CN111167418B - 一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用，属于生物化工领域。本发明通过大肠杆菌重组质粒外源表达获得带有His‑tag的包涵体N‑Lg‑Flo1p，通过变性溶解及复性，经Ni‑NTA琼脂糖凝胶6FF纯化后，制得一种结合了N‑Lg‑Flo1p的新型亲和吸附剂，经检测其吸附甘露低聚糖的能力达到10.14mg/mL，为甘露低聚糖特异性吸附剂的工业化生产奠定了基础。

Description

一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用

技术领域

本发明涉及一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用，属于生物化工领域。

背景技术

酵母絮凝蛋白(Lg-Flo1p)是由酵母菌基因组中典型的含基因内重复序列的基因(统称为FLO基因家族)编码，由N端、C端和中间重复序列三个结构域组成的细胞壁蛋白，这些蛋白的C端以共价键连接到细胞壁上，暴露的N端则可与相邻酵母细胞壁的甘露糖残基特异性结合导致絮凝。

甘露低聚糖不被人体胃肠道消化，可以促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的特异性增殖并抑制有害菌的生长，减少有毒代谢产物的生成，改善人体肠道功能的作用，防止便秘，保护肝脏，抗肿瘤及增强免疫力，可用作食品或饲料添加剂。甘露低聚糖具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代的功能性食品。

目前，甘露低聚糖的生产方法主要包括从天然原料中提取、化学降解及生物降解。前两种方法的后期处理较为复杂，成本高，并且借助酸碱水解的化学法对环境的污染较大。生物降解的过程无毒且安全，反应条件温和。甘露低聚糖主要采用内切甘露聚糖酶水解甘露聚糖获得，但副反应较多，分离纯化有一定的困难，因此开发一种特异性吸附剂，将甘露聚糖酶解后的产物进行特异性分离，对单一甘露低聚糖的制备具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种以酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)为配基的新型亲和吸附剂，用于甘露低聚糖等功能性糖类物质的分离纯化。

本发明的第一个目的是提供一种亲和吸附剂，所述吸附剂是以酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)为配基，与琼脂糖凝胶结合得到的。

在一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶为Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF或CNBr活化的琼脂糖凝胶4B。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)携带6×组氨酸标签。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p是从重组大肠杆菌中表达得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种以N-Lg-Flo1p为配基的亲和吸附剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将含有Lg-Flo1p的N端基因序列的重组质粒在大肠杆菌中进行表达，获得外源包涵体N-Lg-Flo1p，并对其进行变性溶解及复性；

(2)吸取Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF 1mL装柱子，用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl、0.2mMNaCl)平衡10个柱体积；

(3)将N-Lg-Flo1p复性液(已测定蛋白含量)加入到吸附柱中纯化，用5倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，收集洗涤液，直到没有蛋白流出，获得。

本发明的第三个目的是提供一种采用上述亲和吸附剂吸附甘露低聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)将结合了N-Lg-Flo1p的Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF 1mL，加入到含有甘露低聚糖的溶液中，在转速为80～100r/min振荡0.5～1.5h；

(2)将吸附剂装柱，用含有0.2M NaCl、pH4.5的20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集甘露低聚糖。

在一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：

(1)取上述结合了N-Lg-Flo1p的Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF 1mL，加入到含有50mg甘露低聚糖的吸附缓冲液(20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、2mM CaCl₂)中，在转速为100r/min的摇床上振荡1h；

(2)将吸附剂装柱，用含有0.2M NaCl、pH4.5的20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集甘露低聚糖。

本发明还要求保护由上述亲和吸附剂制备的甘露低聚糖。

本发明还要求保护上述亲和吸附剂在制备食品或饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过大肠杆菌重组质粒外源表达包涵体N-Lg-Flo1p，通过复性、纯化得到N-Lg-Flo1p的产量为25mg/L发酵液，与酵母重组质粒外源表达相比提高了8-16倍。将纯化过程中得到的结合了N-Lg-Flo1p的Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF作为一种新型亲和吸附剂，用于纯化含有甘露糖基的糖类。经检测其吸附甘露低聚糖的能力达到10.14mg/mL吸附剂，与其他技术相比，将甘露低聚糖的吸附量增加了2倍。该技术可以将N-Lg-Flo1p的纯化与吸附剂的制备同时完成，效率较高，甘露低聚糖的洗脱过程中N-Lg-Flo1p配基不会脱落。还可以用含咪唑的洗脱缓冲液将N-Lg-Flo1p洗脱，Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF可继续用于其他带有His-tag蛋白的纯化。

具体实施方式

实施例1重组大肠杆菌表达外源N-Lg-Flo1p

基于酵母絮凝的理论，将酵母细胞外壁絮凝蛋白的N端在大肠杆菌中进行外源表达，并以此为配基，制备分离甘露低聚糖等功能性糖类物质的亲和吸附剂。具体步骤如下：

(1)合成SEQ ID NO.1所示的编码N-Lg-FLO1的基因，将该基因连接到pET21b(+)载体NdeI和XhoI之间，在大肠杆菌中诱导表达，筛选阳性克隆，接种至含50μg/mL的LB培养基中，37℃、200r/min培养12h，以1％的接种量转接至含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200r/min培养至对数生长期(OD₆₀₀值达0.6)，采用终浓度0.2mmol/L IPTG在37℃、200r/min诱导8h，目的蛋白以包涵体的形式存在于胞内。

(2)收集步骤(1)得到的重组大肠杆菌细胞，超声破碎，离心收集沉淀，用包涵体洗涤液(含有2M尿素、50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0)洗涤2次，离心弃上清。

(3)将步骤(2)的包涵体沉淀加入适量包涵体溶解液(8M尿素、50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH8.0)，在磁力搅拌器上冰浴搅拌3h，12000rpm离心10分钟，取上清，测蛋白浓度及SDS-PAGE。

(4)取1体积步骤(3)制备的蛋白变性液分3次(每次1/3体积，每次间隔6h)加入到8体积复性缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1M尿素，0.5M L-Arg，2mM GSH，0.5mM GSSG，pH8.0)中，迅速混匀(蛋白液：复性液比例为1:8)，4℃冰浴复性。最后一次1/3体积加入后，4℃静置复性12h。

(5)将步骤(4)的复性蛋白液装入透析袋置于透析液(50mM Tris-HCl、150mMNaCl、5％甘油pH8.0)中透析24h，期间更换2次透析液，使用搅拌器加速透析。

(6)取出透析袋，置于培养皿中，覆盖PEG20000粉末，在冰上低温浓缩。待透析袋中液体体积减至10mL左右，将蛋白液转入离心管中，12000rpm离心10分钟，上清即为复性好的蛋白。测定复性率为51％。

(7)包涵体形式表达的目的蛋白含量多，纯度高且便于提取。最终1L发酵液可以纯化得到25mg N-Lg-Flo1p。

实施例2以酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)为配基的亲和吸附剂制备

取实施例1制备的N-Lg-Flo1p复性液8mL(测得含N-Lg-Flo1p蛋白16.5mg)，经Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF亲和柱纯化，用5倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，收集洗涤液，直到没有蛋白流出，用Q5000超微量核酸蛋白测定仪测定杂蛋白及未结合的N-Lg-Flo1p含量，计算得到N-Lg-Flo1p在Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF上的吸附量为12.1mg/mL。从而获得以N-Lg-Flo1p为配基的亲和吸附剂。

实施例3用N-Lg-Flo1p-Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF亲和吸附剂吸附甘露低聚糖

取N-Lg-Flo1p-Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF亲和吸附剂1mL，加入到含有50mg甘露低聚糖的10mL吸附缓冲液(20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.5，其中含有0.2mol/L NaCl，2mmol/L CaCl₂)中，在转速为100r/min的摇床上振荡1h。将亲和吸附剂装柱，用含有0.2M NaCl、pH4.5的20mM Tris-HCl缓冲液洗脱5个柱体积，收集甘露低聚糖。用蒽酮比色法测定洗脱液中甘露低聚糖的含量，计算吸附量为10.14mg/(mL吸附剂)。

实施例4：

具体实施方式同实施例2和3，区别在于，将Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF替换为CNBr活化的琼脂糖凝胶4B。称取纯化的N-Lg-Flo1p 15mg，溶解于10mL、pH8.0的0.1mol/L Na₂CO₃缓冲液中，与1mL CNBr活化的琼脂糖凝胶4B偶联，将偶联后的填料装柱子，用5倍体积的0.5mol/L的NaCl溶液洗柱，收集洗涤液，测定偶联量为10.5mg N-Lg-Flo1p/mL。用此N-Lg-Flo1p为配基的亲和吸附剂吸附甘露低聚糖，所得甘露低聚糖的含量为8.55mg。

对比例1：

具体实施方式同实施例1，区别在于，目的基因多了蛋白N端信号肽对应的DNA序列，且连接到pET28a(+)载体上，变性液先经Ni-NTA柱纯化，目的蛋白纯度为90％，目的蛋白收率为88％。再将目的蛋白变性液进行复性，测定复性收率为2％。最终1L发酵液可以纯化得到0.75mg N-Lg-Flo1p。

对比例2：

具体实施方式同实施例3，区别在于，将N-Lg-Flo1p-Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF亲和吸附剂替换为ConA-琼脂糖凝胶4B吸附剂，所得甘露低聚糖的含量为3.3mg/mL吸附剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcacccagg cgtgcctgcc ggttggtagc cgtaagaacg gcatgaacgt gaacttctat 60

aaatacagcc tgcaggatag caccacctat agcgacccgc aatacatggc gtataagtac 120

agcgatacca agaaactggg tagcgttagc ggccagaccc acctgagcat ctactatggt 180

ccgaacaccg cgttctggaa caccgcgagc tggagcagcg acctgttcgg cttttatacc 240

accccgacca acgtgaccgt tgagatgacc ggttattttc tgccgccgca aaccggcagc 300

tacaccttca aatttgcgac cgttgacgat agcgcgatcc tgagcgtggg tggcagcatt 360

gcgtttgagt gctgcgcgca ggaacaaccg ccgatcacca gcaccgactt caccatcaac 420

ggtattaaac cgtgggatgc ggcggcgccg accgacatta aaggtagcac ctatatgtac 480

gcgggctact attacccgat caagatcgtg tacagcaacg cgaaagttct ggcgcgtctg 540

ccggtgagcg tggttctgcc ggatggtacc gaggttaacg acgatttcga aggctacgtg 600

tacagctttg acgatgacct gagccaaagc aactgcacca ttccggaccc gagcaagcac 660

acc 663

Claims (5)

1.亲和吸附剂在吸附甘露低聚糖中的应用，其特征在于，所述亲和吸附剂以酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p为配基，与琼脂糖凝胶结合制备而成；所述琼脂糖凝胶为Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF或CNBr活化的琼脂糖凝胶4B。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p携带6×组氨酸标签。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p通过微生物表达；编码所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种吸附甘露低聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将结合了N-Lg-Flo1p的Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF，加入到含有甘露低聚糖的溶液中，在转速为80～100r/min振荡0.5～1.5h；

(2)将吸附剂装柱，用含有0.2M NaCl、pH4.5的20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集甘露低聚糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含有甘露低聚糖的溶液中甘露低聚糖含量为20～100mg。