BRPI0718088A2 - Método in vitro para diferenças de investigação no processamento proteolítico entre duas ou mais diferentes amostras, uso do mesmo, kit de reagentes, e, dispositivos para análise de duas amostras de proteína usando-se rotulação isotópica e para análise por multiplexação de amostras de proteína usando-se rotulação dupla. - Google Patents

Description

"MÉTODO IN VITRO PARA DIFERENÇAS DE INVESTIGAÇÃO NO PROCESSAMENTO PROTEOLÍTICO ENTRE DUAS OU MAIS DIFERENTES AMOSTRAS, USO DO MESMO, KIT DE REAGENTES, E, DISPOSITIVOS PARA ANÁLISE DE DUAS AMOSTRAS DE PROTEÍNA USANDO-SE ROTULAÇÃO ISOTÓPICA E PARA ANÁLISE POR MULTIPLEXAÇÃO DE AMOSTRAS DE PROTEÍNA USANDO-SE ROTULAÇÃO DUPLA" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a instrumentos e métodos para determinar o processamento proteolítico simultaneamente em diferentes amostras empregando-se a análise MS. FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

As proteases foram inicialmente caracterizadas como enzimas degradativas não-específicas que estão associadas com catabolismo proteico. Entretanto, torna-se cada vez mais reconhecido que a proteólise é um mecanismo importante para obter-se controle celular preciso de processos biológicos em todos os organismos vivos, através de clivagem elevadamente específica de certas proteínas [Barrett (1998) em "Handbook of Proteolytic Enzymes" Academic Press, Londres]. Esta elevadamente específica e limitada clivagem de substrato é denominada de processamento proteolítico. As proteases, através de sua capacidade para catalisar reações hidrolíticas irreversíveis, regulam o destino e a atividade de muitas proteínas, pelo controle da apropriada localização intra ou extracelular, pelo derrame das superfícies das células, por ativação ou inativação de proteases e outras enzimas, citocinas, hormônios ou fatores do crescimento, pela conversão de agonistas de receptor em antagonistas e pela exposição de neoproteínas crípticas (isto é, o produto de clivagem proteolítica é uma proteína funcional com um papel que é distinto da proteína precursora). Portanto, as proteases iniciam, modulam e concluem uma ampla faixa de funções celulares importantes pelo processamento de moléculas bioativas e, desse modo, controlam diretamente os processos biológicos essenciais, tais como replicação de DNA, progressão de ciclo celular, proliferação celular, diferenciação e migração, morfogênese e remodelagem de tecido, excrecência neuronal, hemostasia, cura de ferimento, imunidade, angiogênese e apoptose (revisto, por exemplo, em Sternlicht et al. (2001), Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 17, 463-516).

Considerando-se a relevância funcional das proteases para todos os processos vivos, incluindo morte celular, não é difícil entender-se que uma deficiência ou uma atividade temporal e espacial mal dirigida destas enzimas salienta diversas condições patológicas, tais como câncer, artrite, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. Além disso, muitos microorganismos infecciosos, vírus e parasitas, utilizam proteases como fatores de virulência e o veneno animal normalmente contém proteases para realizar a destruição de tecido ou evadir respostas de hospedeiro. Portanto, muitas proteases ou seus substratos são um importante foco de atenção para a indústria farmacêutica como alvos de medicamento potencial.

Devido aos papéis de expansão das enzimas proteolíticas, tem havido um crescente interesse na identificação e caracterização funcional das muitas proteases que estão presentes em vários organismos, das bactérias ao homem. O próximo término de diversos projetos de sequenciamento de genoma de larga escala forneceu novas oportunidades para avaliar a complexidade de sistemas de protease. O genoma humano contém mais do que 500 genes que codificam moléculas de protease ou semelhantes a protease.

A despeito do conhecimento aumentado sobre as proteases, os substratos e papéis in vivo para proteases identificadas recentemente são desconhecidos e, mesmo para proteases que foram bem caracterizadas, suas funções biológicas são freqüentemente não completamente compreendidas. Novas técnicas são urgentemente requeridas para identificar o repertório de protease que é expresso e ativo em uma célula, tecido ou organismo, bem como para identificar todos os substratos naturais de cada protease.

A evidência para a complexidade crescente e a importância dos sistemas proteolíticos que funcionam em todos os organismos, e a capacidade para analisar sistemas em sua totalidade em vastas escalas de genomas e proteomas, requerem a introdução de novos termos para esclarecer conceitos surgindo neste campo. Assim, os "degradômicos" foram primeiro planejados para definir o repertório do substrato de uma protease em uma vasta escala de proteomas por Mc Quibban et al.(2000), Science 289, 1202- 1206. Além disso, o termo também é usado para o conjunto completo de proteases que são expressas em um momento ou circunstância específicos por uma célula, tecido ou organismo. O campo de degradômicos será construído usando-se tecnologias emergentes e novas, genômicas e proteômicas para investigar e definir ambos os tipos de degradomo de protease.

A identificação de degradomos do substrato de proteases individuais facilitará nossa compreensão de seus papéis fisiológicos e patológicos e, desse modo, apontará novos biomarcadores de diagnóstico, bem como novos alvos de medicamento. Esta informação, em relação ao conhecimento do degradomo de protease de uma célula, aumentará nossa compreensão dos papéis biológicos das proteases no contexto celular com relação à função e patologia celular. Informação similar em uma vasta escala de tecidos deve provar-se útil no diagnóstico molecular da doença, com a calibração dos níveis de protease à severidade da doença ou ao grau de tumor, possibilitando que predições prognósticas mais precisas sejam feitas para os pacientes.

Os degradômicos funcionais têm duas ramificações: a primeira é baseada no perfil de atividade das proteases individuais e a segunda envolve a determinação de clivagem dos substratos alvo. Assim, em lugar de definir contribuições individuais de proteases específicas, esta última objetiva considerar o degradomo de protease como um sistema que resulta na clivagem do substrato. O campo de promessas degradômicas revela novas proteases e substratos fisiológicos, e identifica novos e conhecidos trajetos reguladores que são controlados pelo processamento proteolítico. A regulação destes trajetos poderia ser rompida nestes estados doentios, ou proteases de hospedeiro poderiam ser usadas por microorganismos para infecção e poderiam ser, portanto, terapeuticamente alvejados. Diferentes métodos proteômicos são descritos para estudar o processamento proteolítico.

Hancock et al. (W02006044666) isola a fração inferior de peptídeo Mr de uma amostra e identifica as proteínas nela. Nenhuma informação é obtida sobre as próprias proteínas processadas, que permanecem na fração superior da proteína MR.

McDonald et al. ((2005) Nat. Methods 2, 955-957), descreve um método em que peptídeos de terminal-N de uma mistura proteica são isolados e identificados por MS. Este método é bem sucedido na identificação de um novo sítio de clivagem em uma proteína de fígado. Neste método, apenas uma amostra é estudada e todos os peptídeos, também aqueles das proteínas não processadas, necessitam ser verificados por MS e determinação de seqüência, para revelar eventuais novos casos de processamento proteolítico.

Overall et al., por outro lado, utiliza um método em que duas amostras são ensaiadas simultaneamente, empregando-se rótulos ICAT (Etiqueta de Afinidade Codificada por Isótopo) [Overall and Dean (2006) Câncer Metastatis 25, 69-75]. Neste método, o grupo tiol de cisteína é modificado com um rótulo etiquetado por afinidade, a amostra é digerida com tripsina e os peptídeos rotulados são isolados. Deste modo, proteínas são detectadas, as quais têm diferentes níveis de expressão, devido à degradação das proteínas processadas aberrantes ou devido ao derrame aumentado. Este método, entretanto, não dá informação sobre o sítio de clivagem destas proteínas.

Fisher et al (US20060134723) descreve métodos para estudar maturação e processamento de proteína em diferentes amostras, usando-se rotulação isotópica e pela seleção de peptídeos de terminal-N ou de terminal- C.

Permanece uma necessidade de métodos de análise que permitam uma análise eficiente de processamento proteolítico em uma amostra.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos para comparar o

processamento proteolítico entre duas amostras de proteína que são baseadas

na rotulação seletiva e isolamento de peptídeos de terminal-N. A rotulação

seletiva e isolamento de peptídeos de terminal-N são obtidos por uma

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combinação de clivagem de proteína com rotulação isotópica de H21O, seguido por isolamento de peptídeos de terminal-N para outra análise. Este método tem a vantagem de que o número de etapas de manipulação é reduzido em comparação com os métodos da técnica anterior, em que a rotulação isotópica e a clivagem de proteína são realizadas em duas etapas separadas. Além disso, os compostos de rotulação isotópica caros são substituídos por H218O mais baratos. Combinando-se a clivagem de proteína e

a rotulação com H218O, todo o peptídeo que é clivado, será automaticamente

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rotulado, o que aumenta a eficiência da rotulação. A incorporação de 10O

mediada por protease tem a vantagem adicional de ser específica para

términos-C e não interferir com o grupo carboxila funcional de aminoácidos

internos Asp e Glu, onde presentes.

A presente invenção ainda provê métodos de rotulação dupla

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por multiplexação, em que a incorporação de O mediada por protease e rotulação isobárica específica de amina são combinadas. Nestes métodos, a rotulação isobárica é combinada com uma etapa de modificação de proteína, que normalmente é realizada em duas etapas separadas.

Aspectos particulares e preferidos da invenção são expostos nas reivindicações independentes e dependentes acompanhantes. As características das reivindicações dependentes podem ser combinadas com as características das reivindicações independentes e com as características de outras reivindicações dependentes quando apropriado e não meramente quando explicitamente exposto nas reivindicações.

Um primeiro aspecto da presente invenção provê métodos in vitro para comparação do processamento proteolítico entre duas ou mais diferentes amostras de proteína. Os métodos, de acordo com este aspecto da invenção, compreendem as etapas de (a) modificação da amina de término-N e de resíduos de Lisina das proteínas em ditas amostras, (b) clivagem das

proteínas modificadas em peptídeos e simultaneamente rotulação de cada uma

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das amostras com O ou O pela incorporação induzida por protease de O ou

18O, (c) isolamento dos peptídeos obtidos dos peptídeos de terminal-N e (e) submissão dos peptídeos de terminal-N a MS. Os métodos, de acordo com este aspecto da invenção, ainda compreendem a etapa de agrupar (d) as amostras rotuladas obtidas na etapa (b) ou os peptídeos de terminal-N isolados obtidos na etapa (c). Em uma etapa seguinte (f), as frações de peptídeos pertinentes são selecionadas com base na análise MS da etapa (e), e estas frações de peptídeos pertinentes são opcionalmente ainda analisadas (g) para identificação dos peptídeos nelas.

De acordo com uma forma de realização, os métodos compreendem, após a etapa (c), a etapa de submeter os peptídeos de terminal- N isolados a uma etapa de separação de peptídeo.

Em formas de realização particulares dos métodos da presente invenção, a modificação na etapa (a) é realizada por cada amostra com diferentes reagentes de rotulação isobáricos, compreendendo um grupo reativo amina. Nestas formas de realização, a etapa de modificação é uma etapa de rotulação diferencial, pela qual um rótulo diferente é incorporado em cada amostra.

Em outras formas de realização particulares dos métodos da invenção, a clivagem na etapa (b) é realizada com tripsina.

Em formas de realização particulares dos métodos da invenção, o isolamento dos peptídeos de terminal-N é realizado ligando-se covalentemente uma etiqueta de afinidade ao término-N dos peptídeos internos e de terminal-C e removendo-se os peptídeos internos e de terminal- C das amostras por cromatografia por afinidade.

Em formas de realização particulares destes métodos, a etapa (g) compreende analisar as amostras de proteína identificadas em MS/MS.

Em formas de realização particulares dos métodos de acordo com este aspecto da invenção, quando duas amostras são usadas a etapa de seleção da etapa (f) consiste da identificação daqueles picos para os quais a relação entre os picos dos peptídeos rotulados isotopicamente é abaixo de 0,5 ou acima de 1,5, mais particularmente, abaixo de 0,1 ou acima de 10.

Em formas de realização particulares, os métodos da invenção são empregados em amostras de proteína, das quais uma ou mais são amostras de pacientes com tumor.

Um segundo aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos métodos descritos acima para determinar sítios de clivagem proteolítica na caracterização de enzimas, proteínas, condições de clivagem, estados doentios, etc..

Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos

métodos descritos acima para a determinação dos efeitos a jusante do processamento proteolítico.

No entanto, um outro aspecto da presente invenção provê instrumentos para a realização dos métodos da presente invenção, mais particularmente kits de reagentes para a rotulação diferencial de amostras, que

são caracterizados pelo fato de compreenderem um conjunto de dois ou mais

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reagentes de rotulação isobáricos e H2 O.

Em uma forma de realização, os kits ainda compreendem

meios para isolamento de polipeptídeos com um término-N livre.

Em, no entanto, um outro aspecto da presente invenção,

dispositivos são fornecidos, os quais são particularmente adequados para

realizar os métodos descritos aqui. Os dispositivos (100') providos na

presente invenção para análise simultânea de duas amostras de proteína

usando-se rotulação isotópica, tipicamente compreendem duas fontes de

amostra (101), uma unidade de modificação de proteína (103') com uma fonte

de reagente de modificação (104'), uma rotulação e unidade de clivagem de

proteínas (105) para rotulação mediada por protease com 16O ou 18O e fontes

de rótulo correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de

terminal-N (106), uma unidade de separação (108), uma unidade de

espectrômetro de massa (109) e uma unidade de análise de dados (110).

Contudo, um outro aspecto da presente invenção provê

dispositivos (100) para análise por multiplexação de duas ou mais amostras de

proteínas, usando-se rotulação dupla compreendendo pelo menos duas fontes

de amostra (101), uma unidade de rotulação (103) com pelo menos duas

fontes de reagente de rotulação (104), uma rotulação e unidade de clivagem

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de proteína (105) para rotulação mediada por protease com O ou Oe fontes de rótulo correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-N (106), uma unidade de separação (108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e um controle de circuitos e unidade de análise de dados (110).

As formas de realização particulares dos dispositivos descritos acima ainda compreendem uma unidade de preparação de amostra (102).

A acima e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes da seguinte descrição detalhada, tomada em combinação com os desenhos acompanhantes que ilustram, por meio de exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é fornecida somente por causa dos exemplos, sem limitar o escopo da invenção. As figuras de referência citadas abaixo referem-se aos desenhos anexados. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra estruturas exemplares de reagentes iTRAQ (A) e peptídeos rotulados com eles (Β). A estrutura detalhada de um reagente de rotulação isobárico de acordo com uma forma de realização da presente invenção, consiste de um grupo repórter com uma variação de massa de 114 a 117 Da, um grupo de equilíbrio com uma variação de massa de 31 a 28 Da e

um grupo reativo de peptídeo específico de amina (NHS).

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A Fig. 2 ilustra a incorporação de O mediada por tnpsina

dentro de ambos os átomos de carboxil oxigênio do aminoácido de terminal-C de um peptídeo clivado (E: enzima).

A Fig. 3 demonstra a identificação de uma proteína diferentemente processada em duas amostras de acordo com formas de realização particulares da presente invenção. (1): desnaturação de proteína; (2): modificação de cisteínas; (3): modificação de aminas primárias; (4): digestão enzimática; (5): isolamento de peptídeos de terminal-N; O painel esquerdo mostra uma proteína não processada in vivo Ά'. Após clivagem, a proteína Ά' é clivada em um peptídeo de terminal-N (a), um peptídeo interno (b) e um peptídeo de terminal-C. No painel direito a proteína A da amostra é processada in vivo em aminoácido (z) em dois fragmentos A' e A". Sob digestão, A' é clivado em um peptídeo de terminal-N (a) e um interno/terminal-c (b'). A" é clivado em um peptídeo de terminal-N (a') e o peptídeo de terminal-c (c). A seleção de peptídeos de terminal-N isola o peptídeo (a) no painel esquerdo e os peptídeos (a) e (a') no painel direito.

A Fig. 4 ilustra a análise simultânea de múltiplas amostras usando-se rotulação dupla com rotulação isotópica de 18O e rotulação isobárica específica de amina, de acordo com as formas de realização particulares da presente invenção. 1-8: amostras; A-D rótulos isobáricos, 16 e 18 são rótulos isotópicos.

A fig. 5 mostra, de acordo com uma forma de realização

particular da presente invenção, um dispositivo (100) para análise por multiplexação de 8 amostras de proteína, usando-se rotulação dupla compreendendo oito fontes de amostra (101), uma unidade de preparação de amostra (102), uma (primeira) unidade de rotulação (103) com fontes de rótulo do primeiro correspondente (104), uma clivagem e unidade de rotulação (segunda) (105), com fontes (H216O H218O) de rótulo do segundo correspondente (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-N (106), uma unidade de separação (108) compreendendo dois sistemas de separação consecutivamente ligados (1108) e (2108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e um conjunto de circuitos de controle e unidade de análise de dados (110) acoplados a um sistema de leitura (111).

A Fig. 6 mostra de acordo com uma forma de realização

particular da presente invenção, um diapositivo (100') para análise de 2

amostras de proteína usando-se rotulação isotópica, compreendendo duas

fontes de amostra (101), uma unidade de preparação de amostra (102), uma

unidade de modificação de proteína (103') com uma fonte de reagente de

modificação (104'), uma unidade de clivagem e rotulação (105) com fontes

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correspondentes de reagentes de rotulação (H2idO e H210O) (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-N (106), uma unidade de separação (108) compreendendo dois sistemas de separação consecutivamente ligados (1108) e (2108), uma unidade de espectrômetro de massa (109), um conjunto de circuitos de controle e unidade de análise de dados (110) acoplados a um sistema de leitura (111).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO Nas diferentes Figuras, os mesmos sinais de referência referem-se aos mesmos elementos ou análogos.

A presente invenção será descrita com respeito às formas de realização particulares e com referência a certos desenhos, porém a invenção não é limitada a eles, mas somente às reivindicações. Quaisquer sinais de referência às reivindicações não devem ser interpretados como limitantes do escopo. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não desenhado em escala para fins ilustrativos. Onde o termo "compreendendo" for usado na presente descrição e reivindicações, não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido for usado, quando referindo-se a um nome singular, por exemplo, "um" ou "uma", "o", "a", este inclui um plural daquele nome, exceto se alguma outra coisa for especificamente citada. Além disso, os primeiro, segundo, terceiro termos e similares

da descrição e das reivindicações, são usados para fazer distinção entre os elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intermutáveis sob circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção descritas aqui são capazes de operar em outras seqüências que não as descritas ou ilustradas aqui.

Os termos ou definições seguintes são fornecidos unicamente para auxiliar no entendimento da invenção. Exceto se especificado, estas definições não devem ser interpretadas tendo um escopo menor do que o compreendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

O termo "polipeptídeo" ou "proteína", como aqui usado, refere-se a uma pluralidade de aminoácidos naturais ou modificados conectados via uma ligação peptídica. O comprimento de um polipeptídeo pode variar de 2 a milhares de aminoácidos diferentes (o termo, desta forma, também inclui o que é geralmente referido como oligopeptídeos). Incluídos dentro deste escopo estão os polipeptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos que são modificados por modificações de pós-translação in vivo, tais como glicosilação, fosforilação, etc. e/ou compreendendo um ou mais aminoácidos que foram modificados in vitro com agentes de modificação de proteína (por exemplo, agentes de alquilação e acetilação).

O termo "fragmento de polipeptídeo" ou "peptídeo", como aqui usado, é empregado para referir-se à seqüência de aminoácidos obtida após clivagem enzimática de uma proteína ou polipeptídeo. Um fragmento de polipeptídeo ou peptídeo não é limitado em tamanho ou natureza.

Os termos "interno", "terminal-N" e "terminal-C" quando referindo-se a um peptídeo, são aqui usados para referir-se ao local correspondente de um peptídeo em uma proteína ou polipeptídeo. Por exemplo, em uma clivagem tríptica de proteína NH2-Xi-K-X2-R-X3-K-X4- COOH (em que Xj, X2, X3 e X4 são seqüências de peptídeos de comprimento indeterminado sem Lisina (K) ou Arginina (R)), o peptídeo de terminal-N é NH2-X1-K-COOH, os peptídeos internos são NH2-X2-R-COOH e NH2-X3-K- COOH e o peptídeo de terminal-C é NH2-X4-COOH.

O termo "degradomo", quando aqui usado no contexto do degradomo de uma célula, refere-se ao completo conjunto de proteases que são expressas em um momento ou circunstância específicos por uma célula, tecido ou organismo. O mesmo termo, quando aqui usado no contexto de uma protease, pode referir-se ao repertório do substrato daquela protease em uma célula, tecido ou organismo. O termo "clivagem de proteína", como aqui usado, refere-se à

hidrólise de uma ligação péptica entre dois aminoácidos em um polipeptídeo. Nos métodos da presente invenção, a clivagem de proteína é realizada enzimaticamente. No contexto de processos fisiológicos os termos, tais como "hidrólise enzimática", "processamento proteolítico", e "maturação de proteína", são usados também.

O termo "fragmentação", como aqui usado, refere-se ao rompimento de uma ou mais ligações químicas e subsequente liberação de uma ou mais partes de uma molécula como obtido, por exemplo, por dissociação induzida por colisão (CID) em Espectrometria de massa (MS). Em certas formas de realização, a ligação é uma ligação de peptídeo, porém não é limitada a ele.

O termo "rótulo", como aqui usado, refere-se a um composto ou molécula que pode ser covalentemente ligado ou incorporado em um peptídeo ou polipeptídeo e que, com base em suas propriedades particulares, é detectável em um espectrômetro de massa. Os rótulos incluem moléculas químicas compostas que podem ser covalentemente ligadas a um peptídeo ou polipeptídeo através de um grupo reativo de proteína/peptídeo presente no reagente de rotulação. Os rótulos também incluem átomos únicos (por exemplo, um isótopo), que são incorporados no peptídeo ou polipeptídeo de interesse por meio de uma reação química e/ou enzimática. Embora o termo rótulo seja usado em um sentido geral, pode ser feita uma distinção entre a molécula de rótulo quando ligada a uma proteína ou peptídeo e o reagente de rotulação (mais especificamente com referência aos compostos compreendendo o rótulo antes da ligação com o peptídeo ou proteína, compreendendo um grupo reativo para ligação em uma proteína ou peptídeo). A presente invenção considera o uso de diferentes tipos de rótulos, tais como rótulos isotópicos e isobáricos definidos abaixo. O termo 'conjunto de rótulos', como aqui usado com relação aos rótulos isotópicos ou isobáricos (ou reagentes de rotulação), refere-se a dois ou mais diferentes rótulos ou reagentes de rotulação que podem ser usados simultaneamente em um experimento em amostras de rótulos diferentes, isto é, que têm a mesma estrutura química, porém podem ser diferenciados com base na massa em MS ou MS/MS. O termo "rótulo(s) isotópico(s)", como aqui usado, refere-se a um conjunto de moléculas com essencialmente a mesma estrutura e comportando-se do mesmo modo em eletroforese e cromatografia, porém diferindo em um ou mais átomos para gerar uma diferença de massa, e que pode ser usado como (parte de) um rótulo. A diferença de massa entre os diferentes componentes do rótulo isotópico é garantida pela substituição de um átomo com um isótopo do mesmo átomo. Os peptídeos idênticos, cada um rotulado com um rótulo compreendendo um componente de rótulo com a mesma ou essencialmente a mesma fórmula química, porém diferindo em massa com base na presença de diferentes isótopos dos mesmos átomos (em número ou tipo), podem ser distinguidos entre si por MS.

O termo "rótulo O isotópico", como aqui usado, refere-se a um

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rótulo compreendendo um ou mais diferentes átomos O. O uso combinado

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da incorporação de um ou mais O em uma amostra ou conjunto de amostras,

com a incorporação de um ou mais oxigênio ou 16O (mais freqüentemente referido como O aqui) em outra amostra ou um conjunto alternativo de amostras, resulta na rotulação isotópica destas amostras. O rótulo O isotópico é incorporado como uma alternativa para O no término-C de um peptídeo durante a proteólise enzimática, resultando em uma diferença de massa em

MS entre aqueles peptídeos compreendendo um O de terminal-C e aqueles

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compreendendo um O de terminal-C. Portanto, peptídeos idênticos, rotulados diferentemente com um rótulo O isotópico, podem ser diferenciados como tal em MS com base na diferença de massa.

O termo "rótulos isobáricos", como aqui usado, refere-se a um conjunto de rótulos tendo a mesma estrutura e a mesma massa, que sob fragmentação libera um fragmento particular com a mesma estrutura para todos os rótulos isobáricos daquele conjunto, que difere em massa entre os rótulos isobáricos individuais daquele conjunto, devido a uma distribuição diferencial de isótopos dentro dos rótulos isobáricos. Os rótulos isobáricos tipicamente compreendem um grupo repórter (RG), que é um fragmento relativamente pequeno, e um grupo de equilíbrio (BG). A "massa combinada" de um conjunto de rótulos isobáricos, refere-se à massa total do grupo repórter e do grupo de equilíbrio para aquele conjunto de rótulos isobáricos.

O termo "grupo repórter (RG)" refere-se à parte dos rótulos

isobáricos que gera um íon de assinatura forte sob Dissociação Induzida por Colisão (CID). Os fragmentos típicos gerados sob liberação do grupo repórter são usados para quantificar o polipeptídeo isobaricamente rotulado correspondente. Tipicamente os íons de fragmento aparecem na região de baixa massa de um espectro MS, onde outros íons de fragmento não são geralmente encontrados.

O termo "grupo de equilíbrio (BG)", como aqui usado, refere- se à parte dos rótulos isobáricos que contém um certo número compensador de isótopos, a fim de assegurar que a massa combinada do grupo repórter e grupo de equilíbrio seja constante para os diferentes rótulos isobáricos de um conjunto. O grupo de equilíbrio pode ou não ser liberado do rótulo sob CID.

O termo "grupo reativo de proteína/peptídeo" (PRG), como aqui usado, refere-se a uma função química de um composto que é capaz de reagir com um grupo funcional de um aminoácido de uma proteína ou peptídeo resultante da ligação (não covalente ou covalente) de tal composto com o aminoácido. Os reagentes tipicamente rotulados compreendem um PRG por meio do qual, sob interação do PRG com um grupo funcional do peptídeo ou proteína, o rótulo liga-se a ele.

O termo "grupo funcional", como aqui usado, refere-se a uma função química de um aminoácido que pode ser usada para ligar-se (geralmente ligação covalente) a um composto químico. Os grupos funcionais podem estar presentes na cadeia lateral de um aminoácido ou no término-N ou término-C de um polipeptídeo ou peptídeo. O termo abrange tanto grupos funcionais que estão naturalmente presentes em um peptídeo ou polipeptídeo como aqueles introduzidos via, por exemplo, uma reação química utilizando- se agentes de modificação de proteína.

Os métodos da presente invenção permitem a comparação exata de eventos de processamento proteolítico em duas ou mais amostras no nível de espectrometria de massa, em que um número mínimo de peptídeos gerados nestas amostras precisa ser analisado sem perder dados valiosos. A combinação de clivagem de proteína e seleção de peptídeos de terminal-N restringe a análise a uma amostra agrupada em que cada polipeptídeo das amostras originais é representado por um peptídeo de terminal-N. A invenção é dirigida a métodos para detectar diferenças na

proteólise entre duas ou mais amostras. Geralmente a amostra será de origem mamífera. Entretanto, outros organismos podem ser usados para estudar o processamento proteolítico de, por exemplo, genes de inativação ou superexpressão de proteases e inibidores de protease de organismos modelo, tais como zebrafish, Drosophila, C. elegans, S. pombe ou S. cerevisiae. Em formas de realização particulares, a amostra é uma amostra de tecido ou células cultivadas de uma amostra de tecido. Em outras formas de realização, a amostra é um fluido corpóreo, tal como sangue (por exemplo, plasma ou soro), saliva, urina, aspirado de mamilo, lavagem dutal, suor ou transpiração, exsudação de tumor, fluido de junta (por exemplo, fluido sinovial), fluido de inflamação, lágrimas, sêmen e secreções vaginais.

Em formas de realização particulares, amostras são amostras de origem mamífera, que estiveram em contato com venenos de cobras, escorpiões e similares. Em outras formas de realização particulares, as amostras são

amostras de origem mamífera, em que um gene é transfectado codificando para uma protease ativa, uma protease inativada, um inibidor de protease ativa ou um inibidor de protease inativada.

No que segue, referência será genericamente feita a uma "amostra" referindo-se desse modo a uma proteína não-purificada ou purificada compreendendo material de uma origem particular. Tal amostra pode compreender uma ou mais proteínas de acordo com a presente invenção. Para simplificar a descrição, referência geralmente será feita a "uma proteína" de uma amostra. Isto não destina-se a limitar os métodos da presente invenção à análise de amostras de uma proteína. Ao contrário, a invenção considera o uso dos métodos da presente invenção para a análise de amostras complexas, em que a presença e o processamento proteolítico das diferentes proteínas em cada amostra podem ser comparados dentro de uma análise. Os métodos e instrumentos da presente invenção referem-se à

análise de amostras de proteína. Como citado acima, o termo "amostra", como aqui usado, não destina-se necessariamente a incluir ou excluir quaisquer etapas de processamento antes da realização dos métodos da invenção. As amostras podem ser amostras brutas não processadas, extraídas de frações de proteína, frações de proteína purificada, etc.

De acordo com uma forma de realização as amostras de proteína são pré-processadas por imunodepleção de proteínas abundantes.

A preparação de amostras difere, dependendo do organismo, tecido ou órgão investigado, porém procedimentos padrões são geralmente disponíveis e conhecidos do especialista. Com respeito as amostras de proteína mamífera e humana, eles cobrem o isolamento de células cultivadas, células microdissecadas por leiser, tecido corporal, fluidos corporais ou outras amostras pertinentes de interesse. Com relação ao fracionamento de proteínas de uma amostra, Iise celular é a primeira etapa de fracionamento celular e purificação proteica. Muitas técnicas são disponíveis para o rompimento das células, incluindo métodos físicos, enzimáticos e baseados em detergente. Historicamente, Iise físico foi o método de escolha para rompimento celular; (homogeneização, Iise osmótico, rompimento celular ultrassônico), entretanto, ele com freqüência requer equipamento caro e complicado e envolve protocolos que são algumas vezes difíceis de repetir, devido a variabilidade dos aparelhos (tais como pilões de homogeneização de encaixe frouxo em comparação com encaixe hermético). Atualmente, Iise baseada em detergente tem se tornado muito popular, devido à facilidade de uso, baixo custo e eficientes protocolos.

As células de mamíferos têm uma membrana plasmática, uma bicamada de proteína-lipídio que forma uma barreira separando os teores celulares do ambiente extracelular. Os lipídios compreendendo a membrana plasmática são anfipáticos, tendo componentes hidrofílicos e hidrofóbicos que associam-se espontaneamente para formar uma lâmina bimolecular fechada. As proteínas de membrana são embutidas na bicamada lipídica, mantidas em posição por um ou mais domínios abarcando o núcleo hidrofóbico. Além disso, proteínas periféricas ligam-se à superfície interna ou externa da bicamada através de interações com proteínas de membrana integral ou com grupos de cabeça lipídica polar. A natureza do teor de lipídio e proteína varia com o tipo de célula. Naturalmente, a técnica escolhida para o rompimento de células, quer física quer baseada em detergente, deve levar em consideração a origem das células ou tecidos sendo examinados e a facilidade ou dificuldade inerente ao rompimento de sua(s) camada(s) externa(s). Além disso, o método deve ser compatível com a quantidade de material a ser processada e as aplicações a jusante pretendidas.

Em formas de realização particulares, a extração de proteína também inclui o pré-fracionamento de proteínas celulares originadas de diferentes compartimentos (tais como proteínas extracelulares, proteínas membranosas, proteínas citosólicas, proteínas nucleares, proteínas mitocondriais). Outros métodos de pré-fracionamento separam as proteínas nas propriedades físicas, tais como ponto isoelétrico, carga e peso molecular.

De acordo com uma forma de realização particular, as amostras são pré-tratadas antes da rotulação ou clivagem, para desnaturar as proteínas por acesso otimizado a reagentes ou proteases, usando-se agentes apropriados (por exemplo, cloreto de guanidino, uréia, ácidos (por exemplo, 0,1 % de ácido trifluórico), bases (por exemplo, 50 % de piridina) e detergentes iônicos ou não-iônicos).

Dependendo dos reagentes usados nas diferentes formas de

realização dos métodos da presente invenção, pode ser considerado reduzir e modificar os resíduos de cisteína das proteínas por reagentes reativos por tiol. Os reagentes largamente usados para especificamente modificar a cisteína são iodoacetamida ou vinilpiridina. Um primeiro aspecto da presente invenção provê métodos para

a análise simultânea de eventos de clivagem de proteína em duas ou mais amostras. Os métodos da presente invenção compreendem as seguintes etapas: modificação das aminas primárias das proteínas presentes nas amostras, clivagem das proteínas e rotulação simultânea dos términos-C dos peptídeos gerados, isolamento de peptídeos de terminal-N, purificação de peptídeos de terminal-N e, finalmente, análise MS diferencial de peptídeos.

Portanto, os métodos da presente invenção compreendem uma etapa pela qual a amina primária de término-N da(s) proteína(s) e as aminas da cadeia lateral de Lisina da(s) proteína(s) presente(s) nas amostras, são modificadas. Isto é assegurado contatando-se as amostras com um composto tendo um grupo reativo de proteína específico de amina. Tal reagente pode ligar-se a uma amina de um modo reversível ou irreversível, tornando desse modo o grupo amina indisponível para reagentes reativos por amina. Esta etapa é importante, visto que todas as aminas primárias da(s) proteína(s) necessitam ser modificadas, antes que uma seleção de peptídeos de terminal- N de grupos amina possa ser realizada, como explicado em detalhes abaixo. Como um resultado da modificação dos grupos amina livres das proteínas nas amostras, as amostras conterão apenas peptídeos cujos términos-N são ocupados, como um resultado da modificação in vitro (descrita acima) ou devido a sua presença nas amostras como bloqueadores de términos-N antes da etapa de modificação in vitro.

Em uma forma de realização, a modificação de aminas primárias é realizada somente para remover estes grupos funcionais das proteínas de uma amostra. Os reagentes de modificação adequados neste contexto são reagentes reativos por amina, tais como aqueles descritos abaixo.

Os reagentes reativos de amina incluem carbamatos (incluindo metila, etila, terc-butila (por exemplo, Boc) e 9-fluorenilmetil carbamatos (por exemplo, Fmoc) amidas), derivados de imida cíclica, N-Alquil e N-Aril aminas, derivados de imina e derivados de enamina. Outros agentes reativos por amina são anidrido acético, dicarbonato de di-terc-butila (isto é, anidrido Boc) ou reagente de 9-fluorenilmetóxi carbonila (isto é, reagente Fmoc), que geram um 9-fluorenilnietóxi carbamato sob reação com uma amina livre reativa. Os exemplos de reagentes Fmoc incluem Fmoc-Cl, Fmoc-N3, Fmoc- O-benzotriazol-l-ila), Fmoc-O-succinimidila e Fmoc-OC6F5.

De acordo com uma forma de realização particular, a etapa de modificação dos aminotérminos nos métodos da presente invenção, inclui a modificação seletiva de resíduos de Lisina com um reagente antes da modificação do término-N. A Lisina pode ser modificada com O- metilisouréia ou O-metil imidazol e seus derivados químicos (por exemplo, O-metil imidazol substituído). Estes reagentes seletivamente reagem com resíduos de Lisina, sem afetarem grupos amino de terminal-N livres, com a exceção de polipeptídeos com Glicina de terminal-N.

Alguns destes agentes de modificação de Lisina impedem a clivagem enzimática das proteases específicas de Lisina, tais como tripsina, o que pode ser de interesse para limitar a clivagem da proteína na etapa de clivagem enzimática.

Em uma forma de realização particular dos métodos da presente invenção, a etapa de modificar as aminas primárias presentes nas proteínas das amostras é combinada com uma etapa de rotulação; de acordo com esta forma de realização, a modificação das aminas primárias é explorada para assegurar a incorporação de outro rótulo de término-N nos peptídeos. Portanto, em combinação com a etapa de rotulação induzida por protease, a rotulação através da modificação das aminas primárias, resulta em uma rotulação dupla dos (pelo menos alguns de) peptídeos das amostras.

Mais particularmente, os rótulos adequados para a rotulação dos peptídeos no contexto da presente invenção são rótulos isobáricos (tais como aqueles descritos por Ross et al. ((2004) Mol. Cell. Proteomics 3, 1154- 1169 e descritos no W02004070352).

O conceito de rotulação isobárica é exemplificado na Figura 1. Os reagentes de rotulação isobáricos compreendem um grupo repórter (RG), um grupo de equilíbrio (BG) e um grupo reativo de proteína/peptídeo (PRG), como definido aqui. Na forma de realização ilustrada na Figura 1, o reagente de rotulação isobárico completo consiste de um grupo repórter baseado em N- metilpiperazina, um grupo de equilíbrio de massa que é uma carbonila e um grupo reativo de proteína/peptídeo, que é um grupo reativo amina, que é um éster NHS. Embora a massa do grupo repórter seja específica para cada rótulo isobárico dentro de um conjunto, a massa total do grupo repórter e o grupo de equilíbrio dos diferentes rótulos isobáricos são mantidos constantes. De acordo com uma forma de realização particular isto é assegurado usando-se o

13 15 18

enriquecimento isotópico diferencial com átomos 13C, ,JN e '0O, como indicado na Figura IA. Os rótulos isobáricos descritos na Figura 1, que são comercialmente disponíveis, permitem a introdução de quatro diferentes rótulos em grupos amina.

Em vista da estrutura idêntica dos diferentes reagentes isobáricos, o número e a posição dos centros enriquecidos no anel não têm efeito no comportamento cromatográfico ou MS. Sob reação do grupo reativo específico de amina deste reagente de rotulação com um grupo funcional amina (grupo amina ou de terminal-N de lisina) de um peptídeo, o rótulo torna-se conectado via uma ligação de amida ao peptídeo. Estas ligações de amida fragmentam-se de um modo similar as ligações peptídicas da cadeia principal, quando submetidas a, por exemplo, CID na análise MS/MS. No exemplo fornecido na Figura 1, o componente de equilíbrio (carbonila) é perdido (perda neutra) seguindo-se a fragmentação da ligação amida, embora a carga seja retida pelo fragmento do grupo repórter. Os números em parênteses indicam o número de centros enriquecidos em cada seção da molécula.

A parte B da Figura 3 ilustra as diferenças da distribuição de

isótopos dentro dos grupos repórter e de equilíbrio, usadas para chegar-se a quatro reagentes de rotulação isobáricos compreendendo quatro diferentes massas de grupo repórter. Uma mistura de peptídeos idênticos, cada um rotulado com um membro diferente do conjunto de reagentes de rotulação isobáricos, aparece como um íon precursor único, não dissolvido em MS (idêntico m/z). Em seguida a CID, os quatro íons do grupo repórter aparecem como massas distintas (114-117 Da). Todos os outros íons de fragmentos informantes de seqüência (b-, y-, etc) permanecem isobáricos e seus sinais de corrente iônica individuais (intensidade de sinais) são aditivos. Este também é o caso para aqueles peptídeos trípticos que são rotulados tanto no término-N como nas cadeias laterais de Lisina, e aqueles peptídeos contendo resíduos de Lisina internos, devido a incompleta clivagem com tripsina.

Os métodos de rotulação dupla da presente invenção, assim permitem, por análise MS/MS, a determinação da concentração relativa dos peptídeos diferentemente rotulados, visto que ela pode ser deduzida das intensidades relativas dos íons repórter correspondentes. Ao contrário das estratégias de ICAT e de rotulação de diferença de massa similares, a quantificação é assim realizada no estágio MS/MS em vez de no MS.

A rotulação através das aminas primárias de um peptídeo objetiva tanto o término-N como as aminas das Lisinas internas, presentes nos peptídeos. De acordo com uma forma de realização, os métodos de rotulação dupla da presente invenção não compreendem uma etapa de modificação dos grupos de amina internos antes das etapas de rotulação e, portanto, a rotulação isobárica através das aminas primárias é vinculada, em que tanto o término-N como as cadeias laterais de Lisina de uma proteína são modificados. Os peptídeos de terminal-N compreendendo resíduos de Lisina, portanto, conterão mais do que um rótulo isobárico.

Alternativamente, a presente invenção considera métodos de rotulação dupla, em que, antes das etapas de rotulação, as amostras são pré- tratadas de modo que a Lisina seja modificada, por exemplo, um pré- tratamento com um componente, tal como O-metilisouréia. Como mencionado acima, a O-metilisouréia não reage com aminas de terminal-N, com a exceção de polipeptídeos com Glicina de término-N. Mais adiante, os términos-N livres restantes das diferentes amostras são diferentemente rotulados com um rótulo isobárico reativo de amina. O reagente de rotulação isobárico não reagirá com proteínas com términos-N bloqueados (ou anteriormente modificados). Um término-N bloqueado pode ser um término- N bloqueado ocorrendo naturalmente ou pode ser gerado durante o processamento de amostra (por exemplo, o uso de uréia). As modificações mais freqüentes, N-acetilação, podem ser removidas com enzimas (acilpeptídeo hidrolase) ou por métodos químicos (desacetilação alcoolítica). De outra maneira, a rotulação apenas dos términos-N livres dá uma redução adicional da complexidade de uma amostra e pode ter propriedades vantajosas. Assim, dependendo do tipo de ensaio e amostra, os métodos são considerados compreendendo a etapa de desbloquear os terminais-N bloqueados e/ou remover as modificações do terminal-N, ou em que a rotulação do terminal-N é realizada na amostra como tal.

Os métodos da presente invenção são caracterizados de modo que eles compreendem uma etapa em que as proteínas de uma amostra são enzimaticamente clivadas e simultânea e isotopicamente rotuladas em uma etapa única. De fato, foi determinado que a etapa de clivagem enzimática tradicionalmente realizada por análise MS e a etapa de rotulação podem ser combinadas para racionalizar ainda a análise por multiplexação.

De acordo com uma forma de realização particular, a etapa de clivagem enzimática é realizada pelo tratamento das amostras com tripsina na presença de água (H216O) ou H218O. Os detalhes da incorporação de 18O mediada por tripsina são, por exemplo, fornecidos em Heller et al. (2003) J.

Am. Soe. Mass Spectrom. 14(7), 704-718. Sob clivagem enzimática com tripsina, dois átomos de O são incorporados no término-C de peptídeos

gerados recentemente. Portanto, sob clivagem enzimática com tripsina na

18 18 presença de H21O, dois átomos de O são incorporados no término-C de

peptídeos gerados recentemente (vide Figura 2). Naturalmente, as proteínas

que não compreendem uma Lisina de terminal-C ou uma Arginina, gerarão peptídeos de terminal-C que não têm um átomo de O incorporado, de modo que nem todos os peptídeos de terminal-C da amostra serão isotopicamente rotulados. Isto, entretanto, não é de importância para os métodos da presente invenção, visto que apenas os peptídeos de terminal-N das proteínas são

eventualmente analisados.

• 18 Introduzindo-se diferentemente dois O ou dois O por

clivagem combinada e etapa de rotulação dos métodos da presente invenção,

os peptídeos resultantes tornam-se isotopicamente rotulados com uma

diferença de massa de 4, sem a ligação de grupos adicionais ao peptídeo.

De acordo com formas de realização alternativas, enzimas, que

não a tripsina, são usadas, tais como Lis-C ou Glu-C.

De acordo com ainda outra forma de realização, a etapa de clivagem das proteínas é realizada usando-se Peptidil-Lis metaloendopeptidase (Lis-N). A clivagem com Lis-N resulta na incorporação de apenas um átomo de 18O no peptídeo resultante, o que resulta em uma diferença de massa de 2 entre as espécies rotuladas e não rotuladas. Isto tem a vantagem de que esta enzima não gera uma mistura de peptídeos

isotopicamente rotulados resultantes da incorporação de um ou dois átomos

18

de 10O em um peptídeo. Também Asp-N e quimotripsina incorporam um único 18O sob clivagem (Schnolzer et al. (1996) Electrophoresis 17, 945-953).

E observado que a rotulação isotópica mediada por enzima usada nos métodos da presente invenção é específica para terminais-C gerados recentemente de peptídeos clivados. O grupo carboxila de Asp e Glu não é modificado. Assim, ao contrário dos métodos da técnica anterior, não há necessidade de modificar os grupos funcionais de Asp e Glu em uma etapa adicional do método antes da rotulação isotópica.

Os métodos da presente invenção compreendem a etapa de

clivagem de pelo menos duas diferentes amostras, cada uma na presença de

18

H2O ou H21O. Onde os métodos da invenção consideram um grau mais

elevado de multiplexação, por exemplo, pelo uso de uma rotulação adicional

com rótulos isobáricos como descrito acima, as amostras para rotulação com 18

O ou O serão selecionadas de modo que combinações únicas dos rótulos * r · 18

isobáricos com O ou O são providas nos peptídeos de cada amostra, para permitir diferenciação dos peptídeos originando-se das proteínas das diferentes amostras.

Isto é ilustrado na Figura 4. Usando-se quatro diferentes (comercialmente disponíveis) rótulos iTRAQ, dois conjuntos de quatro amostras podem ser rotulados com os rótulos iTRAQ individuais. Cada conjunto de quatro amostras pode ser agrupado antes da clivagem, após o que

• Ift

um conjunto de quatro amostras é rotulado com O durante a clivagem, embora o outro seja clivado na presença de água. Deste modo, uma rotulação diferencial de 8 diferentes amostras é realizada, o que pode ser analisado como uma amostra agrupada. Atualmente, o conjunto de reagentes de rotulação iTRAQ comercialmente disponível aumentou para 8, permitindo uma multiplexidade ainda maior.

Como um resultado da etapa de bloquear o terminal-N e a clivagem combinada e a etapa de rotulação da presente invenção, todos os

peptídeos de terminal-N das proteínas presentes na amostra compreenderão o " 18

O ou o isótopo O. Além disso, todos os peptídeos internos e de terminal-C têm um término-N livre, embora todos os peptídeos de terminal-N tenham um término-N modificado, porque ele foi bloqueado como tal na amostra ou como um resultado da etapa de modificação (e opcionalmente rotulação). Os métodos da presente invenção ainda compreendem uma

etapa de isolamento, em que os peptídeos internos e de terminal-C das proteínas das amostras são removidos dos peptídeos de terminal-N das proteínas clivadas. Embora diferentes amostras possam ser tratadas separadamente, em geral todos as amostras de um ensaio são agrupadas antes da etapa de isolamento dos peptídeos de terminal-N.

De acordo com uma forma de realização os peptídeos internos e de terminal-C compreendendo um término-N livre, são ligados a ou reagido com uma matriz que é específica para aminas primárias. Exemplos dos quais são materiais de NTA-Ni -quelado (ácido nitrilotriacético) providos em contas magnéticas, resinas de sefarose ou agarose, etc.

De acordo com outra forma de realização o término-N dos peptídeos internos e de terminal-C é reagido com uma etiqueta de afinidade. Os exemplos de etiquetas de afinidade incluem:

d-biotina ou reagentes baseados em biotina estruturalmente modificada, incluindo d-iminobiotina,

1,2-dióis, tais como 1,2-di-hidroxietano (HO-CH2-CH2- OH), e outros 1,2-di-hidroxialcanos, incluindo aqueles de alcanos cíclicos, por exemplo, 1,2-di-hidroxiciclo-hexano que se liga a um ácido alquil ou aril borônico ou ésteres de ácido borônico, tais como fenil-B(OH)2 ou hexil- B(OEtil)2 (por exemplo, ligados via um grupo alquila ou arila a um suporte, tal como agarose)

maltose que se liga a Proteína de Ligação de Maltose; ou outros pares de Proteína de Ligação açúcar/Açúcar, ou mais genericamente, a algum par de Proteína de Ligação de ligando/Ligando que obedece ao critério de etiquetas de afinidade acima mencionado.

um hapteno, tal como o grupo dinitrofenila, que se liga ao anticorpo anti-hapteno correspondente, tal como anti-dinitrofenil-IgG;

um ligando que se liga a um metal de transição, por exemplo, uma histidina oligomérica (chamada de 6His-tag) que se ligará a Ni(II), o metal de transição CR é, em formas de realização particulares, usado na forma de um metal de transição quelado ligado por resina, tal como Ni(II) quelado por ácido nitrilotriacético ou Ni(II) quelado por ácido iminodiacético;

glutationa que se liga a glutationa-S-transferase.

Em formas de realização particulares dos métodos da presente invenção, os peptídeos internos e de terminal-C são descartados e não são usados para outra análise. Assim, nestas formas de realização não há necessidade por uma ligação reversível destes peptídeos com a matriz, ou por etiquetas de afinidade que possam ser liberadas da matriz de afinidade com um ligando de deslocamento, ou por etiquetas de afinidade com um ligador clivável entre a etiqueta e o peptídeo. Se, entretanto, a recuperação dos peptídeos internos e de terminal-C for considerada ligação reversível, ligandos de deslocamento ou etiquetas de afinidade cliváveis serão opcionalmente usadas.

Em formas de realização particulares a etiqueta de afinidade usada para a remoção de peptídeos internos e de terminal-C da(s) amostra(s) de peptídeo é biotina. Os reagentes para ligação de biotina para grupos amina são comercialmente disponíveis e incluem, por exemplo, succinimidil D- biotina, succinimidil éster do ácido 6-((biotinoil)amino)hexanóico e succinimidil éster do ácido 6-((6-((biotinoil)amino)hexanoil)amino) hexanóico. Os peptídeos etiquetados com afinidade de Biotina são ligados via cromatografia convencional de afinidade de avidina ou estreptavidina na coluna ou nas contas. As instruções para uso podem ser encontradas nas folhas de dados técnicos de Pierce (Rockville, IL).

Nos métodos de separação descritos acima, os peptídeos de terminal-N não se ligarão e serão recuperados como a fração de não ligação, e serão assim indireta seletivamente isolados para outra análise.

Os métodos da invenção proveem, para análise simultânea de amostras diferentemente rotuladas, melhorar a precisão da comparação entre estas amostras. Portanto, os métodos da invenção compreendem a etapa de reunir as diferentes amostras para análise. Como indicado acima, as amostras de proteína diferentemente rotuladas e clivadas, podem ser agrupadas antes do isolamento seletivo dos peptídeos de terminal-N. Alternativamente, o isolamento seletivo dos peptídeos de terminal-N é realizado em amostras individuais (ou parcialmente agrupadas) e as diferentes frações de peptídeos de terminal-N são agrupadas neste estágio.

Os métodos da invenção ainda compreendem uma ou mais etapas de separação que são tipicamente realizadas após o isolamento dos peptídeos de terminal-N ou (onde apropriado) a reunião das diferentes frações de peptídeo de terminal-N. De acordo com a presente invenção, a natureza da rotulação diferencial, tanto com relação a rotulação isotópica de O como a rotulação isobárica opcional, é de modo que a estrutura química dos rótulos seja a mesma. Assim, a estrutura química dos rótulos presentes em cada uma das amostras diferentemente rotuladas é a mesma, de modo que não gerará uma diferença significativa nas propriedades das técnicas de cromatografia (multidimensional) entre os peptídeos idênticos que são diferentemente rotulados sozinhos ou duplos. Portanto, os peptídeos rotulados com a mesma seqüência de aminoácidos comportar-se-ão identicamente e permanecerão na mesma fração.

As técnicas de separação adequadas, que permitem a separação de uma amostra de peptídeo complexa em múltiplas frações, são conhecidas da pessoa hábil e incluem, mas não são limitadas a focalização isoelétrica, cromatografia de troca iônica, HPLC de fase inversa, cromatografia por afinidade,...etc. As técnicas, tais como SDS PAGE, eletroforese de gel bidimensional, cromatografia de exclusão por tamanho, são menos adequadas para os peptídeos de terminal-N de comprimento genericamente limitado, os quais foram isolados na etapa do método anterior. Para amostras de peptídeo obtidos de, por exemplo, digestões

proteolíticas, abordagens 2D-LC são mais adequadas para separação e também a automação e a produção são significativamente melhores. Diversas tecnologias para separar digestos de peptídeos por cromatografia líquida foram descritas, incluindo HPLC-(RP) de fase inversa e cromatografia líquida multidimensional. Também a eletroforese capilar (CE) é um método adequado para a separação de peptídeos.

Colunas de troca de íons usam geralmente 2D-LC (usualmente, forte troca de cátions, SCX) acoplados em linha com uma coluna de fase inversa operada em uma série de ciclos. Em cada ciclo a concentração de sal é aumentada na coluna de troca iônica, a fim de diluir peptídeos de acordo com sua carga iônica nos sistemas de fase inversa. Aqui, os peptídeos são separados em hidrofobicidade por, por exemplo, gradiente com CH3CN.

Muitos parâmetros influenciam o poder de resolução e, subseqüentemente, o número de proteínas que podem ser deslocadas por LC- MS. Usualmente, a configuração 'on-line' entre a técnica de separação de primeira dimensão (SCX) e a abordagem de separação de HPLC-RP de segunda dimensão é instalada pelo fracionamento da amostra. A cromatografia de troca iônica pode ser realizada por eluição escalonada com a concentração de sal aumentando ou por um gradiente de sal. Tipicamente, SCX é realizado na presença de, por exemplo, até 30 % de acetonitrila, para minimizar as interações hidrofóbicas durante a cromatografia de SCX. Antes da cromatografia de Fase Inversa em, por exemplo, uma coluna C18, solventes orgânicos, tais como acetonitrila, são removidos ou fortemente reduzidos por, por exemplo, evaporação.

Os métodos da invenção ainda compreendem a etapa de identificação de peptídeos para os quais o processamento diferencial tem ocorrido nas diferentes amostras. Esta etapa de identificação é assegurada detectando-se a massa diferencial dos peptídeos das amostras (por MS ou MS/MS) e determinando-se a sua seqüência. A seqüência dos peptídeos pode ser reconstituída com base na informação gerada pela análise MS/MS dos peptídeos identificados. Portanto, os métodos da presente invenção compreendem a etapa de analisar os peptídeos ou frações de peptídeos, compreendendo os peptídeos rotulados duplos por MS e MS/MS.

O seguinte descreve como a informação obtida por MS e MS/MS pode ser usada para ganhar informação no processamento proteolítico diferencial das proteínas nas amostras.

Como detalhado aqui, o espectro gerado em um espectrômetro de massa de um peptídeo de terminal-N que foi isolado de um pool de amostras diferenciais e isotopicamente rotuladas, contém em princípio, um par de picos com uma diferença de massa característica de 2 ou 4 (dependendo da enzima usada), como resultado da rotulação isotópica (16O versus 18O) das duas amostras ou dois conjuntos de amostras. Onde apenas duas amostras estão envolvidas, devido ao processamento proteolítico ou expressão diferencial (como uma conseqüência direta ou indireta do processamento proteolítico) da proteína correspondente a este peptídeo de terminal-N das duas amostras analisadas, apenas um pico pode estar presente. Isto está detalhado abaixo. A ausência de um dos isótopos de um peptídeo em um espectro MS pode ter diferentes razões.

Primeiro, pode ser causada pelo processamento diferencial in vivo da proteína nas duas amostras. Onde ocorre o processamento diferencial, os peptídeos que geram picos em MS serão diferentes dependendo da natureza do processamento. A Tabela 1 exemplifica diferentes opções para um peptídeo teórico. Os peptídeos de terminal-N resultantes de uma proteína de controle não processada (vide (1) na Tabela 1 abaixo), uma proteína que é processada no peptídeo de terminal-N (isto é, N-terminalmente da clivagem com tripsina, vide (2) na Tabela 1), uma proteína que é processada em um aminoácido que é também o sítio de clivagem para tripsina (vide (3) na Tabela 1) e uma proteína que é processada em um local que situa-se em um peptídeo interno sob clivagem com tripsina (vide (4) na Tabela 1), são fornecidos. Neste Exemplo, a proteína de controle não processada é clivada na presença de água, embora amostras experimentais compreendendo (2), (3) ou (4) sejam clivadas com tripsina na presença de H218O.

Tabela 1: Identificação de peptídeos de terminal-N resultando de uma proteína que não é processada (1) ou processada em locais diferentes da proteína (2, 3, 4). O local de processamento é definido em relação aos peptídeos gerados pela clivagem de tripsina, isto é, dentro do peptídeo de terminal-N (A), dentro dos peptídeos internos (B) ou (C) ou dentro do peptídeo de terminal-C (D). TI, T2 e T3 correspondem a um ponto de clivagem tríptica (Lis ou Arg) separando estes peptídeos. YeZ são sítios hipotéticos para o processamento proteolítico in vivo dentro dos peptídeos de tripsina. #: modificação do terminal-N. 16O e 18O: rotulação isotópica com, respectivamente, água normal e H218O. Em que o processamento ocorre em aminoácidos Y ou Ζ; o término-C do peptídeo resultante não é gerado como um resultado de clivagem de tripsina e 18O não é incorporado. Similarmente, o término-C da proteína não é gerado por clivagem de tripsina e assim não , 9 ^ I ο

incorpora ο ísótopo Ο. Como resultado do processamento, peptídeos AeB são divididos em, respectivamente, A' e A", e B' e B". A: lista de peptídeos ocorrendo sob diferentes condições; B: picos gerados em MS sob reunião de diferentes amostras correspondendo às condições de (A), cada coluna representando uma região de picos correspondendo a peptídeo isotópicos. A.

Condições Proteína/peptídeos correspondentes (1) proteína não-processada modificada SNH2-(A)Y-TI-(B)Z-T2--(C)-T3-(D)-COOH peptídeos clivados e rotulados (16O) #NH2—(A)Y-TI lbO NH2-(B)Z-T216O NH2-(C)-T316O NH2-(D)-COOH peptídeo(s) de terminal-N isolado(s) #NH2-(A) Y-Ti 16O (2) proteína modificada processada em Y #NH2-(A')Y #NH2-A"-TI-(B)Z-T2-(C)-T3-(D)~COOH proteína clivada e rotulada (18O) #NH2-(A')Y SNH2-(Am)- Ti18O NH2-(B)Z-T218O NH2-(C)-T318O NH2-(D)-COOH peptídeo(s) de terminal-N isolado(s) #NH2-(A')Y #NH2-(A")- T118O (3) proteína modificada processada em Ti #NH2~(A)Y—TI #NH2-(B)Z-T2~(C)-T3-(D)~C00H peptídeos clivados e rotulados (18O) #NH2-(A) Y-Ti18O #NH2-(B)Z-T2180 NH2-(C)-T318O NH2-(D)-COOH peptídeo(s) de terminal-N isolado(s) #NH2-(A) Y-Ti18O SNH2-(B)Z-T218O (4) proteína modificada processada em Z #NH2—(A) Y—Ti—(B' )Z #NH2-B"-T2-(C)~T3-(D)-COOH peptídeos clivados e rotulados (18O) SNH2-(A)Y-T118O NH2-(B')Z SNH2-Bn-T218O NH2-(C)-T318O NH2-(D)-COOH peptídeo(s) de terminal-N isolado(s) SNH2-(A)Y-Ti18O SNH2-Bn-T218O Β.

Amostras agrupadas Peptídeos detectados por MS (em diferentes regiões do espectro) 1 +2 #NH2-(A) Y--T1 lbO #NH2-(A')Y #NH2-(A")Y-TI180 1 +3 #NH2~(A) Y-Ti lbO #NH2-(A)Y--Ti180 #NH2-(B)Z- T218O 1+4 #NH2-(A) Y-T1 lbO #NH2-(A) Y-T118O #ΝΗ2-(Β")-Τ2180

As diferentes situações ilustradas na Tabela 1 são comentadas

resumidamente abaixo.

Na primeira situação, uma proteína não é processada em uma amostra (vide (1) na Tabela 1), porém na outra amostra (vide (2) na Tabela 1) é processada in vivo na posição (Y) N-terminalmente do primeiro aminoácido clivável T1 para a etapa de clivagem/rotulagem. Os únicos sinais MS que são gerados após agrupamento e cromatografía podem corresponder ao peptídeo de terminal-N (A) da proteína intacta, ou ao término-N (A') ou ao término-N gerado recentemente (A"), resultante do processamento dentro de (A). O peptídeo A' não será isotopicamente rotulado, visto que seu término-C é gerado por processamento e não por clivagem na presença de H218O (desse modo assumindo-se que Y não é um sítio de clivagem para tripsina).

E observado que a chance de que após o processamento, como ilustrado em (2), o peptídeo (A') resultante do processamento de (A) esteja de fato ainda presente é pouca, mais particularmente quando o processamento é o resultado de uma aminopeptidase ou uma dipeptidase ou outra enzima que N- terminalmente cliva um peptídeo de 5 ou 10 aminoácidos ou menos.

Na segunda situação uma proteína não é processada em uma amostra (1) e é processada em outra amostra (vide (3) na Tabela 1) na posição T1, que é também um aminoácido clivável para a etapa clivagem/rotulagem. Neste caso também o peptídeo A processado será isotopicamente rotulado e peptídeos (A) aparecerão em suas duas formas isotópicas no espectro MS após agrupamento e cromatografía. O único pico que é notado no espectro MS corresponde ao novo peptídeo B de terminal-N da proteína processada. Na terceira situação uma proteína não é processada em uma amostra (1) e é processada em outra amostra (vide (4) na Tabela 1 e também a figura 3) em um peptídeo interno (B) na posição Ζ. A parte processada do peptídeo (Β), o peptídeo (B'), comporta-se como um peptídeo de terminal-C e é descartada durante a etapa de isolamento de peptídeos de terminal-N.

O único sinal MS, que aparecerá após agrupamento e cromatografia, corresponde ao peptídeo de terminal-N (B") da proteína processada.

A Tabela 1 ilustra o processamento in vivo de um peptídeo interno próximo ao término-N de uma proteína. O processamento pode, entretanto, ocorrer também em muitas proteínas ainda ao longe do término-N. Por exemplo, o processamento do fator Van Willebrand por Furin ocorre na posição 763 de uma proteína de 2813 aminoácidos.

Em teoria, cada proteína que é diferentemente processada entre duas amostras deve, contudo, revelar por MS um peptídeo de terminal-N na proteína não processada, do novo término-N gerado como um resultado do processamento da proteína. A determinação de seqüência do novo peptídeo de terminal-N revelará também o sítio de processamento da proteína. A seqüência de aminoácidos em torno do sítio de clivagem pode compreender um motivo que é reconhecido por certas proteases. Deste modo, a informação pode ser obtida próxima a protease (tipo de) que causou a clivagem.

Alternativamente, o processamento proteolítico pode conduzir à degradação da proteína processada, de modo que nenhum peptídeo de terminal-N é recuperado em absoluto para a proteína processada nesta amostra. Um único pico do término-N da proteína não-processada aparecerá por MS. Nesta situação a análise indica uma diferença no processamento, porém não revela em que posição da proteína o processamento ocorre.

No entanto, uma terceira possibilidade é que a ausência do peptídeo de terminal-N em uma das amostras seja causada por efeitos a jusante do processamento. Por exemplo, o processamento ineficiente de proteína pode conduzir a uma sinalização deficiente em um trajeto e subseqüentemente a diminuição ou ausência de transcrição e translação de genes que são controlados por aquele trajeto.

Quando proteínas desconhecidas são analisadas, elas não

podem ser excluídas, de modo que a presença de apenas um peptídeo de terminal-N é causada por mutações dentro do peptídeo de terminal-N dentro de uma das amostras ou por união alternativa que resulta no uso de ATG alternativo (a jusante ou a montante do gene iniciador normal). Nestes casos, diferentes peptídeos de terminal-N estão presentes nas duas amostras, que diluirão como diferentes frações durante a cromatografia e assim não serão analisadas em uma fração por MS.

Alternativamente, um peptídeo de terminal-N de uma proteína de uma amostra pode estar presente em uma quantidade menor ou maior, em comparação ao peptídeo de terminal-N de outra (ou o controle) amostra. Nesta situação, a diferença pode ser explicada por diferenças na estabilidade devido ao diferente processamento, diferenças no derrame ou diferenças na expressão genética, devido ao efeito a jusante do processamento proteolítico, como explicado acima. O uso de apenas duas amostras em que uma é rotulada com

-IQ β

O tem certas vantagens. O pool de peptídeos que são submetidos a purificação contém os peptídeos de terminal-N de todas as proteínas da amostra. As diferentes proteínas e peptídeos são então separados em frações antes de MS. Entretanto, um grande número destas proteínas não são processadas ou são processadas de um modo idêntico em ambas amostras. Todos os peptídeos de terminal-N destas proteínas (não processadas) aparecerão por MS como dois picos de aproximadamente a mesma intensidade e podem ser desprezados para outra análise. Entretanto, onde o objetivo do método é verificar um processamento conhecido de uma certa proteína, pode-se analisar especificamente aqueles picos que correspondem à massa do peptídeo de terminal-N predito de uma proteína processada intacta. Somente aquelas frações de peptídeos para as quais os dois picos (correspondendo aos peptídeos diferenciais e isotopicamente rotulados) têm uma diferença significativa em intensidade por MS (a relação entre os picos dos peptídeos isotopicamente rotulados é abaixo de 0,5 ou acima de 1,5), ou onde um dos dois picos está ausente (ou praticamente ausente, isto é, a relação entre os picos dos peptídeos isotopicamente rotulados é abaixo de 0,1 ou acima de 10 ou mesmo abaixo de 0,05 ou acima de 20), são indicativas de um processamento diferencial do peptídeo e assim são de interesse para outra análise. Portanto, formas de realização particulares da presente invenção abrangem um método para análise simultânea de duas amostras, em que, após clivagem e rotulação concomitante com um rótulo isotópico, as amostras são agrupadas, peptídeos de terminal-N são isolados e separados e analisados por MS e a seleção dos peptídeos pertinentes em MS consiste da identificação daqueles picos para os quais a relação entre os picos dos peptídeos isotopicamente rotulados é abaixo de 0,5 ou acima de 1,5.

Quando a rotulação dupla é realizada (isto é, combinação de rótulos isobáricos e rótulos O isotópicos), a fim de permitir a análise combinada de mais do que duas amostras, a análise MS somente diferenciará os dois grupos de proteínas isotopicamente rotuladas, cada um destes grupos compreendendo as proteínas das amostras diferentemente rotuladas com um rótulo isobárico. Portanto, a chance de que apenas um pico correspondendo a um isótopo seja observado em MS será menor (visto que requereria que em todas as amostras rotuladas com aquele isótopo o processamento daquela proteína fosse afetada). Contudo, as diferenças na intensidade relativa entre os dois picos gerados em MS são indicativas do fato que um dos peptídeos de uma forma isotópica está ausente ou presente em uma concentração mais baixa. De uma outra forma, na análise MS de um grande número de amostras agrupadas, a presença de dois peptídeos isotópicos de igual intensidade não significa que nenhum processamento da proteína pertinente ocorreu em qualquer das amostras, visto que os picos MS apenas proveem a intensidade acumulativa para os diferentes peptídeos rotulados com o mesmo isótopo.

Diferenças individuais podem ser compensadas por outras amostras ou podem deixar de ser notadas se uma amostra para cada um dos isótopos for similarmente afetada. Tal fenômeno pode ser evitado até certo ponto pelo projeto do experimento, mais particularmente a escolha do rótulo de isótopo para cada amostra. Por exemplo, quando uma protease é sabida estar ligada com câncer, um isótopo é usado para rotular uma amostra de um paciente afetado e uma cultura de células saudáveis, em que uma construção é transfectada que superexpressa a protease. O outro isótopo é usado para rotular um tecido de uma pessoa saudável e uma cultura de células saudáveis em que uma construção é transfectada com um inativo da protease como um controle. Estas diferenças de projeto em MS são mais provavelmente observadas quando diferentes processamentos proteolíticos ocorrem.

Onde a rotulação-dupla é realizada, os diferentes picos em MS correspondendo às diferentes amostras isotopicamente rotuladas são cada um ainda analisados por MS/MS para diferenciar outros, entre os peptídeos diferenciais isotopicamente rotulados. Em MS/MS um espectro será gerado dos diferentes grupos repórter gerados por CID. Outros métodos adequados para fragmentar peptídeos incluem CAD (dissociação ativada por colisão), ETD (dissociação de transferência eletrônica), ECD (dissociação de captura eletrônica), IRMPD (dissociação de multifóton infravermelho) e BIRD (dissociação radioativa infravermelha de corpo negro).

A ausência ou a diferença em concentração de um pico correspondendo ao grupo repórter de um certo peptídeo pode também ser indicativo de diferente processamento, diferente estabilidade e diferentes efeitos a jusante na amostra da qual o peptídeo origina-se, como explicado acima.

A este respeito, observa-se que um peptídeo de terminal-N,

que é derivado de um término-N bloqueado, não será rotulado em seu

término-N pelo rótulo isobárico e apenas transportará o rótulo isotópico sob a • 18

incorporação de O mediada por enzima. Diferentemente, os peptídeos isotópicos rotulados são separados durante MS. Entretanto, na MS/MS subsequente, nenhum dos grupos repórter será identificado.

A análise de trocas nos padrões de clivagem de proteínas são de valor na ligação de proteólise alterada com doença. Por exemplo, em um ensaio clínico, qualquer tipo específico de clivagem proteolítica, por exemplo, por um aspártico, cisteína, metalo, serina/treonina ou outro tipo de protease, pode ser determinada como descrito aqui, identificando-se os peptídeos de terminal-N por espectrometria de massa e quaisquer alterações nos padrões de clivagem observados durante o tempo podem ser acompanhadas. Os métodos da presente invenção são adequados para

identificar biomarcadores para monitorar a resposta terapêutica para o inibidor específico de protease, para selecionar e avaliar candidatos a medicamento em estudos pré-clínicos, para selecionar pacientes e suas respostas no desenvolvimento de medicamento clínico, para projetar inibidores de peptídeos para proteases específicas, para identificar novas proteases e ganhar conhecimento a cerca do mecanismo de etiologia da doença. Os métodos podem também ser usados para detectar a expressão ou função de proteína aberrante, devido a mutações genéticas que podem resultar na degradação proteolítica e subsequente geração de peptídeo. Alternativamente, os métodos da presente invenção são usados

para explorar o conjunto de substratos para uma protease selecionada, por exemplo, uma metaloprotease, de uma amostra. Aqui, um plasma ou extrato celular é incubado com uma protease e o(s) sítio(s) de hidrólise é/são determinados. Esta informação permite esperar os mesmos padrões de uma doença específica e usar a observação de um painel associado de peptídeos nas amostras para mostrar que a protease é regulada ascendentemente naquela doença. Além disso, informação concernente aos peptídeos do degradomo pode ser usada para examinar a patologia de uma amostra doentia pela determinação dos padrões de clivagem no tecido ou em um fluido e então usar aquela informação para identificar a protease. Alternativamente, os métodos da invenção são usados para identificar um conjunto de proteases reguladas ascendentemente ou descendentemente em uma doença específica ou condição.

A presente invenção provê instrumentos e métodos para a

identificação simultânea (por MS/MS) e/ou quantificação (por MS ou MS/MS) de peptídeos de terminal-N em diferentes amostras. Mais particularmente, os métodos da presente invenção referem-se à identificação de proteínas proteoliticamente processadas de diferentes amostras em MS e MS/MS, usando-se rotulação isotópica diferencial e opcionalmente rotulação isobárica adicional. Portanto, os dispositivos para realização dos métodos da presente invenção compreendem um ou mais instrumentos espectrométricos de massa.

As medições de massa por espectrometria são realizadas por ionização de analisados na fase gasosa. Um instrumento espectrométrico de massa típico consiste de 3 componentes, uma fonte iônica que gera íons das moléculas de interesse, um analisador de massa, que determina a relação de massa para carga (m/z) das moléculas ionizadas e um detector que registra e conta o número de íons para cada valor de m/z individual. Cada aspecto em um espectro MS é definido por dois valores, m/z e uma medida sobre o número de íons, que alcançaram o detector do instrumento.

A ionização de proteínas ou peptídeos para a análise de massa em um espectrômetro é geralmente realizada por Ionização de Eletro- Pulverização (ESI) ou Dessorção/Ionização Leiser Assistida por Matriz (MALDI).

Durante o processo ESI, analisados são diretamente ionizados fora da solução e ESI é, portanto, com freqüência diretamente acoplado a instrumentos de separação cromatográfica líquida (por exemplo, HPLC de fase inversa), MALDI vaporiza-se via amostras secas de pulsos leiser misturados com pequenas moléculas orgânicas iguais ao ácido cinâmico que absorve a energia do leiser para tornar o processo mais eficaz pela adição de pequenas moléculas orgânicas. MALDI-MS é usado normalmente para analisar misturas pépticas relativamente simples, visto que os sistemas MS de cromatografia-líquida integrados (LC-MS) são preferidos para a análise de amostras complexas.

O analisador de massa é um componente fundamental do espectrômetro de massa; os parâmetros importantes são sensibilidade, resolução e precisão de massa. Há cinco tipos básicos de analisadores de massa atualmente usados em proteômicos. Estes incluem o coletor de íon, tempo-de-voo (TOF), quadripolar, orbitrab e cicloton iônico de transformação Fourier (FTICR-MS). Tandem MS ou MS/Ms pode ser realizado no tempo (coletor de íons) e no lugar (com todos os instrumentos híbridos, tais como, p. ex., LTQ-FTICR, LIQ-Orbitrap, Q-TOF, TOF-TOF, coletor de íons linear/quadripolar triplo híbrido e quadrante triplo (QTRAP))

Os métodos da invenção ainda compreendem uma ou mais etapas de separação de peptídeos. Portanto, os dispositivos adequados para realizar os métodos da presente invenção opcionalmente contém ou são conectados a um ou mais instrumentos de separação adequados, tais como instrumentos de eletroforese, instrumentos de cromatografia, tais como, mas não limitados a instrumentos de eletroforese capilar (CE), instrumentos de HPLC-(RP) de fase inversa, e/ou instrumentos de cromatografia líquida bidimensional,...etc.

De acordo com uma forma de realização, os dispositivos da presente invenção (Figura 5), são adequados para análise de duas amostras de proteínas empregando-se rotulação isotópica (100') e compreendem duas fontes de amostra (101), unidade de modificação de proteína (103') com uma fonte de reagente de modificação (104'), uma clivagem e unidade de rotulação (105) com fontes 16O e 18O correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-N (106), uma unidade de separação (108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e um conjunto de circuitos de controle e unidade de análise de dados (110) acoplados a um sistema de leitura (111). Em formas de realização particulares, a unidade de separação (108) compreende dois sistemas de separação consecutivamente ligados (1108) e (2108), em que, por exemplo, (1108) é um sistema de cromatografia de troca de cátion e sistema de separação, (2108) é tipicamente um sistema de fase inversa de HPLC. O elemento de espectrômetro de massa (109) pode ser um espectrômetro MS porém é tipicamente um espectrômetro MS/MS que separa as formas isotópicas e em que o sequenciamento de peptídeo sob nova forma pode ser realizado. A análise MS/MS pode ser feita usando-se dois instrumentos fundamentalmente diferentes. No primeiro tipo de instrumento, o coletor de íon no qual a análise MS/MS é feita é o mesmo coletor de íon onde MS é realizada, porém MS/MS é feita no tempo (o coletor é preenchido, todos os íons são expelidos, exceto o(s) íon(s) de interesse) e CID é realizada, e os íons de fragmento são escaneados. O segundo tipo de instrumentos, instrumentos híbridos (triplo quad, q-tof, ltq-ftms, ltq-orbitrap), separam MS/MS em posição, por exemplo, seleção precursora é feita no primeiro analisador de massa e fragmentos são escaneados no segundo analisador de massa. O dispositivo de acordo com esta forma de realização pode ainda compreender um número de elementos opcionais, tais como uma unidade de preparação de amostra (102) em que, por exemplo, Iise de amostras e imunodepleção ocorrem. Opcionalmente, uma unidade de modificação adicional é incluída com uma correspondente fonte de reagente de modificação, que permite a modificação das Lisinas internas de função amina como descrito aqui. Esta unidade de modificação é colocada de modo que a modificação das amostras ocorra antes da clivagem de proteína.

Uma outra forma de realização dos dispositivos da invenção (100) é fornecida por análise por multiplexação de amostras de proteína usando-se rotulação dupla (Figura 5), compreendendo pelo menos duas fontes de amostra (101), uma unidade de primeira rotulação (103) com fontes de primeiro rótulo correspondentes (104), uma unidade de clivagem e unidade de segunda rotulação (105), com fontes de segundo rótulo correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-N (106), uma unidade de separação (108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e um conjunto de circuitos de controle e unidade de análise de dados (110) acoplados a um sistema de leitura (111). Em formas de realização particulares, a unidade de separação (108) compreende dois sistemas de separação consecutivamente ligados (1108) e (2108), em que, por exemplo, (1108) é um sistema de cromatografia de troca de cátion e sistema de separação, (2108) é tipicamente um sistema de fase inversa de HPLC. O elemento de espectrômetro de massa (109) é um espectrômetro MS/MS como descrito acima, em que adicionalmente nos métodos de rotulação dupla da presente invenção, os grupos repórter dos rótulos isobáricos gerados sob CID são diferentemente detectados. Este dispositivo pode ainda compreender um número de elementos opcionais, tais como uma unidade de preparação de amostras (102), em que, por exemplo, Iise e imunodepleção ocorrem. Similar ao dispositivo descrito acima, uma unidade de modificação adicional para a modificação da função amina de Lisinas é incluída.

Outro aspecto da invenção, assim, prove combinações de reagentes e kits compreendendo tais reagentes, adequados para a realização dos métodos da presente invenção.

De acordo com uma forma de realização, os reagentes 18

compreendem um conjunto de dois ou mais rótulos isobáricos e H2 O.

Opcionalmente, kits são fornecidos que incluem tanto reagentes como meios adequados que estão opcionalmente disponíveis para a realização das etapas de isolamento dos peptídeos de terminal-N. O último meio opcionalmente compreende cromatografia de fase sólida disponível, o que permite a remoção eficiente de peptídeos de terminal-C e internos das amostras individuais ou agrupadas.

Outros arranjos dos métodos, sistemas, dispositivos e kits abrangendo a invenção serão óbvios para aqueles hábeis na técnica.

Deve ser entendido que, embora as formas de realização preferidas, construções e configurações específicas, bem como materiais, tenham sido examinados aqui por dispositivos de acordo com a presente invenção, várias alterações ou modificações na forma e detalhes podem ser feitos sem desviar do escopo e espírito desta invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1: Rotulação isotópica de peptídeos de terminal-N

Duas amostras de proteína (1 e 2) são modificadas no término- N e na lisina com anidrido de ácido acético. Uma amostra é digerida com tripsina na presença de água normal (16). A outra amostra é digerida com

1 o

tripsina na presença de água com um isótopo O saudável (18).

Os peptídeos de ambas amostras são agrupados. Os peptídeos recentemente gerados de terminais-N no terminal-C e interno, são modificados com biotina e isolados por cromatografia por afinidade de avidina.

Os peptídeos de terminal-N são submetidos a cromatografia de

troca iônica e cromatografia de fase inversa. Cada fração de peptídeo é

16 · ' 18

analisada por MS, em que os peptídeos com isótopo O e isótopo O são separados. A relação de ambos os picos é calculada. A seqüência dos peptídeos é determinada por MS/MS. As seqüências são comparadas com seqüência de banco de dados para determinar eventual processamento proteolítico.

Exemplo 2: Rotulação dupla isobárica/isotópica de peptídeos de terminal-N

8 amostras (1 a 8) são rotuladas com 4 diferentes rótulos isobáricos (A a D) (como representado na Figura 4) no término-N das proteínas da amostra. As amostras rotuladas 1 a 4 e 5 a 6 são agrupadas. Um pool (1 a 4 amostras) é digerido com tripsina na presença de água normal (16). O outro pool (5 a 6 amostras) é digerido com tripsina na presença de água com um isótopo 18O saudável (18).

Os peptídeos são modificados com biotina e peptídeos internos e de terminal-C são isolados por cromatografia por afinidade de avidina.

Os peptídeos de terminal-N de todas as amostras rotuladas duplas são agrupados e submetidos a cromatografia de troca iônica e cromatografia de fase inversa. Cada fração de peptídeo é analisada por MS, em que os peptídeos com isótopo 16O e isótopo 18O são separados. Cada isótopo é subseqüentemente analisado por MS/MS, em que as diferentes formas isobáricas liberam o grupo repórter e em que a seqüência dos peptídeos é determinada. A concentração relativa dos diferentes peptídeos é calculada dos grupos repórter e isótopos individuais.

Claims (16)

1. Método in vitro para diferenças de investigação no processamento proteolítico entre duas ou mais diferentes amostras, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) modificar a amina de término-N e de Lisina das proteínas em ditas amostras, (b) clivar as proteínas modificadas em peptídeos e, simultaneamente, rotular cada uma das amostras com O ou 18O (c) isolar os peptídeos de terminal-N (d) agrupar as amostras rotuladas após a etapa (b) ou os peptídeos de terminal-N isolados da etapa (c), (e) submeter os peptídeos de terminal-N a MS, (f) selecionar frações de peptídeos pertinentes para outra análise, e (g) identificar peptídeos que são gerados por processamento proteolítico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender, após a etapa (d), a etapa de: submeter os peptídeos de terminal-N isolados a uma etapa de separação de peptídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a modificação ser realizada em cada amostra com um diferente reagente de rotulação isobárico compreendendo um grupo reativo amina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da clivagem na etapa (b) ser realizada com tripsina.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do isolamento de peptídeos de terminal-N ser realizado por uma etiqueta de afinidade covalentemente ligada ao término-N dos peptídeos internos e de terminal-C, e remover os peptídeos internos e de terminal-C das amostras por cromatografia por afinidade.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa (g) compreender analisar as amostras de proteína identificadas em MS/MS.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando duas amostras são usadas, a etapa de seleção da etapa (f) consistir da identificação daqueles picos para os quais a relação entre os picos dos peptídeos isotopicamente rotulados é abaixo de 0,5 ou acima de 1,5.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando duas amostras são usadas, a etapa de seleção da etapa (f) consistir da identificação daqueles picos para os quais a relação entre os picos dos peptídeos isotopicamente rotulados é abaixo de 0,1 ou acima de 10.

9. Uso do método como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de determinar sítios de clivagem proteolítica.

10. Uso do método como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de determinar efeitos a jusante de processamento proteolítico.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de uma ou mais das amostras de proteína serem amostras corporais de pacientes com tumor.

12. Kit de reagentes, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de dois ou mais reagentes de rotulação isobáricos e H2 O.

13. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ainda compreender meios para isolar polipeptídeos com um término-N livre.

14. Dispositivo (100') para análise de duas amostras de proteína usando-se rotulação isotópica, caracterizado pelo fato de compreender duas fontes de amostra (101), uma unidade de modificação de proteína (103') com uma fonte de reagente de modificação (104'), uma rotulação e unidade de clivagem de proteínas (105) e fontes de rótulo correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-(106), uma unidade de separação (108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e uma unidade de análise de dados (110).

15. Dispositivo (100) para análise por multiplexação de amostras de proteína usando-se rotulação dupla, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos duas fontes de amostra (101), uma unidade de rotulação (103) com pelo menos duas fontes de reagente de rotulação (104), uma rotulação e unidade de clivagem de proteína (105) e fontes de rótulo correspondentes (107), uma unidade de isolamento de peptídeo de terminal-(106), uma unidade de separação (108), uma unidade de espectrômetro de massa (109) e uma unidade de análise de dados (110).

16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma unidade de preparação de amostra (102).