CN101759794A - 分子设计的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白β亚基类荧光蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分子设计的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白β亚基类荧光蛋白、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体，其序列为序列1、序列2、序列3和序列4；并公开了融合链霉亲和素的荧光蛋白直接用于荧光免疫检测的方法；藻红蓝蛋白beta亚基保守的第153位半胱氨酸残基通过硫醚键不仅可以结合藻蓝胆素PCB，通过基因工程发现，藻红蓝蛋白beta亚基保守的第153位半胱氨酸残基通过硫醚键也可以结合藻红胆素PEB，得到一类新型的荧光藻红蓝蛋白，这类蛋白的光谱性质与结合PCB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白完全不同，有较高的荧光效率，同时由于带有His-tag标记，便于提纯，还有助于改善其溶解性，与链霉亲和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫荧光检测，有利于其在各个领域中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子设计的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白及其应用，属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体，以及利用此融合蛋白检测可溶性抗原或抗体的检测方法。
背景技术
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
可以从藻类中提取得到藻红蓝蛋白，并分离出其alpha和beta亚基，alpha亚基的80位半胱氨酸残基通过硫醚健共价结合藻蓝胆素PCB，beta亚基82位和153位半胱氨酸残基分别通过硫醚健共价结合藻蓝胆素PCB；也可以通过基因工程利用大肠杆菌进行生产。PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ，GlazerAN.Biosynthesis ofthecyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in aheterologous host.J Bacteriol.2002；184(17)：4666～4671)。PEC的beta亚基也可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产。我们发现，利用基因工程，不仅可以得到藻红蓝蛋白beta亚基153位结合藻蓝胆素PCB的荧光蛋白(其光谱图如图1所示)，同时还可以对其肽链氨基酸进行突变、进行有益的标记，更重要的是，我们可以得到一种结合藻红胆素PEB而不是结合藻蓝胆素PCB的荧光藻红蓝蛋白beta亚基(如图2、图3所示)。这种结合了PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白，由于结合了新的色素PEB，其荧光特性与天然的结合PCB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白有明显区别。
链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。本发明通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链霉亲和素和藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接；通过藻胆蛋白beta裂合酶能催化藻红胆素与藻红蓝蛋白亚基脱辅基蛋白及其同源蛋白质共价结合，从而生成具有优良荧光性质的链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质(其光谱如图4、图5所示)。此蛋白可直接应用于免疫荧光检测等领域。
免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，技术程序也还比较复杂。同时，由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
藻胆蛋白性质稳定，其荧光性质受到环境影响较小，适合作为荧光探针使用。本发明中的藻胆蛋白已经直接标记有链霉亲和素，利用间接检测法，通过生物素-链霉亲和素系统，利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白与生物素标记的抗抗体结合，从而实现对抗原的检测。生物素-链霉亲和素提高了检测的灵敏度，同时由于抗抗体的通用性，使本检测方法可以方便的用于各种抗原的检测；荧光藻胆蛋白具有优良的荧光性质，较高的荧光效率、较大波长的荧光发射峰，可以提高检测灵敏度，减少本底荧光的影响。本方法有利于荧光藻胆蛋白在免疫检测中应用的推广。
藻胆蛋白目前正逐渐在各种领域得到广泛应用，特别是在免疫荧光检测方面有很大的开发利用前景。通过改造后具有较高荧光效率、带有可利用标记的藻胆蛋白，会大大提升其在免疫荧光检测中的应用价值，这为藻胆蛋白在医药和生物工程领域的应用奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一类结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基、其与链霉亲和素形成的融合蛋白及其突变体的氨基酸序列，并标明其色素结合位点，同时提供利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白检测可溶性抗原或抗体的免疫检测方法。这类链霉亲和素标记的结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基具有与天然藻类中存在的藻红蓝蛋白beta亚基不同的结构，并且其荧光光谱性质也有极大区别，同时，提供了此类带有链霉亲和素标记的结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基用于检测可溶性抗原的方法：它是利用抗体与抗原特异性反应、链霉亲和素可以与生物素特异结合的原理，利用链霉亲和素标记的荧光藻胆蛋白检测可溶性抗原或抗体。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一类结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用藻红蓝蛋白beta裂合酶表达质粒以及藻红胆素PEB合成酶质粒，可以在大肠杆菌中合成结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，并且标明了其色素结合位点，该类蛋白质序列N端具有His-tag标记，但是His-tag标记不限于N端。
所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的蛋白质序列为序列1：
序列1：(第201位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点)
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所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在201位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用基因工程方法将其突变，可表达得到藻红蓝蛋白beta亚基突变体，对除结合色素的201外的所有位点进行突变一般不会对蛋白性质有较大的影响，属于同类蛋白，对此蛋白进行部分缺失，对蛋白性质无较大影响，也属于同类蛋白。
结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用基因工程方法把其第130位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第82位)半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基，可表达得到藻红蓝蛋白beta亚基突变体。
所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的突变体的序列为序列2：
序列2：(第201位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点，第130位丙氨酸A由C突变而来)
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所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在201位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因拼接后克隆于表达质粒，表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基的融合蛋白。
所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的蛋白质序列为序列3：
序列3：(第329位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点)
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所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，链霉亲和素在PecB的N端，但是不限于在N端。
所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在329位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因拼接后克隆于表达质粒，利用基因工程方法把其第258位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第82位)半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基，表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基的融合蛋白的突变体。
所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，的蛋白质序列为序列4：
序列4：(第329位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点，第258位丙氨酸A由C突变而来)
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所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，藻红胆素PEB通过硫醚键结合在329位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的应用，利用链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白检测可溶性抗原或抗体的免疫检测。
所述的免疫检测包括以下步骤：
(1)将可与固相结合并能识别抗原的第一抗体包被固相上，封闭液封闭未结合抗体部分，备用；
(2)将待测抗原、识别抗原的第二抗体、识别第二抗体的标记生物素的抗抗体、标记链霉素亲和素的荧光藻胆蛋白按一定步骤加入固相中，充分反应；
(3)利用微孔板荧光检测仪或其它相应的仪器检测荧光，分析结果。
本发明的有益效果是：结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基由于具有His-tag标记，便于提纯，且由于此蛋白是单一亚基构成，比具多个亚基的天然藻红蓝蛋白更具均一性；相比具有与结合PCB的藻红蓝蛋白beta亚基完全不同的光谱性质，其荧光效率高，用于免疫检测中有更好的灵敏度；与链霉亲和素形成融合蛋白后，实现了链霉亲和素直接标记，可以直接用于免疫检测中，不需要利用化学方法等进行链霉亲和素标记。
附图说明
图1：153位半胱氨酸残基结合PCB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白的吸收和荧光光谱图，其中实线为吸收光谱，虚线为荧光光谱；
图2：153位半胱氨酸残基结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白的吸收和荧光光谱图，其中实线为吸收光谱，虚线为荧光光谱；
图3：第82位半胱氨酸残基突变为丙氨酸后，153位半胱氨酸残基结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白的吸收和荧光光谱图，其中实线为吸收光谱，虚线为荧光光谱；
图4：链霉亲和素标记的153位半胱氨酸残基结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白的吸收和荧光光谱图，其中实线为吸收光谱，虚线为荧光光谱；
图5：第82位半胱氨酸残基突变为丙氨酸后，链霉亲和素标记的153位半胱氨酸残基结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白的吸收和荧光光谱图，其中实线为吸收光谱，虚线为荧光光谱。
蛋白质氨基酸序列附件：
序列1：(第201位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点)
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序列2：(第201位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点，第130位丙氨酸A由C突变而来)
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序列3：(第329位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点)
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序列4：(第329位半胱氨酸C为藻红胆素PEB的结合位点，第258位丙氨酸A由C突变而来)
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGMLDAFSRVVEQADKKGAYLSNDEINALQAIVADSNKRLDVVNRLTSNASSIVANAYRALVAERPQVFNPGGPCFHHRNQAAAIRDLGFILRYVTYSVLAGDTSVMDDRCLNGLRETYQALGTPGDAVASGIKKMKEAALKIANDPNGITKGDCSQLMSELASYFDRAAAAVA
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详述，但这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
蛋白质氨基酸序列如序列1所示，将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，表达得到藻红蓝蛋白beta亚基，其N端带有His-tag标记，这不仅有利于对其进行提纯，还有助于提高其溶解性。藻红胆素通过硫醚健结合在第201位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第153位)半胱氨酸残基上。其光谱如图2所示，吸收峰为547nm，荧光发射峰为566nm。
实施例2
蛋白质氨基酸序列如序列2所示，将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用基因工程方法对其进行突变，可表达得到藻红蓝蛋白beta亚基突变体，其N端带有His-tag标记，这不仅有利于对其进行提纯，还有助于提高其溶解性。藻红胆素通过硫醚健结合在第201位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第153位)半胱氨酸残基上。其光谱如图3所示，吸收峰为547nm，荧光发射峰为566nm。
实施例3
蛋白质氨基酸序列如序列3所示，将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因拼接后克隆于表达质粒，表达得到的链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基的融合蛋白，直接实现链霉亲和素对藻红蓝蛋白beta亚基的标记；且N端带有His-tag标记，这不仅有利于对其进行提纯，还有助于提高其溶解性。藻红胆素通过硫醚健结合在第329位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第153位)半胱氨酸残基上。其光谱如图4所示，吸收峰为547nm，荧光发射峰为566nm。
实施例4
蛋白质氨基酸序列如序列4所示，将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因突变体拼接后克隆于表达质粒，利用基因工程方法对其进行突变，表达得到的链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基突变体的融合蛋白突变体，直接实现链霉亲和素对藻红蓝蛋白beta亚基的标记；且N端带有His-tag标记，这不仅有利于对其进行提纯，还有助于提高其溶解性。藻红胆素通过硫醚健结合在第329位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第153位)半胱氨酸残基上。其光谱如图5所示，吸收峰为547nm，荧光发射峰为566nm。
实施例5
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，4℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL，取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，做九个平行样，另取三孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)每三个平行样为一组，分以下三种步骤完成：
第一种：①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至10μg/mL，取150μL加入到步骤①准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；③取标记链霉亲和素的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液稀释至10μg/mL，取150μL加入到步骤②准备的平行样及空白对照孔中，37℃孵育0.5小时；
第二种：①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，两个组分的终浓度分别都是10μg/mL，取上述溶液150μL加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，37℃孵育1.5小时；
第三种：取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体、生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体终浓度为2μg/mL，另外两个组分的终浓度分别都是10μg/mL；取上述溶液150μL加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，37℃孵育1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
实施例6
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，两组平行样分别4℃和37℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL，取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，做六个平行样，另取两孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)每一组平行样分别按以下步骤完成：
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，两个组分的终浓度分别都是10μg/mL，取上述溶液150μL加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，37℃孵育1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
实施例7
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，4℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL，取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，做二十七个平行样，另取九孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)每一组平行样分别按以下步骤完成：
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，两个组分的终浓度分别为：5μg/mL、5μg/mL，5μg/mL、10μg/mL，5μg/mL、20μg/mL，10μg/mL、5μg/mL，10μg/mL、10μg/mL，10μg/mL、20μg/mL，20μg/mL、5μg/mL，20μg/mL、10μg/mL，20μg/mL、20μg/mL，取上述溶液150μL分别加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，每一种浓度对应一组平行样，37℃孵育1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
实施例8
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，4℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL，取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，做六个平行样，另取二孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)每一组平行样分别按以下步骤完成：
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液或pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液)中，两个组分的终浓度分别为：生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体20μg/mL、标记链霉亲和素的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白10μg/mL，取上述溶液150μL分别加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，每一种溶液对应一组平行样，37℃孵育1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
实施例9
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，4℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL，取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，做九个平行样，另取三孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)每一组平行样分别按以下步骤完成：
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，两个组分的终浓度分别为：生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体20μg/mL、标记链霉亲和素的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白10μg/mL，取上述溶液150μL分别加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，三组平行样分别37℃孵育0.5小时、1小时、1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
实施例10
(1)将癌胚抗原CEA的小鼠单克隆抗体用包被缓冲液(0.05M、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到2μg/mL，取150μL加入黑色96孔酶标板，4℃包被12至20小时；倒去包被用的抗体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体；每孔加入封闭缓冲液(含1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)300μL，37℃封闭30分钟；倒去封闭液，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释到50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.562ng/mL、0.781ng/mL、0.390ng/mL，分别取150μL加入到步骤(1)准备好的酶标板微孔中，每个浓度做二个平行样，另取二孔直接加入稀释缓冲液作为空白对照，37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；
(3)按以下步骤完成：
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗体，用稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，取150μL加入到步骤(2)准备好的酶标板微孔中，做三个平行样以及空白对照；37℃孵育1.5小时，倒去液体，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体，备用；②取生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和标记链霉亲和素的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白混合加入稀释缓冲液(含0.1％牛血清蛋白的含0.05％Tween-20的pH7.2的PBS缓冲液)中，两个组分的终浓度分别为：生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体20μg/mL、标记链霉亲和素的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基荧光蛋白10μg/mL，取上述溶液150μL分别加入到步骤①准备的平行样及空白对照孔中，37℃孵育1.5小时；
(4)把步骤(3)所得酶标板倒去液体，用pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液洗涤酶标板，洗涤4次，甩干液体后，每孔加入150μL pH7.2的0.05M磷酸钾、0.5M NaCl缓冲液，置于微孔板荧光检测仪中检测荧光值。
上述蛋白中，His-tag标记和链霉亲和素标记所处的位置不限定位于蛋白N端，位于别的位置只要不影响藻红蓝蛋白beta亚基蛋白的活性也可以同样实施本发明。同时，除了153位半胱氨酸外，对藻红蓝蛋白beta亚基氨基酸序列进行的其余突变，若对藻红蓝蛋白beta亚基蛋白荧光性质无较大影响，也可同样实施本发明；对藻红蓝蛋白beta亚基氨基酸序列的N端或C端进行部分缺失，也不会对藻红蓝蛋白beta亚基蛋白荧光性质产生较大影响，也可同样实施本发明。
上述检测方法适用于利用各种不同抗体或抗原、不同固相载体、荧光检测仪器来检测可溶性抗原或抗体。但由于可能涉及的抗体种类及其繁多，藻胆蛋白种类也较多，本发明只选取癌胚抗原及其一种鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体、链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白beta亚基(82位半胱氨酸突变为丙氨酸)为例，在以96孔板为固相载体，利用微孔板荧光检测仪，对本发明加以说明。本领域内的技术人员可以根据上述公开的内容，材料其他材料和仪器，实施本发明。
Claims (17)
1.一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：藻红胆素PEB通过硫醚键结合在重组藻红蓝蛋白beta亚基的201位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
2.根据权利要求1所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：所述的蛋白质的序列为序列1。
3.根据权利要求1或2所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：所述的蛋白质序列N端具有His-tag标记，但是His-tag标记不限于N端。
4.根据权利要求1、2或3所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在201位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
5.一种结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用基因工程方法将其突变，可表达得到藻红蓝蛋白beta亚基突变体，对除结合色素的201外的所有位点进行突变一般不会对蛋白性质有较大的影响，属于同类蛋白，对此蛋白进行部分缺失，对蛋白性质无较大影响，也属于同类蛋白。
6.根据权利要求1所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：将藻红蓝蛋白beta亚基编码基因克隆于表达质粒，利用基因工程方法把其第130位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第82位)半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基，可表达得到藻红蓝蛋白beta亚基突变体。
7.根据权利要求6所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的突变体，其特征在于：所述的突变体的序列为序列2。
8.根据权利要求5、6或7所述的结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在201位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
9.一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因拼接后克隆于表达质粒，表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：所述的蛋白质的序列为序列3。
11.根据权利要求9所述的一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：链霉亲和素在PecB的N端，但是不限于在N端。
12.根据权利要求9、10或11所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白，其特征在于：所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在329位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
13.一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：将链霉亲和素编码基因和藻红蓝蛋白beta亚基编码基因拼接后克隆于表达质粒，利用基因工程方法把其第258位(相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基第82位)半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基，表达得到链霉亲和素和藻红蓝蛋白beta亚基的融合蛋白的突变体。
14.根据权利要求13所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：所述的蛋白质的序列为序列4。
15.根据权利要求13或14所述的链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白突变体，其特征在于：所述的结合藻红胆素PEB是指藻红胆素PEB通过硫醚键结合在329位，相当于原始藻红蓝蛋白beta亚基的153位。
16.结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的应用，其特征在于：利用链霉亲和素标记的结合藻红胆素PEB的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白检测可溶性抗原或抗体的免疫检测。
17.根据权利要求16所述的结合藻红胆素的藻红蓝蛋白beta亚基类荧光蛋白的应用，其特征在于：所述的免疫检测包括以下步骤：
(1)将可与固相结合并能识别抗原的第一抗体包被固相上，封闭液封闭未结合抗体部分，备用；
(2)将待测抗原、识别抗原的第二抗体、识别第二抗体的标记生物素的抗抗体、标记链霉素亲和素的荧光藻胆蛋白按一定步骤加入固相中，充分反应；
(3)利用微孔板荧光检测仪或其它相应的仪器检测荧光，分析结果。
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