CN104946705A - 一种连续化生产c-di-AMP的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种采用固定化DisA蛋白连续生产c-di-AMP的方法。该方法步骤：1、DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；2、重组质粒转化，CBM-DAC融合蛋白的表达；3、一步纯化和固定化DAC酶；4、连续化生产c-di-AMP；5、反应产物分离浓缩与纯化。本发明特异性的利用了CBM结构域与纤维素结合但无水解功能的特点，工艺较为成熟，生产成本低廉，环境友好，所制备的DAC酶类型多样，来源广泛，而且浓度、纯度较高，酶促反应效率较高，因而具有较好的开发应用价值。

Description

一种连续化生产c-di-AMP的方法

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种采用固定化DisA蛋白连续生产c-di-AMP的方法。

背景技术

环腺苷二磷酸（Cyclic 3’，5’-diadenosine monophosphate，c-di-AMP）是近几年在细菌和古菌中发现的一种新型的第二信使。作为一个在原核微生物中广泛存在的信号分子，它是细胞生长的必需因子，不仅参与细胞壁合成、细胞形态的控制、细菌DNA的损伤性修复，而且与细菌对抗生素的抗性、病原细菌的致病性相关； c-di-AMP还能刺激真核宿主细胞产生免疫应答，介导宿主产生干扰素，增强机体非特异性免疫的防御能力。然而，目前对于c-di-AMP的作用机制研究还处于起步阶段，是近几年研究的热点，导致科研市场对纯品的c-di-AMP有较大的需求。另一方面，最新研究表明，c-di-AMP可以作为一种小分子免疫佐剂，能够强烈和长期持续刺激机体产生免疫应答，因此，它在疫苗佐剂的市场也存在巨大的潜力。有文献报道可以通过化学法在使用对甲氧基保护的亚磷酰胺固相支持物表面合成c-di-AMP，但因工艺复杂、回收率低、环境不友好和成本过高等问题，难以规模化工业生产。

c-di-AMP合成酶（dia-denylate cyclase，DAC）在三域生命系统中几乎都存在，可以在体外将两分子的ATP合成一分子c-di-AMP，同时生成一分子焦磷酸（图1）。最近一篇文献中Cao Zheng等(Enzyme and Microbial Technology（52）2013，319-324)证实：在大肠杆菌中表达带有组氨酸标签的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的DisA 蛋白，具有DAC功能，从50mL反应体系中检测到100mg的c-di-AMP产物。然而，该研究对产物的分离提纯工艺并未进一步研究，限制了其在规模化生产中的应用。另外一项国际专利：WO2013/066264 A1（Enzymatic synthesis of cyclic and linear diadenosine monophosphate）提出使用来源于Methanocaldococcus jannaschii 和Geobacillus thermodenitrificans 的两个具有DAC功能的耐热蛋白生物催化合成c-di-AMP，同时生产焦磷酸。

然而，以上生物催化合成工艺中，几乎使用的都是异源表达的游离酶，催化一次合成反应之后即被灭活，利用率不高；另外，在宿主细胞中表达之后，要先分离出纯酶，在分离纯化的过程由于存在蛋白酶等因素会使酶的量和活性受到影响。总之，至今为止，c-di-AMP酶法生物合成仍然存在成本高、工艺复杂和商业化生产可行性不强等现状，因此，此类方法还有很大的技术革新的空间。CBM（Cellulose Binding Motif）是一类大多数纤维素酶含有的不具有催化功能的结构域，由30-240个氨基酸组成，能够特异性吸附于纤维素表面但无水解活力。CBM 在生物工艺学上有潜在的应用价值，可以用基因工程的方法把 CBM 与目的蛋白融合在一起，从而使融合蛋白或酶能特异地连到廉价而形式多样的纤维素基质上，从而实现酶的纯化与固定化。Hehuan Liao等(Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-011-3458-1) 将第三家族的CBM与多聚磷酸化葡萄糖激酶在大肠杆菌中进行融合表达，使用处理过的微晶纤维素吸附固定化后，成功催化了6-磷酸葡萄糖的合成，并且可以重复使用多次。然而，目前针对CBM与DAC的融合表达与生物催化合成c-di-AMP的相关研究报道并不多，更未进行工业化应用。本发明针对这一问题，提出了一步纯化和固定化二腺苷酸环化酶方法，简化了工艺同时降低生产成本。

发明内容

本发明通过基因工程技术手段，通过对DisA基因的改造，使其在细胞表达后能够进一步被固定化，从而便于连续化生产c-di-AMP，从而降低c-di-AMP的生产成本。

本发明所采取的技术方案如下。

一种连续生产c-di-AMP的方法，包括以下步骤：

（1）DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；

所述DisA基因编码蛋白包括：

具有合成c-di-AMP功能的DAC，如：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的DisA蛋白(GenBank: CP003695.1)或苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的DisA蛋白(GenBank: ADH04898.1)；其他具有合成c-di-AMP功能的DAC，主要是原核微生物DisA蛋白(Oppenheimer- Shaanan, et al., EMBO Rep., 2011，12, 594–601)，其氨基酸序列与编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的DisA蛋白具有65%以上同源性，且单个亚基具有螺旋-发卡-螺旋的结构特征；

另外如，具有同时合成c-di-AMP、cGAMP和c-di-GMP功能的DAC，如：霍乱弧菌（Vibrio cholerae）Dnc V蛋白(UniProtKB: Q9KVG7.1)也可在本发明中应用；

所述cbm基因序列，使用来源于第三家族的cbm序列，由480个碱基组成，编码160个氨基酸，属于热线梭菌（Clostridium thermocellum）中编码cipA基因的一部分，GenBank: HF912724.1；

cbm基因片段可由原材料质粒自带；所述原材料质粒为：pCG质粒（Nat. Commun.，2014，5，3026）；

所述重组质粒载体构建过程为：

第一，设计引物，采用PCR扩增或全基因人工合成技术得到具有DAC功能活性的基因序列，如：枯草芽孢杆菌DisA；

第二，将DisA基因序列与pCG质粒进行改造和重组，构建pCG-DisA重组质粒载体；

具体为，将pCG质粒上编码cbm结构域基因与编码绿色荧光蛋白（gfp）基因片段相连接；同时将DisA基因序列两端分别加上XhoΙ和BamHΙ酶切位点；

由于在连接处编码绿色荧光蛋白（gfp）基因上游存在XhoΙ酶切位点，而在编码绿色荧光蛋白（gfp）基因下游存在BamHΙ酶切位点，因而可使用XhoΙ和BamHΙ对原pCG质粒进行双酶切；

对连接有绿色荧光蛋白（gfp）基因的pCG质粒和增加酶切位点后DisA基因分别采用XhoΙ和BamH进行双酶切，回收双酶切产物，并进行连接，即可构建pCG-DisA重组质粒载体；

亦可采用You等（DNA Cloning and Assembly Methods，Humana Press，2014，183-192）提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒pCG-DisA；

pCG-DisA重组质粒载体构建示意图如图2所示；

所述pCG质粒为美国弗吉尼亚州理工大学Y.-H. Percival Zhang教授友情赠送（Nat. Commun.，2014，5，3026）；

（2）重组质粒转化，CBM-DAC融合蛋白的表达；

将重组质粒载体pCG-DisA转入感受态宿主细胞E. coli Rosetta或BL21中，挑选阳性重组子于LB培养基中25~37℃培养，待吸光值A₆₀₀达到0.6~0.8时，使用0.05~1 M的 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）或乳糖，16~30℃诱导16~24h，离心收获菌体细胞；

（3）一步纯化和固定化DAC酶；具体步骤如下：

第一，根据文献（Nat. Commun.，2014，5，3026）提供的方法用磷酸对微晶纤维素进行预活化和重生；所述微晶纤维素优选粒径在10~100μm；具体为：

称取100~200g 微晶纤维素（Aladdin，C104843-250g），溶于0.3~0.6L去离子水中，充分混匀；

加入5~10L预冷的磷酸，边加边搅拌混匀，出现澄清；

冰上放置1~2h，每隔10min搅拌一次；然后加入20~40L预冷去离子水，边加边搅拌，此时出现白色沉淀；4℃，5000 r/min离心10~20min，弃上清，再用预冷的去离子水重悬，重复四次；

加入0.2~0.5L 2M的Na₂CO₃，充分混匀，中和磷酸；

加入20~45L预冷的去离子水，重悬沉淀，4℃，5000 r/min离心20min，弃上清；重复2~3次，直到微晶纤维素的pH值在5~7之间，4℃保存备用；

第二，破碎细胞，例如用超声波或其他细胞破碎仪对步骤（2）收获细胞进行破碎，8000~10000转/min，4℃条件下离心弃沉淀；具体地，例如，向收集的诱导表达的菌体中加入10~300mL PBS重悬，加溶菌酶(终浓度为1 mg/mL)和PMSF（终浓度为1mM）室温孵育1h后，低温超声波破碎菌体(超声时间8 s，间歇10 s，200次)；4℃，10000 r/min离心20min，取上清；

第三，将第一步中处理好微晶纤维素与第二步所收集上清液混合，室温结合20~30min；然后4℃、6000 r/min离心5min，弃上清；

加入20~30mL 50mM的Tirs-Hcl（PH=8.5）重悬，充分混匀后，4℃、6000 r/min离心5min，弃上清；重复3~5次，洗掉非特异性结合的蛋白；

处理完成后所得产品即为含有固化DAC的液体酶或固体粉末，可进行液态保藏或低温冷冻干燥后保藏；

需要注意的是，液态保藏或低温冷冻干燥之前需添加保护剂：蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种按照一定比例的混合物；

对于微晶纤维素所吸附蛋白进行检测时，可直接取取带有目的蛋白的微晶纤维素，加入等体积2×SDS蛋白上样缓冲液后，99℃煮沸10min；12%的SDS-PAGE胶检测即可；

需要强调的是，本发明中DAC酶采用微晶纤维素进行固定，而由于所表达的DAC酶含有CBM结构域，因而可特异性吸附于任何含有不溶性纤维素的相关材质上，包括含有纤维素或纤维素为主要成分的膜材料上；

（4）连续化生产c-di-AMP；

酶反应体系设置如下：

步骤（3）中固定化定化DAC的微晶纤维素（每g微晶纤维素固定约250mg蛋白质），456~2280 mg；

底物，ATP 10~100 mM；

40~100 mM HEPES或300~700 mM CHES缓冲液；

5~30 mM Mg²⁺；

30~65℃，反应1~4h；

该生物转化过程可以在保温容器（如反应釜）中进行，也可以将含有固定DAC酶的微晶纤维素装填成可保温的酶柱中进行；

（5）反应产物分离浓缩与纯化；

反应产物即c-di-AMP的分离及纯化工艺原理如图3所示，具体包括以下步骤：

第一，步骤（4）酶促反应结束后，8000~10000转/min离心回收含有固定DAC酶的微晶纤维素，同时得到澄清反应液；将所得澄清反应液煮沸5~30min，8000~12000转/min离心，收集上清；

 第二，将第一步所收集上清液经膜分离器超滤，分离出残留的大分子蛋白、无机盐等杂质；再将超滤之后液体送入纳滤器进一步浓缩，脱盐除杂；

所述超滤采用美国GE公司的三层超滤复合膜，该膜切割分子量为1000~3000道尔顿，工作压力为1.5~3.0 Mpa，小于膜切割分子量的目的产物c-di-AMP（692~727道尔顿）透过该膜；未透过膜的为大分子量的蛋白等，通过超滤器的浓水口收集；

所述纳滤采用美国GE公司的三层纳滤复合膜，该膜切割分子量为150~300道尔顿，工作压力为1.0~2.5 Mpa，小于膜切割分子量的目的产物c-di-AMP（692-727道尔顿）无法透过该膜，而无机盐、水、PPi、ATP等小分子透过膜，目的产物c-di-AMP留在浓缩液中收集；

第三，用20~40%的氨水将钠滤之后的浓缩液调至碱性pH=9.1~12.5；

第四，使用减压蒸发装置蒸馏至液体为粘性，进一步使用乙醇丙酮有机溶剂（体积比1:1）抽提产物，洗涤后离心，将所得固体溶解到少量的0.1-2%氨水中，冷冻干燥；最后所得的产品即为c-di-AMP二铵盐。

CBM（Cellulose Binding Motif）结构域是一类大多数纤维素酶具有的能够结合纤维素表面但无水解功能的结构域，由30~240个氨基酸组成。本发明特异性的利用了CBM结构域与纤维素结合但无水解功能的特点，通过基因工程技术将DisA基因与cbm基因连接构建重组质粒表达载体，所表达DAC由于具有CBM结构域，因而能够固定于纤维素表面，实现DAC的固定，从而便于连续化生产d-di-AMP，从而降低d-di-AMP的生产成本。

总体而言，本发明生产工艺较为成熟，生产成本低廉，环境友好，所制备的DAC酶类型多样，来源广泛，而且浓度、纯度较高，酶促反应效率较高，因而具有较好的开发应用价值。

附图说明

图1为连续化合成c-di-AMP的技术原理和路线；

图2为cbm标签与DisA融合基因重组质粒表达载体构建示意图；

图3为c-di-AMP 分离纯化技术示意图；

图4为蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果，其中M：蛋白marker；1～2：CBM-BsDisA；

图5为固定化酶催化ATP合成c-di-AMP结果（标准品与液相图）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

本实施例以枯草芽孢杆菌DisA为例，对于DisA-CMB基因重组及重组表达质粒构建、DisA-CMB蛋白表达和纯化简要介绍如下。

（1）DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；pCG-DisA重组质粒载体构建示意图如图2所示；具体包括以下步骤：

第一，根据已知DisA基因序列设计引物，采用PCR扩增或全基因人工合成技术得到相应DisA基因序列；具体而言，根据枯草芽孢杆菌的DisA基因的序列以及pCG质粒的结构特点，上游加上XhoI，下游加上BamHI两个酶切位点，设计上下游引物序列如下：

F引物：CCGCTCGAG ATGGAAAAAGAGAAAA AAGGGGCGAAACAC；

R引物：CGCGGATCCT CACAGTTGTCTGTCTAAATAATGCTTCTCTTG；

引物由上海生工生物工程有限公司合成，并进行特异性检测。

PCR反应体系设置如下：

rTaq聚合酶，25μL；

F（10pmol/μL），2μL；

R（10pmol/μL），2μL；

枯草芽孢杆菌基因组DNA，200ng；

ddH₂O，补足50μL。

PCR反应程序：95℃ 5min；95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 1min；20s；72℃ 10 min；4℃停止，35循环。

第二，将枯草芽孢杆菌DisA基因序列与pCG质粒（质粒本身含有cbm基因）连接构建pCG-DisA重组质粒载体，构建方法采用先限制性酶切后连接技术或采用You等（DNA Cloning and Assembly Methods，Humana Press，2014，183-192）提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；

本发明中所述pCG质粒为美国弗吉尼亚州理工大学Y.-H. Percival Zhang教授友情赠送（Nat. Commun.，2014，5，3026）；

本实施例中采用先限制性酶切后连接技术，具体如下：

将第一步PCR扩增后产物胶回收，用XhoI和BamHI双酶切并回收酶切产物，同时对pCG质粒进行双酶切并回收酶切产物。

双酶切体系如下：

BamHI，2μL；

XhoI，2μL；

10×Buffer，4μL；

PCR胶回收产物或pCG质粒，2μg；

ddH₂O加到40μL。

37℃双酶切反应1h。

双酶切产物经DNA切胶回收纯化试剂盒进行回收。

对回收后双酶切产物进行连接，连接体系设置如下：

T4 DNA连接酶，0.5μL；

10×Buffer，1μL；

PCR扩增后双酶切产物，6μL；

双酶切pCG载体，2μL。

16℃连接过夜。

至此，构建DisA-pCG重组质粒完成。

（2）重组质粒转化，CBM-DAC融合蛋白表达；

将重组质粒载体pCG-DisA转入感受态宿主细胞E. coli Rosetta或BL21中，培养并诱导表达目的蛋白，表达结束后离心收获细胞以便进一步纯化并收集目的蛋白。

具体而言：

取感受态细胞E. coli DH5α悬液，将10μL步骤（1）中连接产物加入，42℃水浴，热激90s，加入890μL LB液体培养液。恒温摇床中37℃、220 rpm震荡培养1h。培养结束后，涂布含卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12~16h 后，挑选阳性克隆子。

对所挑取阳性克隆子继续培养，提取质粒后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中。在含Amp的LB平板上挑取含重组质粒的单个菌落，菌液PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的菌液接种于含100 μg/mL Amp（氨苄青霉素）的4 mL LB液体培养基中，37℃、220 r/min培养过夜。

将得到的菌液按体积比1:100接种于含100 μg/mL Amp的200 mL LB液体培养基中，37℃、220 r/min震荡培养，OD₆₀₀达0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃、220 r/min 诱导过夜。

诱导结束后8000 r/min离心5min，弃上清收集菌体至50mL离心管中。

对上述各步骤中的蛋白表达结果进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。

通过选择表达量相对较高的阳性重组子，将含有CBM-DAC融合蛋白基因载体的重组菌株进行扩大培养：按照1%的接种量接入3L的LB液体培养基中，37℃、220 r/min震荡培养至OD₆₀₀达0.8，加入终浓度1mM的IPTG，25℃、220 r/min 诱导过夜，离心，收集菌体，即可用于进一步的固定DAC即固定DisA蛋白并用于催化合成c-di-AMP过程。

实施例2

本实施例在实施例1基础上，对于一步纯化和固化化CBM-DAC融合蛋白，以及利用该DisA蛋白催化合成c-di-AMP并进一步纯化的过程做进一步解释说明，简要介绍如下。

（3）一步纯化和固定CBM-DAC融合蛋白；具体步骤如下：

第一，根据文献（Nat. Commun.，2014，5，3026）提供的方法用磷酸对微晶纤维素进行预活化和重生；所述微晶纤维素优选粒径在10~100μm。具体为：

称取100g 微晶纤维素（Aladdin，C104843-250g），溶于0.3L去离子水中，充分混匀；

加入5L预冷的磷酸，边加边搅拌混匀，出现澄清；

冰上放置1h，每隔10min搅拌一次；然后加入20L预冷去离子水，边加边搅拌，此时出现白色沉淀；4℃，5000 r/min离心10min，弃上清，再用预冷的去离子水重悬，重复四次；

加入0.2L 2M的Na₂CO₃，充分混匀，中和磷酸；

加入20L预冷的去离子水，重悬沉淀，4℃，5000 r/min离心20min，弃上清；重复3次，直到微晶纤维素的PH值在5~7之间，4℃保存备用。

第二，破碎细胞，向实施例1所收集的菌体加300mL PBS重悬，加溶菌酶(终浓度为1 mg/ml)和PMSF（终浓度为1mM）室温孵育1h后，低温超声波破碎菌体(超声时间8 s，间歇10 s，200次)；4℃，10000 r/min离心20min，取上清。

第三，取第一步活化后的微晶纤维素30g（相当于约6g干重），和第二步所制备上清液混合，室温结合30min，4℃，6000 r/min离心5min，弃上清。加入300mL 50mM的Tirs-HCl（PH=8.5）重悬，充分混匀后，4℃，6000 r/min离心5min，弃上清；重复3~5次，洗掉非特异性结合的蛋白。

吸附结合完成后进行液态保藏或低温冷冻干燥，所得产品即为含有固化DAC的液体酶或固体粉末。

测定结果表明，CBM-DAC融合蛋白吸附量为，1mg干重微晶纤维素吸附250mg目的蛋白。

需要注意的是，液态保藏或低温冷冻干燥之前需添加保护剂，所用保护剂为混合剂，以质量比计，蔗糖：甘露醇：甘氨酸=3：3：1。

对最后洗涤液即带有目的蛋白DisA蛋白的微晶纤维素进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。

测定结果表明，CBM-DAC融合蛋白吸附量为，1g干重微晶纤维素吸附250mg目的蛋白。

（4）连续化生产c-di-NMP；

c-di-AMP的合成酶反应体系设置如下：

反应体系为5L，固定化CBM-DAC的微晶纤维素456mg（相当于融合蛋白2μM），2mM的ATP在包含10mM  MgCl₂和40mM的HEPES的缓冲液中，37℃反应2小时。

反应体系为5L，2uM DisA蛋白与2mM的ATP在包含10mM  MgCl2和500mM CHES的缓冲液中，50℃反应2小时。

（5）反应产物分离浓缩与纯化；

反应产物即c-di-AMP的分离及纯化工艺原理如图3所示，具体包括以下步骤：

第一，步骤（4）酶促反应结束后，12000转/min离心回收含有固定化酶的微晶纤维素，加入300mL 50mM的Tirs-HCl（PH=8.5）重悬，充分混匀后，4℃，6000 r/min离心5min，弃上清，重复3次；所得沉淀即为固定化CBM-DAC融合蛋白，可进行液态保藏或低温冷冻干燥，以备下次使用，同时得到含有反应产物c-di-AMP的澄清反应液；将所得澄清反应液煮沸99℃煮沸10min，然后12000rmp/min离心10min，取上清，用0.22μm滤器过滤

 第二，将第一步所收集滤液经膜分离器超滤，分离出残留的大分子蛋白、无机盐等杂质；再将超滤之后液体送入纳滤器进一步浓缩，脱盐除杂；

所述超滤采用美国GE公司的三层超滤复合膜，该膜切割分子量为1000~3000道尔顿，工作压力为1.5~3.0 Mpa，小于膜切割分子量的目的产物c-di-NMP（692~727道尔顿）透过该膜，同时AMP，Mg²⁺等小分子物质也透过该膜，所透过物质通过超滤器淡水口收集；未透过膜的为游离的微晶纤维素、未分离的含有固定酶DisA蛋白的微晶纤维素、游离的大分子量的DisA蛋白等，通过超滤器的浓水口收集；对超滤器浓水口收集物可返入容器中继续进行合成反应；

对从超滤器淡水口收来的含有c-di-AMP、AMP、焦磷酸、Mg²⁺等小分子物质的溶液进一步经纳滤器进行浓缩，所述纳滤采用美国GE公司的三层纳滤复合膜，该膜切割分子量为500道尔顿，工作压力为2.5 Mpa，小于膜切割分子量的目的产物c-di-NMP（692~727道尔顿）无法透过该膜，而无机盐、水、PPi、AMP等小分子透过膜，从纳滤器的淡水口流出，而目的产物c-di-NMP留在浓缩液中收集。

第三，用20%的氨水将纳滤之后的浓缩液调至碱性(pH=10)。

第四，使用减压蒸发装置将调至碱性的纳滤液蒸馏至液体为粘性，进一步使用乙醇丙酮有机溶剂（体积比1:1）抽提产物，有机相:水相=95:5，洗涤后离心(重复两次)，将所得固体溶解到少量的0.1%氨水中，冷冻干燥；最后所得398mg 的c-di-AMP二铵盐。

对所得c-di-AMP二铵盐进行检测，以文献公布的（Enz. Microb. Technol.，2013，52，319）方法，使用高效液相色谱（HPLC）技术对样品含量进行测定，以Sigma公司的纯度为99.9%的c-di-AMP二铵盐作为标准品。

检测结果如图5所示，其中（1）表示ATP、c-di-AMP二铵盐在高效液相色谱柱上的保留时间；（2）表示最终产品中c-di-AMP二铵盐在高效液相色谱柱上的保留时间。结果表明，使用本发明生产的c-di-AMP二铵盐，纯度较高，具有很好的使用价值和意义。

Claims (7)

1.一种连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体； 

（2）重组质粒转化，CBM-DAC融合蛋白的表达；

（3）一步纯化和固定化DAC酶；

所述固定化DAC酶采用微晶纤维素进行固定化；

（4）连续化生产c-di-AMP；

（5）反应产物分离浓缩与纯化。

2.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，步骤（1）中所述DisA基因编码蛋白为枯草芽孢杆菌的DisA蛋白，其编号为，GenBank: CP003695.1。

3.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，步骤（1）中所述cbm基因序列，使用来源于第三家族的cbm序列，由480个碱基组成，编码160个氨基酸，属于热线梭菌Clostridium thermocellum中编码cipA基因的一部分，编号为，GenBank: HF912724.1；具体采用pCG质粒中cbm基因片段。

4.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，步骤（2）中转化所采用宿主细胞为E. coli Rosetta。

5.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，步骤（3）中所述微晶纤维素粒径在10~100μm。

6.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，连续化生产c-di-AMP时，酶反应体系设置如下：

步骤（3）中固定化DAC的微晶纤维素，456~2280 mg；

底物，ATP 10~100 mM；

40~100 mM HEPES或300~700 mM CHES缓冲液；

5~30 mM Mg²⁺；

30~65℃，反应1~4h。

7.如权利要求1所述连续生产c-di-AMP的方法，其特征在于，所述分离浓缩纯化依次包括离心、超滤、纳滤、调pH值、减压蒸发、冷冻干燥步骤；

所述超滤采用美国GE公司的三层超滤复合膜；

所述纳滤采用美国GE公司的三层纳滤复合膜。