的原子是氧原子。
如本文所采用的术语“具有至少两个羟基的化合物”是指任何具有两个或更多个羟基的化合物。出于本发明的目的，所述两个羟基优选地由至少两个连接原子、优选地约2到约5个连接原子、更优选地2或3个连接原子隔开。为方便起见，可使用术语“二羟基化合物”来指如上文所定义的具有至少两个羟基的化合物。因此，如本文所采用的术语“二羟基化合物”不打算受限于仅具有两个羟基的化合物。从具有至少两个羟基的化合物衍生的部分可通过其任两个羟基中的氧原子附接到硼。优选地，硼原子、附接到硼的氧原子和连接两个氧原子的原子一起形成5元或6元环。
出于本发明的目的，硼酸络合剂优选地是医药上可接受的，即适合投与人类的。在一些优选实施例中，硼酸络合剂是糖，如(例如)以下文献中所述：普拉蒙登(Plamondon)等人，WO02/059131和笈多(Gupta)等人，WO02/059130。术语“糖”包括任何多羟基碳水化合物部分，包括单糖、二糖、多糖、糖醇和氨基糖。在一些实施例中，糖是单糖、二糖、糖醇或氨基糖。适宜糖的非限制性实例包括葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡糖胺和N-甲基葡糖胺。在某些实施例中，糖是甘露醇或山梨醇。因此，在其中糖为甘露醇或山梨醇的实施例中，Z1和Z2一起形成式C6H12O6部分，其中两个去质子化羟基中的氧原子与硼形成共价附接以形成硼酸酯化合物。在某些实施例中，Z1和Z2一起形成从D-甘露醇衍生的部分，如美国专利第7,442,830号中所揭示，其是全文以引用方式并入本文中。
在一些实施例中，硼酸络合剂是α-羟基羧酸或β-羟基羧酸，如(例如)艾略特(Elliott)等人，WO09/154737中所述，其是全文以引用方式并入本文中。在一些实施例中，硼酸络合剂选自由以下组成的群组：羟乙酸、苹果酸、六氢扁桃酸、柠檬酸、2-羟基异丁酸、3-羟基丁酸、扁桃酸、乳酸、2-羟基-3,3-二甲基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基异己酸、β-羟基异戊酸、水杨酸、酒石酸、二苯乙醇酸、葡庚糖酸、麦芽糖酸、乳糖醛酸、半乳糖二酸、双羟萘酸、1-羟基-2-萘甲酸和3-羟基-2-萘甲酸。在某些实施例中，硼酸络合剂是柠檬酸。
在其中所述α-羟基羧酸或β-羟基羧酸是柠檬酸的某些实施例中，式(I)化合物的特征在于式(III-A)或(III-B)：
或其混合物或其医药组合物。
在其中所述α-羟基羧酸或β-羟基羧酸是柠檬酸的某些实施例中，式(I)化合物的特征在于式(III-A)：
或其医药组合物。
式(III-A)化合物2,2'-{2-[(1R)-1-({[(2,5二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}氨基)-3-甲基丁基]-5-氧代-1,3,2-二氧杂硼烷-4,4-二基}乙酰乙酸(MLN9708，柠檬酸伊克昔佐米)揭示于艾略特等人，WO09/154737中，其是全文以引用方式并入本文中。
另外，蛋白酶体抑制剂包括肽醛蛋白酶体抑制剂(斯泰因(Stein)等人，美国专利第5,693,617号(1997)；西曼(Siman)等人，国际专利公开案WO91/13904；伊克巴尔(Iqbal)等人，医学化学杂志(J.Med.Chem.)38:2276-2277(1995)；和饭沼(Iinuma)等人，国际专利公开案WO05/105826，所述每一文献是全文以引用方式并入本文中)、肽基环氧酮蛋白酶体抑制剂(克鲁斯(Crews)等人，美国专利第6,831,099号；史密斯(Smyth)等人，国际专利公开案WO05/111008；贝内特(Bennett)等人，国际专利公开案WO06/045066或美国专利申请公开案第US20050245435号，例如(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉基乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)戊酰胺(卡非佐米(carfilzomib))；斯伯坦斯坦(Spaltenstein)等人四面体快报(Tetrahedron Lett.)37:1343(1996)；孟(Meng)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)96:10403(1999)；和孟，癌症研究59:2798(1999))、α-酮酰胺蛋白酶体抑制剂(查特吉(Chatterjee)和马拉莫(Mallamo)，美国专利第6,310,057号(2001)和第6,096,778号(2000)；和王(Wang)等人，美国专利第6,075,150号(2000)和第6,781,000号2004))、肽基乙烯基酯蛋白酶体抑制剂(马拉斯托尼(Marastoni)等人，医学化学杂志48:5038(2005)和肽基乙烯基砜和2-酮基-1,3,4-噁二唑蛋白酶体抑制剂，例如那些揭示于瑞祖斯基(Rydzewski)等人，医学化学杂志49:2953(2006)中者；和博焦(Bogyo)等人，美国国家科学院院刊94:6629(1997))、氮杂肽和(布热(Bouget)等人，生物有机化学与与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.)11:4881(2003)；博迪-弗拉克(Baudy-Floc’h)等人，国际专利公开案WO05/030707；和博纳曼(Bonnemains)等人，国际专利公开案WO03/018557)、艾法肽菌素(efrapeptin)寡肽(帕帕萨纳西乌(Papathanassiu)，国际专利公开案WO05/115431)、乳胞素(lactacystin)和盐孢菌酰胺(salinosporamide)和其类似物(芬特纳(Fenteany)等人，美国专利第5,756,764号(1998)、第6,147,223号(2000)、第6,335,358号(2002)和第6,645,999号(2003)；芬特纳等人，美国国家科学院院刊(1994)91:3358；法尼克(Fenical)等人，国际专利公开案WO05/003137；帕拉迪诺(Palladino)等人，国际专利公开案WO05/002572；施塔德勒(Stadler)等人，国际专利公开案WO04/071382；肖(Xiao)和帕特尔(Patel)，美国专利公开案2005/023162；和科里(Corey)，国际专利公开案WO05/099687)。
诸如NRAS和KRAS等基因在多种癌症类型中发生突变。已有人关注癌症相关突变的公用编目。包括关于癌症相关突变的信息的公用数据库的实例是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，贝塞斯达，马里兰州)维护的基因型和表型数据库(Database of Genotypes and Phenotypes，dbGaP)和由韦尔科姆基金会桑格学院(Wellcome Trust Sanger Institute，剑桥，英国)维护的癌症中的体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COSMIC)数据库。
在来自异种移植肿瘤和细胞系的肿瘤样品中的41种不同癌基因和肿瘤抑制因子基因中的514种已知突变的评估中，一些样品对蛋白酶体抑制剂的抑制具有抗性。对蛋白酶体抑制剂的一致的抗性与KRAS基因的突变状态相关联。令人惊讶的是，来自抗性异种移植物的所有样品都在KRAS中具有突变且几乎所有敏感性或反应性样品都具有野生型KRAS。因此，患有其肿瘤细胞包含野生型KRAS的实体肿瘤的患者可为用蛋白酶体抑制剂治疗的候选者。在一些实施例中，实体肿瘤是非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌。在其它实施例中，实体肿瘤是非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌或黑色素瘤。在一些实施例中，实体肿瘤是非小细胞肺癌、结肠癌、前列腺癌或胰脏癌。在一些实施例中，实体肿瘤是前列腺癌、胰脏癌、非小细胞肺癌或结肠癌。在一些实施例中，实体肿瘤是前列腺癌、非小细胞肺癌或结肠癌。在一些实施例中，实体肿瘤选自由肺癌和结肠癌组成的群组。在一些实施例中，肺癌是非小细胞肺癌或结肠癌的转移形式。在其它实施例中，实体肿瘤是非小细胞肺癌或结肠癌。在一些实施例中，实体肿瘤是肺癌。在一些实施例中，实体肿瘤是非小细胞肺癌。在一些实施例中，实体肿瘤是结肠癌。
提供组合物和方法以确定突变状态以(例如)鉴别实体肿瘤(例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)中标记基因中的突变，以预测在用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗后的结果(例如对治疗的反应、进展时间或存活率)。在一些实施例中，提供组合物和方法以确定选自由非小细胞肺癌、结肠癌和前列腺癌组成的群组的实体肿瘤的突变状态，以预测用蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)治疗的结果。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员通常所了解的含义。一般来说，本文中阐述的结合细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名法和其技术为业内已知。基因库(GenBank)或GenPept登录号和有用核酸和肽序列可在由国家生物技术信息中心，贝塞斯达，马里兰州维护的网站上获得。本申请案通篇(包括表格)引用的所有数据库登录记录(例如，来自昂飞(Affymetrix)HG133注释文件、Entrez、基因库、RefSeq、COSMIC)的内容是以引用方式并入本文中。重组DNA、寡核苷酸合成、蛋白质纯化、组织培养和转化和转染(例如，电穿孔、脂质转染等)使用标准技术。酶促反应(例如，针对RAS活性的GTP酶分析或针对RAS活化信号传导活性的分析(例如报道基因分析))是根据制造商说明书、或根据业内一般完成方式、或如本文所述来执行。一些用于确定RAS定位和信号传导的方法综述于普里奥尔(Prior)和汉考克(Hancock)(2011)临床与发育生物学研究文辑(Semin.Clin.Dev.Biol.)9月8日电子版中；或参见曲福(Cuiffo)和任(Ren)(2010)血液(Blood)114:3598-3605中；或综述于利姆(Lim)等人(1996)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)242:171-185中。上述技术和程序一般是根据业内已知的方法来执行，例如如本说明书中通篇引用和讨论的各个一般和更具体参考文献中所述。例如，参见桑布鲁克(Sambrook)等人，(2000)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约)或哈洛,E.(Harlow,E.)和莱恩,D.(Lane,D.)(1988)抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。本文中阐述的结合分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法以及其实验室程序和技术为业内已知。化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者的治疗使用标准技术。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数含义且复数术语应包括单数含义。倘若出现冲突，则以本说明书(包含定义)为准。
本文所用冠词“一(a)”、“一(an)”和“至少一”是指所述冠词的一个或一个以上语法宾语。举例来说，“一元件”意指一个或一个以上元件、至少一个元件。倘若出现冲突，则以本说明书(包含定义)为准。
如本文所用“标记基因”或“基因型标记基因”是指可具有突变(例如基因型)而使得其DNA、RNA和/或蛋白质具有提供关于治疗后预后或结果的信息(即，“信息性”)的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的基因。本文所述与蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸(例如，硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米))治疗后的结果有关联的标记基因(例如基因型标记基因)是本文中阐述且在表1中提供的染色体基因座标记内的基因的实例。对应于标记基因的mRNA、开放阅读框和蛋白质的序列也列示于表1中。表1中列示的标记基因(例如基因型标记基因)可具有普遍存在或具有受限表达的同种型。表1中的DNA SEQ ID NO只是指编码主要或最长同种型的mRNA，且蛋白质SEQ ID NO代表所述同种型的至少一个前体且不一定是成熟蛋白质。这些序列不打算将标记基因的身份限制于所述同种型或前体。所属领域技术人员通过考察在Entrez基因(由国家生物技术信息中心，贝塞斯达，马里兰州维护的数据库)下提供的通过表1中所列示ID编号标识的信息可容易地检索并理解其它同种型和成熟蛋白质。
表1标记基因说明
如本文所用“表型标记基因”是指其中没有体细胞DNA突变的标记基因，即其不具有基因型改变，但其其它标记(例如转录物，例如RNA和/或蛋白质)可具有提供关于治疗后的预后或结果的信息(即“信息性”)的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)。这个名称不会与针对与基因型标记基因相关的标记测量但在业内作为表性特征已知的特征(例如组成、数量和活性)混淆。本文阐述为与蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸，例如硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)治疗后结果相关联的表型标记基因包括GLUT4、SEQ ID NO:7、8、9。
如本文所用“KRAS”是指v-Ki-ras2克斯坦大鼠肉瘤病毒癌基因同系物，所述基因与基因库登录号NM_004985,SEQ ID NO:1相关(开放阅读框是SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1的核苷酸182到748)，其编码GenPept登录号NP_004976,SEQ ID NO:3，即KRAS基因在染色体12上的主要转录变体。KRAS的其它名称包括KRAS2和努南综合症3(NS3)。KRAS起具有GTP酶活性的癌基因的功能且可发现于染色体12上。KRAS与细胞膜和各种效应物蛋白质(例如Akt和Cdc42)相互作用，所述效应物蛋白质可通过细胞骨架实施所述KRAS的信号传导功能和对细胞运动性的效应(佛提亚都(Fotiadou)等人(2007)分子与细胞生物学(Mol.Cel.Biol.)27:6742-6755)。
如本文所用“NRAS”是指神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同系物，所述基因与基因库登录号NM_002524,SEQ ID NO:4相关(开放阅读框是SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:4的核苷酸255到824)，其编码GenPept登录号NP_002515,SEQ ID NO:6)。NRAS的其它名称包括自身免疫性淋巴细胞增生综合症IV型(ALPS4)、NRAS1和努南综合症(Noonan Syndrome)6(NS6)。NRAS起具有GTP酶活性的癌基因的功能且可发现于染色体1p上。NRAS与细胞膜和各种效应物蛋白质(例如Raf和RhoA)相互作用，所述效应物蛋白质通过细胞骨架实施所述NRAS的信号传导功能和对细胞粘附的效应(佛提亚都等人(2007)分子与细胞生物学27:6742-6755)。
如本文所用“GLUT4”是指葡萄糖转运蛋白-4，所述基因与基因库登录号NM_001042,SEQ ID NO:7相关(开放阅读框是SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:7的核苷酸201到1730)，其编码GenPept登录号NP_001033,SEQ ID NO:8)。GLUT4的另一名称是溶质载体家族2(经促进葡萄糖转运蛋白)成员4(SLC2A4)。GLUT4起葡萄糖转运蛋白功能且可发现于染色体17p上。GLUT4细胞位置可取决于胰岛素的存在，其刺激诸如肌肉和脂肪组织等细胞将GLUT4从细胞内储备移动到细胞表面以开始其作为葡萄糖转运蛋白的功能。葡萄糖转运蛋白(包括GLUT1、GLUT4和GLUT9)在肿瘤细胞中可具有高于正常的活性以容许高于正常细胞中的葡萄糖代谢水平(综述于艾德库拉(Adekola)等人(2012)24:650-654中)。GLUT1、GLUT3和GLUT4可在肺癌中表达(伊藤(Ito)等人(1999)组织学与组织病理学(Histol.Histopathol.)14:895-904)。KRAS突变体结肠直肠癌细胞在营养胁迫下显示比野生型细胞更高的葡萄糖摄取和糖酵解以及更佳的生长和存活(云(Yun)等人2009科学325:1555)。与较早研究(诺古基(Noguchi)等人(2000)癌症快报(Cancer Lett.)154:137-142)相比，所述研究鉴别结肠直肠癌细胞中GLUT1(葡萄糖转运蛋白1)上调与突变体KRAS之间的关联。
如本文所用“标记”包括与患者的肿瘤细胞中已鉴别为具有突变的标记基因相关的材料，且此外所述突变是其对通过(例如)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸或肽基环氧酮)治疗的结果有利或不利的患者的特征。标记的实例包括某种材料，例如染色体基因座、基因的DNA、基因的RNA或基因的蛋白质。举例来说，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示患者对治疗的反应不良；或者标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示患者具有良好反应。在另一实例中，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示患者的疾病在治疗后具有短进展时间(TTP)；或者，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)指示患者的疾病具有长TTP。在另一实例中，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成或数量)指示患者的疾病在治疗后具有短期存活；或者，标记包括标记基因材料，例如染色体基因座、DNA、RNA或蛋白质，其突变或特征(例如，大小、序列、组成或数量)指示患者的疾病具有长期存活。标记可包括与患者的肿瘤细胞中尚未鉴别为具有突变的标记基因相关的材料，但其特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)指示对患者实体肿瘤的蛋白酶体抑制治疗的反应。因此，如本文所用标记打算包括这些可能性中的每一种可能性，且进一步可包括个别或独立地作为标记的每一单一标记；或者在提到“标记”或“标记组”时可共同包括一或多个特征或所有特征。
在一些实施例中，标记选自由核酸和蛋白质组成的群组。在一些实施例中，标记是核酸。在一些实施例中，核酸标记是染色体或基因组DNA。在一些实施例中，核酸是mRNA。在一些实施例中，核酸是从mRNA制备的cDNA。在一些实施例中，标记是蛋白质。
在一些实施例中，特征选自由以下组成的群组：大小、序列、组成、活性和数量。在一些实施例中，特征是序列。在一些实施例中，特征是数量。在一些实施例中，特征是组成。在一些实施例中，特征是大小。在一些实施例中，特征是活性。
在一些实施例中，标记是染色体DNA或基因组DNA且特征是序列。在一些实施例中，标记是mRNA且特征是序列。在一些实施例中，标记是cDNA且特征是序列。在一些实施例中，标记是mRNA且特征是数量。在一些实施例中，标记是mRNA且特征是大小。
在一些实施例中，标记是蛋白质且特征是数量。在一些实施例中，标记是蛋白质且特征是活性。在一些实施例中，标记是蛋白质且特征是序列。
可用于测量以供确定预后或治疗或疾病管理策略的染色体基因座标记选自由以下组成的群组：染色体1p13.2(NRAS，例如碱基对115247085到115259515)；和染色体12p12.1(KRAS，例如碱基对25358180到25403854)。染色体基因座和碱基对数目是基于NCBI基因数据库中的参考人类基因组版本37.3(截止2011年10月5日前为最新)。标记DNA、标记RNA或标记蛋白质可对应于染色体基因座标记上的碱基对。举例来说，在(例如)包含肿瘤细胞的样品中，标记DNA可包括来自染色体基因座标记的基因组DNA，标记RNA可包括从基因座标记转录的多核苷酸，且标记蛋白质可包括从染色体基因座标记的表达获得的多肽。
“标记核酸”是本发明标记基因编码的、与其相关的或与其对应的核酸(例如，基因组DNA、mRNA、cDNA)。所述标记核酸包括DNA，例如基因组DNA的有义股和反义股(例如，包括其中存在的任何内含子)，所述DNA包含任一标记基因的完整或部分序列(例如基因组DNA的一或多个外显子，至多且包括开放阅读框)或所述序列的补体。标记核酸还包括包含任一标记的完整或部分序列或所述序列的补体的RNA(其中所有胸苷残基经尿苷残基置换)，通过基因组DNA的转录(即在剪接前)生成的RNA，通过剪接从基因组DNA转录的RNA生成的RNA，和通过翻译所剪接RNA生成的蛋白质(即包括在诸如跨膜信号序列等正常裂解区域裂解之前和之后二者的蛋白质)。如本文所用“标记核酸”可能还包括通过RNA逆转录制备的cDNA，所述RNA是通过基因组DNA转录生成(包括经剪接RNA)。标记核酸还包括如下序列：其由于遗传密码的简并性而不同于编码对应于本发明标记的蛋白质的核酸的核苷酸序列，且因此编码相同蛋白质或非常类似的蛋白质，例如野生型蛋白质或具有多态现象但具有野生型功能的蛋白质。如本文所用词组“等位基因变体”是指在给定基因座存在的核苷酸序列或是指由所述核苷酸序列编码的多肽。所述天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列的1-5％差异。交互等位基因可通过对多个不同个体中(例如在无癌症个体的细胞(例如生殖细胞)中)的所关注基因测序来鉴别。这可通过使用杂交探针鉴别多个个体中的相同遗传基因座容易地实施。是天然等位基因变异的结果且不改变野生型标记基因的功能活性的任一和所有所述核苷酸变异和所得氨基酸多态现象或变异的检测都打算处于本文所述标记的野生型形式的范围内。“标记蛋白质”是本发明标记(例如核酸)编码的或与其对应的蛋白质。术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。特定来说，标记的蛋白质可以其名称或氨基酸序列来提到，但所属领域技术人员应理解，突变(例如无义突变、错义突变、插入或缺失)可以多种方式影响蛋白质的结构、外观、细胞位置和/或特性。除非另有指示，否则在本文中不区分所述差异，且本文所述的突变体标记打算包括任一或所有所述多样性。
具有突变RAS基因的典型肿瘤在一个或另一个(不超过一个)RAS基因中具有突变。在KRAS情形中，野生型核酸(例如mRNA)的实例是SEQ ID NO:1。野生型KRAS核酸的另一实例是SEQ ID NO:2。野生型KRAS蛋白质的实例是SEQ ID NO:3。在一些实施例中，可在KRAS标记的至少一个突变位点中发现突变。在本发明研究中，在KRAS(SEQ ID NO:2)的密码子12、13、61和146中发现突变。在一般实施例中，野生型RAS基因(例如KRAS)对于实体肿瘤(例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌或结肠癌)预测有利结果(例如反应性、长进展时间和/或长期存活)，而突变KRAS基因预测不利结果。在一些实施例中，包含KRAS(SEQ ID NO:2)的密码子146的突变的突变位点不预测用蛋白酶体抑制剂治疗的不利结果。如本文所用“密码子146的突变”或“突变密码子146”是指KRAS(SEQ ID NO:2)的开放阅读框中的稀有突变。其特征提供突变密码子146的信息的标记可为氨基酸序列在氨基酸残基146处与SEQ ID NO:3不同的KRAS蛋白质。在一些实施例中，其特征在所述方法中提供有利结果的信息的蛋白质标记在KRAS的残基146处具有苏氨酸而不是丙氨酸。如果至少一个选自由碱基617、618和619组成的群组的碱基突变，那么包含SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸或其补体(其中所述片段包含碱基617到619)的核酸标记可具有密码子146的突变的信息性特征。
突变体KRAS(其在实体肿瘤癌症患者中的存在指示无反应或不利结果)的实例包括在至少一个突变位点(例如SEQ ID NO:2的密码子12(碱基34-36)、密码子13(碱基37-39)或密码子61(碱基181-183)中的至少一个碱基或SEQ ID NO:1中的类似密码子(分别为SEQID NO:1的碱基215-217、碱基218-220或碱基362-364))具有至少一种变化且导致SEQ IDNO:3的至少一个氨基酸残基12、13或61变化的标记核酸。在一些实施例中，KRAS的等位基因变体在并非SEQ ID NO:2中的密码子12、密码子13或密码子61或SEQ ID NO:1中的类似密码子的密码子中具有变化，其中所得所编码的等位基因变体蛋白质具有野生型RAS(例如GTP酶)活性，且因此与不利结果无关。或者，KRAS的等位基因变体在密码子12、密码子13或密码子61的碱基中具有变化，其中所述变化是由于(例如)遗传密码的简并性所致且不导致所翻译残基的变化。在所述实施例中，等位基因变体核酸编码野生型氨基酸残基，例如在SEQ IDNO:3的位置12处的甘氨酸，在SEQ ID NO:3的位置13处的甘氨酸和在SEQ ID NO:3的位置61处的谷氨酰胺，且所编码多肽具有野生型RAS活性(例如GTP酶活性)且因此与不利结果无关。
如果至少一个选自由碱基215、216和217组成的群组的碱基以可导致SEQ ID NO:3的氨基酸残基12变化的方式突变，那么包含SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸的片段或其补体(其中所述片段包含碱基215到217)的核酸标记可具有密码子12中突变的信息性特征。在一些实施例中，核酸标记包含SEQ ID NO:2的碱基34到36。在一些实施例中，KRAS核酸中的突变可产生KRAS蛋白质，其具有选自由以下组成的群组的氨基酸残基来代替SEQ IDNO:3的残基12处的甘氨酸：丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸酯、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸和缬氨酸。如果至少一个选自由碱基218、219和220组成的群组的碱基以可导致SEQ ID NO:3的氨基酸残基13变化的方式突变，那么包含SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸的片段或其补体(其中所述片段包含碱基218到220)的核酸标记可具有密码子13中突变的信息性特征。在一些实施例中，核酸标记包含SEQ ID NO:2的碱基37到39。在一些实施例中，KRAS核酸中的突变可产生KRAS蛋白质，其具有选自由以下组成的群组的氨基酸残基来代替SEQ ID NO:3的残基13处的甘氨酸：天冬氨酸酯、缬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸和精氨酸。如果至少一个选自由碱基362、363和364组成的群组的碱基以可导致SEQ ID NO:3的氨基酸残基61变化的方式突变，那么包含SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸的片段或其补体(其中所述片段包含选自由碱基362到364组成的群组的碱基)的核酸标记可具有密码子61中突变的信息性特征。在一些实施例中，核酸标记包含SEQ ID NO:2的碱基181到183。在一些实施例中，KRAS核酸中的突变可产生KRAS蛋白质，其具有选自由以下组成的群组的氨基酸残基来代替SEQ ID NO:3的残基61处的谷氨酰胺：谷氨酸酯、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸和精氨酸。
如本文所用标记的“信息性”特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)是指其值或差异与预后或结果相关的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)。标记的信息性特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)可通过分析对应于标记基因(例如基因型标记基因或表型标记基因)的核酸(例如DNA或RNA)或蛋白质来获得。如果标记(例如染色体基因座标记或患者样品中的标记)的特征(例如，大小(例如，长度或分子量)、序列(例如，核酸序列或蛋白质序列)、组成(例如，碱基或氨基酸组成或肽消化或基因片段模式)、活性(酶活性或信号传导活性)或数量(例如，拷贝数和/或表达水平))与所分析物质的野生型或等位基因变体不同，那么所述特征是“信息性”的。在一些实施例中，如果标记的特征指示标记基因为野生型，那么所述特征是信息性的。在一些测量标记的数量的实施例中，如果数量大于或小于参考数量且相差大于用于评价表达的分析的标准误差的程度，那么所述数量是“信息性”的。标记的信息性表达水平可基于所测量表达水平与结果(例如良好反应、不良反应、长进展时间、短进展时间、短期存活或长期存活)的统计学关联来确定。统计学分析的结果可建立用于选择用于本文所述方法中的标记的阈值。或者，标记(例如染色体基因座标记或具有不同特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的标记基因)将具有预测结果的典型数量范围。信息性特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)是落在针对结果确定的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的范围内的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)。此外，如果一组标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)的组合如通过本文所提供方法所确定，符合或高于或低于标记(例如染色体基因座标记或标记基因组)的预定分数，那么所述标记组可共同为“信息性”的。基因易位、转录物剪接变异、缺失和截短是除了可改变标记的序列或组成的点突变以外，可改变标记的大小、序列或组成的事件的实例。仅测量标记基因(即DNA、RNA或蛋白质)的一种特征(例如标记)可提供预后，即指示结果。仅测量标记基因(即DNA、RNA或蛋白质)的一种特征(例如标记)可提供预后，即预测或指示结果。在两种特征的信息性结果彼此一致(即结果的生物学不矛盾)时，测量标记基因的一种以上特征(例如标记)可提供预后。标记基因的多个特征的测量的一致结果的实例可为以下情况的鉴别：DNA或RNA中的无义突变、点突变、插入或缺失和所编码蛋白质的低数量或改变分子量，或编码蛋白质的结合袋或活性位点的区域中的突变和所编码蛋白质的改变活性。在蛋白质处于具有基于其活性水平控制其合成的反馈环的路径中时，可存在不同实例。在这个实例中，由于组织因标记基因突变而渴求蛋白质活性并重复传导产生所述蛋白质的信号，所以蛋白质的低数量或活性可与其突变mRNA的高数量有关。
借助非限制性阐释，在本发明情形中，基于测量KRAS标记(例如DNA、mRNA或蛋白质)的特征(例如序列)的信息性结果的实例将为鉴别KRAS序列(例如SEQ ID NO:1、2或3)的突变状态的结果。在本发明情形中，鉴别包含肿瘤细胞的样品中的KRAS序列中的突变将提供不利结果的信息，而鉴别野生型序列将提供用蛋白酶体抑制剂治疗肿瘤的有利结果的信息。在一个实施例中，鉴别KRAS中的A146T突变将提供有利结果的信息。在另一实例中，如果存在高GTP酶活性或低信号传导活性，那么测量KRAS标记(例如蛋白质)的特征(例如活性)将提供有利结果的信息性结果。
标记的“正常”特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)可是指“参考样品”中的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)。参考样品可为来自从其取得(例如)具有体细胞突变的肿瘤的同一患者的匹配的正常(例如生殖)样品。参考样品可为来自健康个体的样品，所述健康个体不具有标记相关疾病或参考特征，例如，若干个健康个体中的野生型标记的平均特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)。参考样品的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)可包括来自参考数据库的一或多个标记的特征(例如大小、序列、组成、活性或数量)。或者，标记的“正常”特征(例如，大小、序列、组成、活性或表达水平)是在类似环境或反应状况下来自从其取得肿瘤的同一患者的非肿瘤细胞中的标记(例如标记基因)的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)。DNA拷贝数的正常数量是2或二倍体，但雄性中的X连锁基因例外，其中正常DNA拷贝数为1。
标记基因的“过表达”和“表达不足”分别是指患者标记基因的表达水平高于或低于测试样品中标记基因的正常表达水平(例如大于二分之三倍或小于三分之二、至少两倍或至多二分之一、至少三倍或至多三分之一、更高或更低水平等)，例如如通过mRNA或蛋白质所测量，所述差异大于用于评价表达的分析的标准误差。“显著”表达水平可是指如通过本文所提供方法所确定，符合或高于或低于标记基因组的预定分数的水平。
如本文所用“基因缺失”是指DNA拷贝数的数量小于2，且“扩增”是指DNA拷贝数的数量大于2。“二倍体”数量是指拷贝数等于2。术语“二倍体或扩增”可解释为基因拷贝“无缺失”。在其替代性信息性数量是基因缺失的标记中，一般不会见到扩增。相反，术语“二倍体或缺失”可解释为拷贝数“无扩增”。在其替代性信息性数量是扩增的标记中，一般不会见到基因缺失。出于清晰性原因，序列缺失可在基因内因标记基因突变而发生，且可导致不存在转录蛋白质或mRNA或蛋白质缩短。所述缺失可不影响拷贝数。
如本文所用“有利”结果或预后是指长进展时间(TTP，或无进展存活)、长期存活和/或良好反应。相反，“不利”结果或预后是指短期存活、短进展时间(TTP，或无进展存活)和/或不良反应。
术语“长期存活”和“短期存活”是指在接受第一剂量的治疗后预测癌症患者可存活的时间长度。“长期存活者”是指预期与那些鉴别为短期存活者的患者相比，具有较慢进展速率或较迟因肿瘤死亡的患者。“延长存活”或“较慢死亡速率”是基于本文所述一或多个标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，与(例如)参考标准相比的估计寿命确定，群体中的70％、80％、90％或更多患者在接受第一剂量的治疗后将存活足够长时间。“较快死亡速率”或“较短存活时间”是指基于本文所述一或多个标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，与(例如)参考标准相比的估计寿命确定，群体中的50％、40％、30％、20％、10％或更少患者在接受第一剂量的治疗后将不会存活足够长时间。在一些实施例中，从第一天接受癌症疗法开始测量，足够长时间是至少6、12、18、24或30个月。
如果癌症的生长速率与其在不存在与治疗剂的接触下的生长相比因与治疗剂接触而受到抑制，那么所述癌症对治疗剂是“反应性”的或对治疗存在“良好反应”。癌症的生长可以多种方式来测量，例如可测量特征，例如肿瘤的大小或适合于所述肿瘤类型的肿瘤标记的表达。国际工作组(International Working Groups)定期集合以设置、更新并公开多种类型的癌症的反应准则。可遵循所述公开报道来支持个体肿瘤的标记和其对蛋白酶体抑制剂的反应的鉴别。举例来说，对于实体肿瘤，可使用实体肿瘤中的反应评估准则(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)导则(艾森豪尔(Eisenhauer)等人(2009)欧洲癌症杂志(E.J.Canc.)45:228-247)来支持与实体肿瘤相关的标记和实体肿瘤对蛋白酶体抑制剂的反应的鉴别。用于支持与骨髓瘤相关的标记和其对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法的反应的鉴别的反应定义，可使用西南肿瘤协作组(Southwestern Oncology Group，SWOG)准则，如布莱德(Blade)等人(1998)英国血液学杂志(Br J Haematol.)102:1115-23中所述。这些准则定义在骨髓瘤中测量的反应类型以及疾病进展时间的表征，所述疾病进展时间是肿瘤对治疗剂的敏感性的另一重要量度。其它实例是用于急性髓性白血病(AML，切森(Cheson)等人(2003)临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)21:4642-4649)、淋巴瘤(例如非霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤)(切森等人(2007)临床肿瘤学杂志25:579-596)的准则。除了传统方法(例如组织学，以鉴别细胞组成(例如，血液涂片或骨髓活检中的胚细胞计数、有丝分裂象的存在和数目)或组织结构(例如，无序组织构造或基膜的细胞浸润))以外，准则还考虑到分析方法，例如考虑到正电子发射层描记术(PET)用于(例如)鉴别具有可测量经改变代谢活性的位点(例如，肿瘤位点)或在活体内跟踪进入肿瘤中的特定标记；考虑到免疫组织化学以(例如)通过检测抗体与特定肿瘤标记的结合来鉴别肿瘤细胞；且考虑到流式细胞术以(例如)依据差异性标记和荧光染色来表征细胞类型。对蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)疗法具有反应性的特性可为可变特性，且不同癌症在不同条件下对给定治疗剂展现不同水平的“反应性”。此外，反应性的量度可使用除了肿瘤生长大小以外的其它准则来评价，包括患者生活质量、转移程度等。另外，可在适用状况中评价临床预后标记和变量(例如，骨髓瘤中的M蛋白质、前列腺癌中的PSA水平)。
如果癌症的生长速率在与其在不存在与治疗剂的接触下的生长相比时，不因与治疗剂接触而受抑制或受抑制程度极低，那么所述癌症对治疗剂“无反应”或具有“不良反应”或对治疗存在不良反应。如上文所述，癌症的生长可以多种方式来测量，例如可测量肿瘤的大小或适合于所述肿瘤类型的肿瘤标记的表达。举例来说，用于支持与肿瘤对治疗剂的无反应性相关的标记的鉴别的反应定义，可使用诸如上文所述导则的导则。对治疗剂无反应的特性可为高度可变的特性，且不同癌症在不同条件下对给定治疗剂展现不同水平的“无反应性”。此外，无反应性的量度可使用除了肿瘤的生长大小以外的其它准则来评价，包括患者生活质量、转移程度等。另外，可在适用状况中评价临床预后标记和变量(例如，骨髓瘤中的M蛋白质、前列腺癌中的PSA水平)。
如本文所用“长进展时间”、“长TTP”和“短进展时间”、“短TTP”是指直到治疗引起的稳定疾病转化为活动性或进展性疾病时之前的时间长度。偶尔，治疗引起稳定疾病(SD)，这既不是良好反应也不是不良反应，或为MR，所述疾病只是在一段时间内不再恶化(例如不变成进展性疾病)。这段时间可为至少4-8周、至少3-6个月或6个月以上。
“治疗”应意指使用疗法预防或抑制肿瘤进一步生长，以及引起肿瘤收缩，和提供更长存活时间。治疗还打算包括预防肿瘤转移。如果癌症或肿瘤的至少一个症状(如通过反应性/无反应性、进展时间或业内已知和本文中阐述的指示物所确定)得以减轻、终止、减慢、最小化或预防，那么肿瘤“受抑制”或“经治疗”。如本文进一步阐述，依照使用治疗方案(例如，蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)方案)的治疗获得的肿瘤任何症状(身体症状或其它症状)的任何改善在本发明范围内。
如本文所用术语“药剂”广泛定义为可在治疗方案中将癌细胞(包括肿瘤细胞)暴露于其中的任何事物。在本发明情况下，所述药剂包括(但不限于)蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)药剂，以及业内已知且在本文中更详细阐述的化学治疗剂。
术语“探针”是指能选择性结合到特定计划的靶分子(例如本发明标记)的任何分子(例如分离分子)。探针可由所属领域技术人员合成，或从适当生物制剂取得。出于检测靶分子的目的，探针可经特定设计以经标记，如本文所述。可用作探针的分子的实例包括(但不限于)RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机单体。
“互补”是指两个核酸股的区域之间或同一核酸股的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知，如果与第一区域反向平行的第二核酸区域中的残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，那么第一核酸区域的腺嘌呤残基能与第二核酸区域中的所述残基形成特定氢键(“碱基配对”)。类似地已知，如果与第一股反向平行的第二核酸股中的残基是鸟嘌呤，那么第一核酸股的胞嘧啶残基能与第二核酸股中的所述残基碱基配对。如果在核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域以反向平行的方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能与第二区域的残基碱基配对，那么所述两个区域互补。在一些实施例中，第一区域包含第一部分且第二区域包含第二部分，其中在第一部分与第二部分以反向平行的方式排列时，第一部分中至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％或所有核苷酸残基能与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所用“同源性”是指同一核酸股的两个区域之间或两个不同核酸股的区域之间的核苷酸序列的相似性。在两个区域中的核苷酸残基位置都被相同核苷酸残基占据时，则所述区域在所述位置具有同源性。如果每一区域的至少一个核苷酸残基位置由相同残基占据，那么第一区域对第二区域具有同源性。两个区域之间的同源性表示为两个区域中由相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位置的比例(即一致性百分比)。举例来说，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域与具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域共享具有50％一致性的同源性。在一个实施例中，第一区域包含第一部分且第二区域包含第二部分，其中每一部分中至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置由相同核苷酸残基占据。在一些100％一致性的实施例中，每一部分的所有核苷酸残基位置都由相同核苷酸残基占据。
除非本文中另外指明，否则术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”广泛涵盖抗体的天然形式，例如多克隆抗体(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)以及单克隆和重组抗体，例如单链抗体、双链和多链蛋白质、嵌合、CDR移植、人类和人类化抗体以及多特异性抗体，以及所有上述抗体的片段和衍生物，所述片段(例如，dAbs、scFv、Fab、F(ab)′2、Fab′)和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体偶联的蛋白质或化学部分。术语“抗体”还包括合成和遗传改造变体。
“试剂盒”是任何制造物品(例如，包装或容器)，其包含至少一种用于特异性检测本发明标记或标记组的试剂(例如探针)。所述制造物品可作为用于(例如)在活体外对(例如)已从患者获得的样品执行本发明方法的单元被促销、分配、销售或提供用于销售。所述试剂盒中包括的试剂可包含至少一种核酸探针和任选地一或多种引物和/或抗体用于分析本文所述的一或多个标记，例如检测标记的特征(例如大小、序列、组成或数量，例如表达)。另外，本发明试剂盒可含有阐述适宜检测分析的说明书。所述试剂盒可在(例如)临床或约定测试环境中便捷地用于生成关于(例如)一或多种标记的表达水平、特征(例如，大小、序列、活性或组成)的信息，所述信息将被记录、存储、传送或接收以容许诊断、评估或治疗展现癌症症状的患者、尤其展现可能存在能用蛋白酶体抑制疗法治疗的癌症(例如，包括非血液癌症，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)的患者。
本发明方法和组合物经设计用于诊断和治疗患有癌症的患者。根据本发明方法来治疗或诊断癌症或肿瘤。“癌症”或“肿瘤”打算包括患者中的任何肿瘤生长，包括初始肿瘤和任何转移。癌症可具有血液或实体肿瘤类型。血液肿瘤包括血液源肿瘤，包括(例如)骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、白血病(例如，沃尔登斯特罗姆综合症(Waldenstrom’ssyndrome)、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、其它白血病)、淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)和骨髓增生异常综合症。实体肿瘤可起源于多个器官中，且包括诸如在皮肤、肺、脑、乳房、前列腺、卵巢、结肠、肾、胰脏、肝、食管、胃、肠、膀胱、子宫、子宫颈、睾丸、肾上腺等之中的癌症。癌症可包含其中标记基因具有突变的细胞。如本文所用癌细胞(包括肿瘤细胞)是指以异常(增加)速率分裂的细胞，或对其生长或存活的控制不同于所述癌细胞产生或存活的相同组织中的细胞。癌细胞包括(但不限于)诸如以下等疾病中的细胞：癌症，例如鳞状细胞癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分化癌、支气管原癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝细胞瘤-肝细胞癌、胆管癌、胆管上皮癌、乳头状癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、乳癌、胃肠癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈区鳞状细胞癌；肉瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤和间皮肉瘤；血液癌症，例如骨髓瘤、白血病(例如，急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、粒细胞白血病、单核细胞性白血病、淋巴细胞白血病)和淋巴瘤(例如，滤泡淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状细胞肉瘤或霍奇金氏病)；以及神经系统肿瘤，包括神经胶质瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、许旺细胞瘤(schwannoma)或室管膜瘤。
如本文所用术语“非侵入性”是指对个体施加最小伤害的程序。在临床应用情形中，非侵入性采样程序可在(例如)无预约环境中快速执行，通常不进行麻醉和/或不实施手术或缝合。非侵入性样品的实例包括血液、血清、唾液、尿液、腮抹试、咽喉培养物、粪便样品和宫颈涂片。非侵入性诊断分析包括x射线、磁共振成像、正电子发射层描记术等。
本文阐述通过测量药物基因组标记(例如基因型标记基因(例如RAS)的突变状态)的数量来评价肿瘤治疗结果。本发明方法的特征可为包含在来自患者的细胞或核酸样品中检测存在或不存在野生型或突变体KRAS基因。突变可为：(i)至少一个核苷酸的一致性差异或(ii)核苷酸数目的差异，所述差异可为单一核苷酸或若干个核苷酸。本发明还提供检测KRAS基因中的差异的方法，例如染色体重排，例如染色体异位。还阐述通过非侵入性、便捷或低成本手段(例如从血液样品)评价结果。确定癌症程度或实体肿瘤(例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)的结果的典型方法可采用活检来收集组织用于基因型或表型(例如组织学)分析。本发明提供用于确定、评价、建议或提供用于在患者中治疗肿瘤或管理疾病的适当治疗方案的方法。使用本文所揭示的试剂盒和方法监测治疗可鉴别不利结果的可能性并容许预防所述可能性，且由此通过调整治疗方案、停止疗法或使用替代性疗法来降低发病率、死亡率和治疗成本。
术语“样品”打算包括从个体分离的样品，例如组织、细胞、生物流体和其分离物，以及存在于个体体内的组织、细胞和流体，且所述样品可从患者或正常个体获得。在骨髓的血液肿瘤(例如骨髓瘤)中，可对骨髓样品(例如包含骨髓瘤细胞的样品)执行肿瘤的初步分析。然而，一些肿瘤细胞(例如，克隆型肿瘤细胞、循环内皮细胞)是全血中细胞群的一部分。这些细胞还可在骨髓移植(血液肿瘤(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)的标准治疗)的准备中用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗患者期间移动到血液中。例如，皮拉斯基(Pilarski)等人(2000)血液95:1056-65和瑞格林(Rigolin)等人(2006)血液107:2531-5已研究多发性骨髓瘤中循环肿瘤细胞的实例。因此，(例如)用于活体外测量标记以确定治疗结果的非侵入性样品可包括外周血样品。因此，可测试外周血内细胞的标记数量。对于血液肿瘤患者，正常特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的对照参考样品可从患者的皮肤或腮抹试获得。对于实体肿瘤，包含肿瘤细胞的典型样品是原发性肿瘤或相邻淋巴结的活检。通过侵入性较低的手段(例如从肿瘤位点脱落或刮擦)获得的实体肿瘤样品包括宫颈涂片(例如，来自宫颈癌患者)、肿瘤渗出物(例如，淋巴液、囊性液、乳头抽吸物(例如，来自乳癌患者)、腹水、胸膜液、痰(例如，来自肺癌患者)、妇科液体(例如，来自卵巢癌患者)、尿液、粪便(例如，对于结肠癌))。对于实体肿瘤，正常特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的对照参考样品可从患者血液获得。
在一些实施例中，肿瘤细胞选自由肺癌细胞和结肠癌细胞组成的群组。在一些实施例中，包含实体肿瘤细胞的样品包含肺癌细胞。在一些实施例中，包含实体肿瘤细胞的样品包含非小细胞肺癌细胞。在一些实施例中，包含实体肿瘤细胞的样品包含结肠癌细胞。
血液收集容器可包含抗凝剂，例如肝素或乙二胺四乙酸(EDTA)、具有用于保存血液完整性的添加剂(例如右旋糖或白蛋白或缓冲液(例如磷酸盐))的柠檬酸钠或柠檬酸盐溶液。如果正在通过测量标记DNA在样品中的水平来测量标记的数量，那么可将DNA稳定剂(例如抑制DNA酶的药剂)添加到样品中。如果正在通过测量标记RNA在样品中的水平来测量标记的数量，那么可将RNA稳定剂(例如抑制RNA酶的药剂)添加到样品中。如果正在通过测量标记蛋白质在样品中的水平来测量标记的数量，那么可将蛋白质稳定剂(例如抑制蛋白酶的药剂)添加到样品中。血液收集容器的实例是管(普雷安纳(PREANALYTIX)，巴伦西亚，加利福尼亚州)，其可用于在血液收集中稳定RNA。外周血样品或肿瘤渗出物可经改性，例如分级分离、分选或浓缩(例如，以产生富含肿瘤或排空肿瘤(例如，用于参考样品)的样品)。改性样品的实例包括克隆型骨髓瘤细胞，其可通过以下方式来收集：例如负向选择，例如分离白血细胞与红血细胞(例如，通过糖或聚合物浓溶液(例如，蔗聚糖溶液(通用医疗基团的安玛西亚生物科学分公司(AmershamBiosciences division of GE healthcare)，皮斯卡特维，纽泽西州)或-1077溶液(西格玛-奥德里奇生物技术LP公司(Sigma-Aldrich Biotechnology LP)和西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州))差速离心；和/或通过使B细胞结合到选择剂(例如，结合到肿瘤细胞或骨髓原始细胞标记(例如CD34、CD38、CD138或CD133)用于直接分离(例如，向包含结合到B细胞标记的磁性珠(例如，来自美天旎生物技术(Miltenyi Biotec)，奥本，加利福尼亚州)的细胞溶液施加磁场)或荧光活化细胞分选的试剂)来进行正向选择。非骨髓瘤样品(例如来自实体肿瘤的肿瘤渗出物)可通过与骨髓瘤样品类似的方法(例如)使用业内已知的肿瘤细胞选择标记处理以富集肿瘤细胞。
或者，可分析肿瘤细胞系，例如HCT-116、A549、NCI-H1975、NCI-H1650、HCC-827、SW48、Calu-1、OCI-Ly3、OCI-Ly10细胞(阿里扎德(Alizadeh)等人(2000)自然(Nature)403:503-511)、RPMI6666细胞、SUP-B15细胞、KG-1细胞、CCRF-SB细胞、8ES细胞、卡苏米(Kasumi)-1细胞、卡苏米-3细胞、BDCM细胞、HL-60细胞、Mo-B细胞、JM1细胞、GA-10细胞或B细胞淋巴瘤(例如，BC-3)或细胞系或肿瘤细胞系的集合(例如，参见麦克德莫特(McDermott)等人(2007)美国科学院院报(PNAS)104:19936-19941或ONCOPANELTM抗癌肿瘤细胞剖析筛选(利色卡生物科学(Ricerca Biosciences)，博瑟尔，华盛顿州))。所属领域技术人员可容易地选择并获得用于本发明方法中的适当细胞(例如，来自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，)，马纳萨斯，维吉尼亚州)。如果使用组合物或方法来预测在患者中的治疗结果或监测治疗方案的有效性，那么已从所治疗患者获得的组织或血液样品是用于分析的细胞或标记基因或基因产物的有用来源。
在评价样品中标记的数量之前，样品(例如肿瘤(例如活检或骨髓)、血液或经改性血液(例如，包含肿瘤细胞)、肿瘤渗出物和/或参考(例如匹配的对照(例如，生殖)样品)可经受多种业内熟知的收集后制备和储存技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、储存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
在一些实施例中，标记中的突变可通过对核酸(例如DNA、RNA、cDNA)或与标记基因(例如基因型标记基因(例如KRAS))相关的蛋白质测序来鉴别。业内已知若干种对核酸测序的测序方法。核酸引物可经设计以结合到包含潜在突变位点的区域，或可经设计以与突变序列而不是野生型序列互补。引物对可经设计以位于标记基因中包含潜在突变的区域两端。可使用引物或引物对来对对应于标记基因的DNA的一股或两股测序。引物可结合探针(例如核酸探针，例如杂交探针)用于在测序之前扩增所关注区域，以增加用于检测标记基因中的突变的序列数量。可被测序的区域的实例包括完整基因、基因转录物和基因或转录物的片段，例如一或多个外显子或未翻译区域或包含突变位点的标记的一部分。用于引物选择以及序列或组成分析的靶突变的实例可参见收集突变信息的公用数据库，例如COSMIC和dbGaP。标记基因(例如KRAS)的一些突变作为可能与对蛋白酶体抑制(例如肽基硼酸(例如硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)的抑制)的抗性相关的突变的实例列示于实例中的实例1和表5中。
测序方法为所属领域技术人员已知。方法的实例包括桑格法(Sanger method)、西格诺(SEQUENOM)TM方法和下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)方法。桑格法包含使用电泳(例如毛细管电泳)来分离引物延长的经标记DNA片段，其可经自动化用于高通量应用。引物延伸测序可在对所关注区域进行PCR扩增后执行。软件可有助于序列碱基调用和突变鉴别。西格诺TM 测序分析(圣地亚哥，加利福尼亚州)是质谱法，其比较所关注具体片段的实际质量与预期质量以鉴别突变。NGS技术(也称为“大规模平行测序”和“第二代测序”)一般提供比先前方法更高的通量且使用多种方法(综述于张(Zhang)等人(2011)遗传学与基因组学杂志(J.Genet.Genomics)38:95-109以及设杜瑞(Shendure)和李翰(Hanlee)(2008)自然生物技术(Nature Biotech.)26:1135-1145中)。NGS方法可鉴别样品的标记中的低频率突变。一些NGS方法(例如，参见GS-FLX基因组测序仪(罗氏应用科学(Roche Applied Science)，布兰福德，康乃狄克州)、基因组分析仪(伊露米那公司(Illumina,Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOLIDTM分析仪(应用生物系统(AppliedBiosystems)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、普罗内特(Polonator)G.007(都沃系统(DoverSystems)，塞伦，新罕布什尔州)、HELISCOPETM(螺旋生物科学公司(Helicos BiosciencesCorp.)，剑桥，马萨诸塞州))使用循环阵列测序，且进行或不进行在流动细胞中空间分离的PCR产物的克隆扩增和各种方案以检测通过测序酶(例如，聚合酶或连接酶)纳入的经标记的经修饰核苷酸。在一种NGS方法中，可在PCR反应中使用引物对来扩增所关注区域。可将所扩增区域连接到连锁产物。在流动细胞中从PCR或连接产物生成克隆文库且在聚合酶添加经标记的可逆封端碱基时进一步扩增(“桥式”或“集群式”PCR)用于单一末端测序，所述可逆封端碱基是根据所述经标记碱基的身份在四个通道中的一个中成像，之后在下一循环中移除。软件可帮助与基因组序列进行比较以鉴别突变。另一NGS方法是外显子组测序，其主要对基因组中所有基因的外显子测序。关于其它NGS方法，外显子可通过捕获方法或扩增方法来富集。
蛋白质和核酸的组成可通过业内已知的多种方式来确定，例如通过以裂解、降解或消化所述蛋白质和核酸，之后分析各组份的方式对其进行处理。质谱、电泳和色谱可分离并界定各组份以供比较。引起缺失或插入的突变可在这些方法中通过大小或电荷差异来鉴别。蛋白质消化或限制酶核酸消化可揭露在一些突变后的不同片段模式。识别具体突变体氨基酸的结构特征的抗体可鉴别并检测样品中的这些突变(见下文)。
在一些实施例中，可通过原位和活体外两种格式使用业内已知方法分析生物样品中的对应于野生型或突变标记的DNA(例如基因组DNA)。DNA可从样品直接分离或在分离另一细胞组份(例如RNA或蛋白质)后分离。可获得试剂盒用于DNA分离，例如DNA微量试剂盒(凯杰(Qiagen)，巴伦西亚，加利福尼亚州)。DNA还可使用所述试剂盒进行扩增。
在另一实施例中，可通过原位和活体外两种格式使用业内已知的方法分析生物样品中的对应于标记的mRNA。测量表达水平的方法的实例包括在实例中。多种表达检测方法使用分离RNA。对于活体外方法，可利用任何不针对mRNA的分离进行选择的RNA分离技术从肿瘤细胞纯化RNA(例如，参见奥苏贝尔(Ausubel)等人编辑，分子生物学现行规范(CurrentProtocols in Molecular Biology)，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)，纽约1987-1999)。另外，可使用所属领域技术人员熟知的技术(例如科莫珍斯基(Chomczynski)的一步式RNA分离工艺(1989,美国专利第4,843,155号)容易地加工大量组织样品。RNA可使用标准程序(例如，参见科莫珍斯基和萨基(Sacchi)(1987)分析生物化学(Anal.Biochem.)162:156-159)、溶液(例如，trizol，(分子研究中心公司(MolecularResearch Center,Inc.)，辛辛那提，俄亥俄州；参见美国专利第5,346,994号)或试剂盒(例如，Group分离试剂盒(巴伦西亚，加利福尼亚州)或LEUKOLOCKTM总RNA分离系统，应用生物系统的安并分公司(Ambion division)，奥斯汀，德克萨斯州)来分离。
可采用其它步骤从RNA样品移除DNA。细胞裂解可用非离子型去污剂来完成，之后进行微量离心以移除细胞核且由此移除大部分细胞DNA。随后可从细胞核分离DNA用于DNA分析。在一个实施例中，使用硫氰酸胍裂解从所关注各种类型的细胞提取RNA，之后进行CsCl离心以分离RNA与DNA(彻格温(Chirgwin)等人(1979)生物化学(Biochemistry)18:5294-99)。通过用寡聚dT纤维素选择来选择聚(A)+RNA(参见桑布鲁克等人(1989)分子克隆——实验室手册(第2版)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。或者，分离RNA与DNA可通过有机提取用(例如)热苯酚或苯酚/氯仿/异戊醇来完成。如果需要，可将RNA酶抑制剂添加到裂解缓冲液中。同样，对于某些细胞类型，可能需要在方案中增加蛋白质变性/消化步骤。对于多种应用，可需要相对于其它细胞RNA(例如转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA))富集mRNA。大部分mRNA在其3'端含有聚(A)尾。这容许其通过亲和色谱使用(例如)偶合到固体支撑物(例如纤维素或SEPHADEX.RTM.介质)的寡(dT)或聚(U)来富集(参见奥苏贝尔等人(1994)分子生物学现行规范，第2卷，现行规范出版社(Current Protocols Publishing)，纽约)。在结合后，立即使用2mM EDTA/0.1％SDS从亲和柱洗脱聚(A)+mRNA。
例如在从测试个体获得样品(例如，骨髓样品、肿瘤活检或参考样品)后，可通过众多种用于检测或测量(例如)标记或多个标记(例如核酸(例如，RNA、mRNA、基因组DNA或cDNA)和/或经翻译蛋白质)的特征的熟知方法中的任一种来评价样品中本发明标记的特征。所述方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性分析、核酸杂交方法(任选地包括用于消化错配(即突变体或变体)区域的“错配裂解”步骤(迈尔斯(Myers)等人(1985)科学230:1242)以及从所得消化片段分离和鉴别突变体或变体)、核酸逆转录方法和核酸扩增方法以及对所扩增产物的分析。这些方法包括基因阵列/芯片技术、RT-PCR、基因表达分析(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州，例如在GLP批准的实验室条件下)、原位杂交、免疫组织化学、免疫印迹法、FISH(荧光原位杂交)、FACS分析、北方墨点法(northernblot)、南方墨点法(southern blot)、DNA分析珠粒芯片(伊露米那公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)、定量PCR、细菌人工染色体阵列、单一核苷酸多态现象(SNP)阵列(昂飞，圣塔克拉拉，加利福尼亚州)或细胞遗传分析。
用于检测两个核酸之间至少一个核苷酸的差异的技术的实例包括(但不限于)选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。举例来说，可制备其中已知多态现象核苷酸置于中心的寡核苷酸探针(等位基因特异性或突变体特异性探针)，之后在只有发现完美匹配时才允许杂交的条件下使其与靶DNA杂交(才木(Saiki)等人(1986)自然324:163)；才木等人(1989)美国国家科学院院刊86:6230；和华莱士(Wallace)等人(1979)核酸研究(Nucl.Acids Res.)6:3543)。可使用所述等位基因特异性寡核苷酸杂交技术在KRAS的不同多态现象或突变区域中同时检测若干个核苷酸变化。举例来说，将具有特定等位基因变体或突变体的核苷酸序列的寡核苷酸附接到固体支撑物(例如杂交膜)，然后将所述支撑物(例如膜)与经标记样品核酸杂交。因此，杂交信号的分析可揭露样品核酸中核苷酸的身份。
因此，可使用本发明检测方法在活体外以及在活体内检测(例如)生物样品中的RNA、mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。此外，用于检测对应于本发明标记的多肽或核酸的活体内技术包括将经标记探针引入个体中以检测生物标记，所述探针是(例如)与生物标记的转录物互补的核酸，或针对多肽(例如野生型或突变体标记)的经标记抗体、Fc受体或抗原。举例来说，可用放射性同位素标记抗体，其在个体中的存在和位置可通过标准成像技术来检测。这些分析可以多种方式来实施。所属领域技术人员可基于所关注标记、组织样品和突变的性质从这些或其它适当的可用方法中选择。下文章节中更详细地阐述一些方法。不同方法或方法组合可适合于不同情形中或(例如)不同类型的肿瘤或患者群体中。
用于检测对应于本发明标记的多肽的活体外技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、西方墨点法、蛋白质阵列、免疫沉淀法、免疫组织化学和免疫荧光。在所述实例中，标记的表达是使用抗体(例如，未标记、放射性标记、生色团标记、荧光团标记或酶标记抗体)、抗体衍生物(例如，与衬底或与蛋白质-配体对(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)中的蛋白质或配体偶联的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离抗体超变结构域等)来评价，所述抗体、抗体衍生物或抗体片段特异性结合标记蛋白质或其片段，例如蛋白质或包含可发生突变的区域的片段或在其结构特征中包含突变序列(例如突变位点或突变残基)的部分，包括已经历其正常翻译后修饰的全部或一部分的标记蛋白质。抗体可检测具有选自由SEQID NO:3、6和9组成的群组的氨基酸序列的蛋白质。或者，抗体可检测具有选自由SEQ IDNO:3和6的突变体组成的群组的变体氨基酸序列的突变蛋白质。可在免疫原性组合物中制备诸如dbGaP的COSMIC等公用数据库中列示为突变的残基用于生成将特异性识别并结合到突变体残基的抗体。另一方法可采用抗体对，其中所述对中的一种抗体将结合预期突变(例如无义突变、点突变、插入或缺失)区域上游(即N-末端)的标记蛋白质，且所述对中的另一种抗体将结合下游蛋白质。野生型蛋白质将结合所述对中的两种抗体，但具有无义突变、点突变、插入或缺失突变的蛋白质将仅结合所述对中的N-末端抗体。诸如夹心式ELISA分析等分析可检测肿瘤样品中的野生型蛋白质数量(例如)与参考样品相比的损失，或标准ELISA将比较抗体的结合水平以推断在肿瘤样品中存在突变。
用于确定蛋白质标记的数量或功能的间接方法还包括测量蛋白质的活性。举例来说，可评价样品或从样品分离的蛋白质或从样品分离、克隆或扩增的核酸所表达的蛋白质的标记蛋白质活性。对于RAS癌基因，活化性突变可根据降低的GTP酶活性或改变的与RasGAP或细胞膜的结合来测量。
在一些实施例中，所述方法包括测量GLUT4的数量。在一些实施例中，测量GLUT4表达的分析使用结合到SEQ ID NO:9的抗体。在一些实施例中，GLUT4表达的定量在包含肿瘤细胞的样品中测量结合到SEQ ID NO:9的抗体的结合数量。在一些实施例中，GLUT4的数量是通过肿瘤活检的免疫组织化学来定量。在一些实施例中，GLUT4的数量是通过肿瘤渗出物的免疫组织化学来定量。在一些实施例中，GLUT4的数量是通过抗体结合或染色强度的分数来确定。在一些实施例中，GLUT4的数量是通过在包含肿瘤细胞的样品中比较肿瘤细胞与非肿瘤细胞中的抗体结合或染色来确定。
在一个实施例中，标记的表达是通过以下方式来评价：从患者样品中的细胞制备mRNA/cDNA(即经转录多核苷酸)，和将所述mRNA/cDNA与是标记核酸的补体或其片段的参考多核苷酸杂交。在与参考多核苷酸杂交之前，可任选地使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA。一或多个标记的表达也可使用定量PCR来检测以评价标记的表达水平。使用测量mRNA水平的实例是标记基因中的失活性突变可改变细胞中的mRNA水平。所述水平可因蛋白质无功能或不存在导致反馈信号传导蛋白质产生而上调，或因经改变mRNA序列的不稳定性而下调。或者，可使用检测本发明标记的突变或变体(例如上文所讨论的单一核苷酸多态现象、缺失等)的多种已知方法中的任一种来检测突变在患者的标记基因中的存在。
直接测量的实例是转录物的定量。如本文所用表达的水平或数量是指标记所编码mRNA的表达的绝对数量或标记所编码蛋白质的表达的绝对数量。作为基于所选标记的绝对表达数量进行确定的替代方案，可基于规范化表达数量进行确定。表达数量可通过在比较标记的表达与对照标记的表达后校正其绝对表达水平来规范化，所述对照标记不是(例如)起持家作用的组成型表达的标记。适于规范化的标记还包括持家基因，例如肌动蛋白基因或β-2微球蛋白。用于数据规范化目的的参考标记包括遍在性表达的和/或其表达不受癌基因调节的标记。组成型表达的基因为业内已知且可根据患者的相关组织和/或状况以及分析方法来鉴别并选择。所述规范化容许比较一个样品与另一个样品(例如在来自不同时间或不同个体的样品之间)中的表达水平。此外，表达水平可以相对表达水平来提供。基因组DNA样品的基线(例如二倍体拷贝数)可通过测量在来自无肿瘤个体的细胞中或在来自患者的非肿瘤细胞中的数量来确定。为确定标记或标记组的相对数量，在确定所关注样品的表达水平之前，确定至少1个或2个、3个、4个、5个或更多个样品(例如7个、10个、15个、20个或50个或更多个样品)中的标记或标记组的数量以建立基线。为建立基线测量，确定在较大数目样品中分析的每一标记或标记组的平均数量或水平，且使用其作为所关注生物标记或生物标记组的基线表达水平。然后用所确定测试样品的标记或标记组的数量(例如，绝对表达水平)除以所述标记或标记组获得的基线值。这提供相对数量且有助于鉴别标记蛋白质活性的异常水平。
可使用基于本发明核酸分子的序列的探针来检测对应于本发明一或多个标记的转录物或基因组序列。探针可包含附接到其的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可使用所述探针作为诊断测试试剂盒的一部分，所述试剂盒用于通过(例如)测量来自个体的细胞样品中编码蛋白质的核酸分子的水平(例如检测mRNA水平)或确定编码蛋白质的基因是否已突变或缺失来鉴别表达蛋白质的细胞或组织。
除了在本文所述数据库记录中阐述的核苷酸序列以外，所属领域技术人员将了解，导致氨基酸序列变化的DNA序列多态现象可存在于群体(例如，人类群体)内。所述遗传多态现象可由于天然等位基因变异而存在于群体内的个体之间。等位基因是在给定遗传基因座替代性存在的一组基因中的一者。另外，应了解，还可存在影响RNA表达水平的DNA多态现象，其可影响所述基因的总体表达水平(例如，通过影响调节或降解)。
引物或核酸探针包含与特定标记或其突变区域互补的核苷酸序列，且具有足够长度以与标记基因或与标记基因相关的核酸选择性地杂交，例如其可结合到具有碱基序列特异性的核酸且在(例如)洗涤后保持结合。可使用引物和探针来帮助标记核酸的分离和测序。在一个实施例中，引物或核酸探针(例如实质上纯化的寡核苷酸、分离核酸)包含具有在严格条件下与标记基因的约6、8、10、12或15、20、25、30、40、50、60、75、100、200、350、500或更多个连续核苷酸或标记基因中包含突变的区域或来自其的转录物或其补体杂交的核苷酸序列的区域。在另一实施例中，引物或核酸探针能与标记核酸杂交，所述标记核酸包含以下核苷酸序列：SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8中任一者所述的任一序列，或染色体1p(例如碱基对115247085到115259515)和染色体12p(例如碱基对25358180到25403854)上的序列，或前述序列中任一者的补体。举例来说，本发明提供引物或核酸探针，其包含如下核苷酸序列：具有至少约15个连续核苷酸、至少约20个连续核苷酸、至少约25个连续核苷酸、至少约35个连续核苷酸、至少约50个连续核苷酸或具有SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8中任一者所述的约15到约20个连续核苷酸，或染色体1p(碱基对115247085到115259515)或染色体12p(碱基对25358180到25403854)上的序列或前述序列中任一者的补体。具有超过约25、40或50个核苷酸的序列的引物或核酸探针也在本发明范围内。在另一实施例中，引物或核酸探针的序列可与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8中任一者所述的任一序列或染色体1p(碱基对115247085到115259515)、染色体12p(碱基对25358180到25403854)上的序列或前述序列中任一者的补体的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、80％或85％或至少90％、95％或97％一致性。可使用核酸类似物作为用于杂交的结合位点。适宜核酸类似物的实例是肽核酸(例如，参见埃格霍尔姆(Egholm)等人，自然363:566568(1993)；美国专利第5,539,083号)。
在一些实施例中，核酸探针可经设计以结合到野生型序列，因此所述区域中突变的存在可引起所述探针的结合或杂交的降低(例如可测量的降低)。在另一实施例中，核酸探针可经设计以结合到突变体序列，因此所述区域中突变的存在可引起所述探针的结合或杂交的增加。在其它实施例中，探针和引物组或引物对可经设计以位于标记中可具有突变的区域的两端，因此基于所述引物组或引物对的扩增可产生可经测序以鉴别所述突变的核酸。
引物或核酸探针可使用考虑到结合能、碱基组成、序列复杂性、交叉杂交结合能和二级结构的算法来选择(参见弗兰德(Friend)等人，国际专利公开案WO01/05935，2001年1月25日公开；休斯(Hughes)等人，自然生物技术(Nat.Biotech.)19:342-7(2001))。本发明的可用引物或核酸探针结合每一转录物的独特序列(例如靶突变区域)且可在PCR中仅用于所述具体核酸(例如转录物或突变转录物)的扩增、检测和测序。标记基因(例如KRAS)的一些突变的实例参见实例中的实例1和表5。其它突变阐述于本文所引用的参考文章中和本文所述的公用数据库中。所属领域技术人员可使用相关技术(例如通过操作引物或核酸探针中的简并性或GC含量来调节引物或核酸探针结合到标准序列、突变体或等位基因变体的潜力)设计用于本文所揭示标记或具有类似特征的相关标记(例如染色体基因座上的标记或本文所述同一标记基因的不同区域中的突变)的引物和核酸探针。业内熟知的计算机程序可用于设计具有所需特异性和最适扩增性质的引物，例如Oligo5.0版(国家生物科学(National Biosciences)，普利茅斯，明尼苏达州)。尽管可使用完全互补的核酸探针和引物来检测本文所述标记和其突变体、多态现象或等位基因，但预期从完全互补性的偏离，其中所述偏离不会阻止分子与靶区域特异性杂交。举例来说，寡核苷酸引物可在其5'端具有非互补片段，且引物的其余部分与靶区域互补。或者，非互补核苷酸可散布到核酸探针或引物中，只要所得探针或引物仍能与靶区域特异性杂交即可。
治疗结果的指示可通过研究1个标记、2个标记、3个标记或4个标记或更多个(例如5、6、7、8、9、10、15、20或25个标记)、其包含突变位点的部分或突变部分(例如参与RAS路径或与其相互作用的标记基因，例如控制细胞周期的基因，例如其可因癌症中的体细胞突变而失活，或其参与葡萄糖转运)的数量来评价。标记可与治疗结果的另一量度组合研究，例如生物化学标记(例如，骨髓瘤中的M蛋白质、肾健康标记(例如蛋白尿)、C反应性蛋白质或用于NSCLC的细胞角蛋白19、细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)或碳水化合物抗原19-9(CA19-9)的血清水平或用于胰脏癌的代谢轮廓分析)或组织学标记(例如，胚细胞计数、每单位面积的有丝分裂象数目、黑色素瘤或头颈(例如食道)肿瘤侵入的深度测量)。
统计学方法可帮助基于标记数量的测量(例如DNA、RNA或蛋白质的测量)来确定治疗结果。一个标记的数量可在多个时间点测量，例如在用药剂(例如蛋白酶体抑制剂)治疗前、在治疗期间、在治疗后测量。为确定标记的表达从基线(例如)随时间变化的进展，可通过重复测量线性回归模型来分析表达结果(利特尔(Littell)、米利津(Miliken)、斯特鲁普(Stroup)、沃尔芬格(Wolfinger)、司考本伯格(Schabenberger)(2006)混合模型的SAS(SASfor Mixed Models)，第2版，SAS研究所公司(SAS Institute,Inc.)，卡瑞，北卡罗来纳州))：
方程1
Yijk-Yij0＝Yij0+治疗i+天数k+(治疗*天数)ik+εijk
其中Yijk是第j个动物在第i次治疗中的第k天的log2转换表达(规范化为持家基因)，Yij0是第j个动物在第i次治疗中的所定义基线log2转换表达(规范化为持家基因)，天数k是按分类变量处理，且εijk是残差项。可将协方差矩阵(例如，一阶自回归的、复合对称的空间幂)指定到对每一动物随时间重复测量的模型。此外，可将每一治疗时间点与媒剂组中的相同时间点返回比较以测试治疗值是否与媒剂显著不同。
可使用多种其它方法来分析数据。例如，可分析相对表达值来代替循环数。这些值可以倍数变化或以与基线的绝对差异来检查。另外，如果差异在所有组和时间点之间相等，那么可使用差异的重复测量分析(ANOVA)。在最后(或其它)时间点观察到的从基线的变化可使用配对t-测试来分析，所述测试是用于测试小样本量的数据显著性的费雪精确性测试(Fisher exact test)(p值＝□P(X＝x)，从x＝1到状况(例如野生型或突变)数，所测试p值显示敏感性，例如有利结果或对蛋白酶体抑制无反应)；或如果数据不是正态分布，那么可使用魏克森符号等级测试(Wilcoxon signed rank test)以比较肿瘤患者是否与正常个体显著不同。
从一个时间点到下一时间点或从肿瘤样品到正常样品的数量差异可指示治疗结果的预后。基线水平可通过在治疗前的1、2、3、4或更多个时间(例如在零时间、治疗前一天、三天、一周和/或两周或更久)测量表达来确定。或者，基线水平可从多个个体(例如正常个体或未经历或尚未经历治疗的具有相同健康状态或病症的患者)确定，如上文所讨论。或者，可使用以基因表达汇编(Gene Expression Omnibus，GEO)程序存放在国家生物技术信息中心(NCBI，贝塞斯达，马里兰州)的表达值。举例来说，在蛋白酶体抑制疗法前采样的骨髓瘤mRNA表达数量的数据集包括GEO登录号GSE9782(其还在马利根(Mulligan)等人(2006)血液109:3177-88中加以分析)和GSE6477(其还在庄(Chng)等人(2007)癌症研究67:292-9中加以分析)为测试治疗对肿瘤的效应，可在某次治疗后的任一时间或多个时间(例如在1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、一个3周治疗循环、4周、一个4周治疗循环、1个月、一个5周治疗循环、2个月、3个月、5个循环和/或6个月或更久的治疗后)测量标记的表达。举例来说，标记的数量可在某次治疗后立即测量，或在治疗期间以多个间隔(例如1周、2周、4周、一个3周、4周或5周循环、两个循环、2个月、3个月、5个循环或更长间隔)测量。硼替佐米的治疗循环可参见用所述药剂治疗的公开案或产品插页。柠檬酸伊克昔佐米(MLN9708)的治疗循环可参见由美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)，贝塞斯达，马里兰州维护的临床试验网站。相反，为确定进展性疾病在停止投与治疗方案后的发作，可在(例如)最后一次治疗后的1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月和/或6个月或更久后的任一时间或多个时间测量标记的数量。可比较在治疗后标记的测量与在治疗结束时相同标记的测量。所属领域技术人员可根据多种因素确定用于评价标记数量的时间点，例如治疗的药物代谢动力学、治疗持续时间、治疗的药效学、患者年龄、病症的性质或治疗的作用机制。相对于对蛋白酶体抑制疗法的敏感性的标记表达的基线或预定标准，数量的负向趋势或降低指示肿瘤对疗法的反应降低，例如抗性增加。相对于治疗结果的标记表达的基线或预定标准，朝向有利结果的趋势指示治疗方案的可用性或疗法的连续益处。
任何标记(例如标记基因)或标记(例如本发明标记基因)的组合或其突变以及任何已知标记与所述标记(例如本发明标记基因)的组合可用于本发明组合物、试剂盒和方法中。一般来说，标记是针对包含肿瘤细胞的样品中的标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)与对照细胞中相同标记的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)之间尽可能大的差异来选择。尽管这个差异可小到用于评价标记数量的方法的检测极限，但在另一实施例中，所述差异可至少大于评价方法的标准误差。在RNA或蛋白质数量的情形中，差异可为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、100倍、500倍、1000倍或更大。“低”RNA或蛋白质数量可表示，相对于肿瘤样品(例如，实体肿瘤)之间的总体平均值，表达较低。在DNA数量(例如拷贝数)情形中，数量为0、1、2、3、4、5、6或更多个拷贝。缺失使拷贝数为0或1；扩增使拷贝数大于2。差异可通过置信水平(例如p<0.05，p<0.02，p<0.01或更低p值)来定性。
一个以上标记(例如一组2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25或更多个标记，例如一组包含KRAS标记的标记)的测量可提供指示治疗结果的表达谱或趋势。在一些实施例中，标记组包含不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25个标记。在一些实施例中，标记组包括多个染色体基因座、多个标记基因或一或多个标记基因的多个标记(例如，核酸和蛋白质、基因组DNA和mRNA或本文所述标记的各种组合)。通过评价组中标记的数量分析治疗结果可通过统计学方法来完成，例如加权表决分析，其解释可影响组中标记的数量对治疗结果的类别或趋势的贡献的变量，例如每一标记的测量或杂交效率的信噪比。标记组(例如一组2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25或更多个标记)可包含引物、探针或多种引物以分析本文所述的至少一个标记DNA或RNA，例如染色体1p(碱基对115247085到115259515)、染色体12p(碱基对25358180到25403854)、NRAS、KRAS、GLUT4或前述各项中任一者的补体上的标记。标记组(例如一组2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25或更多个标记)可包含引物、探针或多种引物以检测至少一个或至少两个或更多个标记，或(例如)NRAS和/或KRAS和/或GLUT4的标记上的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25或更多个突变。在另一实施例中，标记组可包含野生型KRAS核酸或探针或引物，其包含突变区域的野生型形式或其补体，或能帮助鉴别KRAS中突变区域的序列(例如SEQ ID NO:2的密码子12、密码子13或密码子61)。在一些实施例中，标记组可包含能帮助鉴别KRAS的突变密码子146的序列的探针或引物。所选标记组可使用本文所提供方法和业内已知的类似方法从本文提供的标记组装或选自多个标记之间。一种对用于本发明分析中的新标记定性的方式是将包含肿瘤细胞的样品中的DNA拷贝数与标记(例如标记基因)的表达差异(例如，从基线的倍数变化)相关联。一种判断关系的有用方式是在对r求解后计算确定r2的系数(所述系数是皮尔逊(Pearson)积矩相关系数)和/或使用标准统计学方法制备最小二乘法曲线。关联可分析DNA拷贝数对标记(例如标记基因)的表达水平。如果关联结果(例如，r2，此分析中数据的线性斜率)为至少0.1-0.2、至少0.3-0.5或至少0.6-0.8或更大，那么可选择基因产物作为标记。标记可对反应、TTP或存活以正相关变化(即表达水平与拷贝数以相同方式变化，例如在拷贝数降低时降低)。对拷贝数以负相关变化(即表达水与拷贝数水平平以相反方式变化，例如在拷贝数降低时增加)的标记提供结果的不一致确定。
另一种对用于分析中的新标记定性的方式可为分析在用测试剂治疗之前和之后多个个体中大量标记的表达。表达结果容许鉴别在治疗后相对于治疗前样品在给定方向上显示显著变化的标记。可构建重复测量线性回归模型来鉴别显示统计学显著变化或差异的基因。则为了将这些重要基因分级，可计算从(例如)基线的变化对时间的曲线下面积。这可获得将显示最大统计学显著变化的基因的列表。然后可使用诸如以下等方法将若干个标记在一组中组合在一起：主要组份分析、聚类方法(例如，k-平均值聚类、层次聚类)、多元方差分析(MANOVA)或线性回归技术。为使用所述基因(或一组基因)作为标记，从基线显示2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、7倍、10倍或更大表达差异的基因将被包括在标记组中。表达谱(例如从集合标记组的基线或参考的表达水平差异的复合物)将指示一种趋势，例如是否大部分标记(例如60％、70％、80％、90％、95％或更多标记)显示具体结果(例如从基线或参考的显著差异)；或在一个方向上显示显著结果的标记多于另一个方向，例如多10％，多20％，多30％，多40％。
在使用本发明组合物、试剂盒和方法来表征患者中的治疗结果的实施例中，本发明的标记或标记组经选择以使得在至少约20％、至少约40％、60％或80％或在实质上所有经测试剂治疗的患者中获得显著结果。本发明的标记或标记组可经选择以使得一般群体获得大于约10％的阳性预测值(PPV)，且在PPV与大于80％的分析特异性偶合时，可推断标记中的额外置信。
治疗剂
可使用本发明的标记和标记组基于本发明标记的至少一个特征(例如组成或数量)的值或变化来评价患者(例如癌症患者，例如患有实体肿瘤癌症(例如，肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)或肺腺癌)、结肠癌、胰脏癌或前列腺癌)的患者)的有利结果(例如，对治疗剂的敏感性)的可能性。使用此预测，可评估癌症疗法以设计最适于被预测具有有利结果或不利结果的患者的治疗方案。
具体来说，可使用所述方法来预测患者对如上文章节中所述蛋白酶体抑制剂的敏感性。本发明方法中所测试的药剂可为单一药剂或药剂组合。本发明方法包括蛋白酶体抑制疗法与其它或额外药剂(即“组合剂”，例如选自由化学治疗剂组成的群组)的组合。举例来说，可使用本发明方法来确定是否可使用单一化学治疗剂(例如蛋白酶体抑制剂，例如肽基硼酸(例如，MLN9708)或肽基环氧酮)来治疗癌症，或是否应使用一或多种药剂与蛋白酶体抑制剂(例如，MLN9708)的组合。可用组合剂可包括具有不同作用机制的药剂，例如使用抗有丝分裂剂或烷化剂与蛋白酶体抑制剂的组合。蛋白酶体抑制剂阐述于上文章节中。
本发明方法包括蛋白酶体抑制疗法与糖皮质激素抑制疗法的组合。在本发明的某些应用中，用于与蛋白酶体抑制剂(例如，MLN9708)组合的组合剂是糖皮质激素剂(例如，地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(predisolone)、泼尼松(prednisone)或曲安西龙(triamcinolone))。用于与蛋白酶体抑制疗法组合的其它治疗剂包括化学治疗剂。“化学治疗剂”打算包括抑制增殖性细胞或组织生长的化学试剂，其中所述细胞或组织的生长是不需要的。化学治疗剂(例如抗代谢剂，例如Ara AC、5-FU和甲氨蝶呤；抗有丝分裂剂，例如紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))、长春碱和长春新碱；烷化剂，例如美法仑(melphanlan)、卡莫司汀(Carmustine，BCNU)和氮芥；拓扑异构酶II抑制剂，例如VW-26、托泊替康(topotecan)和博来霉素(Bleomycin)；断链剂，例如多柔比星(doxorubicin)和米托蒽醌(Mitoxantrone，DHAD)；拓扑异构酶I抑制剂，例如托泊替康和伊立替康(irinotecan)；酪氨酸激酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)或厄洛替尼(erlotinib)；血管发生抑制剂/免疫调节剂，例如沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)；交联剂，例如顺铂(cisplatin)、奥利沙铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin，CBDCA))；辐射和紫外光为业内所熟知(例如，参见吉尔曼A.G.(Gilman A.G.)等人，治疗剂的药理学基础 (ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第8版，Sec12:1202-1263(1990))，且通常用于治疗肿瘤疾病。化学疗法治疗中一般采用的化学治疗剂的实例列示于下表2中。
表2：化学治疗剂
本发明方法中所测试的药剂可为单一药剂或药剂组合。举例来说，可使用本发明方法来确定是否可使用单一化学治疗剂(例如蛋白酶体抑制剂)来治疗癌症，或两种或更多种药剂的组合是否可与蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)组合使用。有用组合剂可包括具有不同作用机制的药剂，例如使用抗有丝分裂剂与烷化剂和蛋白酶体抑制剂的组合。在一个实例中，蛋白酶体抑制剂是与亚德里亚霉素组合投与。在另一实施例中，蛋白酶体抑制剂是与泰素帝一起投于。
在一些实施例中，蛋白酶体抑制剂是与至少一种组合剂组合投与。在一些实施例中，组合剂选自由以下组成的群组：伊立替康、CPT-11、顺铂、卡铂、多西他赛、吉西他滨、依托泊苷、培美曲塞和长春瑞滨。在一些实施例中，组合剂选自由以下组成的群组：5-氟尿嘧啶或其变体、伊立替康、奥利沙铂和甲酰四氢叶酸。
本文所揭示药剂可通过任一途径投与，包括真皮内、皮下、经口、动脉内或静脉内途径。在一个实施例中，将通过静脉内途径投与。可通过推注或输注来提供非经肠投与。
所揭示化合物在医药上可接受的混合物中的浓度将根据若干种因素而变化，所述因素包括要投与的化合物的剂量、所采用化合物的药物代谢动力学特征和投与途径。药剂可以单一剂量或以重复剂量投与。治疗可根据多种因素每天投与或更频繁地投与，所述因素包括患者的总体健康情况和所选择化合物的配方和投与途径。
检测方法
预后分析的一般原理涉及在适当条件下制备可含有标记和探针的样品或反应混合物并保持足够时间以容许标记和探针相互作用并结合，由此形成可在反应混合物中移除和/或检测的复合物。这些分析可以多种方式来实施。
举例来说，一种实施所述分析的方法将涉及将标记或探针锚定到固相支撑物(也称作衬底)上，和在反应结束时检测锚定在固相上的靶标记/探针复合物。在所述方法的一个实施例中，可将来自个体的要用于分析标记的存在和/或浓度的样品锚定到载体或固相支撑物上。在另一实施例中，可能出现相反的状况，其中可将探针锚定到固相上且可容许来自个体的样品作为分析的未锚定组份来反应。所述一些实施例的一个实例包括使用含有经锚定用于样品的表达分析的预测标记或标记组的阵列或芯片。
已确立多种方法用于将分析组份锚定到固相。这些方法包括(但不限于)通过生物素与抗生蛋白链菌素的偶联固定的标记或探针分子。所述生物素化分析组份可使用业内已知的技术(例如，生物素化试剂盒，皮尔斯化学(Pierce Chemicals)，罗克福德，伊利诺伊州)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备，且固定在经抗生蛋白链菌素涂布的96孔板(皮尔斯化学)的孔中。在某些实施例中，具有固定分析组份的表面可提前制备并储存。
用于所述分析的其它适宜载体或固相支撑物包括能结合标记或探针所述类别的分子的任何材料。熟知支撑物或载体包括(但不限于)玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。所属领域技术人员将得知多种用于结合抗体或抗原的其它适宜载体，且将能调整所述支撑物用于本发明。举例来说，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行从细胞分离的蛋白质，且将其固定到诸如硝酸纤维素等固相支撑物上。然后可用适宜缓冲液洗涤支撑物，之后用具有可检测标记的抗体处理。然后可用缓冲液第二次洗涤固相支撑物以移除未结合抗体。然后可通过常规手段检测结合在固体支撑物上的标记的数量。
为了用上文所提到的方法实施分析，将未固定组份添加到固相，在所述固相上锚定第二组份。在反应完成后，可在使得所形成的任何复合物都将保持固定在固相上的条件下移除(例如，通过洗涤)未复合组份。锚定到固相的标记/探针复合物的检测可以本文概述的多种方法来完成。
在一些实施例中，在探针是未锚定分析组份时，其可经本文所讨论且为所属领域技术人员熟知的可检测标记直接或间接标记用于分析的检测和读出目的。术语“经标记”对于探针(例如，核酸或抗体)打算涵盖通过将可检测物质偶合(即物理连接)到探针来直接标记探针，以及通过与经直接标记的另一试剂反应来间接标记探针。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体。还有可能不经任一组份(标记或探针)的进一步操作或标记，通过(例如)利用荧光能量转移技术(FET，例如，参见莱考魏兹(Lakowicz)等人，美国专利第5,631,169号；斯塔弗瑞诺普洛斯(Stavrianopoulos)等人，美国专利第4,868,103号)直接检测标记/探针复合物形成。第一‘供体’分子上的荧光团标记经选择以使得在用适当波长的入射光激发后，其所发射荧光能量将由第二‘受体’分子上的荧光标记吸收，其继而能因所吸收能量而发荧光。或者，‘供体’蛋白质分子可仅利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，从而使得可区分‘受体’分子的标记与‘供体’的标记。由于标记之间能量转移的效率与分子相隔的距离有关，可评价分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的状况中，分析中‘受体’分子标记的荧光发射应最大。FET结合事件可通过业内熟知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)便捷地测量。
在另一实施例中，可不经任一分析组份(探针或标记)的标记，通过利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)等技术即可完成探针识别标记的能力的确定(例如，参见斯约兰德,S.(Sjolander,S.)和厄班尼斯基,C.(Urbaniczky,C.)(1991)分析化学(Anal.Chem.)63:2338-2345和邵博(Szabo)等人(1995)结构生物学新见(Curr.Opin.Struct.Biol.)5:699-705)。如本文所用“BIA”或“表面电浆共振”是用于不标记任一相互作用物(例如，BIACORETM)实时研究生物特异性相互作用的技术。结合表面质量的变化(指示结合事件)导致表面附近光的折射率变化(表面电浆共振(SPR)的光学现象)，从而产生可用作指示生物分子之间的实时反应的可检测信号。
或者，在另一实施例中，可用作为液相中的溶质的标记和探针实施类似的诊断和预后分析。在所述分析中，通过多种标准技术(包括(但不限于)差速离心、色谱、电泳和免疫沉淀法)中的任一种将复合的标记和探针与未复合组份分离。在差速离心中，由于复合物的基于其不同大小和密度的不同沉降平衡，可通过一系列离心步骤将标记/探针复合物与未复合分析组份分离(例如，参见里瓦斯,G.(Rivas,G.)和明顿,A.P.(Minton,A.P.)(1993)生物化学科学趋势(Trends Biochem Sci.)18:284-7)。还可使用标准色谱技术来分离复合分子与未复合分子。举例来说，凝胶过滤色谱基于大小且通过利用呈柱格式的适当凝胶过滤树脂来分离分子，例如，可分离相对较大的复合物与相对较小的未复合组份。类似地，可利用标记/探针复合物与未复合组份相比相对不同的电荷性质通过(例如)利用离子交换色谱树脂来区分复合物与未复合组份。所述树脂和色谱技术为所属领域技术人员所熟知(例如，参见黑格,N.H.(Heegaard,N.H.)(1998)分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)11:141-8；哈格,D.S.(Hage,D.S.)和特维德,S.A.(Tweed,S.A.)(1997)色谱学杂志B-生物医学科学与应用(J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.)699:499-525)。还可采用凝胶电泳来分离复合的分析组份与未结合组份(例如，参见奥苏贝尔等人编辑，分子生物学现行规范，约翰威利父子出版社，纽约，1987-1999)。例如，在这种技术中，蛋白质或核酸复合物是基于大小或电荷来分离。在一些实施例中，使用非变性凝胶基质材料和不存在还原剂的条件，以在电泳过程期间维持结合相互作用。具体分析的适当条件和其组份将为所属领域技术人员所熟知。
可在杂交或扩增分析中使用分离mRNA，所述分析包括(但不限于)南方或北方分析、聚合酶链式反应和基因表达分析(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州)以及探针阵列。一种用于检测mRNA水平的诊断方法涉及使分离mRNA与核酸分子(探针)接触，所述核酸分子可与所检测基因编码的mRNA杂交。可使用包含标记基因的突变的核酸作为探针或引物。本发明核酸探针或引物可为单股DNA(例如，寡核苷酸)、双股DNA(例如，双股寡核苷酸)或RNA。本发明引物是指与邻近所关注区域并延伸或覆盖所关注区域的核酸序列杂交的核酸。核酸探针可为(例如)全长cDNA或其部分，例如具有标记的至少7、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250或500或更多个连续核苷酸且足以在严格条件下与编码本发明标记的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。核酸探针的精确长度将取决于所属领域技术人员通常所考虑并实践的多种因素。本发明核酸探针可通过化学合成使用业内已知的任何适宜方法来制备，可通过重组技术来产生，或可通过(例如)限制消化从生物样品获得。用于本发明诊断分析中的其它适宜探针阐述于本文中。探针可包含附接到其的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶、酶辅因子、半抗原、序列标签、蛋白质或抗体。核酸可在碱基部分、在糖部分或在磷酸骨架处经修饰。核酸标记的实例是使用SUPERTM修饰碱基技术来纳入(纳米基因(Nanogen)，博瑟尔，华盛顿州，参见美国专利第7,045,610号)。表达水平可作为一般核酸水平(例如)在测量扩增DNA水平(例如使用DNA嵌入染料，例如SYBR绿色染料(凯杰公司，巴伦西亚，加利福尼亚州))后测量，或作为特定核酸使用(例如)基于探针的设计(且探针经标记)来测量。分析格式可使用基于探针的设计来增加特异性和信噪比。
可使用所述引物或探针作为诊断测试试剂盒的一部分，所述试剂盒用于通过(例如)测量来自个体的细胞样品中转录的核酸分子的数量(例如检测转录物、mRNA水平)或确定编码蛋白质的基因是否已突变或缺失来鉴别表达蛋白质的细胞或组织。RNA或cDNA与核酸探针的杂交可指示所关注标记正在被表达。本发明进一步涵盖检测由于遗传密码的简并性而与编码标记蛋白质(例如，具有SEQ ID NO:3、6或9的序列的蛋白质)的核酸的核苷酸序列不同且因此编码相同蛋白质的核酸分子。所属领域技术人员将了解，在群体(例如，人类群体)内可存在引起氨基酸序列变化的DNA序列多态现象。在群体内的个体之间可由于天然等位基因变异而存在所述遗传多态现象。等位基因是在给定遗传基因座替代性存在的一组基因中的一者。所述天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列中的1-5％差异。交互等位基因可通过对多个不同个体中(例如在来自个体的正常样品中)的所关注基因测序来鉴别。这可通过使用杂交探针鉴别多个个体中的相同遗传基因座容易地实施。检测任一和所有所述核苷酸变异和由于天然等位基因变异产生且不改变功能活性的所得氨基酸多态现象或变异打算在本发明的范围内。另外，应了解，还可存在影响RNA表达水平的DNA多态现象，其可影响所述基因的总体表达水平(例如，通过影响调节或降解)。
如本文所用术语“杂交”打算阐述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下，彼此显著一致或同源的核苷酸序列保持彼此杂交。在一些实施例中，所述条件使得彼此至少约70％、至少约80％、至少约85％、90％或95％一致的序列保持彼此杂交以用于后续扩增和/或检测。严格条件根据所涉及核苷酸序列的长度而变化但为所属领域技术人员已知且可参见以下文献或基于所述文献中的教示内容来确定：分子生物学现行规范，奥苏贝尔等人编辑，约翰威利父子公司(1995)，第2、4和6节。其它严格条件和用于确定所述条件的准则可参见分子克隆：实验室手册，桑布鲁克等人，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，第7、9和11章。用于长度为至少10个碱基对的杂合体的严格杂交条件的非限制性实例包括在4×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约65-70℃下杂交(或在4×SSC加50％甲酰胺中在约42-50℃下杂交)，之后在1×SSC中在约65-70℃下洗涤一或多次。用于所述杂合体的高严格性杂交条件的非限制性实例包括在1×SSC中在约65-70℃下杂交(或在1×SSC加50％甲酰胺中在约42-50℃下杂交)，之后在0.3×SSC中在约65-70℃下洗涤一或多次。用于所述杂合体的降低严格性杂交条件的非限制性实例包括在4×SSC中在约50-60℃下杂交(或者在6×SSC加50％甲酰胺中在约40-45℃下杂交)，之后在2×SSC中在约50-60℃下洗涤一或多次。上文所列举值(例如在65-70℃下或在42-50℃下)的中间范围也打算涵盖在本发明内。严格杂合条件的另一实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，之后在0.2×SSC、0.1％SDS中在50-65℃下洗涤一或多次。严格杂交缓冲液的另一实例是在1M NaCl、50mM2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH6.5)、0.5％肌氨酸钠和30％甲酰胺中杂交。在杂交和洗涤缓冲液中，可用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)取代SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后执行洗涤，每次15分钟。用于长度预计小于50个碱基对的杂合体的杂交温度应比杂合体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm是根据以下方程来确定。对于长度小于18个碱基对的杂合体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度介于18个与49个碱基对之间的杂合体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂合体中的碱基数，且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。所属领域从业人员还应认识到，可将其它试剂添加到杂交和/或洗涤缓冲液中以减少核酸分子与膜(例如硝酸纤维素或尼龙膜)的非特异性杂交，所述其它试剂包括(但不限于)阻断剂(例如，BSA或鲑鱼或鲱鱼精液载体DNA)、去污剂(例如，SDS)、螯合剂(例如，EDTA)、蔗聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。在使用尼龙膜时，具体来说，严格杂交条件的另一非限制性实例是在0.25-0.5MNaH2PO4、7％SDS中在约65℃下杂交，之后在0.02MNaH2PO4、1％SDS中在65℃下洗涤一或多次，例如，参见丘奇(Church)和吉尔伯特(Gilbert)(1984)美国国家科学院院刊81:1991-1995(或者0.2×SSC，1％SDS)。引物或核酸探针可在检测方法中单独使用，或引物可在检测方法中与至少一种其它引物或核酸探针一起使用。引物还可用于扩增核酸的至少一部分。在一些实施例中，扩增核酸标记中包含突变位点的部分。本发明核酸探针是指与所关注区域杂交且不进一步延伸的核酸。举例来说，核酸探针是与生物标记的突变体区域特异性杂交的核酸，且其通过与患者DNA的杂交或不存在杂交或所形成杂合体的类型可指示生物标记中突变的存在或身份或标记活性的数量。
在一种格式中，通过(例如)在琼脂糖凝胶上运行所分离RNA并将所述RNA从凝胶转移到膜(例如硝酸纤维素)来将RNA固定在固体表面上并与探针接触。在替代性格式中，将核酸探针固定在固体表面上且(例如)在使用包含至少一个指示治疗结果的标记的标记组的昂基因芯片阵列或SNP芯片(圣塔克拉拉，加利福尼亚州)或定制阵列中使RNA与探针接触。所属领域技术人员可容易地调整已知RNA和DNA检测方法以供用于检测本发明标记的数量。举例来说，高密度微阵列或分支DNA分析可受益于样品(例如如上文章节中所述已经改性以分离肿瘤细胞的样品)中的较高肿瘤细胞浓度。在相关实施例中，使从样品获得的经转录多核苷酸的混合物与已固定有与标记核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个连续核苷酸残基)互补或同源的多核苷酸的衬底接触。如果与标记互补或同源的多核苷酸可在衬底上差异性检测(例如，可使用不同生色团或荧光团检测，或固定到不同所选位置)，那么可使用单一衬底同时评价多个标记的表达水平(例如，固定在所选位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)。在一些实施例中，在使用涉及一种核酸与另一种核酸杂交的评价标记表达的方法时，杂交可在严格杂交条件下执行。
确定样品中对应于本发明标记的RNA数量的替代性方法涉及通过(例如)以下方法进行的核酸扩增过程：RT-PCR(实验性实施例阐述于穆利斯(Mullis)，1987，美国专利第4,683,202号中)、连接酶链式反应(巴拉尼(Barany)，1991，美国国家科学院院刊，88:189-193)、自主序列复制(瓜泰利(Guatelli)等人，1990,美国国家科学院院刊87:1874-1878)、转录扩增系统(郭(Kwoh)等人，1989,美国国家科学院院刊86:1173-1177)、Q-β复制酶(利萨尔迪(Lizardi)等人，1988，生物技术(Bio/Technology)6:1197)、滚环式复制(利萨尔迪等人，美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法；之后使用所属领域技术人员熟知的技术检测所扩增分子。如果核酸分子以极低数目存在，那么这些检测方案尤其可用于检测所述核酸分子。如本文所用的扩增引物定义为一对核酸分子，其可复性到基因的5'或3'区域(分别为+股和-股，或反之亦然)且在其之间含有短区域。一般来说，扩增引物的长度为约10到约30个核苷酸，且侧接长度为约50到约200个核苷酸的区域。在适当条件下且使用适当试剂，所述引物允许扩增包含侧接有所述引物的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法，在检测前不需要从细胞分离RNA。在所述方法中，使用已知组织学方法制备/加工细胞或组织样品。然后将样品固定在支撑物(通常为载玻片)上，之后使其与可与编码标记的RNA杂交的探针接触。
在本发明的另一实施例中，检测对应于标记的多肽。在一些实施例中，用于检测本发明多肽的药剂是能结合到对应于本发明标记的多肽的抗体。在相关实施例中，抗体具有可检测标记。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。可使用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab')2)。
可采用多种格式来确定样品是否含有结合给定抗体的蛋白质。所述格式的实例包括(但不限于)免疫组织化学(IHC)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、西方墨点法分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)。所属领域技术人员可容易地调整已知蛋白质/抗体检测方法以用于确定肿瘤细胞是否表达本发明标记。所属领域技术人员还可容易地调整所述方法以供对肿瘤细胞中的蛋白质数量进行定量，或确定肿瘤细胞是否表达多于样品中的非肿瘤细胞的蛋白质、正常量的蛋白质或少于所述非肿瘤细胞的蛋白质。在一些实施例中，在免疫组织化学分析中测量GLUT4表达。
用于确定对应于标记的多肽水平的另一方法是质谱。举例来说，可从含有一或多种多肽标记的样品(例如血液样品、淋巴样品或其它样品)分析完整蛋白质或肽(例如胰蛋白酶肽)。所述方法可进一步包括处理样品以降低高丰度蛋白质(例如血清白蛋白)的数量，以提高所述方法的灵敏性。举例来说，可使用液相色谱分级分离样品，因此可通过质谱独立分析样品的各部分。所述步骤可在单独系统中或在组合液相色谱/质谱系统(LC/MS，例如，参见廖(Liao)等人(2004)关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.)50:3792-3803)中执行。质谱系统还可呈串联(MS/MS)模式。可经一或多次扫描获得蛋白质或肽混合物的电荷态分布，且通过统计学方法(例如使用LC/MS系统中的保留时间和质荷比(m/z))来分析，以鉴别来自对蛋白酶体抑制疗法有反应或无反应的患者的样品中以统计学显著水平差异性表达的蛋白质。可用质谱仪的实例是离子阱系统(热电菲尼根(ThermoFinnigan)，圣约瑟，加利福尼亚州)或四级杆飞行时间质谱仪(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州)。所述方法可进一步包括(例如)基质辅助激光解吸电离和飞行时间(MALDI-TOF)质谱法中的肽质量指纹分析步骤。所述方法可进一步包括对一或多种胰蛋白酶肽测序的步骤。可使用此方法的结果从一级序列数据库(例如由国家生物技术信息中心(贝塞斯达，马里兰州)或瑞士生物信息学研究院(Swiss Institute for Bioinformatics，日内瓦，瑞士)维护)且基于质谱胰蛋白酶肽m/z基峰鉴别蛋白质。
电子设备可读阵列
还预期包含本发明至少一个预测标记的电子设备(包括可读阵列)以供结合本发明方法使用。如本文所用“电子设备可读介质”是指用于储存、保持或含有可通过电子设备直接读取和访问的数据或信息的任何适宜介质。如本文所用术语“电子设备”打算包括任何适宜的计算或处理设备或经配置或调整用于储存数据或信息的其它装置。适用于本发明并监测所记录信息的电子设备的实例包括独立式计算设备；网络，包括局域网络(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子用具，例如个人数码助手(PDA)、手机、传呼机等；以及局部和分布式处理系统。如本文所用“经记录”是指在电子设备可读介质上储存或编码信息的过程。所属领域技术人员可容易地采用任何当前已知的方法用于在已知介质上记录信息以生成包含本发明标记的制品。
举例来说，微阵列系统为业内所熟知且用于通过(例如)评价基因表达(例如，DNA检测、RNA检测、蛋白质检测)或代谢物产生来评价样品。根据本发明使用的微阵列包括本发明特征的预测标记的一或多个探针，所述特征为对如本文所述治疗方案的反应和/或无反应。在一个实施例中，微阵列包含一或多个对应于一或多个选自由以下组成的群组的标记的探针：其突变状态指示反应的标记，其突变状态指示长进展时间的标记和其突变状态指示患者中的长期存活者的标记。多种不同微阵列配置和其制造方法为所属领域技术人员已知且揭示于(例如)以下文献中：美国专利第5,242,974号、第5,384,261号、第5,405,783号、第5,412,087号、第5,424,186号、第5,429,807号、第5,436,327号、第5,445,934号、第5,556,752号、第5,405,783号、第5,412,087号、第5,424,186号、第5,429,807号、第5,436,327号、第5,472,672号、第5,527,681号、第5,529,756号、第5,545,531号、第5,554,501号、第5,561,071号、第5,571,639号、第5,593,839号、第5,624,711号、第5,700,637号、第5,744,305号、第5,770,456号、第5,770,722号、第5,837,832号、第5,856,101号、第5,874,219号、第5,885,837号、第5,919,523号、第5981185号、第6,022,963号、第6,077,674号、第6,156,501号、第6261776号、第6346413号、第6440677号、第6451536号、第6576424号、第6610482号、第5,143,854号、第5,288,644号、第5,324,633号、第5,432,049号、第5,470,710号、第5,492,806号、第5,503,980号、第5,510,270号、第5,525,464号、第5,547,839号、第5,580,732号、第5,661,028号、第5,848,659号和第5,874,219号；谢娜(Shena)等人(1998)，生物技术趋势(Tibtech)16:301；达根(Duggan)等人(1999)自然遗传学(Nat.Genet.)21:10；鲍特尔(Bowtell)等人(1999)自然遗传学21:25；利普舒茨(Lipshutz)等人(1999)自然遗传学21:20-24,1999；布兰查德(Blanchard)等人(1996)生物传感器与生物电子学(Biosensors andBioelectronics),11:687-90；麦斯考斯(Maskos)等人，(1993)核酸研究21:4663-69；休斯等人(2001)自然生物技术(Nat.Biotechol.)19:342,2001；其各自以引用方式并入本文中。可使用组织微阵列进行蛋白质鉴别(参见韩(Hans)等人(2004)血液103:275-282)。可使用噬菌体-表位微阵列基于蛋白质是否诱导患者的自身抗体来鉴别样品中的一或多种蛋白质(布拉德福德(Bradford)等人(2006)泌尿肿瘤学(Urol Oncol.)24:237-242)。
微阵列因此包含一或多个对应于一或多个本文所鉴别标记(例如那些指示治疗结果的标记)的探针以(例如)鉴别野生型标记基因、正常等位基因变体和标记基因的突变。微阵列可包含对应于(例如)至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个或至少100个指示治疗结果的生物标记和/或其突变的探针。微阵列可包含对应于一或多个如本文所述生物标记的探针。此外，微阵列可包含如本文所述且可根据本文所述方法选择并搜集的完整标记组。可使用微阵列来分析一或多个预测标记或预测标记组在阵列中的表达。在一个实例中，可使用阵列来分析样品中一个以上预测标记或标记组的表达，以确定标记在阵列中的表达谱。以这种方式，可同时分析多达约44,000个标记的表达。这容许产生显示在一或多个样品中特异性表达的一套标记的表达谱。此外，这容许产生表达谱以评价治疗结果。
阵列还可用于确定一或多个标记在正常和异常(例如，样品，例如肿瘤)细胞中的差异性表达模式。这提供一套标记，其可用作便于鉴别患者的治疗结果的工具。此外，阵列可用于确定参考标记的表达的参考表达水平。在另一实例中，可使用阵列来监测一或多个标记在阵列中的表达的时程。
除了所述定性确定以外，本发明容许对标记表达进行定量。因此，可基于标记组或依照样品中标记数量的结果指示来将预测标记分组。这可用于(例如)借助根据本文所提供方法对数量评分来确定样品的结果。
阵列还可用于确定标记的表达对其它预测标记在相同细胞或在不同细胞中的表达的效应。如果预测患者具有不利结果，那么这可提供(例如)用于治疗性干预的替代性分子靶的选择。
试剂和试剂盒
本发明还涵盖用于检测样品(例如骨髓样品、肿瘤活检或参考样品)中对应于本发明标记的多肽或核酸的存在的试剂盒。所述试剂盒可用于评价治疗结果，例如确定个体(例如)在蛋白酶体抑制剂治疗后是否可具有有利结果。举例来说，试剂盒可包含能检测生物样品中对应于本发明标记或标记基因的突变的基因组DNA区段、多肽或经转录RNA的经标记化合物或药剂，以及用于确定样品中基因组DNA区段、多肽或RNA的数量的构件。用于与标记蛋白质结合的适宜试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于与标记核酸(例如，基因组DNA、mRNA、剪接mRNA、cDNA等)结合的适宜试剂包括互补核酸。试剂盒还可含有对照或参考样品或一系列对照或参考样品，可对其进行分析并与测试样品进行比较。举例来说，试剂盒可具有包括(例如)一或多个本文所述标记或突变或参考标记(例如持家标记)的阳性对照样品以将(例如)来自无肿瘤个体的样品或时间点或参考基因组之间的分析标准化，从而建立标记的二倍体拷贝数基线或参考表达水平。举例来说，试剂盒可包含适于使互补核酸复性或使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的流体(例如，缓冲液)以及一或多个样品槽。本发明试剂盒可任选地包含可用于执行本发明方法的其它组件，例如样品收集器皿(例如管)和(任选地，例如如果在采样时间与分析时间之间可有时机或存在不利的储存和操作条件)用于优化所检测标记的数量的构件。举例来说，试剂盒可含有用于增加如上文所述样品中的肿瘤细胞数的构件、缓冲剂、防腐剂、稳定剂或用于制备用于所提供方法中的细胞材料或探针的其它试剂；以及单独的或与所提供探针偶联或纳入所提供探针内的可检测标记。在一个实例性实施例中，包含样品收集器皿的试剂盒可包含(例如)包含如上文所述或为所属领域技术人员已知的抗凝剂和/或稳定剂(例如，RNA稳定剂)的管。试剂盒可进一步包含检测可检测标记所需的组份(例如，酶或底物)。对于标记组，试剂盒可包含用于检测生物标记的标记组阵列或芯片。试剂盒还可包括用于解释使用试剂盒获得的结果的说明书。试剂盒可含有用于检测一或多个生物标记(例如2、3、4、5或更多个本文所述生物标记)的试剂。
在一个实施例中，试剂盒包含探针以检测至少一个生物标记，例如指示治疗结果(例如，在蛋白酶体抑制剂治疗后)的标记。在实例性实施例中，试剂盒包含核酸探针以检测选自由以下组成的群组的标记基因：SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8，或染色体1p(碱基对115247085到115259515)、染色体12p(碱基对25358180到25403854)上的序列，或前述序列中任一者的补体，或SEQ ID NO:3、6和/或9。在一些实施例中，试剂盒包含探针以检测选自由以下组成的群组的标记：NRAS和KRAS。在一些实施例中，试剂盒包含探针以检测包含两个或更多个来自由以下组成的群组的标记的标记组：NRAS和KRAS。在另一实施例中，试剂盒包含探针以检测非血液(例如实体肿瘤)癌症样品中的KRAS。在相关实施例中，试剂盒包含核酸探针，其包含或衍生自(例如，其片段、突变体或变体(例如，同源或互补))选自由以下组成的群组的核酸序列：SEQ ID NO:1、2、4和5。试剂盒可包含用于鉴别SEQ ID NO:2的密码子12、密码子13和/或密码子61或SEQ ID NO:1的类似序列中的突变的存在的试剂。在一些实施例中，试剂盒包含探针以检测表型标记基因(例如葡萄糖转运蛋白，例如GLUT4)。在一些实施例中，试剂盒包含试剂(例如探针,例如核酸探针或蛋白质探针)以检测至少两个标记，例如至少一个对应于基因型标记基因(例如RAS标记基因，例如KRAS)的标记和至少一个对应于表型标记基因(例如葡萄糖转运蛋白(例如GLUT4))的标记。在一个实施例中，包含至少两种用于评价来自患者的肿瘤样品是否与用蛋白酶体抑制剂治疗后的有利结果相关的试剂的试剂盒包含至少一种用于检测野生型或突变体KRAS的试剂和至少一种容许测量GLUT4的数量(例如正常、低或高表达)的试剂。在前述实施例中，至少两种试剂是核酸试剂。或者，所述至少两种试剂中的至少一者(例如用于检测KRAS突变的试剂)是核酸试剂且所述至少两种试剂中的至少一者(例如用于测量GLUT4的表达的试剂)是蛋白质试剂(例如结合到GLUT4、例如SEQ ID NO:9的抗体)。对于包含核酸探针的试剂盒(例如基于寡核苷酸的试剂盒)，试剂盒可包含(例如)：一或多种核酸试剂，例如任选地固定到衬底的与对应于本发明标记的核酸序列杂交的寡核苷酸(经标记或未经标记)；且可任选地进一步包含未与衬底结合的经标记寡核苷酸、引物、一对PCR引物(例如可用于扩增对应于本发明标记的核酸分子)、分子信标探针、包含与至少两个对应于本发明标记的核酸序列杂交的寡核苷酸的标记组等。试剂盒可含有RNA稳定剂。
或者，试剂盒可包含用于确定SEQ ID NO:3中残基12的甘氨酸、残基13的甘氨酸和/或残基61的谷氨酰胺是否存在或是不同氨基酸的试剂。对于包含蛋白质探针的试剂盒(例如基于抗体的试剂盒)，试剂盒可包含(例如)：(1)第一抗体(例如，附接到固体支撑物)，其与对应于本发明标记的多肽结合；和任选地(2)不同的第二抗体，其结合到多肽或第一抗体且偶联到可检测标记。试剂盒可含有蛋白质稳定剂。试剂盒可含有试剂以减少样品中的非生物标记材料与探针的非特异性结合的数量。试剂的实例包括非离子型去污剂、含有非特异性蛋白质的溶液(例如含有白蛋白或酪蛋白的溶液)或所属领域技术人员已知的其它物质。
本发明还提供含有与可检测物质偶联的本发明抗体和使用说明书的试剂盒。本发明的另一方面是包含本发明探针和医药上可接受的载体的诊断组合物。在一个实施例中，诊断组合物含有本发明抗体、可检测部分和医药上可接受的载体。
抗体
可使用对应于本发明预测标记或其片段或突变体的分离多肽作为免疫原以使用用于制备多克隆和单克隆抗体的标准技术生成抗体。举例来说，通常使用免疫原通过对适宜(即免疫活性)个体(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物或脊椎动物)进行免疫来制备抗体。在另一方面中，本发明提供单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段特异性结合到包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的多肽：本发明氨基酸序列、由本发明cDNA编码的氨基酸序列、具有本发明氨基酸序列的至少8、10、12、15、20或25个氨基酸残基的片段、与本发明氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列(其中所述一致性百分比是使用GCG软件包的ALIGN程序来确定，所述程序具有PAM120重量残基表，空位长度罚分为12且空位罚分为4)和由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子与由本发明核酸分子或其补体组成的核酸分子在于6×SSC中在45℃下杂交并在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤的条件下杂交。用作免疫原的KRAS片段可包含SEQ ID NO:3的氨基酸12、氨基酸13或氨基酸61。单克隆抗体可为人类、人类化、嵌合和/或非人类抗体。适当免疫原性制剂可含有(例如)重组表达的或化学合成的多肽。所述制剂可进一步包括佐剂，例如弗氏(Freund's)完全或不完全佐剂或类似的免疫刺激剂。
用于制备人类抗体的方法为业内已知。一种用于制备人类抗体的方法采用转基因动物、例如转基因小鼠的使用。这些转基因动物含有大部分人类抗体，从而产生插入其自身基因组中的基因组，且在抗体产生中使动物缺乏自身的内源性抗体产生。用于制备所述转基因动物的方法为业内已知。所述转基因动物可使用XENOMOUSE TM技术或通过使用“微小基因座”方法来制备。用于制备XENOMICETM的方法阐述于美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598号和第6,075,181号中，所述案件是以引用方式并入本文中。用于使用“微小基因座”方法制备转基因动物的方法阐述于美国专利第5,545,807号、第5,545,806号和第5,625,825号中；还参见国际公开案第WO93/12227号，所述案件是各自以引用方式并入本文中。
抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(例如本发明多肽，例如本发明多肽的表位)的抗原结合位点的分子。特异性结合本发明给定多肽的分子是结合多肽，但实质上不结合样品(例如天然含有多肽的生物样品)中的其它分子的分子。举例来说，抗原结合片段以及衍生自上述抗体的全长单体、二聚或三聚多肽自身是可用的。这种类型的可用的抗体同系物包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其是由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其是由抗体单一臂中的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，自然341:544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)单一结构域功能重链抗体，其由VHH结构域组成(称为纳米抗体)，例如，参见科迪斯-雷特蒙祖(Cortez-Retamozo)等人，癌症研究64:2853-2857(2004)和其中引用的参考文献；和(vii)分离互补决定区(CDR)，例如一或多个分离CDR与足够框架一起提供抗原结合片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独基因编码，但其可使用重组方法通过合成连接体联结，从而使其能被制备为单一蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；例如，参见伯德(Bird)等人，科学242:423-426(1988)；和赫斯顿(Huston)等人，美国国家科学院院刊85:5879-5883(1988)。所述单链抗体还打算涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用所属领域技术人员已知的常规技术来获得，且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段以供使用。抗体片段(例如Fv、F(ab')2和Fab)可通过裂解(例如通过蛋白酶或化学裂解)完整蛋白质来制备。本发明提供多克隆和单克隆抗体。本发明还预期前述抗体中任一者的合成和遗传改造变体(参见美国专利第6,331,415号)。多克隆和单克隆抗体可通过多种技术产生，包括常用鼠类单克隆抗体方法(例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)的标准体细胞杂交技术，自然256:495(1975))、人类B细胞杂交瘤技术(参见克兹博(Kozbor)等人，1983，今日免疫学(Immunol.Today)4:72)、EBV-杂交瘤技术(参见科尔(Cole)等人，第77-96页，单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，爱伦R.利斯公司(Alan R.Liss,Inc.),1985)或三源杂交瘤技术。一般参见哈洛,E.和莱恩,D.(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；以及现代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)，科林根(Coligan)等人编辑，约翰威利父子出版社，纽约，1994。对于诊断应用，抗体可为(例如)在小鼠、大鼠或兔中生成的单克隆抗体。另外，对于活体内应用，本发明抗体可为人类或人类化抗体。产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过使用(例如)标准ELISA分析针对结合所关注多肽的抗体筛选杂交瘤培养物上清液来检测。
如果需要，可从个体(例如，从个体的血液或血清)采集或分离抗体分子，且通过熟知技术(例如蛋白质A色谱)进一步纯化以获得IgG部分。或者，本发明蛋白质或多肽的特异性抗体可经选择或通过(例如)亲和色谱(例如，部分纯化)或纯化，以获得实质上纯化的和纯化的抗体。在本文中，实质上纯化的抗体组合物意指，抗体样品含有至多仅30％(以干重计)的针对除了本发明所需蛋白质或多肽的表位以外的表位的污染抗体，且至多20％、至多10％或至多5％(以干重计)的样品是污染抗体。纯化抗体组合物意指组合物中至少99％的抗体是针对本发明的所需蛋白质或多肽。
可使用针对对应于本发明标记的多肽的抗体(例如，单克隆抗体)来检测标记(例如，在细胞样品中)以评估标记的表达水平和模式。所述抗体还可诊断性地用于检测组织或体液(例如在血液样品中)中的蛋白质水平作为临床测试程序的一部分以(例如)确定给定治疗方案的效能。可通过偶合抗体与可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。适宜酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适宜辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适宜荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素(luciferin)和水母荧光素(aequorin)；且适宜放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
因此，在一个方面中，本发明提供实质上纯化的抗体或其片段和非人类抗体或其片段，所述抗体或片段特异性结合到包含由本文所鉴别标记编码的氨基酸序列的多肽。本发明的实质上纯化的抗体或其片段可为人类、非人类、嵌合和/或人类化抗体。
在另一个方面中，本发明提供非人类抗体或其片段，所述抗体或片段特异性结合到包含由本发明预测标记的核酸分子编码的氨基酸序列的多肽。所述非人类抗体可为山羊、小鼠、绵羊、马、鸡、兔或大鼠抗体。或者，本发明非人类抗体可为嵌合和/或人类化抗体。另外，本发明的非人类抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。
实质上纯化的抗体或其片段可特异性结合到本发明多肽的信号肽、分泌序列、细胞外结构域、跨膜或细胞质结构域或细胞质溶质袢(cytoplasmic loop)。本发明的实质上纯化的抗体或其片段、非人类抗体或其片段和/或单克隆抗体或其片段特异性结合到本发明氨基酸序列的分泌序列或细胞外结构域。
敏感性分析
从患者获得癌细胞样品。在样品中测量对应于至少一个本文所述标记的标记的表达水平。可利用标记组，其包含本文所述鉴别的且使用本文所述方法一起置于标记组中的标记。使用所述分析获得患者肿瘤的表达谱。然后使用表达谱的评估来确定是否预期患者具有有利结果且会受益于治疗(例如蛋白酶体抑制疗法，例如，用单独的或与其它药剂组合的蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)治疗)或是否预期替代性药剂对存活具有类似效应。还可使用表达谱的评估来确定是否预期患者具有不利结果且会受益于除了蛋白酶体抑制疗法以外的癌症疗法或会受益于改变的蛋白酶体抑制治疗方案。评估可包括使用一个使用所提供任一方法或业内已知的其它类似评分方法(例如，加权表决、阈值特征的组合(CTF)、考克斯比例危险分析(Cox proportional hazards analysis)、主要组份评分、线性预测分数、K-最近邻居等)制备的标记组，例如使用以基因表达汇编(GEO)程序存放在国家生物技术信息中心(NCBI，贝塞斯达，马里兰州)的表达值。此外，评估可包含使用一个以上所制备标记组。在评估结果显示有利结果时，蛋白酶体抑制疗法将被鉴别为适于治疗癌症，或对于具有预期不利结果的患者，将鉴别更积极的治疗方案。
在一个方面中，本发明的特征为评估患者(例如患有癌症(例如实体肿瘤，例如非血液癌症(例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌))的患者)的治疗结果的方法。所述方法包括提供患者标记的标记组中的标记表达的评估，其中所述标记组具有以下性质：其包括多个基因，其中每一基因在具有已鉴别结果的患者与未患病个体之间差异性表达，且其含有足够数目的差异性表达的标记从而使得个体的标记组中的每一标记的差异性数量(例如，与未患病参考样品中的水平相比)预测假阳性不大于约15％、约10％、约5％、约2.5％或约1％的治疗结果(其中假阳性意指在个体并非反应性或无反应时预测患者为反应性或无反应)；和提供来自患者的组中的每一标记的数量与参考值的比较，由此评估患者。
检查在蛋白酶体抑制疗法期间取自患者的肿瘤样品中的一或多个经鉴别标记或标记组的数量，还可能确定治疗剂是否继续发挥作用或癌症是否变得对治疗方案无反应(难治性)。举例来说，接受硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米治疗的患者的肿瘤细胞将被移除并监测其标记或标记组的表达。如果一或多个本文所鉴别标记的数量谱在药剂(例如蛋白酶体抑制剂)存在下更偏向于代表有利结果，那么将继续治疗。然而，如果本文所鉴别一或多个标记的数量谱在药剂存在下更偏向于不利结果，那么癌症可以变得对疗法(例如蛋白酶体抑制疗法)有抗性，且应起始另一治疗方案以治疗患者。举例来说，癌症可在标记基因中包含与对蛋白酶体抑制的抗性相关的突变。
重要的是，这些确定可基于不同患者或基于不同药剂(或药剂组合)来作出。因此，可确定具体蛋白酶体抑制疗法是否可能有益于具体患者或患者组/类别，或是否应继续具体治疗。
信息的使用
在一种方法中，将(例如)关于患者肿瘤的突变状态(例如患者标记特征，例如，大小、序列、组成、活性或数量，例如评估本文所述标记或标记组的结果)或关于是否预期患者具有有利结果的信息提供(例如，传达，例如以电子方式传达)给第三方，例如，医院、诊所、政府实体、偿还方或保险公司(例如，人寿保险公司)。举例来说，信息的功能可为医疗程序的选择、医疗程序的支付、偿还方的支付或服务或保险的成本。例如，第三方接收信息，至少部分基于信息作出决定，并任选地传达信息或基于信息选择程序、支付、支付水平、保险范围等。在所述方法中，确定选自表1或从表1取得和/或阐述于本文中的标记或标记组的信息性特征。
在一个实施例中，根据关于一或多个标记的突变状态或表达水平(例如标记或标记组，例如与治疗结果相关的表达水平(例如，信息性数量))的信息评估保险(例如，人寿保险或医疗保险)的费用。举例来说，如果本文所述患者的标记基因或患者标记组在受保候选者(或寻求保险覆盖的候选者)与参考值(例如，未患病个人)或参考样品(例如匹配的对照)之间具有不同特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，那么费用可增加(例如，某一百分比)。费用还可根据评估本文所述标记或标记组的结果按比例变化。举例来说，可根据(例如)标记、例如评估本文所述标记或标记组的结果来评价费用以分散风险。在另一实例中，根据从具有已知治疗结果的患者获得的保险精算数据来评价费用。
在(例如)人寿保险的承保过程中，可使用关于标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量，例如评估本文所述标记或标记组的结果(例如，信息性特征))的信息。可将信息纳入关于个体的文件中。文件中的其它信息可包括(例如)出生日期、性别、婚姻状况、银行信息、信用信息、子女情况等。可根据关于标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量，例如评估本文所述标记或标记组的结果)的信息以及文件中的信息的另外一或多项来推荐保险单。还可根据标记或标记组信息来评估保险费用或风险评价。在一种实施中，基于预期的治疗结果分配点数。
在一个实施例中，通过确定是否授权转移资金以支付提供给个体的服务或治疗(或作出本文中提到的另一决定)的功能来分析关于标记特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量，例如评估本文所述标记或标记组的结果)的信息。举例来说，分析本文所述标记或标记组特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的结果可指示预期个体具有具有有利结果，从而表明需要疗程，由此引发指示或导致授权以支付提供给个体的服务或治疗的结果。在一个实例中，确定选自表1或从表1取得和/或阐述于本文中的标记或标记组的信息性特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)，且如果所述信息性数量鉴别有利结果，那么授权支付。举例来说，实体(例如医院、看护机构、政府机构或保险公司)或其它支付或偿还医疗开支的实体可使用本文所述方法的结果来确定一方(例如除了个体患者以外的一方)是否将支付提供给所述患者的服务(例如，具体疗法)或治疗。举例来说，第一实体(例如保险公司)可使用本文所述方法的结果来确定是否向患者或代表患者提供财务支付，例如是否为提供给患者的服务或治疗偿还第三方(例如商品或服务销售商、医院、医师或其它看护机构)。举例来说，第一实体(例如保险公司)可使用本文所述方法的结果来确定是否继续、中断保险计划或方案(例如健康保险或人寿保险计划或方案)或在保险计划或方案(例如健康保险或人寿保险计划或方案)中招收个体。
在一个方面中，本发明的特征为提供数据的方法。所述方法包括提供本文所述数据(例如通过本文所述方法生成的数据)以提供记录(例如本文所述记录)用于确定是否将提供支付。在一些实施例中，通过计算机、光盘、电话、传真、电子邮件或信件提供数据。在一些实施例中，第一方向第二方提供数据。在一些实施例中，第一方选自个体、保健提供者、治疗医师、健康维护组织(HMO)、医院、政府实体或销售或供应药物的实体。在一些实施例中，第二方是第三方支付者、保险公司、雇主、资助健康计划的雇主、HMO或政府实体。在一些实施例中，第一方选自个体、保健提供者、治疗医师、HMO、医院、保险公司或销售或供应药物的实体，且第二方是政府实体。在一些实施例中，第一方选自个体、保健提供者、治疗医师、HMO、医院、保险公司或销售或供应药物的实体，且第二方是保险公司。
在另一个方面中，本发明的特征为包括患者标记或标记组的特征(例如，大小、序列、组成、活性或数量)的列表和值的记录(例如，计算机可读记录)。在一些实施例中，记录包括每一标记的一个以上值。
筛选分析
本发明提供用于鉴别蛋白酶体抑制剂(即对(例如)KRAS突变体表达或RAS路径活性具有抑制效应或对(例如)RAS路径中的KRAS底物或蛋白质的表达或活性或对葡萄糖转运蛋白(例如GLUT4)的表达或活性具有刺激或抑制效应的候选或测试化合物或药剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其它药物))的方法(本文中还称作“筛选分析”)。可在治疗方案中使用由此鉴别的化合物来调节靶基因产物(例如，KRAS突变体基因)的活性，以发挥靶基因产物的生物学功能或鉴别破坏KRAS突变体相互作用的化合物。可鉴别引起细胞(例如来自实体肿瘤(例如非血液肿瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、胰脏癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌或肾细胞癌)的细胞)或细胞系(例如从来自无反应患者的肿瘤外植体生长的细胞，其具有突变体KRAS基因或活性RAS路径和/或增加的葡萄糖转运)死亡、细胞凋亡或衰老的化合物(例如蛋白酶体抑制剂)。
在其它实施例中，所述分析可鉴别调节KRAS突变体的一或多种活性的化合物，所述活性是(例如)结合核苷酸(例如GTP或GDP)的能力；水解核苷酸的能力；结合RASGAP的能力、结合磷脂双层(例如细胞膜)的能力；控制细胞周期的能力、细胞调节蛋白质内稳态的能力；和/或支持肿瘤细胞存活的能力。在一些实施例中，可比较在测试药剂存在下的KRAS突变体的活性与在蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸，例如硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)存在下的活性，所述KRAS突变体或包含所述KRAS突变体的细胞对所述蛋白酶体抑制剂具有抗性。
本发明测试化合物可使用业内已知的组合文库法中的多种方式中的任一种来获得，包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有新颖非肽骨架的对酶促降解具有抗性但仍保持生物活性的分子的文库；例如，参见楚克曼(Zuckermann)等人(1994)医学化学杂志37:2678-85)；空间可定位平行固相或溶液相文库；要求重叠合的合成文库法；'一珠一化合物(one-bead one-compound)'文库阀；和使用亲和色谱选择的合成文库法。生物文库和类肽文库法受限于肽文库，而其它四种方法可应用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(拉姆(Lam)(1997)抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)12:145)。其它化合物可根据揭示上文章节中所述蛋白酶体抑制剂的出版物中提供的指导来合成。
化合物文库可存在于溶液中(例如，霍坦(Houghten)(1992)生物技术(Biotechniques)13:412-421)或在珠粒(拉姆(1991)自然354:82-84)、芯片(福多(Fodor)(1993)自然364:555-556)、细菌(拉德纳(Ladner)，USP5,223,409)、孢子(拉德纳USP'409)、质粒(卡尔(Cull)等人(1992)美国国家科学院院刊89:1865-1869)上或在噬菌体上(斯科特(Scott)和史密斯(Smith)(1990)科学249:386-390)；德夫林(Devlin)(1990)科学249:404-406；施为乐(Cwirla)等人(1990)美国国家科学院院刊87:6378-6382；费利奇(Felici)(1991)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222:301-310；拉德纳，上述文献)。
在一个实施例中，分析是基于细胞的分析，其中使表达KRAS突变体蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，且确定测试化合物调节KRAS突变体活性或细胞活力的能力。在一个实施例中，对在贫营养(例如低血清或低葡萄糖)条件下生长的细胞实施基于细胞的活体外分析。确定测试化合物调节KRAS突变体活性的能力可通过监测(例如)以下能力来完成：结合核苷酸(例如GTP或GDP)的能力；水解核苷酸的能力；结合RASGAP的能力、结合磷脂双层(例如细胞膜)的能力、控制细胞周期的能力、细胞调节蛋白质内稳态的能力和/或支持肿瘤细胞存活的能力。可比较测试化合物与不暴露于测试化合物的对照细胞的效应。在一些实施例中，可比较在测试药剂存在下的KRAS突变体活性与在蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸，例如硼替佐米或柠檬酸伊克昔佐米)存在下的活性，KRAS突变体或包含KRAS突变体的细胞对所述蛋白酶体抑制剂具有抗性。细胞可具有(例如)哺乳动物来源，例如人类来源。在其它实施例中，分析可确定测试化合物在活体外或在活体内(例如在异种移植肿瘤模型中)的抗药性细胞系中调节结构或机制类似于KRAS的酶的变体的能力。在细胞活力或细胞生长降低时，将化合物鉴别为抗药性的调节剂或蛋白酶体抑制剂。
现将通过以下实例阐释本发明，所述实例不打算以任何方式限制本发明。
实例
实例1
异种移植物
名称始于PHTX的异种移植物是如下所述在千禧制药公司(MillenniumPharmaceuticals,Inc.)取得：从患者取得的肿瘤是通过人类组织合作网(CooperativeHuman Tissue Network)和国家疾病研究交流会(National Disease ResearchInterchange)获得。在手术24小时内，将肿瘤植入4只SCID-NOD小鼠中。在SCID-NOD小鼠中将肿瘤连续传代2-3次以确认生长，且将材料储备在液氮中以在将来使用时重新取得肿瘤。将肿瘤进一步传代到大量NCr-裸鼠和/或CB17SCID小鼠中以供研究如表3中列示的MLN2238。通过H&E染色以组织学方式表征从患者取得的肿瘤，且从经传代肿瘤的冷冻切片制备DNA以供通过西格诺进行突变分析。
表3.原发性人类肿瘤的来源信息
名称始于LXF的异种移植物来自昂科GmbH(Oncotest GmbH)，弗莱堡，德国。使用这些肿瘤的研究是在昂科GmbH执行，且MLN2238是由千禧制药公司提供。SW48和SW48-K-RasG13D细胞系是从地平线发现有限公司(Horizon Discovery Ltd.)，剑桥，英国获得，且使用MLN2238的实验是在千禧制药公司执行。这些研究中的所有其它异种移植物都是从购自ATCC的细胞系取得。
基因组改变的分析
基因组DNA是使用凯杰推荐的方案从异种移植肿瘤和细胞系分离。通过使用西格诺(圣地亚哥，加利福尼亚州)质谱基因型分析系统测试一组癌症基因和已知肿瘤抑制因子来确定突变状态。
所评估突变组由ONCOCARTATM1.0版(LXF细胞模型)和定制分析组成，所述定制分析是与西格诺和千禧协作设计以将所调查的突变列表(2版和3版)扩展到41个癌基因和肿瘤抑制因子基因中的514种已知突变。表4列示具有组中所包括突变的基因，且括号()中的数字指示基因分析中作为目标的突变的近似数目。测试本文所述细胞系中产生以下氨基酸变化的KRAS突变：G12变为A、C、D、F、R、S或V；G13变为D、V、C、S、A或R；L19变为F；Q22变为K；T58变为I；A59变为T或V；G60变为D；Q61变为E、H、K、L、P或R；且A146变为T。
表4.具有包括在ONCOCARTATM组中的突变体区域的基因。
ABL1(16) EGFR(74) GNAQ(1) MLH1(1) RB1(11)
AKT1(9) ERBB(2) HRAS(6) MYC(6) RET(20)
AKT2(2) ERBB2(7) JAK2(1) NRAS(10) SOS1(3)
APC(12) FBX4(6) JAK3(3) PDGFRA(27) SRC(1)
BRAF(44) FBXW7(4) KIT(69) PIK3CA(39) STK11(11)
CDK(2) FGFR1(2) KRAS(16) PTEN(12) TP53(15)
CDKN2A(7) FGFR2(2) MAP2K1(5) PTPN11(1) VHL(7)
CSF1R(4) FGFR3(6) MAP2K2(5)
CTNNB1(27) FLT3(7) MET(11)
定制分析是使用具有单碱基延伸的化学品来设计，其确定延伸产物的预期质量加权以确保在多重反应内发现的所有潜在峰之间分离。使用纳米分配器(Nanodispenser)将15nl经扩增和延伸的产物点样于384SpectroCHIP II上。将3点式校准物添加到每一芯片以确保西格诺Maldi-tof紧凑式质谱仪的适当性能。将SpectroCHIP II置于西格诺MALDI-TOF紧凑式质谱仪中。将质谱仪设定为对于384孔SpectroCHIP上的每一斑点激发最多9次获取。遵循制造商推荐的方案使用TypePLEX Gold试剂盒SpectroCHIPII。
使用西格诺分析软件Typer Analyzer v4以10％的默认突变调用过滤器执行分析。阳性突变体调用的默认阈值是最少10％突变体等位基因频率，但可检测到低到3％的信号。敏感性的内部评估表明，可采用8％的阈值且假阳性比率较低。
异种移植肿瘤在免疫受损小鼠中的生长
试验药MLN9708(库珀曼等人(2010)癌症研究70:1970-1980)是目前在多发性骨髓瘤和轻链淀粉样变性的III期试验中以及在血液和实体肿瘤恶性病的1期和2期试验中评估的口服蛋白酶体抑制剂。在暴露于水溶液或血浆中后，MLN9708立即水解为生物活性形式MLN2238。在多个研究中，使用MLN2238作为MLN9708的替代品。在活体外，MLN2238在众多种用标准细胞活力和集落形成分析评估的实体肿瘤细胞类型中有效(库珀曼等人，上述文献)。然而，并非所有在活体外对MLN2238有反应的细胞系都在作为异种移植物在免疫受损小鼠的活体内生长时对MLN2238有反应。为理解决定对MLN2238的活体内敏感性的影响因素，评估一组6个结肠癌和14个非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植肿瘤在癌症相关基因中的突变以及肿瘤药物代谢动力学和药效学标记。
从细胞系取得的异种移植物：将刚解离的使用标准细胞培养程序生长的肿瘤细胞无菌注射到免疫受损小鼠背侧的皮下空间中。所注射细胞数和小鼠品种列示于表5中。
从原发性人类肿瘤取得的异种移植物：通过在免疫受损小鼠中连续传代使肿瘤生长，且不使用细胞培养程序。将刚从具有异种移植物的小鼠切除的肿瘤碎片通过套针植入表5中所示品种的接受者免疫受损小鼠背侧的皮下空间中。
肿瘤测量：在接种后，每周两次使用游标卡尺测量肿瘤。使用标准公式(0.5×[长度×宽度2])计算肿瘤体积。在肿瘤达到约150-250mm3体积时，将小鼠随机化到治疗组中。
治疗期：药物治疗组经3周每周两次通过静脉内投与以在相同品种的具有肿瘤的小鼠中实施的耐受性研究中鉴别的最大耐受剂量或较低剂量接受MLN2238(品种和剂量列示于表中)。对照组通过相同途径和时间表接受媒剂(5％羟丙基β-环糊精)。每周两次测量肿瘤大小和体重。在表6中所列示的天数计算T/C值(治疗组的平均体积/对照组的平均体积)。
表5.异种移植模型详情
*稀有突变
表6归纳在用MLN2238治疗后的肿瘤生长结果。表6的A部分列示使用较高剂量MLN2238(11-14mg/kg)的结果，且B部分列示使用较低剂量MLN2238(8mg/kg)的结果。图1是依照KRAS基因状态(野生型或突变体)组织分析天数(列示于表6的A部分中)的T/C值的图。KRAS状态与对蛋白酶体抑制剂治疗的敏感性或反应显著相关。在这个实例中，在KRAS中不具有突变的结肠直肠癌和非小细胞肺癌异种移植肿瘤(野生型)对MLN2238的敏感性高于具有KRAS突变的肿瘤。KRAS野生型异种移植物的平均肿瘤对对照的比率(T/C)为0.4，且KRAS突变体异种移植物的平均T/C为0.82。
表6：在用MLN2238治疗后的异种移植肿瘤生长结果
图2A和2B图解说明MLN2238在代表性肿瘤异种移植物中的抗肿瘤活性。图2A图解说明在具有野生型KRAS的异种移植物中对MLN2238的反应。图2B图解说明在具有突变体KRAS的异种移植物中对MLN2238的反应。据确定，KRAS突变体肿瘤对MLN2238的抗性并不是由于肿瘤样品中缺乏药物暴露(如在基于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)的方法中所测量)或缺乏肿瘤蛋白酶体抑制(如通过20S蛋白酶体的β5亚单元的抑制所测量)。
使用KRas-SW48同基因结肠细胞系(地平线发现有限公司)进一步评价KRas突变对活体内MLN2238反应的影响，其中通过rAAV基因剪辑技术将KRas-G13D和KRas-G12V突变引入SW48细胞(KRas WT)中以生成稳定细胞系。尽管在所述三种细胞系中对MLN2238的活体外敏感性(如在治疗72小时时通过发光细胞活力分析(普洛麦格(Promega))所测量)类似(EC50为33nM(wt)、19.5nM(G13D)和20nM(G12V))，但活体内研究显示敏感性有差异。图3A-3C图解说明在具有野生型KRAS的异种移植模型中(图3A)或在匹配的异种移植模型中(其中KRAS在开放阅读框密码子13或12处突变以用另一氨基酸替代每一位置处的甘氨酸，分别是图3B和3C)的肿瘤生长的时程。这种匹配模型的结果显示，在异种移植物研究中，野生型细胞系对MLN2238敏感且突变体细胞系对MLN2238具有抗性。这表明，活化的KRAS可给予一定程度的对蛋白酶体抑制剂的抗性。
实例2.葡萄糖转运蛋白
一般来说，肿瘤细胞展现的葡萄糖代谢水平高于正常细胞(综述于艾德库拉等人(2012)24:650-654中)。KRAS突变体结肠直肠癌细胞显示在营养胁迫下比野生型细胞更高的葡萄糖摄取和糖酵解以及更佳的生长和存活(云等人2009科学325:1555)。所述研究将GLUT1(葡萄糖转运蛋白1)鉴别为在KRAS突变体结肠直肠癌细胞中上调。
大多数肿瘤细胞系在使用高葡萄糖的标准培养条件下在活体外对MLN2238敏感，从而使得难以在活体外在敏感细胞系与抗性细胞系之间加以区分。然而，在活体内条件下，可用的葡萄糖较少。通过表5中列示的未经MLN2238治疗，但在小鼠中作为异种移植物生长或在培养物中生长的肿瘤细胞系的西方墨点法分析葡萄糖转运蛋白表达。在来自赛默科学(Thermo Scientific，弗吉尼亚州)的MPER哺乳动物蛋白质提取试剂中从异种移植肿瘤样品或细胞样品制备蛋白质。在4-12％Bis-Tris凝胶中运行等量蛋白质，将其转移到PVDF膜上并使用试剂通过LI-COR(林肯(Lincoln)，内布拉斯加州)来分析。一级抗体为针对哺乳动物葡萄糖转运蛋白4的兔多克隆抗体(艾博抗(Abcam)，剑桥，马萨诸塞州，目录号ab654)。在多种细胞类型(图4A是培养细胞，且图4B是异种移植物(每种动物一个泳道))中对GLUT4水平的分析显示，KRAS突变体细胞和异种移植物中的GLUT4水平高于KRAS野生型细胞和异种移植物中。这些结果表明，KRAS野生型肿瘤中的较低GLUT4水平可在其对MLN2238的敏感性中具有一定作用。相反，KRAS突变体肿瘤中的较高GLUT4水平可容许其在MLN2238的蛋白酶体抑制的胁迫中存活。.
实例3.其它测序方法和一般程序
桑格测序方法.PCR扩增是根据基因-外显子使用优化的循环条件来实施。引物延伸测序是使用应用生物系统BigDye3.1版来执行。然后在应用生物系统的3730xl DNA分析仪上运行反应。测序碱基调用是使用KBTM碱基调用器(应用生物系统)来实施。体细胞突变调用是通过突变测量器(软遗传学(SoftGenetics))来确定并通过使用Seqman(DNASTAR)比对测序数据与相应的参考序列人工确认。
下一代测序(NGS)方法.使用伊露米那平台(伊露米那公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)的定向NGS用于确认并鉴别标记中的低频率突变。引物对经设计以扩增编码外显子。PCR产物是使用PicoGreen分析来定量且对于每一样品以等摩尔比率组合。将纯化产物末端修复并通过连接来连锁。连锁产物用于Hi-Seq2000文库制备。剪切连锁PCR产物并用于制备由每个多重汇总12个条码化样品组成的条码化Hi-Seq2000文库。汇总的Hi-Seq2000文库通过在Hi-Seq2000流动细胞的八条泳道上成簇来经历克隆扩增，并在Hi-Seq2000上使用1×100单一末端测序来测序。初步测序读数与人类基因组版本Hg18的匹配以及SNP分析是使用伊露米那的CASAVA软件1.7.1版来执行。
化合物和医药组合物的制备式(II)化合物[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸是通过奥尔哈瓦和丹卡，美国专利第7,442,830号(其是全文以引用方式并入本文中)中揭示的方法来制备。式(III-A)化合物2,2'-{2-[(1R)-1-({[(2,5二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}氨基)-3-甲基丁基]-5-氧代-1,3,2-二氧杂硼烷-4,4-二基}乙酰乙酸是通过艾略特等人，WO09/154737(其是全文以引用方式并入本文中)中揭示的方法来制备。式(III-A)化合物的口服胶囊调配物是通过艾略特等人，WO09/154737(其是全文以引用方式并入本文中)中揭示的方法来制备。式(III-A)化合物的IV调配物是通过艾略特等人，WO09/154737(其是全文以引用方式并入本文中)中揭示的方法来制备。式(III-A)化合物的适于重建为IV调配物的冻干调配物是通过艾略特等人，WO09/154737(其是全文以引用方式并入本文中)中揭示的方法来制备。
定量RT-PCR.cDNA合成和定量RT-PCR是使用ABI基因表达分析、试剂和ABI7900HT序列检测系统(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州)来执行，所述系统使用以下循环条件：在50℃下保持2分钟用于AmpErase UNG活化，然后在95.0℃下保持10分钟以活化DNA聚合酶，然后运行40个在95.0℃下保持15秒并在60.0℃下保持1分钟的两部分式循环。dCt是通过使用对照基因B2M(Hs99999907_m1)和RPLPO(Hs99999902_m1)的平均Ct来计算。相对mRNA表达定量是使用比较Ct方法(应用生物系统)取得。mRNA表达倍数变化值是从正常样品和相应的肿瘤样品生成。
等效形式
虽然已使用特定术语阐述了本发明的实施例，但所述说明仅用于说明性目的，且应理解，可在不背离本发明的精神或范畴的情况下做出变化和改变。所属领域技术人员仅使用常规实验就可认识到或能确定本文所述本发明的特定实施例的多种等效形式。所述等效形式打算涵盖于以下权利要求书中。

Claims (38)

1.一种测量包含实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴别可用[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸化合物或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物治疗的癌症患者，
其中所述鉴别包含以下步骤：
a)测量包含肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是v-Ki-ras2克斯坦大鼠肉瘤病毒癌基因同系物KRAS；
b)鉴别步骤a)中测量的所述至少一个特征是否提供关于用所述化合物或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物治疗的结果的信息；和
c)如果所述信息性特征指示所述肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么鉴别所述患者可用所述化合物或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物治疗。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一个标记选自由对应于所述至少一个标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一个特征选自由以下组成的群组：大小、序列、组成、活性和数量。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述至少一个特征是序列。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述至少一个标记是核酸。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述核酸选自由以下组成的群组：DNA、mRNA和cDNA或前述中任一者的一部分，其中所述部分包含所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述核酸包含SEQ ID NO:2的选自由以下组成的群组的密码子：密码子12、密码子13和密码子61或其变体或其补体。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一个标记基因是至少两个标记基因。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述至少两个标记基因包含至少KRAS和GLUT4。
11.根据权利要求10所述的用途，其中GLUT4的所述至少一个特征是数量。
12.根据权利要求11所述的用途，其中GLUT4的所述数量正常或低。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品包含肿瘤渗出物。
14.根据权利要求13所述的用途，其进一步包含针对肿瘤细胞富集所述样品。
15.一种测量包含实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定是否要继续用蛋白酶体抑制剂疗法来治疗患者的实体肿瘤，其中所述蛋白酶体抑制剂是[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物，
所述确定包括以下步骤：
a)用所述蛋白酶体抑制剂治疗具有实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤的患者；
b)从所述患者获得包含实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞的样品；
c)测量所述样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是KRAS；
d)将c)中的所述测量结果与参考比较；和
e)如果所述比较指示所述样品中的所述实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞包含野生型KRAS，那么确定继续用所述蛋白酶体抑制剂治疗。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一个标记选自由对应于所述标记基因的核酸和蛋白质组成的群组。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一个特征选自由以下组成的群组：大小、序列、组成、活性和数量。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述至少一个特征是序列。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述至少一个标记是核酸。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述核酸选自由以下组成的群组：DNA、mRNA和cDNA或前述中任一者的一部分，其中所述部分包含所述至少一个标记基因的至少一个突变位点。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述核酸包含SEQ ID NO:2的选自由以下组成的群组的密码子：密码子12、密码子13和密码子61或其变体或其补体。
22.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一个标记是至少两个标记。
23.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一个标记基因是至少两个标记基因。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述至少两个标记基因包含至少KRAS和GLUT4。
25.根据权利要求24所述的用途，其中GLUT4的所述至少一个特征是数量。
26.根据权利要求25所述的用途，其中GLUT4的所述数量正常或低。
27.根据权利要求15所述的用途，其中所述样品包含肿瘤渗出物。
28.根据权利要求27所述的用途，其进一步包含针对肿瘤细胞富集所述样品的步骤。
29.一种测量包含实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞的患者样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预测实体肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性，其中所述蛋白酶体抑制剂是[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物，
所述预测包含：
a)评价所述细胞是否表达突变KRAS；和
b)预测所述细胞对所述蛋白酶体抑制剂的敏感性，
其中突变KRAS的表达预测对所述蛋白酶体抑制剂的敏感性不良。
30.根据权利要求29所述的用途，其进一步包含评价GLUT4是否过表达，其中GLUT4的过表达预测对所述蛋白酶体抑制剂的敏感性不良。
31.一种用于支付使用蛋白酶体抑制剂的癌症治疗的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂是[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物，所述方法包含：
a)测量来自患者的包含实体非小细胞肺肿瘤或实体结肠肿瘤细胞的样品中与至少一个标记基因相关的至少一个标记的至少一个特征，其中至少一个标记基因是KRAS，并且其中所述患者患有肺癌或结肠癌，
b)记录所述样品中KRAS是否突变，和
c)如果KRAS是野生型，那么授权支付所述蛋白酶体抑制剂治疗。
32.一种试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗无反应的非血液癌症患者，所述鉴别包含确定在来自所述患者的包含肿瘤细胞的样品中存在或不存在至少一种KRAS突变，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中存在至少一种KRAS突变指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂无反应，其中所述蛋白酶体抑制剂是[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述至少一种KRAS突变是活化性突变。
34.根据权利要求32所述的用途，其中至少一种KRAS突变的存在或不存在是通过对怀疑包含所述突变的标记或标记的一部分测序来确定。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述标记或部分包含SEQ ID NO:2或其包含密码子12、密码子13或密码子61的部分。
36.一种试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴别将对蛋白酶体抑制剂治疗具有有利结果的非血液癌症患者，所述鉴别包含确定在来自所述患者的包含肿瘤细胞的样品中存在或不存在至少一种KRAS突变，其中所述患者患有选自由肺癌和结肠癌组成的群组的非血液癌症，其中存在野生型KRAS或密码子146中的突变指示所述患者将对所述蛋白酶体抑制剂有反应，其中所述蛋白酶体抑制剂是[(1R)-1({[(2,4-二氯苯甲酰基)氨基]乙酰基}-氨基)-3-甲基丁基]硼酸或其柠檬酸酯或其医药上可接受的盐或医药组合物。
37.根据权利要求36所述的用途，其中至少一种KRAS突变的存在或不存在是通过对怀疑包含所述突变的标记或标记的一部分测序来确定。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述标记或部分包含SEQ ID NO:2或其包含密码子12、密码子13、密码子61或密码子146的部分。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3008212A4 (en) * 2013-06-10 2017-05-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of cancer
WO2015021376A1 (en) * 2013-08-08 2015-02-12 Onyx Therapeutics, Inc. Immunoglobulin expression levels as biomarker for proteasome inhibitor response
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
EP4146346A1 (en) * 2020-05-08 2023-03-15 Cardiff Oncology, Inc. Methods of monitoring kras mutations

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
DE3924454A1 (de) 1989-07-24 1991-02-07 Cornelis P Prof Dr Hollenberg Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips)
EP0430881A3 (en) 1989-11-29 1991-10-23 Ciba-Geigy Ag Photochromic compounds, process for their preparation and their use
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2077665A1 (en) 1990-03-05 1991-09-06 Robert Siman Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP1231282A3 (en) 1990-12-06 2005-05-18 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for identification of polymers
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
DE69322266T2 (de) 1992-04-03 1999-06-02 Perkin Elmer Corp Proben zusammensetzung und verfahren
US5554501A (en) 1992-10-29 1996-09-10 Beckman Instruments, Inc. Biopolymer synthesis using surface activated biaxially oriented polypropylene
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
DE4311230C2 (de) 1993-04-02 1996-12-19 Mannesmann Ag Nicht-spurgebundenes Fahrzeug mit Elektromotor
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5470710A (en) 1993-10-22 1995-11-28 University Of Utah Automated hybridization/imaging device for fluorescent multiplex DNA sequencing
US5472672A (en) 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US5429807A (en) 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5693617A (en) 1994-03-15 1997-12-02 Proscript, Inc. Inhibitors of the 26s proteolytic complex and the 20s proteasome contained therein
DE69503126T2 (de) 1994-05-05 1998-11-12 Beckman Instruments Inc Repetitive oligonukleotide matrix
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6831099B1 (en) 1999-05-12 2004-12-14 Yale University Enzyme inhibition
AU780454B2 (en) * 1999-06-03 2005-03-24 Jessie L.S. Au Methods and compositions for modulating cell proliferation and cell death
US6077674A (en) 1999-10-27 2000-06-20 Agilent Technologies Inc. Method of producing oligonucleotide arrays with features of high purity
US6713446B2 (en) 2001-01-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US20040161776A1 (en) * 2001-10-23 2004-08-19 Maddon Paul J. PSMA formulations and uses thereof
US20110250133A1 (en) 2003-01-13 2011-10-13 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7576206B2 (en) 2003-08-14 2009-08-18 Cephalon, Inc. Proteasome inhibitors and methods of using the same
US7629332B2 (en) * 2003-10-31 2009-12-08 Auckland Uniservices Limited Nitrophenyl mustard and nitrophenylaziridine alcohols and their corresponding phosphates and their use as targeted cytotoxic agents
US7232818B2 (en) 2004-04-15 2007-06-19 Proteolix, Inc. Compounds for enzyme inhibition
WO2005105826A1 (ja) 2004-04-28 2005-11-10 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai チロペプチンａ類縁体
JP5108509B2 (ja) 2004-05-10 2012-12-26 プロテオリックス， インコーポレイテッド 酵素阻害のための化合物
EP1805208A2 (en) 2004-10-20 2007-07-11 Proteolix, Inc. Labeled compounds for proteasome inhibition
US9120774B2 (en) 2004-11-03 2015-09-01 University Of Kansas Novobiocin analogues having modified sugar moieties
JP2008546421A (ja) 2005-06-28 2008-12-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｅｇｆｒおよびｋｒａｓ変異
JP4495111B2 (ja) 2006-05-10 2010-06-30 本田技研工業株式会社 燃料電池システムにおけるコンタクタ故障検知装置
EP1918713A1 (en) 2006-10-31 2008-05-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Analysis of proteolytic processing by mass spectrometry
PL2121989T5 (pl) 2007-03-13 2023-03-06 Amgen Inc. Mutacje K-RAS oraz terapia przeciwciałem anty-EGFR
US7442830B1 (en) 2007-08-06 2008-10-28 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Proteasome inhibitors
WO2009099991A2 (en) * 2008-01-31 2009-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer
SG194349A1 (en) 2008-06-17 2013-11-29 Millennium Pharm Inc Boronate ester compounds and pharmaceutical compositions thereof
WO2010020618A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Susceptibility to hsp90-inhibitors
AR075090A1 (es) 2008-09-29 2011-03-09 Millennium Pharm Inc Derivados de acido 1-amino-2-ciclobutiletilboronico inhibidores de proteosoma,utiles como agentes anticancerigenos, y composiciones farmaceuticas que los comprenden.
ES2624644T3 (es) * 2009-10-01 2017-07-17 Janssen Pharmaceutica, N.V. Inhibidores de proteasoma para el tratamiento de cáncer
WO2011056688A2 (en) 2009-10-27 2011-05-12 Caris Life Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
CA2779843A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cancer
JP5800460B2 (ja) 2010-02-01 2015-10-28 株式会社ダイセル メタ珪酸アルミン酸マグネシウムを含有するたばこフィルタ
NZ602622A (en) 2010-03-31 2015-01-30 Millennium Pharm Inc Derivatives of 1-amino-2-cyclopropylethylboronic acid
US20110256155A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Medimmune, Llc Methods to molecularly characterize circulating tumor cells
US9207243B2 (en) 2011-04-01 2015-12-08 Northwestern University Use of GLUT4 inhibitors and DNA damaging agents for treating multiple myeloma

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