CN117440963A - 重组蛋白纯化方法 - Google Patents
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Abstract
提供包含盐浓度响应性自聚集肽部分和目的多肽部分的融合多肽，以及通过表达所述融合多肽来生产和纯化目的多肽的方法。
Description
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及包含盐浓度响应性自聚集肽部分和目的多肽部分的融合多肽，以及通过表达所述融合多肽来生产和纯化目的多肽的方法。
发明背景
重组蛋白已经广泛应用于医药、食品、化工、能源、纺织、环保等领域。重组蛋白质的生产，无论在商业规模还是实验室规模都至关重要，而重组蛋白的分离与纯化成本约占其全部成本的30％-80％，是重组蛋白质制备的瓶颈技术(Fields C.等，Biotechnology and Bioengineering,2016,113(1):11-25)。重组蛋白在制备出来后，纯化一般可分为样品捕获、中度纯化和精细纯化等三步。其中，中度纯化可以达到适中的样品纯度，其处理后的蛋白质样品可以被用于多种实验分析，如N端序列分析、抗原抗体反应等。目前可以实现蛋白质中度纯化的方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析，以及近期的研究热点如自切割自聚集功能的融合标签表达等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白质中度纯化方法之一。实验室中常用的亲和纯化技术包括多组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的蛋白的融合表达，再通过装有螯合了金属离子(一般为镍离子)或固定了谷胱甘肽的树脂的层析柱进行特异性结合和洗脱进行纯化，为不同目的蛋白的生产提供了通用的纯化手段(Arnau J.等，Protein Expression and Purification,2006,48(1):1-13)。然而这种方法，1)需要消耗大量价格昂贵的填粒，2)需要专业且贵重的设备来实现纯化过程，3)需要加入蛋白酶进行融合表达标签的移除而使成本升高、步骤增多、回收率降低，这三个主要缺点使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。而且，由于树脂价格高、消耗大，其成本占整个蛋白质纯化市场的约1/4。
近年来，许多工作开始设计具有自聚集自切割功能的融合标签以克服上述缺点。来自典型性猪瘟病毒(CSFV)N-端的具有蛋白酶活性且有强烈的形成不可溶聚集体趋势的N
pro，就具备了将聚集纯化和蛋白质剪切集于一身的特点。但是利用N
pro方法需要对目的蛋白进行复性和进一步的精细纯化来去除产物中的N
pro融合片段(Achmuller C.等，Nature Methods,2007,4:1037-1043)。也有报道显示由多个重复单元组成的两亲性β折叠的自聚集倾向随着重复单元数目增加而增强(Zhang S.等，EMBO Journal,1992,11:3787-3796)。本领域还有通过多个重复单元串联重复形成具有自聚集特性的多肽的报道，如类弹性蛋白(E lastin-Like Polypeptide,ELP)，其由数十至上百个VPGXG(其中，X 表示任意氨基酸)重复单元组成，其聚集特性与重复单元数目相关，一般采用60-110个重复(即有300个氨基酸以上的)ELP。将具有诱导聚集功能的ELP与具有自切割功能的内含肽(Intein)结合，构建出的新融合标签可以产生与N
pro相似的功效。与这一标签融合表达的蛋白可以通过控制温度或离子浓度，使融合蛋白在液相(可溶)和固相(沉淀)之间不断转换，从而达到纯化目的(Meyer D.E.等，Nature Biotechnology,1999.17(11):1112-1115；Banki M.R.等，Nature Methods,2005,2(9):659-661)。然而，在实际操作中往往是需要温度和离子浓度同时调节，而且需要采用两轮的盐结合温度的相变来反复诱导聚集，蛋白纯度以及收率通常较低，难以达到工业应用的标准，特别是较高的温度有可能影响所纯化蛋白质的活性，并且多步操作不利于简化工艺流程。另外，由于ELP本身长度较长(至少300个氨基酸残基)，对于融合蛋白的表达以及纯化均有不利的影响。
因此，本领域仍然需要低成本、简便、高效的蛋白质纯化方法。
发明简述
在本发明的第一方面，提供一种融合多肽，其包含目的多肽部分和盐浓度响应性自聚集肽部分，其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述盐浓度响应性自聚集肽部分，并且其中所述间隔物包含切割位点，
其中所述盐浓度响应性自聚集肽为CpA变体，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
在本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸，其包含编码CpA变体的核苷酸序列或其互补序列，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。
在本发明的第四方面，提供表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或由本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
在本发明的第六方面，提供生产和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养本发明的宿主细胞，从而表达融合多肽；
(b)在第一盐条件下，裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的不溶部分，回收可溶部分；
(c)在第二盐条件下，所述融合蛋白形成不溶部分；
(d)回收步骤(c)中形成的不溶部分；
(e)通过切割所述切割位点从收集自步骤(d)的不溶部分释放可溶的目的多肽；和
(f)去除步骤(e)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。
附图简述
图1示出基于盐浓度响应性自聚集肽诱导的蛋白质纯化方法以及所采用的表达载体结构图。A：纯化策略(以盐浓度响应性自聚集肽MpA/CpA和内含肽MtuΔI-CM为例)；B：pET30-MpA-Mtu-hGH、pET30-MpA-Mtu-RFP、pET30-MpA-Mtu-GST、pET30-MpA-Mtu-LCB3、pET30-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher、pET30-CpA-Mtu-hGH、pET30-CpA-Mtu-RFP和pET30a-Xylanase-Mxe-MpA的载体结构图。
图2示出人生长激素hGH融合蛋白和红色荧光蛋白RFP融合蛋白表达结果图。A：MpA-Mtu-hGH和MpA-Mtu-RFP表达SDS-PAGE分析结果；B：CpA-Mtu-hGH和CpA-Mtu-RFP表达SDS-PAGE分析结果。
图3示出通过3M NaCl诱导聚集肽MpA聚集来纯化人生长激素hGH、红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图4示出通过0.7M Na
2SO
4诱导聚集肽MpA聚集来纯化人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图5示出通过0.7M(NH
4)
2SO
4诱导聚集肽MpA聚集来纯化人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图6示出通过3M NaCl诱导聚集肽CpA聚集来纯化人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图7示出通过0.7M Na
2SO
4诱导聚集肽CpA聚集来纯化人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图8示出通过0.7M(NH
4)
2SO
4诱导聚集肽CpA聚集来纯化人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP的SDS-PAGE分析结果图。A：人生长激素hGH表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：红色荧光蛋白RFP表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图9示出通过自然光下RFP呈现红色和365nm紫外光下RFP显红色荧光来鉴定聚集体MpA/CpA-Mtu-RFP和切割上清RFP的活性表征结果图。A：自然光下MpA-Mtu-RFP裂解上清分别加三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)后形成的聚集体实物图；B：自然光下MpA-Mtu-RFP分别在三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)条件下得到的切割上清实物图；C：365nm紫外光下MpA-Mtu-RFP分别在三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)条件下得到的切割上清荧光图；D： 自然光下CpA-Mtu-RFP裂解上清分别加三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)后形成的聚集体实物图；E：自然光下CpA-Mtu-RFP分别在三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)条件下得到的切割上清实物图；F：365nm紫外光下CpA-Mtu-RFP分别在三种盐(3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4)条件下得到的切割上清荧光图。
图10示出通过3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4诱导聚集肽MpA聚集来纯化谷胱甘肽巯基转移酶GST、新冠多肽LCB3和多价骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher的SDS-PAGE分析结果图；A：3M NaCl介导GST纯化的SDS-PAGE分析结果，B：3M NaCl介导LCB3纯化的SDS-PAGE分析结果，C：3M NaCl介导ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher纯化的SDS-PAGE分析结果，D：0.7M Na
2SO
4介导GST纯化的SDS-PAGE分析结果，E：0.7M Na
2SO
4介导LCB3纯化的SDS-PAGE分析结果，F：0.7M Na
2SO
4介导ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher纯化的SDS-PAGE分析结果，G：0.7M(NH
4)
2SO
4介导GST纯化的SDS-PAGE分析结果，H：0.7M(NH
4)
2SO
4介导LCB3纯化的SDS-PAGE分析结果，I：0.7M(NH
4)
2SO
4介导ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher纯化的SDS-PAGE分析结果。
图11示出通过3M NaCl、0.7M Na
2SO
4、0.7M(NH
4)
2SO
4诱导融合蛋白Xylanase-Mxe-MpA聚集来纯化木聚糖酶xylanase的SDS-PAGE分析结果图；A：3M NaCl介导xylanase表达与纯化SDS-PAGE分析结果；B：0.7M Na
2SO
4介导xylanase表达与纯化SDS-PAGE分析结果；C：0.7M(NH
4)
2SO
4介导xylanase表达与纯化SDS-PAGE分析结果。
图12示出通过生物膜层光学干涉(BLI)技术检测纯化后人生长激素hGH与人生长激素受体蛋白Growth hormone receptor(Abcam,ab180053)的亲和力表征结果图。A：通过3M NaCl介导纯化的人生长激素hGH的亲和力测试；B：通过0.7M Na
2SO
4介导纯化的人生长激素hGH的亲和力测试；C：通过0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的人生长激素hGH的亲和力测试；D：商业化的人生长激素hGH的亲和力测试。
图13示出通过生物膜层光学干涉(BLI)技术检测纯化后新冠多肽LCB3与其受体蛋白SARS-CoV-2 Spike protein(GenScript,Z03483)的亲和力表征结果图。A：通过3M NaCl介导纯化的新冠多肽LCB3的亲和力测试；B：通过0.7M Na
2SO
4介导纯化的新冠多肽LCB3的亲和力测试；C：通过0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的新冠多肽LCB3的亲和力测试。
图14示出通过SDS-PAGE鉴定多价骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher与LCB3-SpyTag的共价结合，根据其共价结合产物的形成来表征多价骨架蛋白的活性。
发明详述
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人 员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
在本文中，术语“变体”是指与其亲本相比包含一个或多个氨基酸或核苷酸突变的多肽或多核苷酸。在本文中，术语“变体”与“突变体”可互换使用。
在本文中，术语“对应于”是指本领域技术人员利用已知的序列比对方法以最大化匹配来比对两个或更多个相关多肽或核酸序列(包括分子的序列、分子的区域和/或理论序列)从而获得最高等级匹配时，互相对齐的部分、位置或区域。换句话说，在两个或更多个多肽或核酸序列最适比对时，两个类似位置(或部分或区域)对齐。当比对两个或更多个序列时，基于沿线性核酸或氨基酸序列的位置鉴定类似部分/位置/区域。
如本文所用，“多核苷酸”是指多个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善多肽的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
在本文中，术语“在严格条件下杂交”是指多核苷酸分子与靶核酸分子通过互补的碱基配对退火。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的参数，例如特定分子的长度和组成。与杂交特别相关的参数还包括例如退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。在一个实施方式中，在严格条件下杂交是指在高度严格条件下杂交，即0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃。在一个实施方式中，在严格条件下杂交是指在中度严格条件下杂交，即0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃。在一个实施方式中，在严格条件下杂交是指在低度严格条件下杂交，即0.2×SSPE，0.1％SDS，40℃。等效的严格条件是本领域已知的。本领域技术人员能够调整影响杂交的参数，以在低、中或高度严格条件下实现多核苷酸分子与靶核酸分子的杂交。
“包含”或“包括”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留， 但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列。相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子。
术语“表达”通常是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。在本文中，术语“表达”可理解为“异源表达”，即是指在宿主细胞中表达或体外表达由异源核酸编码的多肽。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。通常，在表达构建体中，感兴趣的核苷酸序列与调控序列可操作地连接。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关感兴趣的序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控序列与目的核苷酸序列连接，使得目的核苷酸序列的转录被所述调控序列控制和调节。用于将调控序列可操作地连接于目的核苷酸序列的技术为本领域已知的。
如本文所用，“自聚集”是指多肽的一种特性，即多肽单体在一定物理和/或化学条件诱导下组装成多聚体。
如本文所用，“纯度”是指目的蛋白的纯度，即在纯化液中，目的蛋白占总蛋白的比例。由于通过细胞表达目的蛋白，在胞内有大量的其他蛋白(如大肠杆菌就有几千种蛋白)，要把目的蛋白从如此多种类且量较大的蛋白混合物中纯化出来一直是一个关键的技术难题。通过细胞的破碎、离心、切割后的分离等步骤，纯化液中基本只有蛋白质和无机盐，因此纯化液中目的蛋白的比例越高，则生产的纯度越高。
术语“离子强度”是溶液中离子浓度的度量，离子强度的单位为摩尔浓度(mol/L)，其计算方式为溶液中每种离子i的质量摩尔浓度(mi)乘以该离子的价数(zi)的平方所得诸项之和得一半。
二、CpA变体及其融合多肽
“CpA”或“CpA短肽”是指本领域中已知的一种两亲性(amphipathic)多肽，其具有彼此分隔的亲水性区域和疏水性区域，其中CpA的α螺旋状态受盐浓度调控，在含盐的溶液中盐离子诱导的疏水相互作用以及其它推动力作用下能自发地形成特定的自聚集结构，并且在一定的范围内随着盐离子浓度提高，聚集体强度增强且体积增大(Daniel E.W.等，Proceedings of the National Academy of Sciences,2005, 102:12656–12661)。在一个实施方案中，CpA肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，CpA肽具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明通过引入氨基酸突变构建了短肽CpA的变体MpA，其具有比CpA更优异的盐浓度响应性自聚集特性，尤其是聚集效率更高、回收效率更高且目的蛋白的纯度更高。其中，所述盐浓度响应性自聚集特性是指在第一盐条件下可溶且在第二盐条件下能够自聚集的性质。在一个实施方案中，所述第一盐条件包含第一盐浓度，所述第二盐条件包含第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐浓度与所述第二盐浓度不同。在一个实施方案中，所述第一盐浓度高于所述第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐浓度低于所述第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐条件包含第一盐种类，所述第二盐条件包含第二盐种类。在一个实施方案中，所述第一盐种类与所述第二盐种类相同。在一个实施方案中，所述第一盐种类与所述第二盐种类不同。在一个实施方案中，与CpA的聚集效率相比，本发明的CpA变体的聚集效率升高5％至300％。
因此，在第一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其为CpA短肽的变体，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基具有突变，例如缺失、插入和/或取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基具有氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基被甲硫氨酸(M)取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的半胱氨酸(C)被甲硫氨酸(M)取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CpA变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在多肽中引入氨基酸突变的方法为本领域技术人员所熟知。例如参见Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。例如，可使用市售试剂盒，例如QuikChange
TM定点诱变试剂盒Stratagene，或者直接通过化学法合成具有突变的多肽。
本发明通过将具有盐浓度响应性自聚集特性的肽与两种结构上和功能上均不相关的目的多肽构成融合多肽，盐浓度响应性自聚集功能的短肽会使融合蛋白三联体在改变缓冲液盐浓度后将融合蛋白三联体诱导聚集成沉淀，可以利用简单的离心或过滤手段使融合多肽三联体与细菌蛋白提取液中的杂质成分分离，获得高纯度的融合蛋白三联体。这样的蛋白纯化过程简化了蛋白分离纯化的步骤、避免为了保证收率而反复多次进行纯化、避免使用昂贵的纯化柱、显著地降低生产成本、并且在低温或常温下进行聚集从而避免了目的多肽的降解，并最终所得纯化的蛋白纯度高、回收率高且保持相应的蛋白活性。本发明人意外地发现，利用CpA变体MpA作为盐浓度响应性自聚集肽与目的多肽构成融合多肽，仅需要一次盐浓度的调整进行蛋白沉淀，即可获得纯度通常达到85％以 上的目的蛋白，其纯化效率与纯化柱相当且步骤简便，一方面可用于实验室规模的高通量蛋白纯化，另一方面由于其较高的经济性，克服了工业领域应用的瓶颈。
因此，本发明涉及一种融合多肽，其包含目的多肽部分和盐浓度响应性自聚集肽部分，其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述盐浓度响应性自聚集肽部分，并且其中所述间隔物包含切割位点。在一个实施方案中，所述盐浓度响应性自聚集肽部分包含盐浓度响应性自聚集肽。在一个实施方案中，所述盐浓度响应性自聚集肽为在第一盐条件下可溶且在第二盐条件下能够自聚集的肽。在一个实施方案中，所述盐浓度响应性自聚集肽为CpA变体，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基具有突变，例如缺失、插入和/或取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基具有氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的氨基酸残基被甲硫氨酸(M)取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置处的半胱氨酸(C)被甲硫氨酸(M)取代。在一个实施方案中，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。在一个实施方案中，所述盐浓度响应性自聚集肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个实施方案中，本发明的盐浓度响应性自聚集肽部分可以包括一或多个串联连接的所述盐浓度响应性自聚集肽。本发明的盐浓度响应性自聚集肽部分可以包含1至150、1至130、1至110、1至90、1至70、1至50、1至30、1至10、1至5个所述盐浓度响应性自聚集肽，例如1、2、3、4、5个所述盐浓度响应性自聚集肽。所述盐浓度响应性自聚集肽部分中的两或多个盐浓度响应性自聚集肽可以形成串联重复。为了便于重组操作以及考虑到生产成本问题，期望使用较少的重复。因此，在一些实施方案中，所述盐浓度响应性自聚集肽部分仅包含一个所述盐浓度响应性自聚集肽。
如本文所用，“间隔物”是指具有一定长度的氨基酸组成的多肽，其包括实现切割所需的序列，如用于酶切割的蛋白酶识别序列、用于自切割的内含肽序列等，以连接融合蛋白的各部分并不影响各部分的结构和活性。因此，本发明的间隔物包含“切割位点”。在本发明的融合多肽中，间隔物与目的多肽部分和/或盐浓度响应性自聚集肽部分直接连接。在另一些实施方案中，所述间隔物在其N端和/或C端进一步包含接头。在另一些实施方案中，所述间隔物通过接头与目的多肽部分和/或盐浓度响应性自聚集肽部分连接。在一些实施方案中，所述切割位点位于所述间隔物的C端，且所述切割位点紧邻所述目的多肽部分的N端。在一些实施方案中，所述切割位点位于所述间隔物的N端，且所述切割位点紧邻所述目的多肽部分的C端。在一些实施方案中，所述间隔物通过所述切割位点连接于所述目的多肽部分。在一些实施方案中，所述间隔物通过所述切割位点直接连接于所述目的多肽部分的N端或C端。
本发明的用于将可溶的目的多肽部分从不可溶部分(沉淀)释放出来的切割位点包括 可以选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点、离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点，或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。在一些具体实施方案中，所述切割位点为自切割位点。在一些实施方案中，所述切割位点是pH依赖性切割位点。在一些实施方案中，所述间隔物连接于所述目的多肽部分的N端或C端。应当理解，本领域技术人员可以根据需要选择合适的间隔物，并选择间隔物合适的连接位置。
在一些具体实施方案中，所述间隔物包含内含肽，所述内含肽包含自切割位点。内含肽是一段具有蛋白酶活性的特殊序列多肽，在诱导其蛋白酶活性产生后可以在设计位点的特定氨基酸残基切割，从而目的多肽从融合多肽三联体中分离并释放到可溶的溶液中，即可获得高纯度的目的多肽。因此，基于内含肽的切割方法不需要外加酶或使用如化学法中所用的溴化氢等有害物质，而仅仅需要改变聚集体所处的缓冲环境就能简单地诱导切割(Wu et al.,1998；TELENTI et al.,1997)。本领域已知多种自切割内含肽，例如NEB公司的一系列具有不同自切割特性的内含肽。
在本发明的一些具体实施方案中，所述内含肽选自Mxe GyrA、Ssp DnaB或MtuΔI-CM。如本文所用，“MtuΔI-CM”衍生自Mtu recA野生型内含肽，其通过缺失Mtu recA特大型内含肽的核酸内切酶结构域，保留N端110个氨基酸和C端58个氨基酸，得到极小型内含肽，再引入四个突变：C1A、V67L、D24G、D422G而得到(Wood等，1999)。在一些可选的实施方案中，所述MtuΔI-CM包含SEQ ID NO:3所示的序列。在一些可选的实施方案中，所述MtuΔI-CM具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列。在一些可选的实施方案中，所述MtuΔI-CM连接于所述目的多肽部分的C端。在一个具体的实施方案中，所述内含肽MtuΔI-CM通过在pH 5.5-6.8的缓冲体系可诱导该内含肽在其羧基端的自切割。在一些可选的实施方案中，所述间隔物为MtuΔI-CM的突变体。
本领域技术人员能够理解，为了减少本发明的融合蛋白中不同部分之间的相互干扰，可以通过接头连接融合蛋白的不同部分。如本文所用，“接头”是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的多肽，其用于融合蛋白时可以使所连接的各部分充分展开，互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。
本领域常用的接头包括例如，富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性的GS型接头；富含脯氨酸(P)和苏氨酸(T)的刚性的PT型接头。在一些实施方案中，所述接头选自GS型接头和PT型接头。在一些实施方案中，本发明所使用的GS型接头的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。在另一些实施方案中，本发明所使用的PT型接头的氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，本发明所使用的GS型接头的核苷酸序列示于SEQ ID NO:13。在另一些实施方案中，本发明所使用的PT型接头的核苷酸序列示于SEQ ID NO:14。
在一些实施方案中，所述目的多肽长度为20、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸残基，或为任意两个上述长度之间的任意长度。在一些实施方案中，所述目的多肽部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子。
所述治疗性分子包括但不限于核酸药物、蛋白药物(包括治疗性多肽、治疗性抗体 等)等。示例性的治疗性分子包括但不限于毒素、免疫调节剂、拮抗剂、细胞凋亡诱导剂、激素、放射性药物、抗血管生成剂、基因药物细胞因子、趋化因子、前药、化疗药物等，例如人生长激素(hGH)、新冠多肽LCB3等。
所述可检测分子包括但不限于荧光蛋白、酶、标签等，例如红色荧光蛋白(RFP)、谷胱甘肽巯基转移酶GST、Xylanase等。
所述靶向性分子包括但不限于靶向性抗体、特异性受体配体等。例如，所述靶向性分子可以是特异性靶向肿瘤抗原的抗体。
在一个实施方案中，所述目的多肽选自人生长激素(hGH)、红色荧光蛋白(RFP)、谷胱甘肽巯基转移酶GST、新冠多肽LCB3、多价骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher或Xylanase。在一个实施方案中，所述目的多肽部分包含选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述目的多肽具有选自如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述目的多肽部分位于所述融合多肽的N端或C端。在一些实施方案中，所述间隔物连接于所述目的多肽部分的N端或C端。在一些实施方案中，所述目的多肽部分位于所述融合多肽的C端，且所述间隔物连接于所述目的多肽部分的N端。在一些实施方案中，所述目的多肽部分位于所述融合多肽的N端，且所述间隔物连接于所述目的多肽部分的C端。在一些实施方案中，所述融合多肽从N端到C端具有以下结构：盐浓度响应性自聚集肽例如MpA－间隔物－目的多肽，或目的多肽－间隔物－盐浓度响应性自聚集肽例如MpA。在一些实施方案中，所述融合多肽从N端到C端具有以下结构：盐浓度响应性自聚集肽例如MpA－接头－间隔物－目的多肽，或目的多肽－间隔物－接头－盐浓度响应性自聚集肽例如MpA。在一些实施方案中，所述融合多肽从N端到C端具有以下结构：MpA－接头－MtuΔI-CM－目的多肽例如人生长激素或RFP，或目的多肽例如人生长激素或RFP－Mxe GyrA－接头－MpA。
三、多核苷酸、表达构建体、宿主细胞和融合多肽制备方法
在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码CpA变体的核苷酸序列或其互补序列，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。
在一些实施方式中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:61的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包括在严格条件下与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。在上述实施方案中，本发明的多核苷酸编码的多肽仍保持与MpA相当的聚集效率。
在另一方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含与表达调控序列可操作地连接的本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的表达构建体包含与表达调控序列可操作地连接的本发明的多核苷酸。
用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合多肽或能够表达本发明的CpA变体。
可用于表达本发明的融合多肽或本发明的CpA变体的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞。
可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。
在另一方面，本发明提供了一种产生本发明的融合多肽的方法，包括：
a)在允许融合多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞；
b)从得自步骤a)的培养物获得由所述宿主细胞表达的融合多肽。
四、生产和纯化目的多肽的方法
本发明还涉及生产和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养本发明的宿主细胞，从而表达融合多肽；(b)在第一盐条件下，裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的不溶部分，回收可溶部分；(c)在第二盐条件下，所述融合蛋白形成不溶部分；(d)回收步骤(c)中形成的不溶部分；(e)通过切割所述切割位点从收集自步骤(d)的不溶部分释放可溶的目的多肽；和(f)去除步骤(e)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。本发明的方法的示意图可参见图1A。
在本发明中，使宿主细胞裂解的方法选自本领域常用的处理方式，例如超声、匀浆、高压(例如在弗氏压碎器中)、低渗(osmolysis)、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合。
在一个实施方案中，所述第一盐条件包含第一盐浓度，所述第二盐条件包含第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐浓度与所述第二盐浓度不同。在一个实施方案中，所述第一盐浓度高于所述第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐浓度低于所述第二盐浓度。在一个实施方案中，所述第一盐条件包含第一离子强度，所述第二盐条件包含第二离子强度。在一个实施方案中，所述第一离子强度与所述第二离子强度不同。在 一个实施方案中，所述第一离子强度高于所述第二离子强度。在一个实施方案中，所述第一离子强度低于所述第二离子强度。在一个实施方案中，所述第一盐条件包含第一盐种类，所述第二盐条件包含第二盐种类。在一个实施方案中，所述第一盐种类与所述第二盐种类相同。在一个实施方案中，所述第一盐种类与所述第二盐种类不同。
在一个实施方案中，所述第一盐条件下和/或第二盐条件下的所述盐(即所述第一盐种类和/或所述第二盐种类)选自一价金属盐如钾盐或钠盐等，二价金属盐如镁盐、钙盐、锰盐或铜盐等，或铵盐，优选为铵盐、钾盐或钠盐。在一个实施方案中，所述第一盐条件下和/或第二盐条件下的所述盐的阴离子选自硫酸根，磷酸氢根，乙酸根，卤离子如氟离子、氯离子、溴离子或碘离子等，硝酸根，高氯酸根，或硫氰酸根离子，优选为硫酸根、磷酸氢根、氯离子或乙酸根。在一个实施方案中，所述第一盐条件下和/或第二盐条件下的所述盐选自氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钾、硝酸铵、硫酸铵或氯化铵，优选为氯化钠、硫酸钠或硫酸铵。
在一个实施方案中，所述第一离子强度为0-0.2mol/L。在一个实施方案中，所述第一离子强度为0-0.1mol/L或0.1-0.2mol/L。在一个实施方案中，所述第一离子强度为约0mol/L、约0.1mol/L或约0.2mol/L。在一个实施方案中，所述第二离子强度为0.5-5.0mol/L。在一个实施方案中，所述第二离子强度为1.0-4.5mol/L、1.5-4.0mol/L、1.5-2.5mol/L、2.0-3.5mol/L或2.5-3.0mol/L。在一个实施方案中，所述第二离子强度为约0.5mol/L、约0.8mol/L、约1.0mol/L、约1.2mol/L、约1.5mol/L、约1.8mol/L、约2.0mol/L、约2.1mol/L、约2.2mol/L、约2.5mol/L、约2.8mol/L、约3.0mol/L、约3.2mol/L、约3.5mol/L、约3.8mol/L、约4.0mol/L、约4.2mol/L、约4.5mol/L、约4.8mol/L、约5.0mol/L，或为任意两个上述离子强度之间的任意离子强度。
在一个实施方案中，所述第二盐条件选自0.5～4M NaCl，优选为3M NaCl；0.2～1.5M Na
2SO
4，优选为0.7M Na
2SO
4；或0.2～1.5M(NH
4)
2SO
4，优选为0.7M(NH
4)
2SO
4。在一个实施方案中，所述第一盐条件为约0M。在一个实施方案中，步骤(e)在第二盐条件下进行。在一个实施方案中，所述第二盐种类为NaCl，且所述第二离子强度为2.5-3.0mol/L，优选为约3mo/L。在一个实施方案中，所述第二盐种类为Na
2SO
4，且所述第二离子强度为1.5-2.5mol/L，优选为约2.1mo/L。在一个实施方案中，所述第二盐种类为(NH
4)
2SO
4，且所述第二离子强度为1.5-2.5mol/L，优选为约2.1mo/L。在一个实施方案中，所述第二盐种类为K
2SO
4，且所述第二离子强度为1.5-2.5mol/L，优选为约2.1mo/L。在一个实施方案中，所述第二盐种类为Na
2HPO
4，且所述第二离子强度为1.5-2.5mol/L，优选为约2.1mo/L。
在一个具体的实施方案中，在生理条件(如：正常温度18-37℃、中性pH值7.4-7.8)下培养宿主细胞以表达本发明的融合蛋白。因此，由于表达是在正常生理条件下培养的宿主细胞内进行，既避免了宿主细胞培养周期的延长，同时因培养条件适宜可提高融合蛋白的产量和产率。
在一个实施方案中，所述步骤(c)在4℃-25℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(c)在4℃-20℃、4℃-15℃或4℃-10℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(c)在4℃、10℃、15℃、20℃或25℃的温度下进行，优选在4℃下进行。在一个实施方案中，所述步骤(e)在4℃-25℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(e)在4℃-20℃、4℃-15℃或4℃-10℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(e)在4℃、10℃、15℃、20℃或25℃的温度下进行，优选在25℃下进行。在一个实施方案中，所述步骤(c)以及所述步骤(e)均在4℃-25℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(c)以及所述步骤(e)均不在高于25℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(b)至所述步骤(f)均在4℃-25℃的温度下进行。在一个实施方案中，所述步骤(b)至所述步骤(f)均不在高于25℃的温度下进行。因此，本发明省略了通过反复改变温度条件以获得沉淀状态的融合蛋白的步骤，也避免了过高的温度对蛋白质稳定性及活性的影响。
在一个实施方案中，所述步骤(c)包括调节含有收集自步骤(b)的可溶部分的溶液的盐浓度。在一个实施方案中，所述步骤(c)包括降低含有收集自步骤(b)的可溶部分的溶液的盐浓度。在一个实施方案中，所述步骤(c)包括升高含有收集自步骤(b)的可溶部分的溶液的盐浓度。
在一个实施方案中，所述步骤(c)和步骤(d)进行1、2或3次。在一个实施方案中，所述步骤(e)和步骤(f)进行1、2或3次。在一个实施方案中，所述步骤(c)和所述步骤(e)仅进行一次。在一个实施方案中，所述步骤(c)至所述步骤(f)仅进行一次。
在一个实施方案中，所述步骤(b)在中性至弱碱性的pH条件下进行。在一个特定实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件为pH 7.2-8.5。在一个优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 7.4-8.3。在一个更优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 7.6-8.2。在一个最优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 8.0。在一个实施方案中，所述步骤(c)在中性至弱碱性的pH条件下进行。在一个特定实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件为pH 7.2-8.5。在一个优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 7.4-8.3。在一个更优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 7.6-8.2。在一个最优选的实施方案中，所述中性至弱碱性的pH条件是pH 8.0。在一个实施方案中，所述步骤(e)在弱酸性的pH条件下进行。在一个特定实施方案中，所述弱酸性的pH条件为pH 5.5-6.8，且优选5.5-6.5。在一个最优选的实施方案中，所述弱酸性的pH条件是pH 6.2。
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的，本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。
以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook J.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工生物合成。
实施例1：构建MpA-Mtu-POI，CpA-Mtu-POI，POI-Mxe-MpA融合蛋白表达载体
POI表示目的蛋白，在本申请实施例中，POI指人生长激素hGH，红色荧光蛋白RFP，谷胱甘肽巯基转移酶GST，新冠多肽LCB3，多价骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher或木聚糖酶Xylanase。所使用的表达载体包括pET30-MpA-Mtu-hGH、pET30-MpA-Mtu-RFP、pET30-CpA-Mtu-hGH、pET30-CpA-Mtu-RFP、pET30a-MpA-Mtu-GST、pET30a-MpA-Mtu-LCB3、pET30a-MpA-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher和pET30a-MpA-Mtu-Xylanase，构建质粒所需要的引物，通过oligo 6设计并由上海生工合成如表1所示的寡聚核苷酸引物。
表1本实施例所用寡聚核苷酸引物
a引物下划线部分分别为限制性内切酶NdeI和Xho I的识别位点。
首先用在线工具DNAworks(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)设计MpA和PT型接头的核苷酸序列。通过DNAWorks设计并合成如表1中MpA所示的4条寡聚核苷酸引物(SEQ ID No:15～18)，将这4条10μM的寡聚核苷酸引物等体积混合后取2μL，再加入1μL 10μM的dNTP、4μL 5×Q5reaction buffer、ddH
2O 12.8μL、Q5DNA聚合酶0.2μL，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，60℃20sec，72℃15sec，共14个循环，最后72℃2min。反应结束后，以DNAworks的产物作为模板，使用寡聚核苷酸引物MpA-F和PT-Mtu-R进行PCR扩增，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，68℃20sec，72℃15sec，共29个循环，最后72℃2min。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶分离回收，获得NdeI-MpA-PT多核苷酸片段。以pET32-L6KD-MtuΔI-CM-hGH(林章凛等，PCT/CN2020/125054，2020)为模板，使用引物Mtu-F和Mtu-hGH-3-R通过PCR扩增获得Mtu-hGH-XhoI多核苷酸片段。进而以多核苷酸片段NdeI-MpA-PT和Mtu-hGH-XhoI为模板，使用引物MpA-F和Mtu-hGH-3-R，通过重叠PCR(overlapping PCR)法得到NdeI-MpA-PT-Mtu-hGH-XhoI多核苷酸序列。重叠PCR纯化后的多核苷酸片段和pET30a质粒(Novagen)分别用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，然后回收相应的片段进行纯化，纯化后用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。
然后以构建的质粒pET30a-MpA-Mtu-hGH为模板，使用引物Backbone-F和Mtu-R通过PCR扩增获得Backbone-MpA-PT-Mtu多核苷酸片段，以pET30a-SpyTag-GSlinker-RFP(Lin Z.等，Biotechnology and Bioengineering,2020,117:2923-2932)为模板使用引物RFP-F和Backbone-R通过PCR扩增获得RFP-Backbone多核苷酸片段，将纯化后的Backbone-MpA-PT-Mtu和RFP-Backbone多核苷酸片段进行Gibson assembly组装，组装产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。
质粒pET30a-MpA-Mtu-GST和pET30a-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher的构建方法类似，分别以 pET30-MpA-Mtu-hGH和目的基因(GST或ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher)为模板，通过Gibson assembly的方法获得。以pET30a-MpA-Mtu-GST为例，以质粒pET30-MpA-Mtu-hGH为模板，使用引物GST-Backbone-F和Mtu-R扩增获得Backbone-MpA-Mtu多核苷酸片段，以GST基因为模板，使用引物GST-F和GST-R扩增获得GST片段，将纯化后的Backbone-MpA-Mtu和GST多核苷酸片段进行Gibson assembly组装，组装产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。pET30-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher的构建所使用的模板为pET30-MpA-Mtu-hGH质粒和ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher基因，克隆所需的引物和操作流程与pET30a-MpA-Mtu-GST类似。所构建的pET30a-MpA-Mtu-GST和pET30a-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher质粒的结构如图1B所示。
质粒pET30a-MpA-Mtu-LCB3的构建，首先以LCB3基因为模板使用引物LCB3-F和LCB3-R扩增获得LCB3多核苷酸片段，然后以pET32-L6KD-MtuΔI-CM-hGH(林章凛等，PCT/CN2020/125054，2020)为模板，使用引物Mtu-F和Mtu-R扩增获得Mtu多核苷酸片段，进而以多核苷酸片段Mtu和LCB3为模板，使用引物Mtu-F和LCB3-R，通过重叠PCR(overlapping PCR)法得到Mtu-LCB3多核苷酸片段，接着以pET30a-MpA-Mtu-hGH为模板，使用引物LCB3-Backbone-F和LCB3-Backbone-R扩增获得Backbone-MpA多核苷酸片段，最后将纯化后的Mtu-LCB3多核苷酸片段和Backbone-MpA多核苷酸片段进行Gibson assembly组装，组装产物转化到大肠杆菌DHα感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。
质粒pET30-CpA-Mtu-hGH和pET30-CpA-Mtu-RFP的构建方法类似，分别以pET30-MpA-Mtu-hGH和pET30-MpA-Mtu-RFP为模板，通过Gibson assembly的方法获得。以pET30-CpA-Mtu-hGH的构建为例，以质粒pET30-MpA-Mtu-hGH为模板，使用引物Backbone-2-F和CpA-R扩增获得Backbone-CpA多核苷酸片段，使用引物CpA-F和Backbone-2-R扩增获得CpA-Mtu-hGH-Backbone多核苷酸片段，将纯化后的Backbone-CpA和CpA-Mtu-hGH-Backbone多核苷酸片段进行Gibson assembly组装，组装产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。pET30-CpA-Mtu-RFP的构建所使用的模板为pET30-MpA-Mtu-RFP，克隆所需的引物和操作流程与pET30-CpA-Mtu-hGH类似。所构建的pET30-MpA-Mtu-hGH、pET30-MpA-Mtu-RFP、pET30-CpA-Mtu-hGH和pET30-CpA-Mtu-RFP质粒的结构如图1B所示。
质粒pET30a-Xylanase-Mxe-MpA的构建，首先采用与合成NdeI-MpA-PT多核苷酸片段相似的方法通过DNAWorks设计引物GS-MpA-1、GS-MpA-2、GS-MpA-3和GS-MpA-4进行PCR扩增，然后以DNAWorks的产物为模板，使用引物GS-MpA-F和 MpA-R扩增获得GS-MpA多核苷酸片段；然后以pET30a-hGH-Mxe GyrA-L6KD为模板，使用引物Xylanase-Mxe-F和Mxe-R扩增获得Mxe多核苷酸片段；接着以Xylanase基因为模板，使用引物Xylanase-F和Xylanase-R扩增获得Xylanase多核苷酸片段；再然后以质粒pET30a(Novagen)为模板，使用引物30a-F和30a-R扩增获得30a-Backbone多核苷酸片段；最后将纯化后的30a-Backbone、Xylanase、Mxe和GS-MpA多核苷酸片段进行Gibson assembly组装，组装产物转化到大肠杆菌DHα感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡纳霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。pET30a-Xylanase-Mxe-MpA的质粒的结构如图1C所示。
实施例2：MpA-Mtu-POI和CpA-Mtu-POI融合蛋白的表达
将实施例1中构建好的质粒(含有质粒pET30-MpA-Mtu-hGH、pET30-MpA-Mtu-RFP、pET30-CpA-Mtu-hGH和pET30-CpA-Mtu-RFP)转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞获得四种MpA/CpA-Mtu-POI融合蛋白表达菌株。分别将四种表达菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD
600＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在18℃诱导24小时，测量菌浓度OD
600，4℃4,000rpm离心25min收获细胞，除去上清的培养基将菌体冻存-80℃。(以下将1mL的OD
600为1的细胞量称为1OD)
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2Na溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)重悬至100OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：变幅杆Φ2，20％功率，超声时间2sec，间隔时间2sec，运行25min～30min)。在4℃，15,000g的条件下离心30min，分别收集上清和沉淀部分进行制样，SDS-PAGE检测裂解上清和裂解沉淀中融合蛋白的表达情况。
结果如图2所示。图2A中，泳道a-d为分别是MpA-Mtu-hGH和MpA-Mtu-RFP的裂解上清和裂解沉淀，a：MpA-Mtu-hGH细胞裂解上清，可检测到明显的融合蛋白条带；b：MpA-Mtu-hGH细胞裂解沉淀，可检测到较淡的融合蛋白条带；c：MpA-Mtu-RFP细胞裂解上清，可检测到明显的融合蛋白条带；d：MpA-Mtu-RFP细胞裂解沉淀，几乎观察不到融合蛋白条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg、8.0μg。图2B中，泳道a-d为分别是CpA-Mtu-hGH和CpA-Mtu-RFP的裂解上清和裂解沉淀，a：CpA-Mtu-hGH细胞裂解上清，可检测到明显的融合蛋白条带；b：CpA-Mtu-hGH细胞裂解沉淀，可检测到较淡的融合蛋白条带；c：CpA-Mtu-RFP细胞裂解上清，可检测到明显的融合蛋白条带；d：CpA-Mtu-RFP细胞裂解沉淀，几乎观察不到融合蛋白条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg、8.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白上清和沉淀表达的产量，结果如表2所示。
表2MpA-Mtu-POI和CpA-Mtu-POI融合蛋白的表达
| 融合蛋白 | 可溶表达的量 a(mg/L) | 可溶占比 b(％) |
| MpA-Mtu-hGH | 614±9 | 93 |
| MpA-Mtu-RFP | 401±15 | 99 |
| CpA-Mtu-hGH | 446±40 | 98 |
| CpA-Mtu-RFP | 244±34 | 99 |
a裂解上清中融合蛋白的表达量(体积以每升LB培养基来计算)，
b可溶占比＝100％×裂解上清中融合蛋白的表达量/(裂解上清中融合蛋白的表达量+裂解沉淀中融合蛋白的表达量)。
所采用的4种融合蛋白(MpA-Mtu-hGH、MpA-Mtu-RFP、CpA-Mtu-hGH和CpA-Mtu-RFP)均以可溶形式表达，可溶表达的量分别为614±9mg/L、401±15mg/L、446±40mg/L和244±34mg/L，可溶占比分别为93％、99％、98％和99％。
实施例3：3M NaCl介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入NaCl至3M置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将离心后的沉淀用等体积含3M NaCl的缓冲液B2(175.32g的NaCl、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用体积减半的含3M NaCl的切割缓冲液B3(PBS补加NaCl至3M，补加40mM Bis-Tris，pH 6.2，2mM EDTA)充分重悬沉淀，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。图3A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图3B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目 的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表3所示。
表3 3M NaCl介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(MpA-Mtu-hGH、MpA-Mtu-RFP)的裂解上清在3M NaCl的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀(96％的MpA-Mtu-hGH转化为沉淀、54％的MpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同MpA-Mtu分离，切割效率是45～65％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为72mg/L和79mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为99％和86％。
实施例4：0.7M Na
2SO
4介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入Na
2SO
4至0.7M，置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将沉淀用含0.7M Na
2SO
4的缓冲液B4(99.43g的Na
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用含0.7M Na
2SO
4的切割缓冲液B5(不含NaCl的PBS，补加0.7M Na
2SO
4，补加40mM Bis-Tris，pH6.2，2mM EDTA)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。图4A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品， 上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图4B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表4所示。
表4 0.7M Na
2SO
4介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(MpA-Mtu-hGH、MpA-Mtu-RFP)的裂解上清在0.7M Na
2SO
4的情况下融合蛋白大部分由可溶变为沉淀(96％的MpA-Mtu-hGH转化为沉淀、62％的MpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同MpA-Mtu分离，切割效率是61～95％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为91mg/L和164mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为99％和87％。
实施例5：0.7M(NH
4)
2SO
4介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入(NH
4)
2SO
4至3M置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将沉淀用等体积含0.7M(NH
4)
2SO
4的缓冲液B6(92.50g的(NH
4)
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a 溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后，使用体积减半的含3M NaCl的切割缓冲液B7(不含NaCl的PBS，补加0.7M(NH
4)
2SO
4，补加40mM Bis-Tris，pH6.2，2mM EDTA)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分进行自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图5所示。图5A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图5B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-6为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表5所示。
表5 0.7M(NH
4)
2SO
4介导MpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(MpA-Mtu-hGH、MpA-Mtu-RFP)的裂解上清在0.7M(NH
4)
2SO
4的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀(93％的MpA-Mtu-hGH转化为沉淀、50％的MpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同MpA-Mtu分离， 切割效率是72～98％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为115mg/L和87mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为93％和94％。
实施例6：3M NaCl介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入NaCl至3M置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将离心后的沉淀用等体积含3M NaCl的缓冲液B2(175.32g的NaCl、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用体积减半的含3M NaCl的切割缓冲液B3(PBS补加NaCl至3M，补加40mM Bis-Tris，pH 6.2，2mM EDTA)充分重悬沉淀，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图6所示。图6A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图6B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表6所示。
表6 3M NaCl介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合 蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(CpA-Mtu-hGH、CpA-Mtu-RFP)的裂解上清在3M NaCl的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀(89％的CpA-Mtu-hGH转化为沉淀、25％的CpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同CpA-Mtu分离，切割效率是52～80％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为60mg/L和21mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为73％和74％。
实施例7：0.7M Na
2SO
4介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入Na
2SO
4至0.7M，置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将沉淀用含0.7M Na
2SO
4的缓冲液B4(99.43g的Na
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用含0.7M Na
2SO
4的切割缓冲液B5(不含NaCl的PBS，补加0.7M Na
2SO
4，补加40mM Bis-Tris，pH6.2，2mM EDTA)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图7所示。图7A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图7B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表7所示。
表7 0.7M Na
2SO
4介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(CpA-Mtu-hGH、CpA-Mtu-RFP)的裂解上清在0.7M Na
2SO
4的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀(87％的CpA-Mtu-hGH转化为沉淀、26％的CpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同CpA-Mtu分离，切割效率是60～97％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为75mg/L和36mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为79％和96％。
实施例8：0.7M(NH
4)
2SO
4介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
向实施例2中获得的裂解上清中加入(NH
4)
2SO
4至3M置于4℃过夜12h，使得自聚集肽充分聚集。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将沉淀用等体积含0.7M(NH
4)
2SO
4的缓冲液B6(92.50g的(NH
4)
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2N
a溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)洗涤1次后，使用体积减半的含3M NaCl的切割缓冲液B7(不含NaCl的PBS，补加0.7M(NH
4)
2SO
4，补加40mM Bis-Tris，pH6.2，2mM EDTA)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分进行自切割。4℃孵育3h使聚集肽充分聚集，之后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图8所示。图8A中，泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。图8B中，泳道a-d为红色荧光蛋白RFP表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的红色荧光蛋白RFP条带。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率、人生长激素hGH和红色荧光 蛋白RFP回收率及其在上清中的纯度，结果如表8所示。
表8 0.7M(NH
4)
2SO
4介导CpA-Mtu-hGH/RFP相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的2种融合蛋白(CpA-Mtu-hGH、CpA-Mtu-RFP)的裂解上清在0.7M(NH
4)
2SO
4的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀(74％的CpA-Mtu-hGH转化为沉淀、17％的CpA-Mtu-RFP转化为沉淀)，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同CpA-Mtu分离，切割效率是76～99％，切割后释放到上清中hGH和RFP的产量分别为97mg/L和18mg/L，切割后回收的hGH和RFP纯度分别为57％和95％。
实施例9：MpA/CpA-Mtu-RFP聚集体和切割上清中RFP的活性表征
分别对实施例3～8中MpA/CpA-Mtu-RFP的裂解上清加盐孵育过夜12h后形成的聚集体和MpA/CpA-Mtu-RFP的切割上清进行拍照，自然光下RFP呈现红色和365nm紫外光下RFP显红色荧光来鉴定聚集体MpA/CpA-Mtu-RFP和切割上清RFP的活性，结果如图9所示。图9A中从左到右依次为3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4三种盐加入到MpA-Mtu-RFP裂解上清孵育12h后形成的聚集体，在自然光下三种聚集体都显红色，说明MpA-Mtu-RFP加盐后形成的聚集体都是具有活性的。图9B中从左到右依次为3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4三种盐对应的MpA-Mtu-RFP切割上清，在自然光下三种盐对应的切割上清都显红色，图9C中在365nm紫外光下切割上清都显红色荧光，说明三种盐条件下MpA-Mtu-RFP切割上清中的RFP都是具有活性的。图9D中从左到右依次为3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4三种盐加入到CpA-Mtu-RFP裂解上清孵育12h后形成的聚集体，在自然光下三种聚集体都显红色，说明CpA-Mtu-RFP加盐后形成的聚集体都是具有活性的。图9E中从左到右依次为3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4三种盐对应的CpA-Mtu-RFP切割上清，在自然光下三种盐对应的切割上清都显红色，图9F中在365nm紫外光下切割上清都显红色荧光，说明三种盐条件下CpA-Mtu-RFP切割上清中的RFP都是具有活性的。
实施例10：3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导 MpA-Mtu-GST/LCB3/ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher相变和Mtu介导切割的蛋白纯化
为了证明MpA-Mtu-POI方法的普适性，我们使用该方法对另外三种不同类型的目的蛋白进行纯化，谷胱甘肽巯基转移酶GST、新冠多肽LCB3(Cao,L.等Science,2020.370(6515):p.426-431.)和多价骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher。首先将实施1中已介绍的三种表达质粒pET30a-MpA-Mtu-GST、pET30a-MpA-Mtu-LCB3和pET30a-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher导入到表达菌株E.coli BL21(DE3)中，采用与实施例2相同的方法获得了上述三种融合蛋白对应表达菌株的裂解上清。向裂解上清中分别加入NaCl至3M、Na
2SO
4至3M和(NH
4)
2SO
4至0.7M，置于4℃诱导聚集30分钟。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将离心后的沉淀用等体积含相同盐的缓冲液B2、B4或B6洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用体积减半含相同盐的切割缓冲液B3、B5或B7充分重悬沉淀，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。然后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图10所示。图10中，泳道a-f为三种目的蛋白的表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e和f：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的目的蛋白条带，其中e泳道是a-d泳道上样量的2倍，f泳道是a-d泳道上样量的10倍。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg，其中图10B、图10E和图10H中，泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA和异肽酶APR的蛋白定量标准品，BSA和APR各自在泳道中的上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg。泳道M1和M2为蛋白分子量标准品。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、MtuΔI-CM切割效率和回收率及其在上清中的纯度，结果如表9所示。
表9 3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导MpA-Mtu-GST/LCB3/ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher相变和Mtu介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升LB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的3种融合蛋白(pET30a-MpA-Mtu-GST、pET30a-MpA-Mtu-LCB3和pET30a-MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher)的裂解上清在3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀，其中3M NaCl和0.7M Na
2SO
4的诱导聚集效果(聚集效率：65％～96％)比0.7M(NH
4)
2SO
4(聚集效率：51％～93％)的更突出，内含肽MtuΔI-CM自切割，目的蛋白同MpA-Mtu分离，切割效率是68～99％。3M NaCl诱导的情况下3种目的蛋白的产量为10～125mg/L，纯度为68％～97％；0.7M Na
2SO
4诱导的情况下3种目的蛋白的产量为12～102mg/L，纯度为72％～97％；0.7M(NH
4)
2SO
4诱导的情况下3种目的蛋白的产量为2～117mg/L，纯度为33％～85％。
实施例11：3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导Xylanase-Mxe-MpA相变和Mxe介导切割的蛋白纯化
为了测试内含肽Mxe GyrA能否应用于该纯化方法，我们将实施1中已介绍的表达质粒pET30a-Xylanase-Mxe-MpA导入到表达菌株E.coli BL21(DE3)中，采用实施例2中类似的表达方法，将Xylanase-Mxe-MpA表达菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD
600＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在18℃诱导24小时，测量菌浓度OD
600，4℃4,000rpm离心25min收获细胞，除去上清的培养基将菌体冻存-80℃，采用与实施例2相同的方法获得了融合蛋白Xylanase-Mxe-MpA对应表达菌株的裂解上清。向裂解上清中分别加入NaCl至3M、Na
2SO
4至3M和(NH
4)
2SO
4至0.7M，置于4℃诱导聚集30分钟。之后将悬浊液在4℃，15,000g的条件下离心30min，将离心后的沉淀用等体积含相同盐的缓冲液B2、B4或B6洗涤1次后等条件离心分离上清和沉淀，使用体积减半含相同盐的切割缓冲液 B8(175.32g的NaCl、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2Na、6.17g二硫苏糖醇DTT溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)、B9(99.428g的Na
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2Na、6.17g二硫苏糖醇DTT溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)或B10(92.498g的(NH
4)
2SO
4、2.4g的Tris、0.37g的EDTA·2Na、6.17g二硫苏糖醇DTT溶解于800mL水中，调pH至8.0，加水定容至1L)充分重悬沉淀，置于25℃24h，使得内含肽充分自切割。然后将悬浊液4℃，16,000g的条件下离心30min分离。裂解细胞后的上清、加盐聚集后的上清和沉淀、切割后的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测，结果如图11所示。图11中，泳道a-f为三种目的蛋白的表达与纯化样品，分别是a：细胞裂解物上清，可检测到清晰的融合蛋白条带；b：裂解物上清加盐聚集后分离的上清；c：裂解物上清加盐聚集后分离的沉淀，可检测到清晰的融合蛋白条带；d：加盐获得的聚集体切割后的沉淀；e和f：加盐获得的聚集体切割后的上清，可检测到清晰的目的蛋白条带，其中e泳道是a-d泳道上样量的2倍，f泳道是a-d泳道上样量的10倍。泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为0.125μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg，泳道M1和M2为蛋白分子量标准品。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ(National Institutes of Health)凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的蛋白产量、加盐后的聚集效率、Mxe GyrA切割效率和回收率及其在上清中的纯度，结果如表10所示。
表10 3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导Xylanase-Mxe-MpA相变和Mxe介导切割的蛋白纯化情况
a内含肽介导的自切割后的目的蛋白的产量(体积以每升TB培养基来计算)，
b聚集效率＝100％×加盐后沉淀中融合蛋白的量/(加盐后沉淀中融合蛋白的量+加盐后上清中融合蛋白的量)，
c内含肽介导的自切割效率＝100％×(加盐后沉淀中融合蛋白的量-切割后沉淀中融合蛋白的量)/加盐后沉淀中融合蛋白的量，
d回收率＝100％×目的蛋白实际产量/表达上清在完全切割的情况下可生产目的蛋白的理论产量。
所采用的Mxe内含肽融合蛋白(Xylanase-Mxe-MpA)的裂解上清在3M NaCl、0.7 M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4的情况下融合蛋白由可溶变为沉淀，其中0.7M Na
2SO
4的聚集效率最高可达69％，3M NaCl和0.7M Na
2SO
4的聚集效率分别为41％和37％，内含肽Mxe GyrA自切割，目的蛋白同Mxe-MpA分离，切割效率是63～85％。3M NaCl诱导的情况下目的蛋白Xylanase的产量为35mg/L，纯度为49％；0.7M Na
2SO
4诱导的情况下目的蛋白Xylanase的产量为103mg/L，纯度为84％；0.7M(NH
4)
2SO
4诱导的情况下目的蛋白Xylanase的产量为37mg/L，纯度为54％。
实施例12：通过生物膜层光学干涉(BLI)技术检测纯化后人生长激素hGH的亲和力
首先采用标准的色谱柱纯化法对MpA-Mtu-hGH的切割上清进行进一步纯化，根据hGH的等电点(pI＝5.27)选择阴离子交换柱Capto Q(GE Healthcare,USA),通过透析或超滤的方法将切割上清的切割缓冲液更换为用于离子交换的起始缓冲液(2.4g的Tris，溶解于800mL水中，调pH至7.2，加水定容至1L)，然后使用0.22μm滤膜对样品进行过滤，使用
KTA
TM蛋白纯化层析系统进行上样，采用20个柱体积0～1M NaCl的线性梯度洗脱，收集离子交换纯化获得的洗脱样品。将离子交换纯化获得hGH样品分别通过SDS-PAGE和BCA Kit(Thermo Fisher,USA)进行纯度和质量浓度的测定。使用商品化的人重组生长激素hGH(金赛药业，中国)作为阳性对照，整个BLI实验使用分子相互作用仪Octet RED96(ForteBio)进行检测，按照Amine Reactive 2nd Generation(AR2G)生物传感器(ForteBio,CA)说明书将20μg/ml的人生长激素受体蛋白hGH receptor(Abcam,UK)在10mM醋酸钠(pH 4.0)的溶液中固定到AR2G传感器上，然后使用1M乙醇胺溶液封闭传感器，接着在动力学缓冲液(含0.1％牛血清白蛋白BSA和0.02％吐温-20的PBS,pH 7.4)中平衡已经固定了生长激素受体蛋白的传感器，再然后将平衡后的传感器与待测的hGH样品(浓度梯度为25nM、50nM、100nM、200nM和400nM的hGH)在动力学缓冲液中亲和600秒，然后再将亲和后的传感器在动力学缓冲液中解离600秒，结合和解离的动力学结果如图12所示。按照Octet动力学操作手册进行结合解离常数K
D、结合的动力学常数Kon和解离的动力学常数Koff的计算，结果如表11所示。
表11 3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的人生长激素hGH与人生长激素受体蛋白hGH receptor的亲和力测试结果
*商品化的冻干粉直接使用
采用该方法初纯化的人生长激素hGH经过离子交换精纯化后都能与人生长激素受体蛋白hGH receptor发生结合和解离且与商品化的人生长激素hGH效果相近。3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4三种盐介导纯化获得的hGH和阳性对照(商品化的hGH)相比较，结合解离常数K
D值都小于10
-12，结合的动力学常数Kon(10
5M
-1s
-1)值在1.82～3.53之间，解离的动力学常数Koff(s
-1)值都小于10
-7 。
实施例13：通过生物膜层光学干涉(BLI)技术检测纯化后新冠多肽LCB3的亲和力
首先采用标准的色谱柱纯化法对MpA-Mtu-LCB3的切割上清进行进一步纯化，根据LCB3的等电点(pI＝4.94)选择阴离子交换柱Capto Q(GE Healthcare,USA),采用实施例12中同样的方法对LCB3进行精纯化、纯度和质量浓度的测定。整个BLI实验使用分子相互作用仪Octet RED96(ForteBio)进行检测，按照Amine Reactive 2nd Generation(AR2G)生物传感器(ForteBio,CA)说明书将20μg/ml的LCB3的受体蛋白即新冠病毒刺突蛋白SARS-CoV-2 Spike protein(金斯瑞，中国)在10mM醋酸钠(pH 6.0)的溶液中固定到AR2G传感器上，然后使用1M乙醇胺溶液封闭传感器，接着在动力学缓冲液(含0.1％牛血清白蛋白BSA和0.02％吐温-20的PBS,pH 7.4)中平衡已经固定了新冠病毒刺突蛋白的传感器，再然后将平衡后的传感器与待测的LCB3样品(浓度梯度为12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM的LCB3)在动力学缓冲液中亲和600秒，然后再将亲和后的传感器在动力学缓冲液中解离600秒，结合和解离的动力学结果如图13所示。按照Octet动力学操作手册进行结合解离常数K
D、结合的动力学常数Kon和解离的动力学常数Koff的计算，结果如表12所示。
表12 3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的新冠多肽LCB3与新冠病毒刺突蛋白SARS-CoV-2 Spike protein的亲和力测试结果
采用该方法初纯化的新冠多肽LCB3经过离子交换精纯化后都能与新冠病毒刺突蛋白SARS-CoV-2 Spike protein发生结合和解离，结合解离常数K
D与文献(Cao,L.等Science,2020.370(6515):p.426-431.)报道的小于10
-9相近。
实施例14：Xylanase-Mxe-MpA切割上清活性验证
采用DNS法(Miller,G.L.等Analytical Chemistry,1959.31(3):p.426-428.)对Xylanase-Mxe-MpA切割上清中的木聚糖酶xylanase进行酶活测定。选择木聚糖(Sigma， USA)作为底物，木糖(阿拉丁，中国)作为标准品用于制作还原糖含量的标准曲线。木聚糖酶的催化反应在含0.5％(W/V)木聚糖的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中进行，反应条件55℃15min，以每分钟水解底物生成1μmoL还原糖所需的酶量定义为一个酶活性单位(IU)。将三种盐3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化得到的切割上清分别稀释到适当的浓度，然后进行酶活测定，结果如表13所示。
| 待测样品 | 初纯化所用的盐 | 酶活(units/mg) |
| Purified xylanase | 3M NaCl | 30 |
| Purified xylanase | 0.7M Na 2SO 4 | 16 |
| Purified xylanase | 0.7M(NH 4) 2SO 4 | 12 |
3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的木聚糖酶xylanase通过DNS法测定的酶活大于商业的木聚糖酶(Sigma,253-439-7)的酶活(≥2.5units/mg)。
实施例15：MpA-Mtu-GST切割上清活性验证
采用谷胱甘肽巯基转移酶活性检测试剂盒(生工生物，D799612)的方法对MpA-Mtu-GST切割上清中的谷胱甘肽巯基转移酶GST进行酶活测定，选择氨基酸序列同样来源于日本血吸虫的GST重组蛋白(义翘神州，11213-HNAE)作为阳性对照。按照试剂盒说明书的方法测定的酶活结果如表14所示。
| 待测样品 | 初纯化所用的盐 | 酶活(units/mg) |
| Purified GST | 3M NaCl | 6.1 |
| Purified GST | 0.7M Na 2SO 4 | 5.4 |
| Purified GST | 0.7M(NH 4) 2SO 4 | 5.7 |
| GST standard | - | 6.8 |
3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的谷胱甘肽巯基转移酶GST酶活(5.4～6.1units/mg)与GST标准品的酶活(6.8units/mg)相近。
实施例16：MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher切割上清活性验证
基于Spy化学(Zakeri,B.等Proceedings of the National Academy of Sciences,2012.109(12):p.E690-E697.)，ΔNSpyCatcher(Liu,Z.等Sci Rep,2014.4:p.7266.)能够与SpyTag自发形成异肽键，采用SDS-PAGE法鉴定共价结合产物的形成，从而验证切割上清中骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher的活性。将三种盐3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的MpA-Mtu-ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher切割上清和已纯化的LCB3-SpyTag分别用PBS稀释到20μM和120μM，然后将三种切割上清分别等体积与LCB3-SpyTag混合，25℃孵育2小时，将反应前后的样品通过SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE结果如图14所示，泳道1为反应前的LBS3-SpyTag，泳道2、4和6为反应前三种盐介导纯化对应的切割上清，泳道3、5和7为反应后的样品。在泳道3、5和7中能够明显观察到骨架蛋白ΔNSpyCatcher-ELP-ΔNSpyCatcher与LCB3-SpyTag形成的二价结合产物(ΔNSpyC-ELP-ΔNSpyC:2 LCB3-SpyTag,44.6kDa)， 且ΔNSpyC-ELP-ΔNSpyC对应条带都基本消失，说明三种盐介导纯化的骨架蛋白ΔNSpyC-ELP-ΔNSpyC都几乎完全参与反应，即三种盐3M NaCl、0.7M Na
2SO
4和0.7M(NH
4)
2SO
4介导纯化的ΔNSpyC-ELP-ΔNSpyC均具有活性。
序列表
参考文献
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[17].Liu,Z.,et al.,A novel method for synthetic vaccine construction based on protein assembly.Sci Rep,2014.4:p.7266.
Claims (29)
- 一种融合多肽，其包含目的多肽部分和盐浓度响应性自聚集肽部分，其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述盐浓度响应性自聚集肽部分，并且其中所述间隔物包含切割位点，其中所述盐浓度响应性自聚集肽为CpA变体，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1的第1位和第17位的位置包含C1M以及C17M的氨基酸取代。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述CpA变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述盐浓度响应性自聚集肽为在第一盐条件下可溶且在第二盐条件下能够自聚集的肽。
- 权利要求3的融合多肽，其中所述第一盐条件包含第一盐浓度，所述第二盐条件包含第二盐浓度，所述第一盐浓度低于所述第二盐浓度。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述间隔物与所述目的多肽部分和/或所述盐浓度响应性自聚集肽部分直接连接。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述间隔物在其N端和/或C端进一步包含接头。
- 权利要求6的融合多肽，其中所述接头选自GS型接头和PT型接头。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述目的多肽部分位于所述融合多肽的C端，且所述间隔物连接于所述目的多肽部分的N端。
- 权利要求8的融合多肽，其中所述间隔物通过所述切割位点连接于所述目的多肽部分。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述切割位点选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点、离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述间隔物包含内含肽，所述内含肽包含自切割位点。
- 权利要求11的融合多肽，其中所述内含肽选自Mxe GyrA、Ssp DnaB或MtuΔI-CM。
- 权利要求11的融合多肽，其中所述内含肽为MtuΔI-CM，其包含SEQ ID NO:3所示的序列。
- 权利要求1的融合多肽，其中所述目的多肽长度为20、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸残基，或为任意两个上述长度之间的任意长度。
- 一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-14中任一项的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
- 一种分离的多核苷酸，其包含编码CpA变体的核苷酸序列或其互补序列，其中所述CpA具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述CpA变体在对应于SEQ ID NO:1 的第1位和第17位的位置处包含C1M和C17M的氨基酸取代。
- 表达构建体，其包含权利要求15的多核苷酸。
- 宿主细胞，其包含权利要求15的多核苷酸或由权利要求17的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
- 权利要求18的宿主细胞，其选自原核生物、酵母和高等真核细胞。
- 权利要求19的宿主细胞，其中所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。
- 权利要求19的宿主细胞，其中所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(E.coli)。
- 生产和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养权利要求18-21中任一项的宿主细胞，从而表达融合多肽；(b)在第一盐条件下，裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的不溶部分，回收可溶部分；(c)在第二盐条件下，所述融合蛋白形成不溶部分；(d)回收步骤(c)中形成的不溶部分；(e)通过切割所述切割位点从收集自步骤(d)的不溶部分释放可溶的目的多肽；和(f)去除步骤(e)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。
- 权利要求22的方法，其中所述第一盐条件包含第一离子强度，所述第二盐条件包含第二离子强度，所述第一离子强度低于所述第二离子强度。
- 权利要求22的方法，其中所述步骤(c)包括调节含有收集自步骤(b)的可溶部分的溶液的盐浓度。
- 权利要求22的方法，其中所述步骤(c)包括升高含有收集自步骤(b)的可溶部分的溶液的盐浓度。
- 权利要求22的方法，其中步骤(e)在第二盐条件下进行。
- 权利要求22的方法，其中所述第一盐条件下和/或第二盐条件下的所述盐选自氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钾、硝酸铵、硫酸铵或氯化铵，优选为氯化钠、硫酸钠或硫酸铵。
- 权利要求22的方法，其中所述第一离子强度为0-0.2mol/L。
- 权利要求22的方法，其中所述第二离子强度为0.5-5mol/L。
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