CN101337986A - 人工重组的六联体蛋白a及其构建方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种人工重组的六联体蛋白A以及其构建方法与用途。本发明所述的一种人工重组的六联体蛋白A，具有如序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。本发明所述的重组的蛋白A，其活性超过已经报道的重组蛋白A和天然蛋白A的水平，而且产量高、纯化工艺相对简单，避免了天然提取蛋白的致病菌的危险，又能大规模生产。

Description

人工重组的六联体蛋白A及其构建方法与用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种人工重组的六联体蛋白A以及其构建方法与用途。

背景技术

蛋白A的发现从一开始就与IgG(免疫球蛋白G)相关联，早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀的物质。Jensen(1959)也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与糖相区别，Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A。1978年，有研究者将加热灭活并经福尔马林固定的金黄色葡萄球菌用于一种癌症的治疗，显示出一定的疗效，这是世界上第一次利用蛋白A的抗体吸附性治疗相关疾病的报道。Uhlen等在1984年阐明了蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。2003年，L.Yang等应用表面张力探针证明每个蛋白A分子可结合两个IgG分子。SPA基因的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列已有报道(Uhlén M，Guss B，Nilsson B，Gatenbeck S，Philipson L，Lindberg M.Complete sequence of thestaphylococcal gene encoding protein A.A gene evolved through multipleduplications.J Biol Chem.1984 Feb 10；259(3)：1695-702.)。

蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成(若加上氨基端信号肽序列则为1572个碱基)，共编码488个氨基酸，分子量约42KD。整个SPA分子包含六个结构域：E、D、A、B、C和X(从氨基端至羧基端)，其中，E、D、A、B、C这五个结构域均具备结合IgG的能力。X结构域的作用是将蛋白A嵌合入金黄色葡萄球菌的细胞壁。

蛋白A主要被应用于科研领域的抗体分离和纯化，其产品来源主要是从金黄色葡萄球菌中提纯而得到的天然蛋白A，例如，美国Sigma公司生产的天然蛋白A(进口SPA)。由于金黄色葡萄球菌是致病菌，且蛋白A在该菌体的含量并不高(约占细胞壁蛋白成分的6.7％)，因此，从发酵培养的金黄色葡萄球菌中提纯蛋白A的方法风险较大且难以满足大规模生产的需要。近年来，人们开始转向采用基因工程法来生产蛋白A，寻求既能避免致病菌的危险，又能大规模生产蛋白A的可行而有效的途径。

名称为“重组蛋白A基因及其表达产物的制备与应用”的中国发明专利申请(申请号：03105360.2，申请日：2003年2月26日，公开号：CN1432578，公开日：2003年7月30日)以及名称为“重组蛋白A基因及其表达产物的制备与应用”的中国发明专利申请(申请号：03149982.1，申请日：2003年8月1日，公开号：CN1524957，公开日：2004年9月1日)公开了一种化学合成的重组蛋白A，所涉及的重组蛋白A基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，各重组蛋白A基因单体间以AccI酶切位点相连，可插入表达载体pBV220中表达。该专利申请所构建的重组蛋白A为178个氨基酸。

名称“一种重组蛋白A基因及其表达产物的制备方法和用途”的中国发明专利申请(申请号：200710085148.X，申请日：2007年3月14日，公开号：CN101050464，公开日：2007年10月10日)公开了另一种化学合成的重组蛋白A，提供的重组蛋白A基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，各单体间以AccI酶切位点相连，可插入表达载体pET32a中表达。该专利申请所构建的重组蛋白A为180个氨基酸。

从已公开的上述专利申请看，他们都选择了用三个单体串联重组为蛋白A的方法，且都选择了同样的AccI酶切位点来连接，可在常见的表达载体如pBV220和pET32a中表达。尽管这两种重组蛋白的氨基酸残基数量比较接近，但它们的具体序列是有明显差别的。第三个专利申请的说明书中，可以看到该重组蛋白A与市售天然产品的性能比较；而在前两个专利申请的说明书中，则看不到有关比较的实验数据。本发明人基于对已申请专利的产品的对比研究，发现这些产品的性能实际上弱于天然产品，因而不能满足抗体分离纯化的应用要求，尤其是随着免疫吸附血液净化技术的快速发展，对蛋白A的抗体吸附性能提出了更高的要求。因此，如何使基因工程生产的重组蛋白A的活性达到甚至超过天然蛋白A的水平，仍然是摆在科研工作和产业应用面前的一道难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的人工重组的六联体蛋白A，其活性超过已经报道的重组蛋白A，并达到天然蛋白A的水平，而且产量高、纯化工艺相对简单。

本发明所述的一种人工重组的六联体蛋白A，具有如序列表中SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列。

本发明还提供了编码如权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A的基因。

本发明所述的基因，具有如序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

本发明还提供了包含如权利要求3所述的基因的重组表达载体。

本发明还提供了用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。

本发明所述的转化体，宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了所述的人工重组的六联体蛋白A的基因的构建方法，包括以下步骤：设计并合成三个单链DNA片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；将这三个片段互为引物和模板，通过聚合酶链反应获得所述重组蛋白A基因的结构单体；经酶切、连接而得到由6个所述结构单体组成的重组蛋白A基因。

本发明还提供了如权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A的制备方法，包括以下步骤：培养本发明所述的转化体，诱导表达重组蛋白A，再经加热处理和镍离子螯合层析纯化得到重组蛋白A。

本发明还提供了所述的人工重组的六联体蛋白A用于人血浆中抗体的吸附和清除的用途。

本发明还提供了一种免疫吸附填料，其含有：本发明所述的人工重组的六联体蛋白A；以及琼脂糖凝胶载体。

本发明所述的人工重组的六联体蛋白A，具有以下特点与优点：

本发明所述的重组蛋白A基因主要是由6个基因单体构成，该基因单体的碱基序列的设计来源于天然蛋白A的B结构域的编码序列。其中，第一个结构单体的氨基酸序列与B结构域完全相同；第二个结构单体的第一个氨基酸由丙氨酸突变成缬氨酸(与B结构域相比)，其余结构单体的第一个氨基酸均由丙氨酸突变成亮氨酸(与B结构域相比)。并且，重组蛋白A的羧基末端有8个组氨酸组成的标签，以便于该蛋白质的纯化。

由于天然蛋白A分子中的E、D、A、B、C这五个结构域均具备结合IgG的能力，并且从已经公开的天然蛋白A的氨基酸序列可以看出，这五个结构域的氨基酸序列具有相当高的同源性，如A、C结构域与B结构域分别具有89％和91％的同源性。其中，B结构域所包含的同源性序列比例最高，由此可以推测，在E、D、A、B、C这五个结构域中，B结构域具有最强的IgG结合能力。本发明采用了六个基于B结构域的单体进行串联，以获得具有更高IgG吸附活性的重组蛋白A，希望达到或超过天然蛋白A的活性。前述的在先申请中披露的重组蛋白A均由三个结构单体串联而成，撇开各自的氨基酸序列设计差异的不同，仅从单体串连的数目看，本发明所述的蛋白A的潜在活性已经优于已报道的重组蛋白A。在后面的实验中，本发明的技术效果得到了证实(具体见实施例5和实施例6)。

在本发明的一个实施例中，所述的重组蛋白A基因(命名为spa-b6)由6个重组蛋白A基因单体(命名为spa-b)串联而成，每个基因单体由人工合成的3个单链DNA引物片段(分别命名为B1，B2，B3)经PCR反应拼接而成。4个基因单体中，前2个通过SalI的酶切位点相连，其余通过SalI和XhoI(同尾酶)的酶切位点相连。其中第一个重组蛋白A基因单体的5’端加入序列GGGCCATGGGT，包括与表达载体pQE_TriSystemHisStrep1相连的NcoI酶切位点，最后一个重组蛋白A基因单体的3’端加入序列CTCGAGCCC，包括与表达载体pQE_TriSystemHisStrep1相连的XhoI酶切位点。

这里所采用的表达载体是pQE_TriSystemHisStrep1，该载体是德国Qiagen公司的商品化的pQE系列载体的一种，pQE系列载体属于pDS载体家族成员(Bujard，H.，Gentz，R.，Lanzer，M.，Stüber，D.Müller，M.，Ibrahimi，I.

M.T.，andDobberstein，B.(1987)A T5 promotor based transcription-translation system for theanalysis of proteins in vivo and in vitro.Methods Enzymol.155，416-433.)，在载体pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS的基础上构建而成(Stüber，D.，Matile，H.，and Garotta，G.(1990)System for high-level production in Escherichia coli and rapidpurification of recombinant proteins：application to epitope mapping，preparation ofantibodies，and structure-function analysis.In：Immunological Methods，Lefkovits，I.and Pernis，B.，eds.，vol.IV，Academic Press，New York，pp.121-152.)，其载体图谱和序列详见http://www1.qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx。

本发明也可采用其他表达载体，只需相应地调整与表达载体相连的酶切位点即可。

经测序，该基因由1080个脱氧核苷酸组成，编码360个氨基酸。该基因序列见序列表SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

附图说明

图1是重组蛋白A基因表达产物及其分离纯化的SDS-PAGE电泳图。图中，泳道1为低分子量蛋白标准，泳道2为细菌总蛋白，泳道3为超声破碎细胞的沉淀组分，泳道4为超声破碎细胞的上清组分，泳道5为加热处理的沉淀组分，泳道6为加热处理的上清组分，泳道7为穿流的蛋白组分，泳道8和泳道9为含100mmol/L咪唑的洗脱液组分。

图2是重组蛋白A与现有重组或天然蛋白A的活性测定结果图。

图3为血浆吸附图谱。

图4为血浆吸附的SDS-GAGE电泳分析结果，图中，泳道1是低分子量蛋白标准，泳道2是洗脱液成分，上下两条带分别是抗体的重链和轻链。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例一：重组蛋白A基因单体的获取

设计三条单链DNA引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5(见序列表)，交由专业公司合成，通过PCR反应进行拼接获得重组蛋白A基因单体，在该单体5’端含有BamHI酶切位点，3’端含有HindIII酶切位点，再通过酶切连接将该基因单体连接入载体pQE_TriSystemHisStrep1中，获得含重组蛋白A基因单体的重组载体pQE-spa-b。

实施例二：重组蛋白A基因的获取及含重组蛋白A基因的表达载体的构建设计第一对引物：

CL1：5’-gggCCATGGGTGcggataacaaattcaacaaag-3’

CL2：5’-cccGTCGACttttggtgcttgCgcatc-3’

设计第二对引物：

CL3：5’-cccGTCGACaacaaattcaacaaagaac-3’

CL4：5’-gggCTCGAGttttggtgcttgCgc-3’

用这两对引物分别扩增基因单体，扩增产物CL1-2的5’端和3’端分别具有NcoI和SalI的识别位点，CL3-4的5’端和3’端分别具有SalI和XhoI的识别位点。CL1-2和CL3-4经SalI酶切后进行连接，获得2个基因单体串联而成的重组蛋白A基因，命名为spa-b2。spa-b2经NcoI和XhoI酶切并与载体pQE_TriSystemHisStrep1连接，获得包含2个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b2。经SalI和XhoI酶切的CL3-4和经XhoI酶切的载体pQE-spa-b2连接，获得包含3个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b3。以此类推，可依次获得含4个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b4，含5个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b5以及含6个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b6。

上述含spa-b6的大肠杆菌表达载体由本发明制备的重组蛋白A基因(spa-b6)与大肠杆菌表达载体pQE_TriSystemHisStrep1构建而成，命名为pQE-spa-b6。

实施例三：能高效表达重组蛋白A的大肠杆菌重组株pQE-spa-b6-BL21(DE3)的构建

将重组载体pQE-spa-b6转化大肠杆菌BL21(DE3)，按常规方法筛选具有氨苄青霉素抗性的重组菌株pQE-spa-b6-BL21(DE3)。

实施例四：利用大肠杆菌重组株pQE-spa-b6-BL21(DE3)生产重组蛋白A

1)将甘油保种的工程菌株pQE-spa-b6-BL21(DE3)按体积比1∶100接入3mL LB培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇12h。

2)上述培养液按1∶100接入100mL LB培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇12h以进一步扩大培养。

3)上述培养液按1∶25接入2L加富培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇3.5h至OD600＝1.5。

4)加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃继续振摇5h。

5)10000g、10min离心收集细菌沉淀，细菌沉淀可放置于-20℃--80℃冰箱保存备用。

6)将上述细菌沉淀的重新混匀于100mL PBS溶液中，超声破碎细胞(相关参数为：超声时间4s，间隔时间4s，功率200W，总时间100min)。

7)10000g，15min离心，收集上清。

8)将上清溶液置于80℃水浴中加热45-60min，10000g，15min离心，上清作为下一步纯化的样品。

9)取Ni NTA Agarose(Qiagen公司生产)约7.5mL填装柱子，先后用5～10个柱床体积的双蒸水和PBS冲洗填料并平衡，将蛋白样品流经填料以吸附目标蛋白。

10)先以含20mmol/L咪唑的PBS冲洗填料至OD280不再下降，用含100mmol/L咪唑的PBS洗脱目标蛋白并收集。

11)含100mmol/L咪唑的PBS洗脱液经硫酸铵沉淀后可获得纯度在90％以上的SPA-B6蛋白。

重组蛋白A基因表达产物的鉴定：SDS-PAGE法，电泳图见图1。本发明的重组蛋白A在该菌株中以可溶形式表达，约占细菌总蛋白的30％，经纯化后蛋白纯度达到90％以上。

实施例五：重组蛋白A与现有重组或天然蛋白A的活性测定

1)分别将本发明的重组蛋白A(SPA-B6)、本元正阳基因技术有限公司生产的重组蛋白A(国产SPA)和美国Sigma公司生产的天然蛋白A(进口SPA)用包被液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH9.6)配成浓度依次为100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.25ng/mL，3.125ng/mL的溶液。

2)各取上述溶液100μL加入96孔板，阴性对照以包被液代替样品，空白对照除底物外，其余反应成分均不加入，每个浓度做2个重复。置于37℃ 1h。

3)甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液(含0.02％ Tween-20的PBS溶液)200μL，振荡3min，甩干，重复洗涤4次，最后一次彻底甩干液体。

4)每孔加入封闭液(含1％BSA和10％蔗糖的PBS溶液)100μL，置于37℃ 1h。

5)洗涤，步骤同3)。

6)每孔加入人IgG溶液(20μg/mL)100μL，置于37℃ 1h。

7)洗涤，步骤同3)。

8)每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀释20000倍)100μL，置于37℃ 1h。

9)洗涤，步骤同3)。

10)每孔加入TMB显色液(武汉博士德公司生产)100μL，置于37℃ 15min。

11)每孔加入终止液(2mol/LH2SO4)100μL，终止反应。

12)于酶标仪中测定A450。

检测结果表明，本发明的重组蛋白A对人IgG具有强吸附能力，其活性高于本元正阳基因技术有限公司生产的重组蛋白A，也高于美国Sigma公司生产的天然蛋白A。(见图3)

实施例六：重组蛋白A琼脂糖凝胶的制备

1)用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖在水介质中和20-60℃温度下反应2-6小时，用蒸馏水清洗至中性后抽干。

2)加入氨水，在40-60℃温度下反应4小时，冲洗干净后加入戊二醛反应2-4小时，用蒸馏水冲洗并抽干。

3)与本发明的重组蛋白A在4-25℃温度下反应16-24小时，加入硼氢化钠还原后用蒸馏水冲洗干净，即得到重组蛋白A琼脂糖凝胶。

实施例七：重组蛋白A琼脂糖凝胶的血浆吸附试验

1)将层析介质以6ml/min的流速装入层析柱中，填料高度5cm，用大量的平衡液以3ml/min的流速冲洗柱子。

2)用20g的人血浆以3ml/min的流速流经柱子，同时用核酸蛋白检测仪在280nm处对柱子的流出液进行监测。

3)用平衡液冲洗柱子，直到柱子的流出液的吸收值接近零点。

4)用洗脱液进行洗脱，待出现洗脱峰是开始收集洗脱液，直至吸收值回到零点附近。

5)用平衡液冲洗柱子，使pH回到中性。用储存液保存柱子于4℃。

6)收集的洗脱液准确称取质量之后，用可见-紫外分光光度计进行200-800nm全波段扫描，读出在A280nm左右的吸收值，并计算洗脱液中抗体的质量。

溶液组成：

平衡液：pH6.4-7.4的磷酸盐溶液

洗脱液：pH1-3的柠檬酸-氯化钠溶液

储存液：0.01％-1％的叠氮钠溶液

血浆吸附图谱见图3；SDS-GAGE电泳分析结果见图4，泳道一是低分子量蛋白标准，泳道二是洗脱液成分，上下两条带分别是抗体的重链和轻链。

结果表明，本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶对人血浆抗体的吸附载量可达到30mg/mL以上，高于市售Protein A Sepharose 4 Fast Flow的吸附载量(15-20mg/mL)，也高于专利(公开号：CN101050464)中重组蛋白A琼脂糖凝胶的吸附载量(25.1mg/mL)。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>广州康盛生物科技有限公司

<120>人工重组的六联体蛋白A及其构建方法与用途

<130>

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>360

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Gly Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Ash Ala Phe Tyr

1               5                   1015

Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe

            20                  25                  30

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala

        35                  40                  45

Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys

    50                  55                  60

Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro

65                  70                  75                  80

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp

                85                  90                  95

Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn

            100                 105                 110

Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln

        115                 120                 125

Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln

    130                 135                 140

Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

145                 150                 155                 160

Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

                165                 170                 175

Leu Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

            180                 185                 190

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

        195                 200                 205

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala AsnLeu Leu Ala Glu Ala

    210                 215                 220

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Asp Asn Lys Phe Asn

225                 230                 235                 240

Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

                245                 250                 255

Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro

            260                 265                 270

Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

        275                 280                 285

Gln Ala Pro Lys Leu Asp Asn Lys Phe As nLys Glu Gln Gln Asn Ala

    290                 295                 300

Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn

305                 310                 315                 320

Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu

                325                 330                 335

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Glu

            340                 345                 350

His His His His His His His His

        355                 360

<210>2

<211>1080

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgggtgcgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat      60

ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat ggtttcatcc aaagcctgaa agatgaccca     120

agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcgca agcaccaaaa     180

gtcgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct     240

aacttaaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagcc tgaaagatga cccaagccaa     300

agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cgcaagcacc aaaactcgac     360

aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct ttctatgaaa tcttacattt acctaactta     420

aacgaagaac aacgcaatgg tttcatccaa agcctgaaag atgacccaag ccaaagcgct     480

aaccttttag cagaagctaa aaagctaaat gatgcgcaag caccaaaact cgacaacaaa     540

ttcaacaaag aacaacaaaa tgctttctat gaaatcttac atttacctaa cttaaacgaa     600

gaacaacgca atggtttcat ccaaagcctg aaagatgacc caagccaaag cgctaacctt     660

ttagcagaag ctaaaaagct aaatgatgcg caagcaccaa aactcgacaa caaattcaac     720

aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatc ttacatttac ctaacttaaa cgaagaacaa     780

cgcaatggtt tcatccaaag cctgaaagat gacccaagcc aaagcgctaa ccttttagca     840

gaagctaaaa agctaaatga tgcgcaagca ccaaaactcg acaacaaatt caacaaagaa     900

caacaaaatg ctttctatga aatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat     960

ggtttcatcc aaagcctgaa agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct    1020

aaaaagctaa atgatgcgca agcaccaaaa ctcgagcacc accatcacca tcaccatcac    1080

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gcggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct    60

aacttaaacg                                                           70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

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ttaggtaaat                                                           70

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

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tgggtcatct                                                           70

Claims (10)

1、一种人工重组的六联体蛋白A，其特征在于：具有如序列表中SEQ IDNO.1所述的氨基酸序列。

2、编码如权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A的基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：具有如序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

4、包含如权利要求3所述的基因的重组表达载体。

5、用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。

6、根据权利要求6所述的转化体，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌。

7、如权利要求2所述的人工重组的六联体蛋白A的基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：设计并合成三个单链DNA片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；将这三个片段互为引物和模板，通过聚合酶链反应获得所述重组蛋白A基因的结构单体；经酶切、连接而得到由6个所述结构单体组成的重组蛋白A基因。

8、如权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养如权利要求6所述的转化体，诱导表达重组蛋白A，再经加热处理和镍离子螯合层析纯化得到重组蛋白A。

9、如权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A用于人血浆中抗体的吸附和清除的用途。

10、一种免疫吸附填料，其特征在于，含有：

根据权利要求1所述的人工重组的六联体蛋白A；以及

琼脂糖凝胶载体。

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