CN108486088A - 腈水解酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位氨基酸，或对第324‑381位氨基酸序列进行一位或多位替换获得的。本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶LNIT5纯酶在45℃下的热稳定性最高提高了4.5倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1‑氰基环己基乙腈，产物得率得到了提高。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。

Description

腈水解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种来源于未培养微生物的腈水解酶的突变体及其在抗癫痫药物中间体1-氰基环己基乙酸合成中的应用。
背景技术
加巴喷丁化学名为1-氨甲基-1-环己烷乙酸。由美国Warner-Lambert公司开发，于1993年5月首先在英国上市，1994年获得FDA批准在美国上市，后来陆续在全世 界众多国家被用于癫痫病治疗，1996年，Warner-Lambert公司开始扩大加巴喷丁适应 症的研究，2002年，FDA批准将其用于治疗神经病理性疼痛药。加巴喷丁除可单独 用于治疗一般癫痛病外，还被作为难治性癫痫病的叠加治疗药，它具有耐受性良好， 副作用轻微的优点，是人们期待的推动世界癫痫药物市场发展的药物之一。目前，加 巴喷丁的专利已经到期，世界各国纷纷开展对于该产品的研究，原料药需求巨大，市 场前景广阔。
1-氰基环己基乙酸(1-Cyanocyclohexaneacetic acid)是合成新一代抗癫痫药物加 巴喷丁(Gabapentin)的关键中间体，市场前景非常广阔。目前，用于合成加巴喷丁 包括其关键中间体1-氰基环己基乙酸全部采用化学合成技术，生产过程中存在三废排 放量大，环境污染严重，三废处理成本高等问题。
腈水解酶(Nitrilase EC 3.5.5.1)是一种能将腈类物质(含有-CN)水解为相应羧酸的 酶。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且具有比较高的区域选择性和立体选择性，反应条件温和，环境污染小，成本低，是一种环境友好的绿色 合成方法，符合原子经济的要求。由于腈水解酶的这些优异的特性，使其成为工业上 极具发展潜力的催化剂。目前工业化应用中比较成功的腈水解酶的例子很多，德国 BASF公司的产品(R)-扁桃酸，首先由苯甲醛和氢氰酸反应生成消旋扁桃腈，再选择 合适的反应条件，通过腈水解酶催化的动态动力学拆分，可以定量地转化为(R)-扁桃 酸。杜邦公司开发了一套工业化生产过程，将2-甲基戊二腈(MGN，己二腈制造尼 龙-66过程中产生的副产物)转化为1,5-二甲基-2-哌啶酮(1,5-DMPD)。1,5-二甲基-2- 哌啶酮在电子学、涂层及溶剂应用中具有令人满意的特性。MGN首先用固定化的含 腈水解酶的微生物细胞催化剂(Acidovoraxfacilis 72W)水解为4-氰基戊酸(4-CPA) 铵盐，水解反应的选择性大于98％，转化率为100％，能得到二分之一氰基羧酸铵盐， 产生1～2％的唯一反应副产物2-甲基戊二酸二铵盐。与一个由MGN加氢直接转化为 1,3-DPMD和1,5-DMPD混合物的化学工艺相比，化学-酶法生产工艺产量高、产生的 浪费较少，并生成单一的内酰胺异构体。此外，许多腈水解酶已经被开发并用于多种 药物中间体和精细化学品的合成。
但是，天然的腈水解酶热稳定性普遍较差，这阻碍了其工业应用。提高酶的热稳定性，可通过对酶进行化学修饰或分子改造而实现。由于腈水解酶的晶体结构报道较 少，对于腈水解酶稳定性的改造也罕有报道。
从敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M 209044克隆的腈水解酶已经在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中过量表达，通过分子改造，对底物1-氰基 环己基乙腈表现出了较高的催化活力，能够催化1-氰基环己基乙腈生产加巴喷丁的中 间体1-氰基环己基乙酸(Catalysis Communications,2015，66,121-125)。但是，该生 物催化剂还存在温度稳定性较差，高温下催化反应效率较低，反应时间较长等问题。 后续的研究中，利用易错PCR及定点突变技术改造来源于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M209044的腈水解酶，使其在45℃下的温度稳定性提高了14倍， 对于利用分子改造技术提高腈水解酶温度稳定性具有重要的参考价值。
发明内容
本发明要针对来源于未培养微生物腈水解酶LNIT5(GenBank Accession no:AAR97494.1)温度稳定性较差的问题，提供了多个腈水解酶突变体蛋白及在1-氰基 环己基乙酸合成中的应用，包括含有该基因的重组载体，以及重组载体转化得到的重 组基因工程菌。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位进行突变，或对第324-381位氨基酸序列中进行替换获得的。
进一步，优选所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位亮氨酸突变为苯丙氨酸，突变体氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核苷酸序列 SEQ IDNo.3；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第324-381位氨基酸替换为来源于 敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)CCTCC NO:M 209044腈水解酶的第324-371位氨 基酸(第324-371位氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，核苷酸序列SEQ ID No.7)，突 变体氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示，核苷酸序列SEQ ID No.5。
本发明利用NCBI数据库，筛选得到来源于未培养微生物腈水解酶编码基因(GenBank Accession no:AAR97494.1)，为了实现其在大肠杆菌等原核生物中的可溶 性表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于SEQ ID No.2所示氨 基酸序的该腈水解酶的核苷酸序列SEQ ID No.1。利用定点突变技术对SEQ ID No.2 所示氨基酸序进行突变，首先利用引物进行PCR扩增，对第201位进行定点突变， 得到含有腈水解酶突变体核苷酸序列的表达载体pET-28b(+)后，转入大肠杆菌宿主， 诱导表达后得到温度稳定性提高的突变体，从而获得能够高效催化双腈化合物区域选 择性水解合成单氰基羧酸化合物的突变体蛋白LNIT5-L201F(核苷酸序列SEQ ID No.3)。
利用同源重组原理，首先设计引物，利用PCR扩增包含同源臂的来源于敏捷食 酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 209044(GenBank Accession no.KJ001820)腈水解酶 中第324-371位氨基酸所对应的核苷酸序列(SEQ ID No.7)；其次，设计引物，利用 PCR扩增包含同源臂及来源于未培养微生物腈水解酶编码基因(GenBank Accession no:AAR97494.1)第1-323位氨基酸所对应的核苷酸序列的线性化载体序列；利用同 源重组将两段核苷酸序列融合，得到含有腈水解酶融合体核苷酸序列的重组表达载体 pET-28b(+)，转入大肠杆菌宿主，诱导表达后得到温度稳定性提高的突变体，从而获 得能够高效催化双腈化合物区域选择性水解合成单氰基羧酸化合物的突变体蛋白 NITLNIT5-AcN(核苷酸序列SEQ ID No.5)。
本发明还涉及一种所述腈水解酶突变体的编码基因、由所述编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。所述的宿主细胞可以 是本领域的各种常规宿主细胞，本发明优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。具体地，合 成后的腈水解酶基因通过酶切连接的方法连接到表达载体pET-28b(+)上，构建成为重 组表达载体pET-28b(+)-LNIT5。本发明还提供了包含上述腈水解酶基因LNIT5的重 组工程菌株，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。将上述的重组表达载体pET-28b(+)–LNIT5 转化到宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)之中得到该重组菌株。
本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在催化双腈化合物制备单氰基羧酸化合物中的应用，具体所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的 湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以1-氰基环 己基乙腈为底物，以pH＝7.0、200M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为反应介质，45℃ 恒温水浴反应完全后，将反应液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述底物终浓度 以缓冲液体积计为100～1300mM，优选1000mM，所述催化剂用量以湿菌体重量计 为10～100g/L缓冲液，优选50g/L。
进一步，所述催化剂按如下方法之一制备：(1)将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中，37℃培养10-12小时，按体积浓度2％的接种量接种至含终 浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基进行扩大培养，37℃培养至培养液的OD600为 0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱 导培养10小时，离心，收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体；(2)将步骤 (1)湿菌体用含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液重悬，超声 波破碎(400W,15min,1s破碎1s暂停)，破碎产物离心(12000×g,20min)后取上清 液作为粗酶液；将粗酶液以1mL/min的流速通过经平衡缓冲液冲洗的Ni-NTA柱， 用洗脱缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min；再用蛋白洗脱缓冲液洗脱并收 集目的蛋白，流速为2mL/min；最后将收集的目的蛋白以质量浓度0.9％氯化钠水溶 液为透析液进行透析，取截留液即为纯酶；所述平衡缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液；所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和50 mM咪唑的pH8.0、50mM NaH2PO4缓冲液；所述蛋白洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和250mM咪唑的pH8.0、50mM NaH2PO4缓冲液。
本发明所述的腈水解酶突变体可以是含有该腈水解酶突变体基因的重组表达转化体(即湿菌体，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3))，也可以是未纯化的粗酶液， 或是经过纯化后的纯酶，如果需要可以对其进行固定化后进行使用。
Luria-Bertani(LB)液体培养基终浓度组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值自然。
LB固体培养基质量终浓度组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯 化钠，琼脂1.5％，溶剂为水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶LNIT5纯酶的热稳定性最高提高了4.5倍，且利用含有腈水解酶突变体的重 组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1-氰基环己基乙腈，产物耐受性得到提高， NIT5-L201F活力提高了20％，而突变体NITLNIT5-AcN在750mM底物浓度下，转 化率提高了1倍，可以在8小时内完成750mM 1-氰基环己基乙腈的完全转化。因此， 本发明所获得的突变体在高效催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰基环 己基乙酸中具有良好的应用前景。
附图说明
图1腈水解酶突变体纯酶活力的比较。
图2腈水解酶突变体在45℃下的热稳定性。
图3含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞活力比较。
图4含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化400mM 1-氰基环己基乙腈时间比较曲线图。
图5含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化750mM 1-氰基环己基乙腈比较时间曲线图。
图6含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化1.0M 1-氰基环己基乙腈时间曲线图。
图7 1-氰基环己基乙酸高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：腈水解酶LNIT5的获得
根据蛋白质NCBI数据库，利用来源于敏捷食酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 209044的腈水解酶为模板进行BLAST，从结果中筛选得到一个腈水解酶基因 (GenBank Accessionno:AAR97494.1)。该腈水解酶开源于未培养微生物，其与来源 于敏捷食酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 209044腈水解酶相似度为76％。根据该睛 水解酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，该段腈水解酶 基因LNIT5如SEQ ID No.2所示，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2：重组表达载体pET-28b(+)-LNIT5的构建以及重组工程菌的构建
通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了含有腈水解酶基因LNIT5的重组表达载体pET-28b(+)-LNIT5。将构建的表达载体pET-28b(+)-LNIT5转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上， 37℃培养过夜。于平板上随机挑取菌落，并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获 得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5。
表1引物设计表
实施例3：腈水解酶LNIT5突变体的构建
以表达质粒pET-28b(+)-LNIT5为模版，通过全质粒扩增进行定点突变。PCR体 系(50μL)为：模版0.5-20ng，引物L201F-f及L201F-r(序列见表1)各10-15pmol， 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)，0.2mM dNTP，1.25U PrimeSTAR HS DNA Polymerase。PCR条件(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)60℃退火5s； (4)72℃延伸6.5min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸5min，4℃ 保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，利用DpnI消化后导入宿主菌E.coli BL21 (DE3)，涂布至含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，得到单克隆。将挑取的单克隆抽 提质粒，由北京擎科新业生物技术有限公司基因测序验证，得到突变体LNIT5-L201F， 其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
以含有来源于敏捷食酸菌(A.facilis)CCTCC NO:M 209044的腈水解酶AcN的 重组表达质粒pET-28b(+)-AcN为模板，通过PCR扩增得到含有同源臂及腈水解酶 AcN其C端324-371位氨基酸所对应的核苷酸序列(第324-371位氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，核苷酸序列SEQ ID No.7)。PCR体系(50μL)为：模板0.5-20ng，引物 I-f及I-r各10-15pmol，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)，0.2mM dNTP，1.25U PrimeSTAR HS DNA Polymerase。PCR条件为1)98℃预变性3min；(2)98℃变性 10s；(3)60℃退火5s；(4)72℃延伸10s，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最 后72℃延伸5min，4℃保存。得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，对150bp 左右的DNA片段进行回收待用。以表达质粒pET-28b(+)-LNIT5为模版，通过PCR扩增得到含有同源臂以及腈水解酶LNIT5中N端1-323位氨基酸所对应的核苷酸序 列的pET-28b(+)线性质粒序列。PCR体系(50μL)为：模板0.5-20ng，引物P-f及P-r 各10-15pmol，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)，0.2mM dNTP，1.25U PrimeSTAR HS DNA Polymerase。PCR条件为1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)60℃ 退火5s；(4)72℃延伸6.5min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸 5min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，使用限制性内切酶DpnI消化， 利用PCR纯化试剂盒得到目的片段。最后，利用II One Step Cloning Kit (南京诺唯赞生物科技有限公司)实现同源重组。将该含有融合蛋白的表达质粒导入 宿主菌E.coli BL21(DE3)，涂布至含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，得到单克隆。 将挑取的单克隆抽提质粒，由北京擎科新业生物技术有限公司基因测序验证，得到融 合蛋白NITLNIT5-AcN，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列如SEQ ID No.5 所示。
实施例4：腈水解酶突变体的表达
实施例2和实施例3中得到的转化子E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5-L201F和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN， 接种到LB培养基中，37℃培养10-12小时，按体积接种量2％接种至含有卡那霉素(终 浓度50mg/L)的LB培养基进行扩大培养(37℃)。待培养液的OD600为0.6-0.8之间， 加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃诱导培养10小 时。培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体。
实施例5：腈水解酶突变体蛋白的纯化
(1)向实施例4中收集到的湿菌体中加入50mM NaH2PO4，300mM NaCl缓冲 液(pH8.0)，重悬菌体后超声波破碎(400W,15min,1s破碎1s暂停)。破碎产物离心 (12000×g,20min)后取上清液作为粗酶液，准备分离纯化。
(2)预装好20mL Ni-NTA亲和层析柱后，使用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4， 300mMNaCl，pH 8.0)进行平衡，流速为2mL/min。
(3)清洗8-10个柱体积后将所得到的粗酶液以1mL/min的流速通过Ni-NTA柱， 目的蛋白则挂载在层析柱上。上样后大量未吸附的杂蛋白不与树脂结合，将直接被除 去。
(4)使用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，50mM咪唑，pH 8.0) 洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min。
(5)使用蛋白洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱并收集目的蛋白，流速为2mL/min。
(6)收集的酶液使用透析袋(Economical Biotech Membrane，14KD，34mm Width，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，透析液为质量浓度0.9％氯化钠水溶液， 取截留液即为纯化后的蛋白。
(7)通过SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。
实施例6：腈水解酶活力的测定
对实施例5中纯化后的蛋白进行酶活的测定。腈水解酶活力检测反应体系(10mL)：缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(100mM,pH 7.0)，200mM 1-氰基环己基乙腈， 75mg纯酶。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应10min。取样500μL上清， 加入500μL 2M的HCl终止反应后，利用液相色谱(岛津LC-16)外标法测定转化 液1-氰基环己基乙酸转化率。色谱柱为XBridge BEH C18Column(5μm,4.6mm ×250mm,1/pkg,Waters)，流动相为缓冲液(0.58g/L磷酸氢二铵，1.83g/L高氯酸钠， 高氯酸调节pH为1.8)∶乙腈＝76∶24(v/v)，流速为1mL/min，紫外检测波长215nm， 柱温40℃。酶活定义(U)：在45℃、pH 7.0，100mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲 液条件下，每分钟催化生成1μmol1-氰基环己基乙酸所需要的酶量定义为1U。结果 见图1所示。
实施例7：腈水解酶突变体45℃下温度稳定性的测定
对实施例5中纯化后的蛋白进行热稳定性的测定。取一定量的蛋白于50mL无菌 聚丙烯离心管中，保存于45℃恒温水浴锅中。于不同时间取出蛋白，按照实施例6 的方法，测定蛋白的活力。以未保存时，蛋白的活力为对照，计算各时间下，蛋白的 相对残余活力(Residual activity)。
结果见图2所示，经测定，原始腈水解酶LNIT5的半衰期为6h，突变体 LNIT5-L201F的半衰期为16h，融合蛋白NITLNIT5-AcN的半衰期为27h。
实施例8：含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力的测定
将实施例4中培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5-L201F和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN进行活力的测定。腈水解酶活力检测反应体系(10 mL)：缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(200mM,pH 7.0)，终浓度100mM 1-氰基环己 基乙腈，重组大肠杆菌湿菌体10g/L。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应 10min。取样500μL上清，利用液相色谱(岛津LC-16)外标法测定转化液1-氰基环 己基乙酸转化率。液相检测条件如实施例6中所述，结果见图3所示。
实施例9：含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌45℃下温度稳定性的测定
将实施例4中培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5-L201F和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN静息细胞用缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(200 mM,pH7.0)配置成20g/L的菌悬液，保存于45℃恒温水浴锅中。于不同时间取出 菌悬液，按照实施例8的方法，测定静息细胞的活力。以未保存时，静息细胞的活力 为对照，计算各时间下，静息细胞的相对残余活力，结果见表2所示。
表2含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞在45℃下的稳定性
实施例10：使用含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌转化400mM 1-氰基环己基乙腈
分别称取0.5g实施例4方法获得的E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5，E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5-L201F和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN湿 菌体悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mM，pH＝7.0)，加入 0.592g 1-氰基环己基乙腈(终浓度400mM)，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样， 12000rpm离心，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高效液 相色谱分析条件如实施例6中所述。
经测定，如图4所述，E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5，E.coli BL21 (DE3)/pET-28b(+)-LNIT5-L201F和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN均可在6 h内将底物反应完全，其中E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN快于E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5。
实施例11：使用含腈水解酶突变体NITLNIT5-AcN的重组大肠杆菌转化750mM 1- 氰基环己基乙腈
分别称取0.5g实施例4方法获得的E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN湿菌体悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mM，pH＝7.0)，加 入1.11g 1-氰基环己基乙腈(终浓度0.75M)，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样， 12000rpm离心3min，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高 效液相色谱分析条件如实施例6中所述。
经测定，如图5所述，突变体E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN可在8h 内将底物反应完全，远快于E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-LNIT5。
实施例12：使用含腈水解酶突变体NITLNIT5-AcN的重组大肠杆菌转化1.0M 1-氰 基环己基乙腈
分别称取0.5g实施例4方法获得的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-NITLNIT5-AcN湿菌体悬浮于10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mM，pH＝7.0)，加入 1.48g 1-氰基环己基乙腈(终浓度1.0M)，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样，12000 rpm离心3min，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高效液 相色谱分析条件如实施例6中所述。
经测定，如图5所述，突变体E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-NITLNIT5-AcN可在 11h内将底物反应完全。
实施例13：使用固定化细胞转化750mM 1-氰基环己基乙腈
称取2g实施例4方法获得的E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NITLNIT5-AcN湿菌体悬浮于20mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mM，pH＝7.0)，加入终浓度0.006 g/mL硅藻土，室温搅拌1h。随后加入终浓度3％(v/v)聚乙烯亚胺(质量浓度5％(w/w) 水溶液形式加入)，室温搅拌1h。最后加入终浓度1％(v/v)戊二醛(25％(w/w)水溶 液形式加入)，搅拌1h，真空抽滤获得固定化细胞。
将上述得到的全部固定化细胞(固定化细胞用量以静息细胞计为100g/L)悬浮于20mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mM，pH＝7.0)，加入2.22g 1-氰基 环己基乙腈(终浓度750mM)，45℃恒温水浴反应，每批次反应8小时。每批反应结 束后，进行真空抽滤固液分离，反应液用高效液相色谱分析产物浓度(见实施例6)， 固定化细胞则投入下一批次反应。结果，所制得的固定化细胞重复利用批次为6批， 每批次转化率都大于99％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 腈水解酶突变体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgctgactt ataaaggcgt tttcaaagcc gctactgttc aggcggaacc ggtgtggatg 60
gacgcagacg cgaccatcac caaagctatc cgtattattg aagaagctgc ggacaacggt 120
gcaaaatttg tagcgtttcc tgaagttttc attccaggtt atccgtggtg gatctggctg 180
ggcaccgcga tgtggggtgc gaagttcgtg gtaccgttcc atgaaaactg tctggaactg 240
ggcgataagc gtatgcagcg cattcaggcc gccgcgaaac aaaatggcat cgcactggta 300
atgggctacg gtgaacgcga cggtggtagc cgttacatga gccaggtgtt catcgatgac 360
agcggtaaaa tcgtggcgaa tcgccgtaag ctgaaaccaa ctcacgaaga gcgtaccatt 420
ttcggtgaag gtaacggttc tgatttcatc acgcatgatt tccctttcgc tcgcgttggt 480
ggttttaatt gctgggaaca cctgcagccg ctgagcaaat acatgatgta tagcctgcaa 540
gaacaggtgc atgtcgcctc ttggccggca atgtgtactt accagccgga cgttccgcag 600
ctgggcgcag gtgcgaatga ggcagtgacg cgttcttacg ccatcgaagg tgcgtgctac 660
gttctgggtg ctacgctggt tattggtaag gcggcgcacg atgcattttg cgataccgaa 720
gaacaccaca aactgctggg catgggtggc ggttgggcgc gcatcttcgg tccggacggt 780
gaatatctgg ctgaaagcct ggctcacgac gcagagggta tcctgtacgc cgatattgac 840
ctgtctaaaa tcctgctggc aaaagctaac accgacacgg tcggtcatta tgcacgtccg 900
gatgtcctgt ccctgctggt taacacccac aaccctggtc cggtacgtta cctggacgaa 960
gaaggtcgtc aggtgagcac tagcatccgt cgccacgaaa aactggaggg tcaatctctg 1020
gacctggagg ttactccggc gaccccggcc accctggaca tcgcatctct ggttcagcag 1080
gctaaaccgt ctactgttaa atctgagtcc aacgccagca cgaaacagcc ggacctggcg 1140
gtataa 1146
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Met Leu Thr Tyr Lys Gly Val Phe Lys Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1 5 10 15
Pro Val Trp Met Asp Ala Asp Ala Thr Ile Thr Lys Ala Ile Arg Ile
20 25 30
Ile Glu Glu Ala Ala Asp Asn Gly Ala Lys Phe Val Ala Phe Pro Glu
35 40 45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Trp Trp Ile Trp Leu Gly Thr Ala Met
50 55 60
Trp Gly Ala Lys Phe Val Val Pro Phe His Glu Asn Cys Leu Glu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Lys Arg Met Gln Arg Ile Gln Ala Ala Ala Lys Gln Asn Gly
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100 105 110
Met Ser Gln Val Phe Ile Asp Asp Ser Gly Lys Ile Val Ala Asn Arg
115 120 125
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130 135 140
Asn Gly Ser Asp Phe Ile Thr His Asp Phe Pro Phe Ala Arg Val Gly
145 150 155 160
Gly Phe Asn Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Ser Lys Tyr Met Met
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Thr Tyr Gln Pro Asp Val Pro Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asn Glu Ala
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Thr Leu Val Ile Gly Lys Ala Ala His Asp Ala Phe Cys Asp Thr Glu
225 230 235 240
Glu His His Lys Leu Leu Gly Met Gly Gly Gly Trp Ala Arg Ile Phe
245 250 255
Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Leu Ala Glu Ser Leu Ala His Asp Ala Glu
260 265 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Lys
275 280 285
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Leu Leu Val Asn Thr His Asn Pro Gly Pro Val Arg Tyr Leu Asp Glu
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Gly Gln Ser Leu Asp Leu Glu Val Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Leu
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Asp Ile Ala Ser Leu Val Gln Gln Ala Lys Pro Ser Thr Val Lys Ser
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<213> 未知(Unknown)
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Met Ser Gln Val Phe Ile Asp Asp Ser Gly Lys Ile Val Ala Asn Arg
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Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Lys
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<210> 5
<211> 1113
<212> DNA
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Claims (10)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位进行突变，或对第324-381位氨基酸序列进行替换获得的。
2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQID No.2所示氨基酸序列的第201位亮氨酸突变为苯丙氨酸；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第324-381位氨基酸替换为SEQ ID No.8所示来源于敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)CCTCC NO:M 209044腈水解酶的第324-371位氨基酸。
3.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列为SEQ IDNo.4或SEQ ID No.6所示。
4.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
5.一种由权利要求4所述编码基因构建的重组载体。
6.一种由权利要求5所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。
7.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化1-氰基环己基乙腈制备1-氰基环己基乙酸中应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH＝7.0、200M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为反应介质构成反应体系，45℃恒温水浴反应完全后，将反应液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度以缓冲液体积计为100～1300mM，所述催化剂用量以湿菌体重量计为10～100g/L缓冲液。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法之一制备：(1)将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中，37℃培养10-12小时，按体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基进行扩大培养，37℃培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导培养10小时，离心，收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体；(2)将步骤(1)湿菌体用含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液重悬，超声波破，破碎产物离心后取上清液作为粗酶液；将粗酶液以1mL/min的流速通过经平衡缓冲液冲洗的Ni-NTA柱，用洗脱缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2mL/min；再用蛋白洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，流速为2mL/min；最后将收集的目的蛋白以质量浓度0.9％氯化钠水溶液为透析液进行透析，取截留液即为纯酶；所述平衡缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液；所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和50mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液；所述蛋白洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和250mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液；(3)将步骤(1)湿菌体悬浮于pH＝7.0、200mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中，加入终浓度6mg/mL硅藻土，室温搅拌1h，随后加入体积终浓度3％聚乙烯亚胺，室温搅拌1h，最后加入体积终浓度1％戊二醛，搅拌1h，真空抽滤，获得固定化细胞；所述聚乙烯亚胺以质量浓度5％水溶液形式加入，所述戊二醛以质量浓度25％水溶液形式加入。
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