KR20020097210A - 아시도보락스 파실리스 ７２ｗ로부터의 니트릴라제에 대한유전자의 단리 및 발현 방법 - Google Patents
아시도보락스 파실리스 ７２ｗ로부터의 니트릴라제에 대한유전자의 단리 및 발현 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 니트릴라제 효소를 발현하며 니트릴 함유 기질의 가수분해에 대한 생촉매로서 유용한 재조합 미생물 균주가 제공된다. 이 재조합 세포는 온화한 반응 조건하에서 니트릴 함유 기질을 카르복실산으로 가수분해시키는 것을 촉매하는 열 안정성 니트릴라제 효소를 코딩하는, 아시도보락스 파실리스 72W로부터 단리된 외래 유전자로 형질전환되어 있다. 니트릴라제 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 니트릴라제 유전자에 의해 코딩되는 추정 아미노산 서열도 제공된다.
Description
니트릴은 다양한 화학 공정에 의해 상응하는 카르복실산으로 쉽게 전환되지만, 이들 공정은 통상 강산성 및 강염기성 반응 조건과 높은 반응 온도를 필요로 하며, 통상적으로 원치않는 부산물 및(또는) 다량의 무기염을 원치않는 폐기물로서 생성한다. 효소-촉매에 의한 가수분해를 통해 니트릴 함유 기질을 상응하는 카르복실산으로 전환시키는 공정은 1) 대체로 상온에서 수행되고, 2) 강산성 또는 강염기성 반응 조건을 필요로하지 않으며, 3) 원치않는 부산물을 다량으로 생성하지 않기 때문에, 화학적인 방법보다 바람직하다. 화학적 가수분해보다 특히 유리한, 다양한 지방족 또는 방향족 디니트릴의 효소-촉매 가수분해는 매우 위치 선택적이어서, 2가지 니트릴기 중 하나만이 상응하는 카르복실산 암모늄염으로 가수분해된다.
니트릴 기질의 상응하는 카르복실산으로의 효소-촉매 가수분해는 1단계 또는 2단계 반응으로 수행될 수 있다 (표 1).
| 기질* | 생성물 | 효소 | |
| 2단계 | |||
| 반응 1 | RCN + H2O | RC(O)NH2 | 니트릴 히드라타제 |
| 반응 2 | RC(O)NH2+ H2O | RC(O)OH + NH3 | 아미다제 |
| 1단계 | |||
| 반응 1 | RCN + 2H2O | RC(O)OH + NH3 | 니트릴라제 |
| *R은 선택된 특정 효소에 대한 특정 유기 치환체의 다양한 범위를 나타낸다. |
로도코커스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 아르트로박터 (Arthrobacter), 바실러스 (Bacillus), 박테리디움 (Bacteridium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 미크로코커스 (Micrococcus) 및 코마모나스 (Comamonas)를 비롯한 다양한 박테리아 속은 모두 공통적으로 다양한 범위의 니트릴 히드라타제, 아미다제 또는 니트릴라제 활성을 지닌다. 이들 미생물의 수성 현탁액 및 단리된 효소 둘 다가 니트릴을 카르복실산으로 전환시키는 데 사용되어 왔다. 이들 효소의 생명공학적 용도는 최근 문헌 [Cowan et al., Extremophiles (1998) 2:207-216]에서 고찰된 바 있다.
니트릴라제 효소는 수용액 중에서 아미드의 중간체 형성없이 니트릴을 상응하는 카르복실산으로 직접 전환시킨다. 방향족 니트릴을 상응하는 카르복실산 암모늄염으로 가수분해시키기 위해 니트릴라제를 사용하는 것은 수년동안 알려져 왔지만, 최근에와서야 지방족 니트릴을 전환시키는 데 니트릴라제가 사용되는 것이 보고되었다. 고바야시 등 (Kobayashi et al.)의 문헌 [Tetrahedron (1990) 46:5587-5590] 및 [J. Bacteriology (1990) 172:4807-4815]에는 지방족 니트릴의 상응하는 카르복실산 암모늄염으로의 가수분해를 촉매하는 (몇몇 지방족 α,ω-디니트릴도 가수분해 됨), 로도코커스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) K22로부터 단리된 지방족 니트릴라제에 대해 기재되어 있다. 일정 범위의 지방족 α,ω-디니트릴을 상응하는 ω-시아노카르복실산 암모늄염 또는 디카르복실산 디암모늄염으로 전환시킬 수 있는, 코마모나스 테스토스테로니 (Comamonas testosteroni)로부터의 니트릴라제가 단리되었다 (CA 2,103,616호; 및 문헌 [Levy-Schil et al., Gene (1995) 161:15-20]).
고정되지 않은 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis) 72W 세포의 니트릴라제 활성은 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 공정에서 이용되어 왔다 (US 5,858,736호). 이 공정에서 지방족 α,ω-디니트릴은, 먼저 지방족 니트릴라제 (EC 3.5.5.7) 활성을 지닌 촉매를 사용하여 수용액 중에서 ω-시아노카르복실산의 암모늄염으로 전환된다. 그 후, ω-시아노카르복실산의 암모늄염은, 중간체인 ω-시아노카르복실산 또는 ω-아미노-카르복실산의 단리없이 수용액 중에서 직접 상응하는 락탐으로 전환된다. 지방족 α,ω-디니트릴이 α-탄소 원자에서 비대칭적으로 치환된 경우에도, 니트릴라제는 ω-니트릴기를 98％가 넘는 위치 선택성으로 가수분해시켜 ω-시아노카르복실산 암모늄염을 생성함으로써, 이후의 수소화 반응시 가능한 2가지 락탐 생성물 중에서 하나만을 생성한다. 예를 들어, 2-메틸-글루타로니트릴 (MGN)을 고정되지 않은 아시도보락스 파실리스 72W 세포에 의해 가수분해시켜 98％가 넘은 위치 선택성 및 100％ 전환율로 4-시아노펜탄산 (4-CPA)을 생성하였다.
니트릴라제 유전자는 클로닝되어 이종 시스템, 특히 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 발현되었다. 피터 등 (Petre et al.)의 문헌 (US 5,635,391호)에는 코마모나스 테스토스테로니로부터의 니트릴라제를 이. 콜라이 (E. coli) 및 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)에서 발현시킨 것에 대해 개시되어 있다. 또한, GroE 샤페로닌 (chaperonin) 단백질의 동시 발현에 의해 이. 콜라이에서 가용성 니트릴라제 단백질의 양을 개선시킴으로써, 보다 높은 니트릴라제 비활성 (specific activity)이 나타나게 하는 방법도 개시되어 있다. 이. 콜라이 프로모터인 Plac및 Ptrp를 사용하여 니트릴라제 코딩 서열의 발현을 유도하였다. 이. 콜라이에서, Plac은 또한 알칼라게네스 파에칼리스 (Alcaligenes faecalis) JM3 (문헌 [Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci (1993) 90:247] 및 JP 4-30663호), 로도코커스 로도크로우스 J1 (Kobayashi et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:20746) 및 로도코커스 로도크로우스 K22 (Kobayashi et al., Biochem. (1992) 31,9000)로부터 유래한 니트릴라제 코딩 서열을 성공적으로 발현시키는 데 사용되었다. 스탈커 (Stalker)의 문헌 (US 4,810,648호)은 할로아릴니트릴-가수분해 니트릴라제에 대한 유전자가 자신의 천연 프로모터의 조절하에 이. 콜라이에서 발현될 수 있음을 개시하고 있다. US 5,602,014호에서, 미즈무라 (Mizumura) 및 유 (Yu)는 로도코커스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis)에서 니트릴라제 유전자를 발현시키기 위한 특별한 조절 시스템을 개시하고 있다.
니트릴라제 효소는 매우 불안정하며 다량으로 얻을 수 없다고 보고되어 있다 (고바야시 등의 문헌 [Tetrahedron (1990) 46:5587-5590] 및 [J. Bacteriology (1990) 172:4807-4815). 니트릴 히드라타제와는 반대로, 니트릴라제는 비활성이 낮고 반응 속도가 낮다는 특징이 있다 (Nagasawa et al., Appl Microbiol. Biotechnol. (1993) 40:189-195). 중온균 (mesophile)으로부터의 니트릴 가수분해 효소는 고유의 열 불안정성으로 인해, 산업적 적용이 제한되는 것으로 보고되었다 (Cramp et al., Microbiol. (1997) 143:2313-2320).
높은 수율의 생성물이 온화한 반응 조건 (극단적으로 산성 또는 염기성인 조건을 제외한 상온 포함)하에서 얻어지며 원치않는 폐기물이 상대적으로 다량 생성되지 않는, 적용시 (예를 들어, 지방족 디니트릴의 시아노카르복실산으로의 위치 선택적 가수분해) 니트릴 함유 기질에 대한 촉매로서 적합하며 산업적으로 유용하고 열에 안정하며 생산성이 높은 니트릴라제 효소가 없다라는 문제점이 남아있는 실정이다.
<발명의 개요>
본 발명은 아시도보락스 72W 니트릴라제 유전자에 특이적인 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 하기 서열목록의 완전한 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편, 및 이와 실질적으로 유사한 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 서열 5 또는 서열 14에 기재된 니트릴라제 효소 아미노산 서열의 전부 또는 그의 실질적인 부분을 코딩하는 임의의 핵산 단편을 포함한다. 또한 본 발명은, 6X SSC (1M NaCl), 40 내지 45％ 포름아미드, 1％ SDS로 37℃에서 혼성화시키고 0.5X 내지 1X SSC로 55 내지 60℃에서 세척하는 조건하에서 서열 5 또는 서열 14의 아미노산 서열의 전부 또는 그의 실질적인 부분을 코딩하는 핵산 단편과 혼성화되는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 서열 1 내지 16에 상보적인 핵산 단편들도 청구된다. 예를 들어, 서열 5 및 서열 14와 같이 본 발명의 핵산 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드도 제공된다. 본 발명은 상기 서열들로부터 전사된 RNA 또는 안티센스 RNA 분자, 및 이들의 cDNA 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명에서는 형질전환된 미생물에서 이들 니트릴라제 코딩 서열로부터의 활성 효소 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명에 의해 얻어진 개선점은, 아시도보락스 파실리스 72W에 비해 증가된 형질전환체 촉매의 비활성으로 인해, 반응 속도가 증가되고 반응 생산성이 높아졌다는 것이다. 본원에서 설명된 유전 물질로 형질전환된 전세포에서 생산된 활성 니트릴라제 효소는 니트릴 함유 기질의 유용한 가수분해를 수용하는 데 사용될 수 있다. 니트릴라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 단편이 함유된 플라스미드를 갖는 키메라 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유하는 형질전환된 미생물 (각 유닛은 본원에 기재된 바와 같음)도 본 발명의 일부이다. 한 실시양태에서는 임의의 특이적 효소 촉매인 이. 콜라이 SW91 (ATCC PTA-1175), 이. 콜라이 DH5α:pnit4 (ATCC PTA-1176), 이. 콜라이 SS1001(ATCC PTA-1177), 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1002 또는 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1011을 α,ω-시아노카르복실산과 접촉시켜 사용한다. 다른 실시양태에서는 α,ω-디니트릴을, 5원 또는 6원 고리 락탐 제조시의 중간체인 ω-시아노카르복실산으로 전환시키는 개선된 방법에 형질전환된 특정 미생물을 사용한다 (US 5,858,736호 참조).
본 발명에서는
(i) 제한 엔도뉴클레아제를,
a) 천연 미생물 유전자,
b) 상기 (i)(a)의 천연 미생물 유전자의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 제1 뉴클레오티드 단편 집단, 및
c) 상기 (i)(a)의 천연 미생물 유전자의 뉴클레오티드 서열과 혼성화되지 않을 제2 뉴클레오티드 단편 집단
을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 혼합물과 접촉시켜, 제한 단편의 혼합물을 수득하는 단계,
(ii) 단계 (i)의 제한 단편 혼합물을 변성 (denaturation)시키는 단계,
(iii) 단계 (ii)의 변성된 제한 단편 혼합물을 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계, 및
(iv) 단계 (ii)와 (iii)을 충분한 회수로 반복하여, 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 비활성 및(또는) 니트릴라제의 증가된 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 특징에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는 돌연변이화 미생물 유전자를 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된, 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 비활성 및(또는) 니트릴라제의 증가된 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 특징에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는 돌연변이화 미생물 유전자를 얻기 위해, 니트릴 함유 기질에 대한 니트릴라제 활성이 있음을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 천연 미생물 유전자, 구체적으로는 아시도보락스 파실리스 72W로부터의 유전자를 사용하는 방법이 제공된다. 본 발명은 이 방법에 의해 생성된 돌연변이화 미생물 유전자를 포함한다.
본 발명은 분자생물학 분야, 및 원하는 유전자 및 유전자 산물을 발현하는 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 사용된 유전자는 다양한 니트릴 함유 기질의 가수분해를 촉매하여 상응하는 카르복실산을 생성하는 니트릴라제 (nitrilase) 효소를 코딩하는 신규 핵산 단편이다. 또한, 본 발명은 니트릴라제 활성을 나타내며 니트릴 함유 기질의 가수분해에 대한 생촉매로서 유용한 재조합 균주도 제공한다. 또한, 본 발명은 그러한 니트릴라제 유전자의 단리를 보조하는 특정 핵산에 관한 것이다.
<도면, 생물 기탁 및 서열목록의 간단한 설명>
본 발명은 도면, 생물 기탁, 첨부된 서열 설명, 상세한 설명 및 청구항에 의해 보다 완전하게 이해될 수 있으며, 이들이 함께 본 출원을 구성한다.
도 1은 pnit4 중 4.1 kb PstⅠ 단편의 제한 맵을 보여준다. BclⅠ-BglⅡ 단편은 니트릴라제 유전자 및 인접 염색체 영역을 함유한다.
본 출원인은 특허 절차 목적상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 하기 생물을 기탁하였다:
| 기탁자 식별 부호 | 국제 기탁 번호 | 기탁일 |
| 이. 콜라이 SW91 | ATCC PTA-1175 | 2000년 1월 11일 |
| 이. 콜라이 DH5α:pnit4 | ATCC PTA-1176 | 2000년 1월 11일 |
| 이. 콜라이 SS1001 | ATCC PTA-1177 | 2000년 1월 11일 |
본원에서 사용된 "ATCC"는 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티블러바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) 국제 기탁 기관을 지칭한다. "국제 기탁 번호"는 ATCC에 기탁시 배양물의 승인번호이다.
상기 목록의 기탁물(들)은 지정된 국제 기탁 기관에 30년 이상 유지될 것이며, 이를 개시한 특허의 허여시 공중이 입수할 수 있게 될 것이다. 기탁물의 입수가능성은 정부의 조치에 의해 허여된 특허 권리를 훼손하여 해당 발명을 실시하도록 허가하는 것은 아니다.
본 출원인은 37 C.F.R. 1.821-1.825 "뉴클레오티드 서열 및(또는) 아미노산 서열 개시를 함유하는 특허 출원에 관한 요건 - 서열 규정 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules)"에 준거하여, 세계 지적 재산 기구 (WIPO) 표준 ST.25 (1998)와 EPO 및 PCT의 서열목록 요건인 규정 5.2 및 49.5(a-bis), 및 관리 지시의 섹션 208 및 별첨 C (Rules 5.2 and 49.5(a-bis), and Section 208 and Annex C of the Administrative Instructions)에 부합하는 32개의 서열을 제공한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 형식은 37 C.F.R. §1.822에 기재된 규정에 부합하는 것이다.
서열 1은 젠뱅크 (GenBank) 데이터로부터 입수가능한 박테리아의 니트릴라제 서열에서 발견되는 보존적 영역에서 유래하였으며, 신규 니트릴라제 유전자를 찾아내기 위해 축퇴성 (degenerate) PCR 프라이머로서 사용된 정방향 프라이머 (1F)의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 젠뱅크 데이터로부터 입수가능한 박테리아의 니트릴라제 서열에서 발견되는 보존적 영역에서 유래하였으며, 신규 니트릴라제 유전자를 찾아내기 위해 축퇴성 PCR 프라이머로서 사용된 역방향 프라이머 (7R)의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 3은 축퇴성 프라이머 영역이 없는, pJJ28-5 클론 중 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 부분의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 pnit4로부터의 4.1 kb 삽입체 내에서 확인된 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 5는 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 코딩 서열에 의해 코딩된 뉴클레오티드 서열 (서열 4, 서열 15)로부터 추정된 아미노산 서열이다.
서열 6은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용된 정방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 7은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용된 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 8은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용된 정방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 9는 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용된 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 10은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용된 정방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 11은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용되었으며, 또한 XhoⅠ 제한 부위를 혼입시키기 위해 사용된 정방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 12는 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 니트릴라제 코딩 서열을 증폭하기 위해 사용되었으며, 또한 XhoⅠ 제한 부위를 혼입시키기 위해 사용된 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 13은 이. 콜라이에서의 과다발현을 위해 사용된 플라스미드 pnitex2 중 니트릴라제 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 14는 이. 콜라이에서 니트릴라제 효소의 과다발현을 위해 사용된 플라스미드 pnitex2 중 니트릴라제 코딩 서열에 의해 코딩된 추정 아미노산 서열이다.
서열 15는 니트릴라제 유전자 및 아시도보락스 파실리스 72W로부터의 인접 염색체 영역을 함유하는 플라스미드 pnit4 중 1776 bp BclⅠ-BglⅡ 게놈 단편의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 16은 피키아 (Pichia)에서의 발현을 위해 코돈 이용도 (codon usage)가 최적화된, 니트릴라제 유전자의 합성 형태이다.
서열 17 내지 32는 서열 16의 합성 니트릴라제 유전자를 제작하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드들이다.
본 출원인은 니트릴 함유 기질의 카르복실산으로의 가수분해를 위한 생촉매로서 유용한 단백질을 코딩하는 니트릴라제 유전자 서열을 사용하는 것과 관련된 발명으로 상기 언급한 문제점을 해결하였다. 또한, 니트릴 가수분해의 생성물인카르복실산은 암모니아 부산물 또는 다른 완충액 성분과의 카르복실산염 형태로 존재할 수도 있다. 니트릴라제 유전자는 아시도보락스 파실리스 72W로부터 단리하였다. 구체적으로, 아시도보락스 파실리스 72W의 활성 니트릴라제 단백질을 발현하는 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)의 재조합 균주는, 디니트릴의 고도의 위치 선택적 가수분해를 비롯하여 다양한 니트릴 함유 기질의 가수분해를 촉매하는 데 매우 유용하다. 통상적인 디니트릴은 NC-R-CN의 화학식을 가질 것이며, 여기서 R은 약 1개 내지 약 10개의 탄소를 갖는 알킬렌기이다.
이 생촉매 과정은 원치않는 폐기물을 매우 소량으로 생성하고, 기존에 알려진 것보다 훨씬 온화한 조건하에서 작동하기 때문에 산업상 매혹적인 것이다. 본 발명의 생성물은 중합체, 용매, 및 화학 산업, 농업 및 제약 산업에서 매우 가치있는 화합물에 대한 전구체로서 유용하다.
당해 기술 분야에 존재하는 문제점에 대한 본 출원인의 해결책은, 하기 및 실시예에서 보다 상세히 논의되는 하기 업적:
Ⅰ. 박테리아에서 미지의 니트릴라제 유전자의 존재를 확인하는 데 유용한 축퇴성 PCR 프라이머 서열 (서열 1 및 2)의 제공;
Ⅱ. 임의의 니트릴라제 유전자의 존재를 스크리닝하는 데 유용한 단리된 핵산 서열;
Ⅲ. 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)에서 유래한, 위치 특이적이고 열에 안정적인 니트릴라제에 대한 완전한 코딩 서열 (서열 4 및 15)의 맵핑, 확인 및 클로닝;
Ⅳ. 재조합 DNA 플라스미드 pSW91, pnit4 및 pnitex2, 키메라 유전자, 및 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)에서 유래한 4.1 kb의 염색체 DNA 단편 내에 위치한 상기 Ⅲ의 코딩 서열을 함유하는 발현 카세트의 제작;
Ⅴ. 아시도보락스 파실리스 72W의 활성 니트릴라제 단백질을 발현하는 이. 콜라이의 재조합 균주 제작;
Ⅵ. 본원에 기재된 아시도보락스 파실리스 72W의 니트릴라제 단백질을 발현하는 재조합 이. 콜라이 전세포를 사용한, 2-메틸글루타로니트릴 (MGN)의 4-시아노펜탄산 (4-CPA)으로의 위치 선택적 가수분해의 입증;
으로부터 가능하였으며,
또한 니트릴 함유 기질 (바람직하게는, 2-메틸글루타로니트릴)에 대한 니트릴라제 활성이 있음을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 천연 미생물 유전자를 사용하여, 변화된 니트릴라제 활성 및(또는) 우수한 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 니트릴라제 단백질의 특징에 비해 증가된 것임) 돌연변이화 미생물 유전자를 얻을 수 있음을 교시하고 있다.
아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제는, 지방족 또는 방향족 니트릴로부터 카르복실산을 생성함에 있어서 예상외로 강력한 촉매임이 증명되었다. 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제를 비롯한 모든 공지의 니트릴라제는 효소의 활성 부위에 친핵성 시스테인을 가지고 있으며 (Cowan et al., (1998)의 상기 문헌), 모두 다 티올 시약 (72W 니트릴라제 효소 활성을 현저히 감소시키는, 1.0 mM 농도의 염화구리, 질산은, 아세트산수은 또는 염화 제2철)에 의해 불활성화될 수 있다. 또한, 시스테인 잔기는 비가역적으로 산화되어 술핀산을 생성함으로써, 효소 활성의 손실을 초래할 수도 있다. 다양한 불활성화 메카니즘에 대한 니트릴라제 효소의 민감성에도 불구하고, 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 세포를 촉매로서 사용하면 니트릴라제 효소 1 몰 당 최고 3.9×107몰의 생성물 (4-CPA) (총 턴오버 (turnover) 수, TTN)이 생성된다.
이종 숙주 세포에서 아시도보락스 파실리스 72W의 활성 니트릴라제를 발현시키는 것은, 아시도보락스 파실리스 72W 세포를 니트릴라제 촉매로서 제조하여 사용하는 경우에 비해 몇몇 부가의 이점이 있다. 아시도보락스 파실리스 72W에서 니트릴라제 단백질의 발현량은 총 가용성 단백질의 약 3.4％이고 (실시예 14), 이 발현은 구성적인 발현이며, 니트릴라제 생산에 대한 잠재적 인듀서 (inducer)(지방족 또는 방향족의 니트릴 또는 아미드, 락탐, 우레아 등)의 스크리닝을 통해 아시도보락스 파실리스 72W의 발효시 생산되는 니트릴라제의 양에 효과가 전혀 없음이 밝혀졌다.
이와는 반대로, 이. 콜라이 형질전환체는 효소적으로 활성인 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제를 총 가용성 단백질의 12％까지의 양으로 발현시켰으며, 이. 콜라이 형질전환체에서 생산된 니트릴라제 (활성 및 불활성)의 총량은 총 가용성 단백질의 58％나 되었다. 이. 콜라이 형질전환체 세포에서 니트릴라제 발현에 대한 이 증가량은 아시도보락스 파실리스 72W 세포에 비해 비활성 (세포 건중량 당 니트릴라제의 활성 유닛)을 2.4배까지 증가시켰으며, 이는 촉매 생산성 (생성된 생성물의 g수/세포 건중량의 g수/시간)(실시예 7 및 9)을 유의하게 증가시킨 것이다. 더욱이, 아시도보락스 파실리스 72W 세포는 발효에 의해 배양시 비교적 값비싼 탄소 기질인 글리세롤을 필요로 하며, 값싼 글루코스를 사용해서는 성공적으로 배양하지 못한다. 이와는 반대로, 이. 콜라이 형질전환체는 약 절반의 시간에 아시도보락스 파실리스 72W 세포와 동일한 세포 밀도로 글루코스 상에서 배양될 수 있기 때문에, 생촉매 생산 비용을 현저히 줄일 수 있다.
또한, 아시도보락스 파실리스 72W 세포는 α,ω-디니트릴을 상응하는 ω-시아노카르복실산 암모늄염으로 전환시에 원치않는 부산물을 생성할 수 있는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 (둘 다 위치 선택성이 없음)를 함유한다. 아시도보락스 파실리스 72W 세포는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 효소를 불활성화시키기 위해서 열처리를 필요로 하기 때문에 (US 5,814,508호), 니트릴라제 활성의 손실 위험이 있고 생산 비용이 증가하게 된다. 니트릴 히드라타제 효소가 결여된 아시도보락스 파실리스 돌연변이체 균주인 72-PF-15 및 72-PF-17을 제조한 바 있으나 (US 5,858,736호), 이들 균주는 아시도보락스 파실리스 72W 모균주의 약 절반에 해당하는 니트릴라제 비활성만을 나타냈다.
이와는 반대로, 니트릴라제 효소를 발현하는 유전 물질로 형질전환된 이. 콜라이는 원치않는 니트릴 히드라타제 또는 아미다제 활성을 불활성화시키기 위한 열처리 단계를 필요로 하지 않아서, 촉매 생산을 위한 이 가공 단계의 비용을 제거할 수 있고 니트릴라제 활성의 우연한 손실을 피할 수 있다. 높은 니트릴라제 비활성을 가지며 부수적인 이점을 갖는 이. 콜라이 형질전환체는 실시예 6 및 7에 기재된바와 같이 본 출원인에 의해 생성되었다.
아시도보락스 파실리스 72W의 전세포 니트릴라제 활성은 약 55℃ 이하의 온도에서 매우 안정적이며, 0.10 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 중의 세포 현탁액은 50℃에서 22.7 시간의 니트릴라제 반감기를 나타냈다 (Gavagan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:654-659). 또한, 정제된 효소는 훌륭한 온도 안정성을 나타내어, 0.10 M 인산염 완충액 중 정제된 니트릴라제 10 mg/㎖ 용액의 활성 손실이 45℃에서 24 시간이 지난 후에야 관찰되었다. 5℃에서 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0) 중의 용액으로서 보관시, 정제된 니트릴라제의 활성 손실은 46 일이 지난 후에야 관찰되었다. 중온성 박테리아인 아시도보락스 파실리스 72W가 32℃의 온도에서 최적으로 배양되기는 하지만, 72W 니트릴라제 효소 그 자체는 바실러스 팔리두스 (Bacillus pallidus) 균주 DAC521 (Cramp et al., Microbiol. (1997) 13:2313-2320)과 같은 고온성 박테리아의 니트릴라제 효소에 필적하는 열 안정성을 가지고 있다.
MGN을 4-CPA로 가수분해시키기 위해 고정되지 않은 세포를 촉매로서 사용하는 경우, 재사용을 위해 고정되지 않은 세포를 회수하는 데 원심분리 또는 한외여과가 필요했다. 높은 생성물 농도 (최고 29 중량％의 4-CPA 암모늄염)에서, 고정되지 않은 세포는 재사용할 때마다 상당한 활성 손실이 있었고, 세포 용해가 관찰되었다. 이와는 반대로 세포를 고정시킨 경우에는, 촉매의 회수 및 재사용이 간편해졌고, 세포 용해에 대한 내성이 개선되었으며, 고정되지 않은 세포를 사용하는 경우에 비해 연속적인 회분식 반응에서 재순환될 때 고정된 세포의 효소 활성에 대한 안정성이 증가하였다.
동일한 조건하에서 전세포 아시도보락스 파실리스 72W 또는 이. 콜라이 형질전환체 SS1001을 카라게닌 (carrageenan)에 고정시킨 경우에는, 고농도의 4-CPA 암모늄염 (약 200 g/ℓ 이하)을 생성하는 연속적인 회분식 반응에서 재순환될 때에도 안정한 겔이 생성되었다. 겔 비드는 우선, 50℃에서 가열된 대두유 중에 세포의 가열된 수성 현탁액 (5％ 세포 건중량) 및 카라게닌 (3 중량％)을 분산시키고, 카라게닌의 겔화 온도 미만으로 대두유의 온도를 저하시켜 결과의 액적을 겔화시킴으로써 제조하였다 (Audet et al., Process Biochem. (1989) 24:217). 평균 직경이 0.5 mm 내지 3 mm인 세포/카라게닌 비드를 대두유로부터 분리한 후, 수성 완충액으로 세척하고 글루타르알데히드 및 폴리에틸렌이민으로 가교결합시켰다.
카라게닌 비드에 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 세포 및 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 세포에 대해, 동일한 조건하에서 나란히 배치하여 수행한 반응에서 1.25 M 4-CPA 암모늄염의 생성을 비교하였다. 고정된 이. 콜라이 형질전환체 SS1001을 사용하는 경우가 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 세포를 사용하는 경우에 비해 반응 속도가 1.7배 더 컸다 (1 시간에 각각 310 mM 4-CPA 암모늄염 및 184 mM 4-CPA 암모늄염; 실시예 9). 이. 콜라이 형질전환체 SS1001을 사용하여 얻은 반응 속도의 증가는 고정된 형질전환체 세포 촉매의 보다 높은 비활성 (비드 1 g 당 니트릴라제 활성의 유닛)의 결과이며, 이는 아시도보락스 파실리스 72W 모균주에 비해 니트릴라제 비활성이 더 높은 형질전환체 세포를 사용하는 경우의 한가지 이점을 입증하는 것이다. 공개된 방법 (Buke, Methods Enzymol. (1987)135:175-189)에 따라 알긴산칼슘 비드에 고정된 이. 콜라이 형질전환체 SW91 세포를 사용하는 경우의 반응 속도는 카라게닌에 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 세포를 사용하는 경우보다 4.0배 더 컸다 (1 시간에 각각 739 mM 4-CPA 암모늄염 및 184 mM 4-CPA 암모늄염; 실시예 9 및 11). 고정된 형질전환체 촉매를 사용하여 달성한 증가된 촉매 생산성 (생성물 g/촉매 g/시간)은 공정 비용을 현저히 감소시킨다.
본 발명은 니트릴라제 효소를 코딩하는 신규 핵산 서열을 제공한다. 이 서열은 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA로부터 단리된 4.1 kb PstⅠ 단편에 존재하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 포함한다. 새로이 정의된 ORF는 니트릴을 상응하는 카르복실산 암모늄염으로 전환시키는 확인가능한 효소를 코딩한다. 이 ORF는 활성 니트릴라제의 발현 및 당업계에 공지된 연산법을 이용한 공개 데이터베이스에의 핵산 및 추정 아미노산 서열의 비교 둘 다에 기초하여 확인되었다. 이 ORF에 의해 코딩된 단백질은 공지된 다른 니트릴라제에 대해 최고 71％의 일차 아미노산 서열 동일성을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 본원에서 보고된 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성이 있는 활성 단백질이다. 보다 바람직한 아미노산 단편은 본원의 서열과 90％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 아미노산 단편은 본원에서 보고된 아미노산 단편과 95％ 이상 동일하다. 이와 유사하게, 해당 ORF에 상응하는 바람직한 핵산 서열은 활성 단백질을 코딩하는, 본원에서 보고된 핵산 서열과 80％ 이상 동일한 것이다. 보다 바람직한 핵산 단편은 본원의 서열과 90％ 이상 동일하다. 가장 바람직한 핵산 단편은 본원에서 보고된 핵산 단편과 95％ 이상 동일하다.
본 발명의 핵산 단편은 cDNA를 단리하는 데 사용될 수 있으며, 또한 동일하거나 다른 박테리아 종으로부터 상동성 효소를 코딩하는 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 서열에 의존적인 프로토콜을 이용하여 상동성 유전자를 단리하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 서열에 의존적인 프로토콜의 예로는 핵산 혼성화 방법, 및 핵산 증폭 기술 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응, 리가아제 연쇄 반응)의 다양한 용도에 의해 예시되는 DNA 및 RNA 증폭 방법이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
일반적으로, 10개 이상의 인접하는 아미노산 서열 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 서열이, 공지된 단백질 또는 유전자와 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 잠정적으로 확인하기 위해 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열에 관해서는 20 내지 30개의 인접하는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가, 서열에 의존적인 유전자 확인 방법 (예를 들어, 서던 (Southern) 혼성화) 및 유전자 단리 방법 (예를 들어, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 원래 위치에서의 혼성화 (in situhybridization))에 사용될 수 있다. 또한, 12 내지 15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드를 증폭 프라이머로서 PCR에 사용하여, 이 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻을 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 것과 유사한 효소를 코딩하는 유전자 (cDNA 또는 게놈 DNA)는, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 임의의 원하는 박테리아로부터의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 DNA 혼성화 프로브로서 해당 핵산 단편의 전부 또는 그 일부를 사용하여 직접 단리할 수 있다. 해당 핵산 서열에 기초한 특정 올리고뉴클레오티드 프로브는 당업계에 공지된 방법에 의해 디자인 및 합성할 수 있다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (이하 "Maniatis"로 언급)). 더욱이, 전체 서열은 랜덤 프라이머 DNA 표지, 닉 (nick) 번역 또는 말단-표지 기술과 같이 당업계에 공지된 방법에 의한 DNA 프로브의 합성, 또는 입수가능한 시험관내 전사 시스템을 이용한 RNA 프로브의 합성에 직접 사용될 수 있다. 또한, 특정 프라이머는 해당 서열의 일부 또는 전부를 증폭하기 위해 디자인 및 사용될 수 있다. 결과의 증폭 생성물은 증폭 반응시 직접 표지되거나 증폭 반응 후 표지될 수 있으며, 적당히 엄격한 조건하에서 전장 cDNA 또는 게놈 단편을 단리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
해당 ORF의 짧은 단편 2개를 중합효소 연쇄 반응 프로토콜에 사용하여, DNA 또는 RNA로부터 상동성 유전자를 코딩하는 보다 긴 핵산 단편을 증폭할 수 있다. 별법으로, 제2 프라이머 서열이 클로닝 벡터로부터 유래한 서열을 기초로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 당업자는 PCR을 이용하여 RACE 프로토콜에 따라 cDNA를 생성함으로써, 전사체의 단일 지점과 3' 또는 5' 말단 사이의 영역을 증폭할 수 있다. 3' 및 5' 방향의 프라이머가 해당 서열로부터 디자인될 수 있다. 상업적으로 시판되는 3' RACE 또는 5' RACE 시스템 (BRL)을 이용하여, 특정 3' 또는 5' cDNA 단편을 단리할 수 있다 (Ohara et al., PNAS USA (1989) 86:5673; Loh et al., Science(1989) 243:217).
통상적으로 PCR형 증폭 기술에 있어서, 프라이머들은 상이한 서열을 가지며 서로 상보적이지 않다. 원하는 시험 조건에 따라, 프라이머의 서열은 표적 핵산을 효율적이고 충실하게 복제할 수 있도록 디자인되어야 한다. PCR 프라이머의 디자인 방법은 통상적인 것이며 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Thein and Wallace, "The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the diagnosis of genetic disorders" (1986) pp.33-50, in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis (Ed.), IRL Press, Herndon, Virginia] 및 [Rychlik, W., PCR Protocols: Current Methods and Applications. (1993) 15:31-39, in Methods in Molecular Biology, B.A. White, (Ed.), Humania Press, Inc., Totowa, NJ] 참조).
별법으로, 해당 서열은 상동체의 확인을 위한 혼성화 반응물로서 사용될 수도 있다. 핵산 혼성화 시험의 기본 성분에는 프로브, 목적 유전자 또는 유전자 단편을 함유할 것으로 생각되는 샘플, 및 특정 혼성화 방법이 포함된다. 본 발명의 프로브는 통상 단일 가닥 핵산 서열로, 검출될 핵산 서열과 상보적이다. 프로브는 검출될 핵산 서열 (cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA)과 "혼성화가능한" 것이다. 프로브의 길이는, 수행되는 특정한 시험에 따라 5개의 염기에서 수천개의 염기까지 달라질 수 있다. 프로브 분자의 일부분만이 검출될 핵산 서열에 상보적이면 된다. 또한, 프로브와 표적 서열 사이의 상보성은 완벽하지 않아도 무방하다. 완벽하지 않게 상보적인 분자들 사이에서 혼성화가 발생하면, 혼성화된 영역의 특정 염기 부분은적절한 상보적 염기와 쌍을 이루지 않는다.
혼성화 방법은 잘 규정되어 있다 (Maniatis, 특히 11장 및 표 11.1). 통상, 프로브와 샘플은 핵산 혼성화가 가능한 조건하에서 혼합되어야 한다. 이는 적당한 온도 및 이온 농도 조건하에서 무기 또는 유기염의 존재하에 프로브와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 프로브와 샘플 핵산은, 이들 프로브와 샘플 핵산 사이에 가능한 임의의 혼성화가 발생하도록 충분히 긴 시간동안 접촉해야 한다. 혼합물 중 프로브 또는 표적의 농도에 따라 혼성화가 발생하는 데 필요한 시간을 결정할 것이다. 프로브 또는 표적의 농도가 높아질수록 혼성화 인큐베이션 시간은 더 짧아진다. 임의로, 카오트로픽제 (chaotropic agent)가 첨가될 수 있다. 카오트로픽제는 뉴클레아제 활성을 억제함으로써 핵산을 안정화시킨다. 또한, 카오트로픽제는 실온에서 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 민감하고 엄격한 혼성화를 가능하게 한다 (Van Ness et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:5143-5151). 적합한 카오트로픽제에는 특히 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 리튬 테트라클로로아세테이트, 나트륨 퍼클로레이트, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 칼륨 요오다이드 및 세슘 트리플루오로아세테이트가 포함된다. 통상, 카오트로픽제는 약 3 M의 최종 농도로 존재할 것이다. 필요한 경우, 혼성화 혼합물에 포름아미드를 통상 30 내지 50 부피/부피％로 첨가할 수 있다.
다양한 혼성화 용액이 사용될 수 있다. 통상 이들은 약 20 내지 60 부피％, 바람직하게는 30％의 극성 유기 용매를 포함한다. 통상적인 혼성화 용액은 약 30 내지 50 부피/부피％의 포름아미드, 약 0.15 내지 1 M의 염화나트륨, 약 0.05 내지0.1 M의 완충액 (예를 들어, 시트르산나트륨, Tris-HCl, PIPES 또는 HEPES; 약 6 내지 9의 pH 범위), 약 0.05 내지 0.2％의 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 도데실술페이트), 또는 0.5 내지 20 mM의 EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.)(약 300 내지 500 kd), 폴리비닐피롤리돈 (약 250 내지 500 kd), 및 혈청 알부민을 사용한다. 또한, 통상적인 혼성화 용액에는 약 0.1 내지 5 mg/㎖의 비표지 담체 핵산, 단편화된 핵산 DNA (예를 들어, 소의 흉선 DNA 또는 연어의 정자 DNA) 또는 효모 RNA, 및 임의로 약 0.5 내지 2 중량/부피％의 글리신을 포함할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜, 음이온성 중합체 (예를 들어, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트) 및 음이온성 사카라이드계 중합체 (예를 들어, 덱스트란 술페이트)와 같은 다양한 극성의 수-용해성 또는 팽윤성 시약을 비롯한 부피 배제 시약 (volume exclusion agent) 등의 다른 첨가제가 포함될 수도 있다.
핵산 혼성화는 다양한 분석 형식을 채택할 수 있다. 가장 적합한 것 중 하나는 샌드위치 분석 형식이다. 샌드위치 분석법은 특히 비변성 조건하에서의 혼성화를 채택할 수 있다. 샌드위치형 분석법의 1차 성분은 고형 지지체이다. 고형 지지체는, 표지되지 않고 서열의 일부에 상보적인 핵산 프로브가 상기 지지체에 흡착 또는 공유결합하게끔 하여 프로브를 고정시킨다.
해당 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열의 이용가능성은 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝을 촉진시킨다. 해당 아미노산 서열의 일부를 나타내는 합성 펩티드가 합성될 수 있다. 이들 펩티드는 동물을 면역화시키는 데 사용되어, 그 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 그 후, 이들 항체를 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝에 사용하여, 목적하는 전장 cDNA 클론을 단리할 수 있다 (Lerner, Adv. Immunol. 36:1 (1984); 및 Maniatis).
이종 숙주 세포:
아시도보락스 파실리스 72W의 활성 니트릴라제 단백질은 이종 숙주 세포, 바람직하게는 미생물 숙주에서 생성될 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 세포는 대규모 발효법에 쉽게 적응할 수 있는 세포이다. 그러한 생물체는 산업적 생물가공 업계에 공지되어 있고, 그 예는 문헌 ["Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications", Murooka et al., eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY (1994)]에서 찾아볼 수 있으며, 여기에는 발효성 박테리아 뿐 아니라 효모 및 섬유상 진균류도 포함된다. 숙주 세포에는 코마모나스 종 (Comamonas sp.), 코리네박테리움 종 (Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 종 (Brevibacterium sp.), 로도코커스 종 (Rhodococcus sp.), 아조토박터 종 (Azotobacter sp.), 시트로박터 종 (Citrobacter sp.), 엔테로박터 종 (Enterobacter sp.), 클로스트리듐 종 (Clostridium sp.), 클레브시엘라 종 (Klebsiella sp.), 살모넬라 종 (Salmonella sp.), 락토바실러스 종 (Lactobacillus sp.), 아스퍼질러스 종 (Aspergillus sp.), 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp.), 자이고사카로마이세스 종 (Zygosaccharomyces sp.), 피키아 종 (Pichia sp.), 클루이베로마이세스 종 (Kluyveromyces sp.), 칸디다 종 (Candida sp.), 한세눌라 종 (Hansenula sp.), 두날리엘라 종 (Dunaliella sp.), 데바리오마이세스 종 (Debaryomyces sp.), 무코르종 (Mucor sp.), 토룰롭시스 종 (Torulopsis sp.), 메틸로박테리아 종 (Methylobacteria sp.), 바실러스 종 (Bacillus sp.), 에셰리키아 종 (Escherichia sp.), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.), 리조비움 종 (Rhizobium sp.) 및 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특히 바람직한 것은 이. 콜라이이다. 니트릴라제 유전자가 발현될 수 있는 적합한 이. 콜라이 숙주 세포의 예에는 본원에서 특정된 숙주 세포 및 MG1655 (ATCC 47076), W3110 (ATCC 27325), MC4100 (ATCC 35695), W1485 (ATCC 12435), 및 이들의 유도체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
미생물 발현 시스템 및 발현 벡터:
외래 단백질을 높은 수준으로 발현시키는 조절 서열을 함유하는 미생물 발현 시스템 및 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 이들은 본 발명의 4.1 kb 단편 유전자 산물의 생산을 위한 키메라 유전자 (chimeric gene)의 제작에 사용될 수 있다. 이들 키메라 유전자는 이후에 형질전환을 통해 적당한 미생물에 도입되어, 니트릴라제 효소를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드는 천연 유전자 서열에 비해 증가되거나 변화된 양의 활성을 지닌 유전자 산물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한, 키메라 유전자는 숙주 세포의 특성을 변화시키는 데 효과적일 것이다. 예를 들어, 적당한 프로모터의 조절을 통해 해당 ORF를 코딩하는 키메라 유전자 1 카피수 이상을 숙주 세포에 도입하면, 숙주 세포가 2-메틸글루타로니트릴을 4-시아노펜탄산으로 전환시키는 능력을 갖게 된다. 본 발명의 키메라 유전자는 해당 니트릴라제 서열의 유전자를 발현시키는 데 유용한, 적합한 조절 서열을 포함할 것이다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 (leader) 서열 및 리보솜 결합 부위가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이들 서열이 숙주 생물체로부터 유도된 경우가 바람직하지만, 당업자는 이종 조절 서열도 사용될 수 있음을 알 것이다.
한 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 구성적인 것이거나 유도가능한 것일 수 있다. 유도가능한 프로모터는 일반적으로 특정 자극 (예,lac프로모터를 유도하는 IPTG)에 반응한다. 유도가능한 프로모터는, 일부를 거명하자면 화학 물질, 성장 주기, 온도 변화, pH 변화 및 삼투 농도 변화를 비롯한 다양한 자극에 반응할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 니트릴라제 코딩 영역을 포함하는 키메라 유전자 (예를 들어, 서열 4, 서열 13 또는 서열 15)가 효과적으로 발현되거나, 또는 조절 영역이 유도가능한 프로모터를 포함하는 경우에 인듀서가 없는 것보다 더 효과적으로 발현됨이 밝혀졌다.
키메라 유전자를 적합한 발현 벡터에 클로닝하여 적당한 숙주에 도입할 수 있다. 적합한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 당업계에 공지되어 있다. 통상, 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 유도하는 서열, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 가능하게 하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는, 전사 개시 조절 성분을 포함하며 코딩 서열의 5'에 있는 영역, 및 전사 종결을 조절하는 3' 영역의 DNA 단편을 포함한다. 조절 서열이 생산용 숙주로 선택된 특정 종에 고유한 유전자로부터 반드시 유래하여야 하는 것은 아니지만, 상기 조절 영역 둘 다가 숙주 세포와 동종인 유전자로부터 유래한 것이가장 바람직하다.
원하는 숙주에서 해당 ORF를 발현시키는 데 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 무수히 많고 당업자에게 친숙한 것이며, 여기에는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, trp, 1PL, 1PR, T7, tac, PBAD및 trc (에셰리키아 콜라이에서의 발현에 유용함)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 그 예로는, 이. 콜라이의 트립토판 오페론 프로모터인 Ptrp, 이. 콜라이의 락토스 오페론 프로모터인 Plac, 이. 콜라이의 Ptac 프로모터, 파지 람다의 우측 프로모터 PR, 파지 람다의 좌측 프로모터 PL, T7 프로모터, 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 유래한 GAP 유전자의 프로모터로부터 선택되는 1종 이상의 프로모터가 포함되거나, 또는 코마모나스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 로도코커스, 아조토박터, 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클레브시엘라, 살모넬라, 락토바실러스, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 자이고사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰롭시스, 메틸로박테리아, 바실러스, 에셰리키아, 슈도모나스, 리조비움 및 스트렙토마이세스로 이루어진 미생물의 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강력한 프로모터가 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 종결 조절 영역도 바람직한 숙주에 고유한 다양한 유전자로부터 유래할 수 있다. 임의로, 종결 부위가 불필요할 수도 있으나, 포함되는 것이 더 바람직하다.
또한, 삽입된 유전 물질은 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 리보솜 결합 부위는 파지 람다 CⅡ 유전자의 형태이거나, 또는 코마모나스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 로도코커스, 아조토박터, 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클레브시엘라, 살모넬라, 락토바실러스, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰롭시스, 메틸로박테리아, 바실러스, 에셰리키아, 슈도모나스, 리조비움 및 스트렙토마이세스의 유전자에서 유래한 리보솜 결합 부위로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
임의로, 해당 유전자 산물은 형질전환된 숙주의 분비 산물인 것이 바람직할 수 있다. 원하는 단백질의 성장 배지로의 분비는 정제 절차를 간단하게 하여 비용을 절감시킨다. 분비 신호 서열은 대체로 발현가능한 단백질의 세포막을 통한 능동 수송을 촉진시키는 데 유용하다. 분비 능력이 있는 형질전환된 숙주는, 분비 신호를 코딩하는 DNA 서열을 숙주에 혼입시킴으로써 생성될 수 있다. 적당한 신호 서열을 선택하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, EP 546049호 및 WO 9324631호 참조). 분비 신호 DNA는 발현 조절 DNA와 해당 코딩 서열 또는 코딩 서열 단편의 사이에 위치할 수도 있고, 코딩 서열과 함께 리딩 프레임 내에 위치할 수도 있다.
회분식, 공급-회분식 또는 연속 방식으로 작동하는 발효는 통상적인 것이며, 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook ofIndustrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.] 및 [Sunderland et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1992) 36:227] 참조).
해당 뉴클레오티드 단편은, 증가되거나 변화된 활성 수준을 갖는 유전자 산물의 생성에 사용될 수 있다. 구체적으로, 뉴클레오티드 단편은 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 활성 및(또는) 증가된 효소 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 니트릴라제 활성에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는 돌연변이화 미생물 유전자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 천연 유전자 서열을 돌연변이화시켜 천연 유전자 서열에 비해 변화되거나 증가된 활성을 지닌 유전자 산물을 생성하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 여기에는 직접 진화법 (direct evolution), 랜덤 돌연변이 유발법, 도메인 스와핑 (domain swapping; 징크 핑거 (zinc finger) 도메인이나 제한효소 이용), 합리적 디자인 (rational design), 에러 유발 (error prone) PCR (Melnikov et al., Necleic Acids Research (1999) 27(4):1056-1062), 부위 지정 돌연변이 유발법 (Coombs et al., in Proteins (1998) 259-311, R. H. Angeletti (Ed.), Academic Press, San Diego, CA), 및 "유전자 셔플링 (gene shuffling)"(US 5,605,793호, US 5,811,238호, US 5,830,721호 및 US 5,837,458호; 이 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
약어 및 용어의 정의:
본 명세서에서, 하기 정의된 방식으로 다수의 용어 및 약어가 사용되고 있다.
본 명세서에서의 약어는 다음과 같은 측정 유닛, 기술, 특성 또는 화합물에 상응한다: "sec"는 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하고, "h"는 시간을 의미하고, "d"는 일을 의미하고, "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "㎖"는 밀리리터를 의미하고, "ℓ"는 리터를 의미하고, "mM"은 밀리몰농도를 의미하고, "M"은 몰농도를 의미하고, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "Ampr"은 앰피실린 내성을 의미하고, "Amps"는 앰피실린 감수성을 의미하고, "kb"는 킬로베이스를 의미하고, "kd"는 킬로달톤을 의미하고, "nm"는 나노미터를 의미하며, "wt"는 중량을 의미한다. "ORF"는 오픈 리딩 프레임을 의미하고, "PCR"은 중합효소 연쇄 반응을 의미하고, "SSC"는 식염수-시트르산나트륨 완충액을 의미하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하고, "ca"는 대략을 의미하고, "dcw"는 세포 건중량을 의미하고, "O.D"는 지정된 파장에서의 광학 밀도를 의미히고, "IU"는 국제 유닛을 의미하고, "MGN"은 2-메틸글루타로니트릴을 의미하고, "4-CPA"는 4-시아노펜탄산을 의미하며, "IPTG"는 이소프로필 β-티오갈락토피라노시드를 의미한다.
"효소 촉매"는 니트릴 함유 기질에 대한 특이적 니트릴라제 활성이 있음을 특징으로 하는 촉매를 나타낸다.
"수소화 촉매"는, 그 자체는 소비되거나 화학적 변화를 겪지 않으면서 수소화를 촉진시키는 물질을 나타낸다. 본 발명에 사용하기 적합한 수소화 촉매에는 다양한 백금 금속, 예를 들어 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 백금 및 팔라듐; 및 다양한 다른 전이 금속, 예를 들어 코발트, 구리, 니켈 및 아연이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 촉매는 지지되지 않을 수도 있고 (예를 들어, 레이니 니켈또는 산화백금), 지지될 수도 있다 (예를 들어, 탄소 상의 팔라듐, 알루미나 상의 백금, 또는 규조토 상의 니켈).
용어 "숙주 세포" 및 "숙주 생물체"는 외래 또는 이종의 유전자, 유전자 단편 또는 DNA 단편을 수용할 수 있는 세포를 나타낸다.
용어 "중온성 박테리아"는 온혈 동물의 온도 범위 근처에서 서식하는 박테리아를 나타내며, 최적 성장 온도는 대개 25 내지 40℃ 사이이다.
용어 "재조합 생물체", "형질전환된 숙주", "형질전환체", "트랜스제닉 생물체" 및 "형질전환된 미생물 숙주"는 이종 또는 외래의 DNA로 형질전환된 숙주 생물체를 나타낸다. 본 발명의 재조합 생물체는 활성 니트릴라제 효소를 코딩하는, 외래의 코딩 서열 또는 유전자를 발현시킨다. "형질전환"은 숙주 생물체의 게놈으로 DNA 단편을 전달하여 유전적으로 안정한 유전형질을 초래하는 것을 나타낸다. "형질전환 카세트"는 숙주 세포로의 삽입을 위해 편리하게 배열된 유전자 성분들의 세트를 대개 플라스미드의 일부로서 함유하는 DNA의 특정 단편을 의미한다. "발현 카세트"는 숙주 세포로의 삽입을 위해 편리하게 배열된 유전자 성분들의 세트를 대개 플라스미드의 일부로서 함유하며, 또한 숙주에서 증가된 유전자 발현을 가능하게 하는 DNA의 특정 단편을 의미한다.
용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 대체로 숙주 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 포함하는 염색체 이외의 성분을 나타내며, 그 형태는 대개 환형의 이중 가닥 DNA 분자이다. 그러한 성분은 임의의 공급원으로부터 유래한, 자가 복제가 가능한 서열, 게놈 혼입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 환형의단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 여기에 다수의 뉴클레오티드 서열이 결합 또는 재조합되어 독특한 작제물을 구성한다.
용어 "핵산"은 살아있는 세포에 존재하는 고분자량의 복잡한 화합물을 나타내며, 그의 기본 유닛은 포스페이트 결합을 통해 서로 연결된 뉴클레오티드이다. 핵산은 리보핵산 (RNA) 및 데옥시리보핵산 (DNA)의 2가지 형태로 더 분류된다.
문자 "A", "G", "T" 및 "C"는 핵산과 관련하여 언급된 경우에 각각 퓨린 염기 (아데닌 (C5H5N5) 및 구아닌 (C5H5N5O)) 및 피리미딘 염기 (티민 (C5H6N2O2) 및 시토신 (C4H5N3O))를 의미한다.
용어 "상보적인"은 서로 혼성화가능한 뉴클레오티드 염기들 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어 DNA의 경우, 아데닌은 티민과 상보적이고, 시토신은 구아닌과 상보적이다. cDNA는 시험관내 역전사에 의해 RNA로부터 합성된, RNA에 상보적인 단일 가닥 DNA이다. 안티센스 RNA는 다른 RNA에 상보적인 RNA 분자이다.
용어 "코딩 서열" 또는 "코딩 영역"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 용어 "ORF", "오픈 리딩 프레임", "코딩 서열" 및 "코딩 영역"은 서로 교환하여 사용가능하며, 단백질로 번역되는 DNA 부분을 나타낸다. ORF는 대개 서열에서 DNA 서열의 단백질 서열로의 번역체 중 출발을 나타내는 3개의 염기쌍 (출발 코돈) 및 정지를 나타내는 3개의 염기쌍 (정지 코돈)에 의해 표시된다.
용어 "핵산 단편" 또는 "뉴클레오티드 단편"은 코딩 유전자 및(또는) 이 코딩 서열에 선행하거나 (5', 상류) 후행하는 (3', 하류) 조절 서열을 코딩할 수 있는 DNA의 단편을 나타낸다. "단편"은 특정 영역의 완전한 핵산 서열 중 일부를 구성한다. 단편은 전체 유전자를 구성할 수도 있다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 이중 가닥 DNA 중 특정 뉴클레오티드 서열 내에서 가수분해성 절단을 촉매하는 효소를 나타낸다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 프라이머, 프로브, 검출될 올리고머 단편, 표지된 복제 차단 프로브 및 올리고머 조절 성분을 나타내며, 또한 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드 (뉴클레오티드), 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기인 임의의 폴리뉴클레오티드를 통칭하여 나타낸다. 또한, "올리고뉴클레오티드"의 정의에는 핵산 유사체 (예를 들어, 펩티드 핵산) 및 구조적으로 변형 (예를 들어, 포스포로티올레이트 결합)된 것들이 포함된다 (문헌 [Thuong et al., Biochimie (1985) Jul-Aug 67(7-8):673-684] 참조). "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"의 길이에는 의도된 구별이 없다.
용어 "프라이머"는 상보적 가닥이 합성되는 조건하에 놓여있을 때 상보적 가닥을 따라 중합효소에 의해 핵산이 합성 또는 복제되는 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드 (합성된 것 또는 자연 발생적인 것)를 나타낸다.
용어 "프로브"는 "단편"에 매우 상보적이어서 이 단편의 적어도 한 가닥과 혼성화에 의해 이중체 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드 (합성된 것 또는 자연 발생적인 것)를 나타낸다.
"적합한 조절 서열"은 전사, RNA 프로세싱, RNA 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미치며, 코딩 서열의 상류 (5' 비코딩 서열), 코딩 서열의 내부 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데니화 인식 서열을 포함할 수 있다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래할 수도 있고, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터에서 유래한 상이한 성분으로 구성될 수도 있으며, 또는 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수도 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도한다는 것을 이해할 것이다. 대부분의 세포형에서 대부분의 시간 동안 또는 대부분의 환경 조건하에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터를 통상 "구성적인 프로모터"라고 지칭한다. 특정 화합물 또는 특정 환경 조건이 존재하는 경우에만 유전자가 발현되도록 하는 프로모터를 통상 "유도가능한 프로모터"라고 지칭한다. 대부분의 경우에 조절 서열의 경계가 완전하게 규정되지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열이 단일 핵산 단편에 결합하여 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에 프로모터는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있음). 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
"3' 비코딩 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치하는 DNA 서열을 나타내며, 여기에는 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열들이 포함된다. 폴리아데닐화 신호는 대개 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 구역 (tract)을 부가시키는 데 영향을 미치는 특징이 있다.
"유전자"는 코딩 서열의 앞 (5' 비코딩 서열) 및 뒤 (3' 비코딩 서열)에 있는 조절 서열들을 포함하여 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 나타낸다. "천연 유전자"는 자연에서 발견되는 바와 같이 배열된 자신의 조절 서열을 갖는 유전자를 나타낸다. "키메라 유전자"는 천연 유전자가 아니며 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하는 임의의 유전자를 나타낸다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원에서 유래한 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하거나, 또는 동일한 공급원에서 유래한 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하되, 자연에서 발견되는 것과 다른 방식으로 배열된 것이다. "내생성 유전자"는 천연 생물체의 게놈에서 본래 위치에 있는 천연 유전자를 나타낸다. "외래" 유전자는 정상적으로는 숙주 생물체에서 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 생물체로 도입된 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비천연 생물체 내로 도입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진 (transgene)"은 형질전환 절차에 의해 게놈내로 도입된 유전자이다.
"합성 유전자"는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 기본 구조물 (building block)로부터 당업계에 공지된 절차를 이용하여 조립될 수 있다. 이들 기본 구조물은 라이게이션 (ligation) 및 어닐링 (annealing)을 통해 효소적으로 조립된 유전자 단편을 형성함으로써, 전체 유전자를 제작할 수 있다. DNA 서열과 관련하여 "화학적으로 합성된"은 성분 뉴클레오티드가 시험관내에서 조립된 것을 의미한다. DNA의 수동 화학 합성이 잘 확립된 절차를 이용하여 수행될 수도 있고, 또는 자동 화학 합성이 상업적으로 시판되는 기계 중 하나를 이용하여 수행될 수도 있다.
당업자는 주어진 아미노산을 특정하기 위해 뉴클레오티드 코돈을 사용하는 경우, 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 "코돈-편향 (codon-bias)"에 대해 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포에서 향상된 발현을 위한 유전자 합성시, 유전자의 코돈 이용도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 편향을 반영하도록 유전자를 디자인하는 것이 바람직하다. 서열 정보를 입수할 수 있는 숙주 세포로부터 유래한 유전자의 검사를 통해 그의 코돈 편향을 결정할 수 있다.
용어 "발현"은 유전자 산물 (통상, 단백질)의 서열을 코딩하는 유전자로부터 유전자 산물로의 전사 및 번역을 의미한다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 서로 교환가능하게 사용하며, 발현된 유전자 산물을 나타낸다. "성숙" 단백질은 번역 후에 프로세싱된 폴리펩티드 (즉, 1차 번역 산물에 존재하는 임의의 프리펩티드 (pre-peptide) 또는 프로펩티드 (pro-peptide)가 제거된 것)를 나타낸다. "전구체" 단백질은 mRNA의 1차 번역 산물 (즉, 프리펩티드 및 프로펩티드가 여전히 존재함)을 나타낸다. 프리펩티드 및 프로펩티드에는 세포내 편재 (localization) 신호가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "동일성 퍼센트"는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 측정된 이들 서열 사이의 관계이다. 또한, "동일성"은 폴리펩티드 서열들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 사이에서, 경우에 따라 그러한 서열 가닥들 사이의 매치 (match)에 의해 결정된 서열 관계의 정도를 의미한다.
"유사성"은 단지 2개의 서열이 몇몇 기준에 의해 서로 닮았음을 암시하며, 그들의 기원 또는 조상에 대해서는 어떠한 제안도 없는 서술적인 용어이다. "상동성"은 특별히 공통 조상으로부터 유래한 자손 서열 (descent)이기 때문에 기인한 유사성을 나타낸다. 일군의 서열들 중에서 유사성 관계에 기초하여 상동성을 부여하는 것은 가능할 수 있지만, 명백한 실험실 모델 시스템을 벗어나면 공통 조상으로부터 유래한 자손 서열인지의 여부는 가설로 남는다 (States et al., Similarity and Homogeneity (1992) pp. 89-92, in J. Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., (Eds.), Freeman and Co.).
"동일성" 및 "유사성"은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)], [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York(1993)], [Computer Analysis of Sequence Data, Part Ⅰ (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, Totowa, New Jersey (1994)], [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)] 및 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 방법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 공지의 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 서열들 사이에 가장 훌륭한 매치를 부여하도록 디자인된 것이다.
2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GCG 프로그램 패키지에 있는 위스콘신 패키지 (Wisconsin Package) 버전 9.0 및 10.0 제네틱 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group; GCG) Gap 프로그램, BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85:2444-2448)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원 (BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410)으로부터 공개적으로 입수가능하다.
용어 "실질적으로 유사한"은 1개 이상의 뉴클레오티드 염기가 변화하여 1개 이상의 아미노산 치환을 초래하지만, DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향이 없는 핵산 단편을 나타낸다. 또한, "실질적으로 유사한"은 1개 이상의 뉴클레오티드 염기가 변하지만, 안티센스 기술 또는 동시 억제 (co-suppression) 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 단편의 능력에는 영향이 없는 핵산 단편을 나타낸다. 또한, "실질적으로 유사한"은 결과의 전사체가 지닌 기능적 특성에 실질적으로 영향이 없는 본 발명 핵산 단편의 변형 (예를 들어, 뉴클레오티드 염기 1개 이상의 치환, 결실 또는 삽입)을 나타낸다.
"코돈 축퇴 (codon degeneracy)"는 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에는 영향이 없이 뉴클레오티드 서열의 변이를 가능하게 하는 유전자 코드 상의 다양성을 나타낸다. 예를 들어, 3글자 코돈 (triplet codon)인 CTT, CTC, CTA 및 CTG는 모두 아미노산 루이신에 대한 코돈임이 공지되어 있다 (Atlas, R., Principles of Microbiology). 또한, 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향이 없으면서 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산을 생성하는 유전자에서의 변화가 통상적임을 당업자는 잘 알 것이다. 따라서, 소수성 아미노산인 알라닌에 대한 코돈이, 코딩된 단백질의 기능적 특성에 대한 영향없이, 보다 덜 소수성인 다른 잔기 (예를 들어, 글리신) 또는 보다 더 소수성인 잔기 (예를 들어, 발린, 루이신 또는 이소루이신)을 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있다. 이와 유사하게, (-)로 하전된 잔기의 다른 잔기로의 치환 (예를 들어, 글루탐산을 아스파르트산으로 치환), 또는 (+)로 하전된 잔기의 다른 잔기로의 치환 (예를 들어, 아르기닌을 리신으로 치환)이 기능적으로 동등한 산물을 생성할 것으로 기대할 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단의 변화를 초래하는 뉴클레오티드 변화도 단백질의 활성을 변화시키지 않을 것으로 기대된다. 각각의 제안된 변형은, 코딩된 산물의 생물학적 활성이 보유되는지의 여부를 결정하는 것과 마찬가지로 당업계의 평범한 기술 범위 내에 있다.
더욱이, 당업자는 본 발명에 포함된 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열이, 본원에서 예시된 서열들과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 능력에 의해 정의될 수도 있음을 알고 있다.
통상적으로 엄격한 조건은, pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5 M Na 이온 미만 (통상, 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 또는 다른 염 농도)이고, 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드)의 경우 온도가 약 30℃ 이상 및 긴 프로브 (예를 들어, 50 뉴클레오티드 초과)의 경우 온도가 60℃ 이상인 조건이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가함으로써 달성될 수도 있다. 낮은 염격 조건의 예로는 37℃에서 6X SSC (1 M NaCl), 30 내지 35％ 포름아미드, 1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충액으로 혼성화시키고 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)로 세척하는 것이 포함된다. 중간 엄격 조건의 예로는 37℃에서 6X SSC (1 M NaCl), 40 내지 45％ 포름아미드, 1％ SDS로 혼성화시키고 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC로 세척하는 것이 포함된다. 높은 엄격 조건의 예로는 37℃에서 6X SSC (1 M NaCl), 50％ 포름아미드, 1％ SDS로 혼성화시키고 60 내지 65℃에서 0.1X SSC로 세척하는 것이 포함된다.
"특이성"은 통상 혼성화 후 세척의 기능으로, 여기서 중요한 인자는 이온 농도 및 최종 세척 용액의 온도이다. 프로브-표적 하이브리드 (hybrid)의 용융 온도 Tm은 올바른 엄격 조건을 결정하기 위한 출발점을 제공하도록 계산될 수 있다. Tm은 50％의 상보적 표적 서열이 완벽하게 매치된 프로브와 혼성화되는 온도 (규정된 이온 농도 및 pH하에서)이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 문헌 [Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267-284]에 기재된 하기 방정식으로부터 대략적으로 계산할 수 있다:
Tm= 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (％ G+C) - 0.61 (％ form) - 500/L
상기 식에서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, ％ G+C는 DNA 중 구아노신과 시토신 뉴클레오티드의 비율이고, ％ form은 혼성화 용액 중 포름아미드의 비율이며, L은 하이브리드의 염기쌍 길이이다.
Tm은 미스매치 (mismatch) 각 1％에 대해 약 1℃씩 감소한다. 따라서, 혼성화 및(또는) 세척 조건인 Tm은 원하는 동일성의 서열에 대해 혼성화되도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 90％가 넘는 동일성의 서열을 찾고자 한다면, Tm은 10℃만큼 낮아질 수 있다. 일반적으로, 엄격 조건은 규정된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보체에 대한 열적 용융점 Tm보다 약 5℃ 낮게 선택한다. 그러나, 매우 엄격한 조건은 열적 용융점 Tm보다 약 1, 2, 3 또는 4℃ 낮은 혼성화 및(또는) 세척을 이용할 수 있고, 중간 엄격 조건은 열적 용융점 Tm보다 약 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 낮은 혼성화 및(또는) 세척을 이용할 수 있으며, 낮은 엄격 조건은 열적 용융점 Tm보다 약 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 낮은 혼성화 및(또는) 세척을 이용할 수 있다. 상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 이용하여, 당업자는 혼성화 및(또는) 세척 용액의 엄격도 변화가 고유하게 설명됨을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매치가 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm을 초래하는 경우, 보다 높은 온도를 이용할 수 있도록 SSC의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다.
혼성화의 엄격도에 따라 염기들 사이에 미스매치가 가능하기는 하지만, 혼성화는 2개의 핵산 서열이 상보적인 서열을 함유할 것을 요구한다. 핵산을 혼성화시키기 위한 적당한 엄격도는 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존적이며, 또한 변할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 유사성 또는 상동성이 높을수록, 그러한 서열을 갖는 핵산들의 하이브리드에 대한 Tm값은 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정도 (더 높은 Tm에 상응함)는 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA의 순서로 감소한다. 길이가 100개를 초과하는 뉴클레오티드의 하이브리드에 있어서, Tm을 계산하기 위한 방정식이 유도된 바 있다 (Sambrook 등의 상기 문헌, 9.50-9.51). 더 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드로 혼성화시키는 경우, 미스매치의 위치는 더욱 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다 (Sambrook 등의 상기 문헌, 11.7-11.8). 한 실시양태에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 혼성화가능한 핵산의 바람직한 최소 길이는 약 15 뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드 이상이며, 가장 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드 이상이다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액의 염 농도가, 프로브의 길이 및 표적 DNA의 G+C 조성과 같은 인자에 따라 필요시 조정될 수 있음을 알 것이다.
핵산 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part Ⅰ, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (1993) Elsevier, New York] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, (1995) Chapter 2, Ausubel et al. (Eds.), Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에서 찾아볼 수 있다.
일반 방법
모든 HPLC 방법은 문헌 [Gavagan et al.,J. Org. Chem. (1998) 63:4792-4801]에 따라 수행하였다.
핵산 및 단백질 서열에 대한 전산화된 조립 및 분석 (동일성 및 유사성의 결정을 포함함)을 위하여, 본 출원인은 GCG 프로그램 패키지에 있는 위스콘신 패키지 버전 9.0 및 10.0 제네틱스 컴퓨터 그룹 (GCG) 갭 프로그램 (표준 디폴트 값인 갭 생성 페널티 (gap creation penalty) = 50 및 갭 확장 페널티 (gap extension penalty) = 3으로 니들만 (Needleman) 및 운쉬 (Wunsch) 연산법을 이용; 문헌 [Devereux et al.,Nucleic Acids Res. (1984) 12:387-395] 참조), 시퀀처 버전 및 벡터 NTI 딜럭스 v 4.0.3 (Sequencher Version and Vector NTI Deluxe v 4.0.3) 소프트웨어 및 데이터베이스 패키지를 사용하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모두 디폴트 파라미터를 사용하였다.
박테리아 배양액의 유지 및 증식에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 하기 실시예에 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (1994) (Phillipp Gerhardt et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC.] 또는 문헌 [Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (1989) Second Edition, (Thomas D. Brock, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA)]에 기재되어 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 니트릴 함유 기질은 화학식 NC-R-CN (식 중, R은 약 1개 내지 약 10개의 탄소를 갖는 알킬렌기임)을 갖는 디니트릴이다. 더 바람직한 니트릴 함유 기질은 화학식 NCCXa(R)(CH2)nCN (식 중, a = 0 또는 1이고, a = 1일 때 X = 수소이고, R = H, 알킬 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 치환된 알케닐, 또는 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴이며, n = 1 또는 2임)을 갖는 지방족 α,ω-디니트릴이다. 2-메틸글루타로니트릴이 본 발명에서 니트릴 함유 기질로서 사용하기에 가장 바람직하다.
본원에서 특허청구된 생물학적 유닛을 포함하는 생촉매로 5원 또는 6원 고리의 락탐을 제조하는 개선된 방법에 있어서, 화학식또는(식 중, R1및 R2는 둘 다 H이고, R3, R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 또는 알케닐 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3과 R4가 함께 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴이거나, 또는 독립적으로 R5와 R6이 함께 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴임)의 지방족 α,ω-디니트릴이 바람직하다. 더 바람직한 니트릴 함유 기질은 α-탄소 원자에서 비대칭적으로 치환된 지방족 α,ω-디니트릴이다 (이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 U.S. 5,858,736호를 참조할 것).
PCR 증폭, DNA 클로닝을 위해 원하는 말단을 생성하기 위한 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 의한 DNA 변형, 라이게이션, 및 박테리아 형질전환에 요구되는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고, Maniatis의 문헌, 문헌 [T.J. Silhavy et al. in Experiments with Gene Fusions, (1984) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, NY] 및 문헌 [Ausubel et al. in Current Protocols in Molecular Biology (1994-1998) John Wiley & Sons, Inc., New York]에 기재되어 있다.
A.아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 효소의 단리 및 부분 아미노산 서열분석:
아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)의 추출물로부터 단리하여 90％를초과하는 순도로 본 발명의 니트릴라제를 정제하였다. 박테리아의 니트릴라제는 일반적으로 한 개의 서브유닛으로 구성됨이 공지되어 있다 (Novo et al.,FEBSLetters (1995) 367:275-279). 니트릴라제 효소를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Bhalla et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992) 37: 184-190], 문헌 [Goldlust et al., Biotechnol. Appl. Biochem. (1989) 11:581-601] 및 문헌 [Yamamoto et al., Agric. Biol. Chem. (1991) 55:1459-1466] 참조). 해당 니트릴라제는 Q-세파로오스 (Sepharose) 이온 교환 매질을 통해 통과시킨 다음 하이로드 16/60 수퍼덱스 200 (Hiload 16/60 Superdex 200) 컬럼 상에서의 겔 여과에 의해 정제하였다. 효소의 정제 및 분리 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Rudolph et al.,Chromatogr. Sci.(1990) 51 (HPLC Biol. Macromol.): 333-50] 참조). 니트릴라제 활성은, 정제 과정 중 245 nm에서 100 mM, pH 7.2 인산염 완충액 중 5 mM의 벤조니트릴 용액의 흡광도 증가에 의해 지시되는 벤조니트릴에서 벤조산으로의 전환율을 측정함으로써 모니터링하였다.
N-말단 아미노산 서열, 및 정제된 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 단백질을 분해하여 얻은 펩티드 산물의 서열을 결정하였다. 겔 여과에 의해 정제된 니트릴라제를 트립신으로 분해한 후, 환원 후 4-비닐피리딘으로의 알킬화에 의한 시스테인 개질을 포함하는 당업계 공지의 방법을 이용하여 서열분석하였다 (예를 들면, 문헌 [Matsudaira, Methods Enzymol. (1990) 182 (Guide Protein Purif.):602-13] 또는 문헌 [Allen, Sequencing of Proteins and Peptides. In : Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Burdon, R. H.and van Knippenberg, P. H., Eds), Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford (1989)]를 참조할 것).
데이터베이스 검색은 위스콘신 소프트웨어 패키지 9.1 (위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹)을 사용하여 GCG에서 실행하였다. 결정된 아미노산 서열을 SWISS-PROT 데이터베이스 내에 포함된 단백질 서열 정보와 비교하였다. 정제된 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 단백질을 분해하여 단리된 10개의 올리고펩티드에는 다른 공지된 니트릴라제 단백질과 60％ 초과의 유사성을 갖는 아미노산 서열이 있었다. 이는 정제된 단백질이 니트릴라제 효소를 함유할 가능성이 높다는 것을 나타낸다.
B.니트릴라제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 이. 콜라이에서의 단리 및 발현:
공지된 니트릴라제 유전자와 상동성을 갖는 가능한 DNA 서열을 확인하기 위하여, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하여 PCR 프라이머용으로 합성하였다. 이 PCR 프라이머는 젠뱅크 데이터베이스로부터 입수가능한 박테리아 니트릴라제 서열 (젠뱅크 허가번호 D12583, J03196, D13419, L32589, D67026)의 보존 코딩 영역에 기초하여 디자인하였다. 게놈 DNA를, 2회의 페놀-클로로포름 추출을 추가함으로써 변형된 표준 방법 (Maniatis)에 의하여 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 단리하였다. 그렇게 단리된 DNA를 수많은 축퇴성 프라이머 조합과 함께 PCR에 대한 표적으로 사용하였다. 결과의 증폭된 생성물을 pGem-T 벡터로 클로닝하고 당업계에 일반적인 방법으로 서열분석하였다. 10개의 다른 PCR 프라이머 쌍으로 실험한 결과, 프라이머 1F (서열 1) 및 7R (서열 2)로부터 생성되고플라스미드 pJJ 28-5에서 발견된 오직 하나의 생성물만이, 로도코커스 로도크로우스 K22 (젠뱅크 허가번호 D12583)로부터의 니트릴라제 DNA 서열 영역과 74.1％의 동일성을 갖는 385 bp의 DNA 단편 (서열 3)을 생성하였다. 또한, 이 385 bp의 DNA 단편으로부터 추정된 단백질 산물은 정제된 72W 니트릴라제 단백질을 분해하여 단리된 것들과 매치되는 수많은 펩티드 서열을 함유하였다. 이는 확인된 385 bp의 단편이 목적한 72W 니트릴라제 유전자의 일부분을 함유한다는 것에 대한 추가의 증거였다.
다른 공지된 니트릴라제 유전자와 높은 상동성을 갖는 이 부분적인 유전자 서열의 발견으로, 본 출원인은 임의의 DNA 라이브러리 내에서 72W 니트릴라제 유전자를 함유하는 재조합 클론을 확인하기 위한 프로브로서 유용한 DNA 단편을 발견하였다. 또한, 신규한 니트릴라제 유전자를 발견하기 위한 축퇴성 PCR 프라이머로서의 서열 1 및 서열 2의 성공적인 사용은, 본 출원인이 박테리아 균주로부터 공지되지 않은 니트릴라제를 확인하고 단리하기 위한 수단으로서 일반적인 용도를 갖는 DNA 서열을 발견했음을 나타낸다.
완전한 니트릴라제 유전자를 단일 제한 단편으로 맵핑하기 위하여, 서던 (Southern) 혼성화를 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA에 대해 수행하였다. 고분자량의 게놈 DNA를, 퀴아겐 (Qiagen) 게놈 tip-100/G DNA 단리 키트 (미국 퀴아겐사)를 사용하여 아시도보락스 파실리스 72W 세포로부터 단리하였다. 1 ㎍의 게놈 DNA를 다양한 제한효소로 분해하고, 1％ 아가로스 겔 상에서 분리한 후 나일론 막으로 전이시켰다. 나일론 막 상에 고정된 제한 단편을 385 bp의 부분 니트릴라제 단편 (서열 3)으로 서던 혼성화에 의해 조사하였다. 게놈 DNA를 하기 임의의 제한효소로 절단하여 니트릴라제 유전자를 단일 제한 단편으로 맵핑하였다:BamHⅠ,BclⅠ,BglⅡ,ClaⅠ,EagⅠ,KpnⅠ,NarⅠ,NheⅠ,NotⅠ,NsiⅠ,PstⅠ,SalⅠ,SpeⅠ,SstⅠ,XbaⅠ,XhoⅠ. 이 조사는 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)에서 단일 니트릴라제 유전자의 존재에 대한 유력한 증거를 제공하였다. 자기 자신 내에 EcoRⅠ 부위를 함유한 공지된 부분 유전자 서열 (서열 3)로부터, EcoRⅠ 분해를 통해 두 개의 밴드를 얻었다.PstⅠ 분해를 통해 프로브와 반응하는 단일의 4.1 kb 밴드를 얻었는데, 이는 니트릴라제 상동체가 염색체로부터의 4.1 kbPstⅠ 단편 상에 존재함을 시사한다. 이 정보는 완전한 니트릴라제 유전자를 단리하기 위해 게놈 단편의 풍부한 라이브러리를 생성하는 제한효소 (이 경우에는PstⅠ)를 선택하는 데 중요했다.
라이브러리를 제작하기 위하여, 아시도보락스 파실리스 72W 게놈 DNA를PstⅠ으로 분해하고 겔 전기영동으로 분리하였다. 크기가 2.5 내지 7 킬로베이스 범위인 단편을 겔로부터 회수하고, 벡터 pBluescript Ⅱ SK (+) (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진사 (Stratagene))로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 이. 콜라이 DH1OB 일렉트로맥스 (electromax) 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 라이프 테크놀로지즈사 (Life Technologies))로 전기형질전환 (electrotransformation)시켰다. 결과의 라이브러리는 아시도보락스 파실리스 72W PstⅠ 단편의 4 x 106개의 독립적인 재조합 클론을 대표한다. 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 플레이트에서 긁어 모은 세포로부터 플라스미드를 제조하였다.
상기 플라스미드 라이브러리를 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. pJJ28-5로부터의 385 bp 니트릴라제 유전자 단편을 함유하는 표지된 프로브 단편을 콜로니 혼성화에 의한 라이브러리 스크리닝에 사용하였다. 니트릴라제 프로브와 (+) 혼성화를 나타내는 세 개의 콜로니를 앰피실린이 존재하는 액상 배지에서 배양하였다.PstⅠ,EcoRⅠ 및HindⅢ로 분해시 이들 콜로니로부터의 플라스미드 (pnit4, pnit5 및 pnit6)는 동일한 제한 단편 패턴을 나타냈는데, 이는 이들 플라스미드가 동일한 삽입체를 함유하고 있음을 시사한다.PstⅠ 분해 결과, 4.1 kb 삽입 단편이 얻어져 서던 혼성화 결과를 확인시켜 주었다. 이미 확인된 부분 유전자 서열 (서열 3)로부터 예상된 바와 같이, 상기 플라스미드 모두에서의 삽입체는 각각 한 개의 내부EcoRⅠ 및 한 개의HindⅢ 부위를 함유하였다.
플라스미드 pnit4, pnit5 및 pnit6에서의 삽입체는 다른 니트릴라제와 길이가 유사한 369개의 아미노산 서열 (서열 5)을 코딩하는 ORF를 함유하는 동일한 뉴클레오티드 서열 (서열 4)을 가지고 있었다. 1차 아미노산 서열은 로도코커스 로도크로우스 K22 (젠뱅크 허가번호 D12583)로부터의 니트릴라제와 71％ 동일하다. ORF 출발 코돈은 GTG인데, 이는 보다 일반적인 출발 코돈인 메티오닌 대신 발린으로 시작하는 단백질을 생성시킨다. 상기 ORF (서열 4)에 의해 코딩된 아미노산 서열 (서열 5)을, 스캔프로사이트 (Scanprosite; www.Espay.ch/tools/scnpsitl.html) 및 프로파일스캔 (Profilescan; www.isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN-form.html)을 이용한 단백질 족 및 도메인의 PROSITE 데이터베이스에서 조사한 결과, 공지된모든 니트릴라제가 보존된 신호 패턴을 함유하는 것으로 나타났다. 이 데이터에 기초하여, 위치 164에서의 시스테인 (서열 5 및 서열 14)이 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 내에서 시스테인 활성 부위인 것으로 추정된다. 공지된 니트릴라제에 대한 서열 유사성 및 니트릴라제 신호의 존재는 함께, 니트릴라제에 대한 유전자가 369개의 아미노산 서열 (서열 5)를 코딩하는 ORF (서열 4)상의 pnit4, pnit5 및 pnit6의 4.1 kb PstⅠ 단편 상에 존재한다는 증거를 제공하였다.
그러므로 본 발명은 완전한 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 유전자 및 조작에 편리한 형태의 인접 염색체 DNA를 함유하는 플라스미드 클론 DH5α:pnit4를 제공한다.
pnit4로부터의 4.1 kb PstⅠ 단편에서 확인된 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 ORF는, 과다발현을 위한 T7 프로모터-T7 RNA 중합효소 시스템에 기초한 수많은 pET 발현 벡터 내로 클로닝되었다 (문헌 [Studier et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 60-89] 참조). 더 구체적으로, ORF는 pET-3c 및 pET-21a (둘 다 위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐 (Novagen)사)로 클로닝되었다. pET-3c 니트릴라제 작제물 (pnitex2 (실시예 6)) 및 pET-21a 작제물 (pSW91 (실시예 7)) 모두 ATG를 대신하여 천연 니트릴라제 ORF의 출발 코돈 (GTG)을 갖는다. 추가의 pET-21a 작제물 (pSW90 (실시예 7))로 단백질의 N-말단에 11개 아미노산의 T7 태그 융합을 함유하는 변형된 형태를 얻었다. 플라스미드 pnitex2를 두 개의 다른 숙주 BL21(DE3) 및 BL21-SI로 형질전환시켜, 균주 SS1001 및 SS1002 (실시예 6)을 얻었다. 이 균주들은 IPTG (균주 SS1001, 실시예 6)에 의한 유도 또는 NaCl (균주 SS1002, 실시예 6)에 의한 유도가 있거나 또는 유도 없이 니트릴라제의 발현을 가능하게 하였다. 플라스미드 pSW90 및 pSW91을 BL21(DE3)에 형질전환시켜 균주 SW90 및 SW91 (실시예 7)을 각각 얻었는데, 이들은 둘 다 IPTG에 의한 유도가 있거나 또는 유도 없이 효소적 활성 니트릴라제를 발현하였다. 이들 작제물을 함유하는 상기 이. 콜라이 균주가 제조사에 의해 공급된 프로토콜에 따라 유도될 때, SS1001, SW90 및 SW91은 예상된 분자량인 약 40 kd의 특정 단백질을 생성하였다. 또한, 니트릴라제 효소 활성 (MGN에서 4-CPA로의 전환을 촉매하는 능력에 의해 나타남)에 대해 시험했을 때, 모든 발현 시스템 (SS1001, SS1002, SW90 및 SW91)이 이 반응을 촉매하였으며, 이는 유전자 조작 이. 콜라이 균주가 활성 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 효소 (실시예 6 및 7)를 생성할 수 있음을 나타낸다.
C. 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 및 이. 콜라이 발현 균주의 생성
아시도보락스 파실리스 균주 72W (ATCC 55746)의 배양
냉동된 시드 로트 (seed lot) 바이알 한 개를 해동시키고, 1 ㎖의 내용물을 하기 기재된 500 ㎖의 무균 접종원 배지 (Inoculum Medium)에 담았다. 접종원을 30℃에서 250 rpm의 속도로 2 ℓ의 플라스크에서 24 내지 30시간 동안 진탕배양하였다.
접종원 배지
성분: 최종 농도:
제1 인산칼륨 1.5 g/ℓ
제2 인산칼륨 3.4 g/ℓ
황산암모늄 1.5 g/ℓ
시트르산삼나트륨, 이수화물 1 g/ℓ
황산마그네슘, 칠수화물 0.4 g/ℓ
미량 금속 용액 (하기 참조) 1 ㎖/ℓ
엠버렉스 (Amberex) 695 (유니버셜 푸드사 (Universal Foods)) 1 g/ℓ
글리세롤 (별도로 멸균) 8 g/ℓ
미량 금속 용액
성분: 원액 농도:
염산 10 ㎖/ℓ
염화칼슘, 이수화물 11.4 g/ℓ
황산망간, 일수화물 1.23 g/ℓ
황산구리, 오수화물 0.63 g/ℓ
염화코발트, 육수화물 0.16 g/ℓ
붕산 0.91 g/ℓ
황산아연, 칠수화물 1.77 g/ℓ
몰리브덴산나트륨, 이수화물 0.05 g/ℓ
황산 바나딜, 이수화물 0.08 g/ℓ
질산니켈, 육수화물 0.04 g/ℓ
아셀렌산나트륨 0.04 g/ℓ
황산 제1철, 육수화물 6.0 g/ℓ
진탕 플라스크로부터의 접종원을 하기 기재된 발효 배지 (Fermenter Medium)를 포함하는 예비 멸균된 브라운 바이오스태트 (Braun Biostat) C로 무균 전이하였다.
발효 배지
성분: 최종 농도:
제1 인산칼륨 0.39 g/ℓ
제2 인산칼륨 0.39 g/ℓ
디프코 (Difco) 효모 추출물 5.0 g/ℓ
하기 조건 하에서 배양하였다: 32℃, pH 6.8 내지 7.0, 25％ 포화도로 용해된 산소. 접종시 발효기에는, 8.5 ℓ의 발효 배지와 218 g의 영양 공급 (Nutrient Feed) 용액을 함유되어, 글리세롤 약 7 g/ℓ의 출발 농도가 제공되었다. 영양 공급 용액은 각각 무균처리되고 냉각 후 배합된 하기 성분을 포함하였다: 탈이온수 0.25 ℓ 중 제1 인산칼륨 19.6 g; 탈이온수 0.15 ℓ 중 황산마그네슘 육수화물 3.3 g과 황산 4 ㎖; 탈이온수 0.80 ℓ 중 미량 금속 용액 67 ㎖과 글리세롤 400 g. 접종 후 18시간에, 영양 공급 용액의 공급을 시작하였다. 처음에는, 영양 공급 용액을 1분 당 0.4 g의 공급량 (글리세롤 0.15 g/분) 속도로 첨가하였다. 550 nm에서 측정된 배지의 광학 농도 (O.D. 550)는 약 8 내지 9였다. 26시간 째에, O.D. 550은 16 내지 18이었고, 공급 속도를 1분 당 0.9 g의 공급량 (글리세롤 0.3 g/분)으로 증가시켰다. 34시간 째에, 마지막으로 공급 속도를 1분 당 1.8 g의 공급량 (글리세롤 0.6 g/분)으로 증가시켰다. 이 속도를 실행이 끝날 때까지 (약 42시간) 계속 유지시켰다. 마지막 O.D. 550은 약 65 내지 75이었고, 이는 세포 농도 25 내지 30 g dcw/ℓ와 등등하다.
세포들을 원심분리에 의해 회수하고, 사용할 때까지 냉동 보관하였다. 생촉매로 사용하기 위하여, 세포들을 0.35 M 인산염 완충액 (pH 7.3)에서 50℃로 1시간 동안 가열한 다음, MGN의 4-CPA로의 변환을 촉매하는데 사용하였다.
전세포 활성 및 고정을 위한 이. 콜라이 세포의 배양:
단일 콜로니로부터 밤새 배양한 이. 콜라이 균주 SS1001 25 ㎖를 신선한 LB 배지 250 ㎖에 접종하였다. 배양액을 중간-로그기로 배양하고, 1시간 동안 1 mM IPTG로 유도하거나 또는 유도 없이 원심분리에 의하여 수확하였다. 균주 SS1002를 LBON (NaCl이 없는 LB) 배지에서 배양하고, BL21-SI 과다발현 균주 (미국 메릴랜드 록빌 소재의 라이프 테크놀로지 (Life Technologies))에 대한 제조사의 지시에 따라 1시간 동안 0.2 M NaCl로 유도하였다. 니트릴라제 활성을 측정하기 전에 박테리아 세포 펠렛을 얼음 상에 하룻밤 보관하였다. 고정을 위하여, 이. 콜라이 균주 SS1001을 10 ℓ의 회분식 발효기 내 LB 배지에서 배양하여 600 nm에서의 O.D.가 8.6이 되게 하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 전세포 활성 및 고정을 위해 젖은 얼음 상에 보관하였다.
상기와 같이 천연 균주로부터 생성된 생촉매의 중량-비활성을 실시예 6, 7 및 15로부터 생성된 유전자 조작 생촉매와 비교해 볼 때, 발현 균주 SS1001,SS1011 및 SW91이 천연 균주의 것보다 실질적으로 더 큰 비활성을 갖는 생촉매 (실시예 6의 표 2, 실시예 7의 표 3 및 표 4, 및 실시예 15의 표 5)를 생성한다는 것은 명백하다(표 2, 3, 4 및 5).
실시예 1
니트릴라제 단백질의 정제
달리 언급하지 않는 한, 이 방법에서의 모든 단계를 5℃ 및 pH 7.5에서 수행하였다.
아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)의 젖은 세포 페이스트의 25 중량％ 현탁액을 20 mM Tris, pH 7.5, 0.1 mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 2.0 mM 디티오트레이톨 중에 제조하였다.
이 현탁액의 추출물을 당업계에 알려진 방법에 따라 프렌치 압착기 (French pressure; 미국 메릴랜드 실버 스프링 소재의 아메리칸 인스트루먼트사 (American Instrument Co.))를 통해 통과시켜 제조하였다. 27,500 g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고, 추출물의 20 내지 55％ 황산암모늄 분획을 제조한 다음, 고형의 황산암모늄을 65％의 포화도로 첨가한 후 밤새 침전에 의해 농축시켰다. 농축된 단백질 침전물을 20 mM Tris, pH 7.5 (완충액 A)의 최소량으로 재액상화하고, 세파덱스 (Sephadex) G-25 수지 (파마시아사 (Pharmacia))를 함유하는 PD10 컬럼 상에서 탈염시켰다.
탈염시킨 후에, 농축된 단백질 추출물을 빠른 유속의 Q-세파로오스 (Sepharose) (파마시아사) 50 ㎖를 함유한 컬럼을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분획하였다. 컬럼에 농축된 단백질 추출물을 로딩한 후에, 컬럼을 유속 2 ㎖/분의 완충액 A (컬럼의 3배 부피의 양)로 세척하여 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 흡착된 단백질을 완충액 A 중에 제조된 0 내지 0.5 M NaCl 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 컬럼으로부터의 단백질 용출을 280 nm에서 모니터링하였다. 벤조니트릴의 가수분해로 벤조산이 생성되는 것을 측정하는 분석법을 이용하여 정제 과정 전체에 대해 니트릴라제 활성을 모니터링하였다. 니트릴라제 활성은 0.4 M NaCl에서 용출되었다. 0.4 M NaCl 단백질 분획 내의 단백질 성분을 10 내지 15％ SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건 (5％ β-메르캅토에탄올) 하에 수행된 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 50％가 넘는 0.4 M NaCl 단백질 분획이 분자량 39.7 kd의 서브유닛을 갖는 단백질로 구성되어 있었다. 이는 니트릴라제 효소에 대한 예상된 분자량 범위 내에 있는 것이다 (문헌 [Cowan et al., Extremophiles (1998) 2:207-216] 참조). 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 겔 여과 MW 표준 (파마시아 # 17-0442-01)을 사용하여 보정된 하이로드 16/60 수퍼덱스 200 컬럼 (파마시아사)을 사용한 pH 7에서의 20 mM 인산염 완충액 중의 겔 여과 크로마토그래피 후에 니트릴라제의 본래 분자량이 570 kd로 결정되었다. 겔 여과 후에, 니트릴라제 단백질의 순도는 90％를 초과하였다. 정제된 효소의 비활성은, 25℃에서 기질로서 2-메틸글루타로니트릴을 사용하여 단백질 1 mg 당 35 IU로 측정되었다.
실시예 2
공지된 니트릴라제에 높은 유사성을 보이는 DNA 단편의 단리
게놈 DNA를, 페놀-클로로포름 추출을 2회 추가하여 변형된 표준 방법 (Maniatis)에 의하여 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 단리하였다. 그렇게 단리된 DNA를, 프라이머 1F (서열 1) 및 7R (서열 2)을 사용하는 PCR에 의한 증폭의 표적으로서 사용하였다. 결과의 증폭된 생성물을 pGem-T 벡터 (위스콘신 매디슨 소재의 프로메가사 (Promega))로 클로닝하고 당업계에 보편적인 방법에 의해 서열분석하였다. 클론 pJJ 28-5로부터, 로도코커스 로도크로우스 K 22 (젠뱅크 허가번호 D12583)에서 유래한 니트릴라제 DNA 서열 일부 영역과 74.1％의 동일성을 갖는 385 bp의 DNA 단편 (서열 3)을 얻었다.
실시예 3
385 bp의 부분 유전자 단편에 높은 상동성을 갖는 서열을 함유한 염색체 단편의 편재
아시도보락스 파실리스 72W로부터의 고분자량 게놈 DNA 1 내지 3 ㎍의 샘플을 제조사 (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재의 라이프 테크놀로지사 (Gibco-BRL))에 의해 공급된 완충액 중에서 제한효소PstⅠ으로 분해하였다. 분해된 샘플을 아가로스 겔 상에서 분리하고 나일론 막 상에서 서던 블롯팅을 하였다. 삽입체에 인접한 제한 부위를 절단하여, pJJ28-5로부터 385 bp의 니트릴라제 유전자 단편 (서열 3)을 함유하는 프로브를 제조하였다. 혼성화를 60℃에서 수행한 후에 고엄격 세척 (0.1 x SSC, 0.1％ SDS, 60℃에서 15분 동안)을 수행하였다. 프로브의 표지, 도트 블롯 (dot blot)을 위한 혼성화 및 검출, 및 이후의 서던 블롯팅 실험을 ECL 랜덤 프라임 표지 및 검출 시스템 버전 Ⅱ (영국 버킹함셔 소재의 아머샴 인터내셔날 피엘씨 (Amersham International plc))를 사용하여 수행하였다.
PstⅠ 분해물로부터, 프로브와 혼성화시에 니트릴라제 유전자가 아시도보락스 파실리스 72W 게놈의 4.1 kbPstⅠ 상에 존재함을 지시하는 단일의 4.1 kb 밴드를 얻었다.
실시예 4
아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 게놈 라이브러리의 제작
아시도보락스 파실리스 72W로부터 고분자량의 게놈 DNA 5 ㎍을PstⅠ로 절단하고, 예비용 1％ 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 크기가 2.5 내지 7 kb 범위인 단편을 겔로부터 회수하고,PstⅠ 절단되고 탈인산화된 pBluescript Ⅱ SK (+) 벡터 (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진사 (Stratagene))로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 이. 콜라이 DH10B 일렉트로맥스 세포 (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재의 라이프 테크놀로지 (Gibco-BRL))로 전기형질전환시키고, 형질전환된 세포를 LB + 앰피실린 (100 ㎍/㎖) + IPTG + X-Gal 플레이트 상에 플레이팅하였다. 95％ 재조합 플라스미드를 갖는 결과의 라이브러리는 4 X 106개의 독립적인 재조합 클론을 대표한다. 라이브러리 스크리닝 및 보관을 위하여, 플레이트에서 긁어 모은 세포로부터 플라스미드를 제조하였다.
상기 플라스미드 라이브러리를 이. 콜라이 DH5α(미국 메릴랜드주 록빌 소재의 라이프 테크놀로지) 세포로 형질전환시키고, 형질전환체를 LB + 앰피실린 100 ㎍/㎖ 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후에, 잘 단리된콜로니를 나일론 막으로 전이시키고, 원래 위치에서 (in situ) 용균하여 DNA를 막에 고정시켰다. 막을 실시예 3에 기재된 표지 니트릴라제 유전자 프로브로 조사하였다. 니트릴라제 프로브와 (+) 혼성화를 나타내는 세 개의 콜로니들은 앰피실린의 존재하에 배양액으로 증식하였다. 플라스미드 pnit4, pnit5 및 pnit6은, 각각 제한효소PstⅠ,EcoRⅠ 및HindⅢ로 절단시 동일한 패턴을 나타냈다. 이 결과로 동일한 삽입체가 pnit4, pnit5 및 pnit6에 존재함을 확인하였다. 제한효소 절단으로 이전에 서던 혼성화로부터 예상된 바와 같이 4.1 kbPstⅠ 삽입물을 얻었다.
실시예 5
아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 니트릴라제 ORF의 서열분석
플라스미드 pnit4 내 4.1 kb 삽입체를 표준 상거 (Sanger) 디데옥시 사슬 종결 방법을 이용하여 서열분석하였다. GCG MAP 및 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하는 서열 분석으로, 1110 bp의 오픈 리딩 프레임 (서열 4; 서열 15, 염기 332 내지 1441)의 존재를 밝혔다. 이 ORF는 pnit4 삽입체의BclⅠ-BglⅡ 단편 (서열 15 및 도 1) 내에 존재하였다. 젠뱅크 서열 데이터베이스의 검색으로, 이 오픈 리딩 프레임 (서열 4)이 로도코커스 로도크로우스 K22 (젠뱅크 허가번호 D12583)에서 유래한 니트릴라제 ORF와 68％의 동일성을 갖는다는 것을 밝혔다. 이 오픈 리딩 프레임 (서열 4)로부터 추정된 369개의 아미노산 서열 (서열 5)은 로도코커스 로도크로우스 K22 니트릴라제 단백질과 71％ 동일하였다. 아시도보락스 파실리스 72W ORF (서열 4)에 의해 코딩된 아미노산 서열 (서열 5)을, 프로파일스캔 및 스캔프로사이트 도구를 이용하여 단백질 족 및 도메인의 PROSITE 데이터베이스에서 조사한 결과, 모두 공지된 니트릴라제에서 보존된 신호 패턴의 존재를 밝혔다.
실시예 6
이. 콜라이에서 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 니트릴라제의 발현
올리고뉴클레오티드 서열 6 및 서열 7을 PCR 반응에 사용하여, 아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 게놈 DNA로부터 니트릴라제 ORF를 증폭하였다. PCR 생성물을NdeⅠ 및BamHⅠ로 분해하고, 이를 NdeⅠ-BamHⅠ으로 선형화된 pET-3c로 클로닝하였다. 결과의 발현 플라스미드 (pnitex2)에서 니트릴라제 ORF의 출발 코돈은 천연 GTG 코돈 (서열 4) 대신 ATG (서열 13)이었다. 따라서, pnitex2로부터 발현된 니트릴라제의 아미노산 서열은 위치 1에 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 (서열 5)의 천연 V (발린) 대신 M (메티오닌)을 갖는다 (서열 14). 플라스미드 pnitex2 및 pET-3c (대조군)를 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐사)로 형질전환시켜 각각 SS1001 및 BL21(DE3):pET-3c를 얻었다.
pnitex2 및 pET-3c를 BL21-SI (메릴랜드주 록빌 소재의 라이프 테크놀로지사)로 형질전환시켜 얻은 결과의 균주를 각각 SS1002 및 BL21-SI:pET-3c로 명명하였다. 플라스미드 pnitex2는 T7 프로모터의 조절 하에 니트릴라제 코딩 서열을 함유한다. T7 프로모터의 조절 하에 유전자 (이 경우 키메라 니트릴라제 유전자)의 전사를 조절하는, 염색체 상에 위치한 T7 RNA 중합효소의 전사는, 숙주 균주 BL21(DE3)에 IPTG를 첨가함으로써 그리고 숙주 BL21-SI에 NaCl을 첨가함으로써 유도된다. 상기 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 (및 대조군 균주 BL21(DE3):pET-3c)과 SS1002 (및 대조군 균주 BL21-SI:pET-3c)를 진탕 플라스크 또는 10 ℓ 발효기내에서 배양하고, 제조사에 의해 공급된 프로토콜에 따라 IPTG 또는 NaCl 첨가에 의한 유도로 또는 유도 없이 키메라 니트릴라제 유전자 발현을 측정하였다. 균주 SS1001, SS1002 및 BL21(DE3):pET-3c의 조 추출물을 제조하고 SDS-PAGE 겔 상에서 레인 당 총 단백질 5 내지 20 ㎍으로 러닝하였다. SDS-PAGE 겔의 분자량 및 레이저 농도계 분석으로, 균주 SS1001 및 SS1002가 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 단백질의 예상된 크기에 상응하는 약 40 kd 크기의 특정 단백질 밴드를 발현함이 측정되었다. 이 밴드는 SS1001 내 총 가용성 단백질의 50％를 초과하였다. BL21(DE3):pET-3c 조 추출물에는 상응하는 밴드가 없었다. SS1001에서 유래한 추출물의 효소 분석은 총 가용성 단백질의 12％가 효소적-활성 니트릴라제였음을 시사하였다.
전세포 이. 콜라이 형질전환체인 SS1001 및 SS1002과 각각의 대조군 균주 BL21(DE3):pET-3c 및 BL21-SI:pET-3c로 또한 니트릴라제 활성에 대하여 시험하였다. 상기 형질전환체들을 후기 로그기로 배양하여, 유도되거나 유도되지 않은 전세포 니트릴라제 활성 수준을 오직 대조군 pET-3c 벡터만을 함유하는 균주의 활성과 비교하였다 (표 2). 니트릴라제 활성은 MGN으로부터 4-CPA의 생성 속도를 결정함으로써 측정하였다. 50 mg (건세포 중량)/㎖의 세포 현탁액을 0.10 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0 중에 제조하였다. 25℃에서, 자성 교반 막대를 구비한 20 ㎖의 유리 섬광 바이알에 0.40 M MGN 수용액 3.0 ㎖을 첨가하였다. 교반하면서 세포 현탁액 1.0 ㎖을 25℃에서 첨가하였다. 세포 현탁액을 첨가한 후 5, 10 및 15분에, 180 ㎕의 분취물을 반응 혼합물로부터 분리하여, 5 ㎕의 6.0 N HCl 및 물 중 0.75M N-메틸프로피온아미드 (HPLC 외부 표준) 20 ㎕와 혼합하고, 원심분리하고, 상층액을 4-CPA 암모늄염의 생성 속도에 대해 HPLC에 의해 분석하였다.
니트릴라제 활성도의 유닛 (IU)은 1분 당 1 마이크로몰의 4-CPA 암모늄염이 생성되는 것과 동등하다. 활성도 수준을 건세포 중량 1 g 당 유닛으로 기록하였고, 에이. 파실리스 72W의 활성과 비교하였다.
| 형질전환체 촉매 | 유도 | 니트릴라제 활성(IU/건세포 중량 g) |
| 이. 콜라이 SS1001(BL21(DE3):pnitex2) | 없음 | 360 |
| 이. 콜라이 SS 1001(BL21(DE3):pnitex2) | IPTG | 466 |
| 이. 콜라이 대조군(BL21(DE3):pET-3c) | IPTG | 0 |
| 이. 콜라이 SS1002(BL21-SI:pnitex2) | NaCl | 288 |
| 이. 콜라이 대조군(BL21-SI:pET-3c) | 없음 | 0 |
| 아시도보락스 파실리스 72W(ATCC 55746) | 적용 불가능 | 271 |
실시예 7
이. 콜라이에서 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 유전자의 발현
72W 니트릴라제 코딩 서열을, 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에서 결정된 DNA 서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 아시도보락스 파실리스 72W로부터 PCR에 의해 단리하였다. 코딩 서열을 서열 8 및 서열 9로서 확인된 프라이머를 사용하여 증폭시키고, pGEM-T (위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가사)로 서브클로닝하였다. 서열 8로서 확인된 프라이머는 천연 GTG 출발 코돈을 ATG로 변화시킨다. 그 다음, 니트릴라제 유전자 단편을 pGEM-T로부터BamHⅠ 및SacⅠ으로 분리하고, 이를 이. 콜라이 발현 벡터 pET-21a (위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐)의BamHⅠ과SacⅠ 사이에 서브클로닝하여, 11개의 아미노산인 T7 태그를 니트릴라제 코딩 서열의 N-말단에서 코딩하도록 플라스미드 pSW90을 생성하였다. 또한, 코딩 서열을 서열 10 및 서열 9로서 확인된 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 이를 pGEM-T로 서브클로닝하였다. 서열 10으로서 확인된 프라이머는 천연 GTG 출발 코돈을 ATG로 변화시킨다. 그 다음, 유전자 단편을 pGEM-T로부터NdeⅠ으로 분리하고, 이를 pET-2의NdeⅠ 위치로 서브클로닝하여 천연 니트릴라제 코딩 서열에는 아무런 변화 (기재된 바와 같이 출발 코돈은 제외)가 없도록 플라스미드 pSW91을 생성하였다. 플라스미드 pSW90 및 pSW91을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) (위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐사)로 형질전환시켜 각각 균주 SW90 및 SW91을 생성하였다. SW90 및 SW91의 표준 배양 및 유도 (노바겐사의 권장) 후에, 세포 추출물을 제조하고 SDS-PAGE에 의해 조사한 후, 72W 니트릴라제 단백질에 상응하는 예상된 크기 (약 40 kDa)의 주요 단백질 밴드를 관찰하였다. SW91의 경우에, PAGE 겔 상의 니트릴라제 단백질은 총 가용성 단백질이 50％를 초과하였다. 어떠한 비교할만한 주요 밴드도 대조군에서는 관찰되지 않았다.
아시도보락스 파실리스 72W (ATCC 55746) 니트릴라제 코딩 서열을 발현하는 이. 콜라이 형질전환체 SW91을 실시예 6에 기재된 바와 같이 MGN으로부터 4-CPA 생성 속도를 측정함으로써 니트릴라제 활성에 대하여 시험하였다.
제조사 (위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐사)에 의한 권장에 따라 배양 및 IPTG 유도 후에, SW91의 니트릴라제 활성 수준을 측정하고, 니트릴라제 유전자가 없는 발현 벡터를 함유하는 대조군 형질전환체의 활성 및 에이. 파실리스 72W에서 관찰된 전형적인 활성과 비교하였다. 결과는 표 3에 나타나 있다. 니트릴라제 활성 1 유닛 (IU)은 1분 당 1 마이크로몰의 4-CPA 암모늄염이 생성되는 것과 동등하고, 이를 건세포 중량 1 g 당 유닛으로 기록하였다.
| 균주 | 니트릴라제 활성(IU/건세포 중량 g) |
| 이. 콜라이 SW91(BL21(DE3):pSW91) | 551 |
| 이. 콜라이 대조군(BL21 (DE3:pET-21a) | 0 |
| 아시도보락스 파실리스 72W(ATCC 55746) | 271 |
이. 콜라이 형질전환체 SW91을 또한 포화될 때 (12 내지 16시간)까지 IPTG 유도 없이 LB 배지 (Maniatis) 내에서 37℃로 진탕 배양한 후에, 세포를 원심분리에 의해 수확하여 니트릴라제 활성에 대하여 분석하였다. 결과는 표 4에 나타나 있고, 에이. 파실리스 72W에 대해 관찰된 전형적인 활성과 비교하였다.
| 주 | 니트릴라제 활성(IU/건세포 중량 g) |
| 이. 콜라이 SW91(BL21(DE3):pSW91) | 662 |
| 아시도보락스 파실리스 72W(ATCC 55746) | 271 |
실시예 8
카라게닌에 아시도보락스 파실리스 72W 또는 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 세포의 고정
250 ㎖ 배지 병 (자성 교반 막대를 구비하고 50℃에서 증류된 탈이온수 64.12 g을 함유)에, 빠르게 교반하면서 3.38 g의 FMC 바이오폴리머 (BioPolymer) 이사겔 (ISAGEL?) RG300 카라게닌을 서서히 첨가하였다. 카라게닌이 완전히 용해될 때까지 혼합물을 빠르게 교반하면서 75 내지 80℃로 가열하고, 결과의 용액을 자동 온도 조절 장치가 있는 수조에서 55 내지 56℃ (겔화 온도 약 52℃)로 냉각시켰다. 0.35 M 인산수소나트륨 완충액 중 아시도보락스 파실리스 72W 세포 또는 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 (12.5％ 건세포 중량)의 현탁액 (총 부피 45 ㎖, pH 7.3)을 50℃에서 60분 (아시도보락스 파실리스 72W) 또는 12분 (이. 콜라이 형질전환체 SS1001)동안 가열한 다음, 카라게닌 용액을 55 내지 56℃에서 교반하면서 첨가하였다. 즉시, 세포/카라게닌 혼합물에 450 ㎖의 대두유를 50℃에서 천정 교반기를 이용하여 교반하면서 서서히 첨가하였다. 교반 속도의 조절에 의해 오일 내에서 목적한 크기의 세포/카라게닌 액적을 생성한 후에, 오일의 온도를 35℃로 낮추어 액적을 겔화시키고, 결과의 비드로부터 오일을 기울여 따라 버린 (decant)후, 이를 0.10 M 중탄산칼륨 완충액 (pH 7.3)으로 세척하였다. 비드 중 20 g 부분을 48.8 ㎖의 0.10 M 중탄산칼륨 완충액 (pH 7.3)에 현탁시키고, 물 중 25 중량％의 글루타르알데히드 0.25 g을 첨가하고, 비드를 25℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 혼합물에 물 중 12.5 중량％의 폴리에틸렌이민 (BASF 루파솔 (Lupasol?) PR971L, 평균 Mw 약 750,000) 1.0 g을 첨가하고, 비드를 25℃에서 추가의 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 가교결합된 비드를 25℃에서 0.30 M 중탄산암모늄 (pH 7.3) 50 ㎖로 세척하고, 동일한 완충액 중에서 5℃에 보관하였다.
실시예 9
4-시아노펜탄산 암모늄염의 생성을 위한 촉매로서 카라게닌에 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 및 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 세포의 비교
전형적인 반응에서, 16.5 g의 고정된 세포/카라게닌 비드를 재순환 온도 조를 이용하여 30℃로 온도가 조절된 125 ㎖의 자켓 (jacketed) 반응 용기에 넣었다. 반응 용기에 69.25 ㎖의 물 및 14.25 ㎖ (13.54 g, 1.25 M)의 2-메틸글루타로니트릴을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 교반하였다. 샘플 (0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 다음, 0.360 ㎖의 희석된 샘플을 물 중 0.75 M N-메틸프로피온아미드 0.040 ㎖ 및 6.0 N HCl 0.020 ㎖과 혼합하였다. 결과의 혼합물을 여과하고 (0.22 ㎛), 여액을 HPLC에 의해 2-메틸글루타레이토니트릴, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산에 대해 분석하였다. 카라게닌에 고정된 아시도보락스 파실리스 72W 및 이. 콜라이 형질전환체 SS1001 세포를 사용하였을 때, 4-시아노펜탄산의 생성 속도는 각각 184 mM/h 및 310 mM/h이었다. 2-메틸글루타로니트릴의 완전한 전환시, 각각의 촉매는 4-시아노펜탄산 암모늄염 및 2-메틸글루타르산 이암모늄염을 각각 수율 98.7％ 및 1.3％로 생성하였다.
실시예 10
알긴산칼슘에 이. 콜라이 형질전환체 SW91 세포의 고정
100 ㎖ 배지 병 (자성 교반 막대를 구비하고 50℃에서 증류된 탈이온수 22.9 g을 함유)에, 빠르게 교반하면서 1.10 g의 FMC 바이오폴리머 프로타날 (Protanal?) LF 10/60 알기네이트를 서서히 첨가하였다. 알기네이트가 완전히 용해될 때까지 혼합물을 빠르게 교반하면서 75 내지 80℃로 가열하고, 결과의 용액을 수조에서 25℃로 냉각시켰다. 0.15 M 아세트산나트륨 완충액 중 이. 콜라이 형질전환체 SW91 (50％ 젖은 세포 중량, 11.5％ 건세포 중량)의 현탁액 (총 부피 16 ㎖, pH 7.0)을 25℃에서 알기네이트 용액에 교반하면서 첨가하였다. 세포/알기네이트 혼합물을, 0.20 M 아세트산칼슘 완충액 (pH 7.0) 213 ㎖에 25℃에서 교반하면서 주사기에 의해 적가하였다. 2시간 동안 교반한 후에, 완충액을 결과의 비드로부터 기울여 따라 버리고, 이를 25℃에서 0.20 M 아세트산칼슘 완충액 (pH 7.0) 84 ㎖에 현탁시켰다. 물 중 25 중량％의 글루타르알데히드 0.88 g을 교반하면서 첨가하고, 비드를 1.0시간 동안 25℃에서 혼합하였다. 그 다음, 혼합물에 물 중 12.5 중량％의 폴리에틸이민 (BASF 루파솔 PR971L (등록상표), 평균 Mw 약 750,000) 3.5 g을 첨가하고, 비드를 추가의 1시간 동안 25℃에서 혼합하였다. 그 다음, 가교결합된 비드를 25℃에서 0.20 M 아세트산칼슘 완충액 (pH 7.0) 84 ㎖으로 2회 세척하고, 동일한 완충액 중에 5℃에서 보관하였다.
실시예 11
4-시아노펜탄산 암모늄염의 생성을 위한 촉매로서 알긴산칼슘에 고정된 이. 콜라이 형질전환체 SW91 세포
125 ㎖의 자켓 반응 용기 (재순환 온도 조를 이용하여 30℃로 온도가 조절됨)에 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조된 16.5 g의 이. 콜라이 SW91/알기네이트 비드를 넣었다. 반응 용기에 68.25 ㎖의 물, 1.0 ㎖의 0.20 M 아세트산칼슘 완충액 (pH 7.0) 및 14.25 ㎖ (13.54 g, 1.25 M)의 2-메틸글루타로니트릴을 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 교반하였다. 샘플 (0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 다음, 0.360 ㎖의 희석된 샘플을 물 중 0.75 M N-메틸프로피온아미드 0.040 ㎖ 및 6.0 N HCl 0.020 ㎖과 혼합하였다. 결과의 혼합물을 여과하고 (0.22 ㎛), 여액을 HPLC에 의해 2-메틸글루타레이토니트릴, 4-시아토펜탄산 및 2-메틸글루타르산에 대하여 분석하였다. 4-시아노펜탄산의 생성 속도는 739 mM/h이었고, 반응은 2.5시간 내에 완결되었다. 2-메틸글루타로니트릴의 전환이 완결되었을 때, 4-시아노펜탄산 암모늄염 및 2-메틸글루타르산 디암모늄염의 수율은 각각 98.5％ 및 1.5％이었다.
반응의 말미에, 생성물 혼합물을 촉매 비드로부터 기울여 따라 버리고, 이를 상기와 같이 추가 5회의 연속 회분식 반응에서 재사용하였다. 반응 6에서 4-시아노펜탄산의 생성 속도는 721 mM/h이었고, 반응은 2.5시간 내에 완결되었다. 2-메틸글루타로니트릴의 전환이 완결되었을 때, 4-시아노펜탄산 암모늄염 및 2-메틸글루타르산 디암모늄염의 수율은 각각 98.0％ 및 2.0％이었다.
실시예 12
고정된 아시도보락스 파실리스 72W 세포 니트릴라제에 대한 총 턴오버 수 (TTN)
125 ㎖의 자켓 반응 용기 (25℃로 온도가 조절됨)에 16.5 g의 고정된 아시도보락스 파실리스 세포 촉매 (실시예 8에 기재된 바와 같이 제조됨)를 넣었다. 반응 용기에 72.1 ㎖의 물 및 11.4 ㎖ (10.83 g, 1.0 M)의 MGN을 넣고, 혼합물을 25℃에서 교반하였다. 샘플 (0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 다음, 360 ㎖의 희석된 샘플을 물 중 0.75 M N-메틸프로피온아미드 0.040 ㎖ 및 6.0 N HCl 0.020 ㎖과 혼합하였다. 결과의 혼합물을 여과하고 (0.22 ㎛), 여액을 HPLC에 의해 분석하였다. MGN의 완전한 전환 후에, 생성물 혼합물 및 촉매를 250 ㎖ 용량의 비이커에 기울여 따라 버리고, 수성 생성물 혼합물을 촉매로부터 기울여 따라 버렸다. 남은 촉매 및 생성물 혼합물 힐 (heel)의 중량을 측정하여 이를 기록한 다음, 물을 최종 총 중량 (물 및 촉매) 88.6 g으로 촉매에 첨가하였다. 촉매 현탁액을 반응 용기로 다시 옮기고, 11.4 ㎖의 MGN을 첨가하고, 반응을 반복하였다.
촉매를 재순환시켜 총 67회의 연속 회분식 반응을 실행하였다. 67회의 재순환 반응 과정에 걸쳐 촉매 비드 중량의 손실은 없었고, 1001 g의 4-CPA/g dcw 아시도보락스 파실리스 72W 세포가 생성되었다. 초기 반응 속도는 142 mM 4-CPA/h이었는데, 이는 237 IU의 니트릴라제 활성 또는 6.76 mg (1.7 x 10-7몰)의 72W 니트릴라제에 상응한다. 67회의 연속 회분식 반응에서 생성된 4-CPA의 양은 6.6 몰이었고, 따라서 총 턴오버 수 (TTN = 효소 1몰 당 생성물의 몰)는 6.6/1.7 x 10-7, 즉 3.9 x 107TTN이었다.
실시예 13
피키아 파스토리스에서 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제 코딩 서열의 발현
합성 니트릴라제 유전자 (서열 16) (아시도보락스 파실리스 72W (서열 14)에 나타난 것과 동일한 단백질 서열을 코딩함)를, 16 개의 90 bp 올리고머 (서열 17 내지 32) 및 PCR-매개된 중첩 연장 (overlap extension) 기술을 이용하여 제작하였다. 합성 유전자는 코돈 이용도를 최적화시켰는데, 이는 에이. 파실리스 72W 니트릴라제 유전자 서열에서 발견되는 것과 상당히 다르다. 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인한 후에, 합성 니트릴라제 유전자를 pGAPZA 및 pPICZA (캘리포니아주 산 디에고 소재의 인비트로겐사 (Invitrogen))의 EcoRⅠ 부위로 서브클로닝하였다. pGAPZA는 외래 유전자 발현을 유도하는 구성적 피. 파스토리스 GAP (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소) 프로모터를 사용하고, pPICZA는 외래 유전자 발현을 유도하는, 메탄올로 유도가능한 피. 파스토리스 AOXI (알코올 산화효소 Ⅰ) 프로모터를 사용한다. 플라스미드 pGAP::nit 및 pAOX::nit를, 문헌 [Cregg et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3376-3385]에 기재된 바와 같이 본질적으로는 스페로플라스트 (spheroplast) 형질전환에 의해 피. 파스토리스 GS 115 (인비트로겐사)를 제오신 내성(zeocin resistance)으로 형질전환시켰다. 적절한 배양 및 유도 (pAOX::nit만이 유도가 필요함) 후에, 문헌 [Sreekrishna et al., Biochem (1989) 28:4117-4125]에 기재된 바와 같이 본질적으로는 제조된 세포 추출물의 SDS-PAGE 단백질 분석에 의해, 그리고 상기 (실시예 6 및 7)와 같은 효소 활성 분석에 의해 니트릴라제를 생성하는 형질전환체를 확인하였다.
실시예 14
총 가용성 단백질의 ％로서 아시도보락스 파실리스 72W 니트릴라제의 측정
상기 (실시예 1)와 같이 프렌치 압착기를 통해 25 중량％ 세포 현탁액을 통과시킴으로써 아시도보락스 파실리스 72W의 조 추출물을 제조하였다. 조 추출물의 가용성 단백질 분획의 분취물 중 단백질 성분을 10 내지 15％ SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건 (5％ β-메르캅토에탄올) 하에 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 전기영동 후에, 겔을 25℃에서 0.2％ 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) 염료, 30％ 메탄올 및 10％ 아세트산으로 구성된 용액으로 15분 동안 처리하였다. 30％ 메탄올 및 10％ 아세트산으로 구성된 용액으로 탈색시킨 후 단백질 밴드가 겔 내에서 가시화되었다. 그 다음, 겔 내 단백질 밴드를 LKB 울트라스캔 XL 인핸스드 레이저 농도계 (Ultroscan XL Enhanced Laser Densitometer)를 사용하여 통합시켰다. MW 약 40 kd의 서브유닛을 갖는 니트릴라제 밴드는 겔 상에서 검출된 총 가용성 단백질 중 3.4％를 나타내었다.
실시예 15
SS1011 [MG1655 (DE3):pnitex2l의 제작 및 그의 니트릴라제 활성
λDE3 프로파지를 이. 콜라이 균주 MG1655 (ATCC 47076) 내로 위치-특이적 통합시켜 균주 MG1655 (DE3)을 얻었다. λDE3 용원화 (lysogenization) 키트 (위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐사, 카탈로그 번호 69734-3)를 제조사의 지시에 따라 본 목적을 위하여 사용하였다. MG1655 (DE3)를 실시예 6에 기재된 바와 같이 플라스미드 pnitex2로 형질전환시켜 SS1011을 얻었다. 균주 SS1011 및 SS1001을LB 배지에서 16 내지 17 시간 동안 배양하였다. 표 5에 나타난 바와 같은 전세포 니트릴라제 활성을, 245 nm에서의 흡광도 증가에 의해 지시되는 벤조니트릴 (9.5 mM, 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.0)의 벤조산으로의 가수분해를 측정하는, 35℃에서 수행된 마이크로리터 플레이트-기재의 분광측정 분석을 이용하여 측정하였다. 이 분석법을 이용하여 측정된 니트릴라제 활성 유닛 (IU)은, 더 높은 분석 온도 (35℃ 대 25℃) 및 상대적으로 더 높은 벤조니트릴에 대한 효소의 기질 특이성 때문에 통상 상기 메틸글루타로니트릴 분석을 이용하여 측정된 것보다 5 내지 6배 높았다.
| 형질전환체 촉매 | 니트릴라제 활성(IU/건세포 중량 g) |
| 이. 콜라이SS1011(MG1655 (DE3):pnitex2) | 3652 |
| 이. 콜라이 SS1001(BL21(DE3):pnitex2) | 4500 |
| 아시도보락스 파실리스 72W(ATCC 55746) | 1491 |
Claims (43)
- (a) 서열 5 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전부 또는 그의 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편,(b) 서열 5 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 전부 또는 그의 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편,(c) 6X SSC (1M NaCl), 40 내지 45％ 포름아미드, 1％ SDS로 37℃에서 혼성화시키고 0.5X 내지 1X SSC로 55 내지 60℃에서 세척하는 조건하에서 (a)의 단리된 핵산 단편과 혼성화되는 단리된 핵산 단편, 및(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)와 완전히 상보적인 단리된 핵산 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 니트릴라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 단편.
- 서열 5로 확인된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 비교시 니들만 및 운쉬 (Needleman and Wunsch)의 연산법에 기초하여 동일성이 71％가 넘는, 아미노산 369개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 제1 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편.
- (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 15 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 핵산 단편,(b) 6X SSC (1M NaCl), 40 내지 45％ 포름아미드, 1％ SDS로 37℃에서 혼성화시키고 0.5X 내지 1X SSC로 55 내지 60℃에서 세척하는 혼성화 조건하에서 (a)의 단리된 핵산 단편과 혼성화되는 단리된 핵산 분자, 및(c) 상기 (a) 또는 (b)와 완전히 상보적인 단리된 핵산 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 니트릴라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 단편 또는 그의 단편.
- 서열 4, 서열 13, 서열 15 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 니트릴라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 서열.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편이 아시도보락스 (Acidovorax) 균주로부터 단리된 것인 단리된 핵산 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 서열 5 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 지방족 니트릴 및 방향족 니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 니트릴 함유 기질에 대한 니트릴라제 활성이 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 단편을 포함하는 키메라 유전자.
- ATCC PTA-1175로 지정된 이. 콜라이 (E. coli) SW91에 함유된 플라스미드 pSW91, ATCC PTA-1176으로 지정된 이. 콜라이 DH5α:pnit4에 함유된 플라스미드 pnit4, 또는 이. 콜라이 SS1002 또는 이. 콜라이 SS1011에 함유된 플라스미드 pnitex2.
- 제9항의 키메라 유전자를 포함하는 발현 카세트.
- 제11항에 있어서, 플라스미드 pSW91, pnit4 및 pnitex2로 이루어진 군으로부터 선택되는 발현 카세트.
- 제9항의 키메라 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물.
- 제10항의 플라스미드를 포함하는 형질전환된 미생물.
- 제11항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 미생물.
- 제15항에 있어서, 발현 카세트가 염색체에 통합된 것인 형질전환된 미생물.
- 제16항에 있어서, 적합한 조절 서열을 더 포함하는 형질전환된 미생물.
- 제17항에 있어서, 적합한 조절 서열이a) 이. 콜라이의 트립토판 오페론 프로모터인 Ptrp, 이. 콜라이의 락토스 오페론 프로모터인 Plac, 이. 콜라이의 Ptac 프로모터, 파지 람다의 우측 프로모터 PR, 파지 람다의 좌측 프로모터 PL, T7 프로모터, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 유래한 AOX1 유전자의 프로모터, 및 피키아 파스토리스에서 유래한 GAP 유전자의 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프로모터, 또는 코마모나스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 로도코커스, 아조토박터, 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클레브시엘라, 살모넬라, 락토바실러스, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 자이고사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰롭시스, 메틸로박테리아, 바실러스, 에셰리키아, 슈도모나스, 리조비움 및 스트렙토마이세스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강력한 프로모터, 및b) 파지 람다 CⅡ 유전자로부터 유래하거나, 또는 코마모나스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 로도코커스, 아조토박터, 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클레브시엘라, 살모넬라, 락토바실러스, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰롭시스, 메틸로박테리아, 바실러스, 에셰리키아, 슈도모나스, 리조비움 및 스트렙토마이세스의 유전자에서 유래한 리보솜 결합 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 리보솜 결합 부위를 포함하는 것인 형질전환된 미생물.
- 제18항에 있어서, 숙주 미생물이 코마모나스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 로도코커스, 아조토박터, 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클레브시엘라, 살모넬라, 락토바실러스, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이세스, 무코르, 토룰롭시스, 메틸로박테리아, 바실러스, 에셰리키아, 슈도모나스, 리조비움 및 스트렙토마이세스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형질전환된 미생물.
- (a) ATCC PTA-1175로 지정된 이. 콜라이 SW91,(b) ATCC PTA-1176으로 지정된 이. 콜라이 DH5α:pnit4,(c) ATCC PTA-1177로 지정된 이. 콜라이 SS1001,(d) 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1002, 및(e) 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1011로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환된 미생물.
- (a) 제4항의 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 이종 숙주를 적합한 조건하에서 니트릴 함유 기질과 접촉시키는 단계, 및(b) 임의로 단계 (a)에서 생성된 카르복실산을 수거하는 단계를 포함하는, 니트릴 함유 기질을 카르복실산으로 효소적 전환시키는 방법.
- 제21항에 있어서, 니트릴 함유 기질이 화학식 NC-R-CN (여기서, R은 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기임)의 디니트릴인 방법.
- 제22항에 있어서, 니트릴 함유 기질이 2-메틸글루타로니트릴인 방법.
- (a) 제9항의 키메라 유전자를 포함하는 형질전환된 이종 숙주를 적합한 조건하에서 니트릴 함유 기질과 접촉시키는 단계, 및(b) 임의로 단계 (a)에서 생성된 카르복실산을 수거하는 단계를 포함하는, 니트릴 함유 기질을 카르복실산으로 효소적 전환시키는 방법.
- 제24항에 있어서, 니트릴 함유 기질이 화학식 NC-R-CN (여기서, R은 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기임)의 디니트릴인 방법.
- 제24항에 있어서, 니트릴 함유 기질이 2-메틸글루타로니트릴인 방법.
- 제24항에 있어서, 키메라 유전자의 적합한 조절 서열이 유도가능한 프로모터를 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 단계 (a)의 적합한 조건에 유도가능한 프로모터에 대한 인듀서 (inducer)의 존재가 더 포함되는 것인 방법.
- (a) ATCC PTA-1175로 지정된 이. 콜라이 SW91을 적합한 조건하에서 2-메틸글루타로니트릴과 접촉시키는 단계, 및(b) 임의로 단계 (a)에서 생성된 카르복실산을 수거하는 단계를 포함하는, 2-메틸글루타로니트릴을 상응하는 카르복실산으로 효소적 전환시키는 방법.
- (a) 수성 반응 혼합물 중의 지방족 α,ω-디니트릴을 효소 촉매와 접촉시킴으로써 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-시아노카르복실산 암모늄염으로 전환시키는 단계,(b) 상기 단계 (a)에서 생성된 수성 생성물 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와접촉시킴으로써, 중간체인 ω-시아노카르복실산, ω-시아노카르복실산 암모늄염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄염의 단리없이 ω-시아노카르복실산 암모늄염을 상응하는 락탐으로 직접 전환시키는 단계, 및(c) 상기 단계 (b)에서 생성된 수성 생성물 혼합물로부터 락탐을 회수하는 단계를 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 고리 락탐 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법에 있어서,상기 단계 (a)에서 수성 반응 혼합물 중의 지방족 α,ω-디니트릴을(1) ATCC PTA-1175로 지정된 이. 콜라이 SW91,(b) ATCC PTA-1176으로 지정된 이. 콜라이 DH5α:pnit4,(c) ATCC PTA-1177로 지정된 이. 콜라이 SS1001,(d) 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1002, 및(e) 플라스미드 pnitex2를 함유하는 이. 콜라이 SS1011로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 촉매와 접촉시키는 것을 포함하는 개선된 제조 방법.
- 제30항에 있어서, 지방족 α,ω-디니트릴이 NCCXa(R)(CH2)nCN (여기서, a는 0 또는 1이고, a가 1인 경우에 X는 수소이며, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 치환된 알케닐, 또는 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴이고, n은 1 또는 2임)의 화학식을 갖는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, α,ω-디니트릴이 2-메틸글루타로니트릴인 방법.
- 제30항에 있어서, 지방족 α,ω-시아노가 α-탄소 원자에서 비대칭적으로 치환된 것이고, 효소 촉매가 ω-시아노기의 위치 선택적 가수분해로부터 생성된 ω-시아노카르복실산 암모늄염을 생성함으로써 단계 (b)에서 가능한 2가지 락탐 생성물 중 단지 하나만을 생성하는 지방족 니트릴라제 활성이 있음을 특징으로 하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (b) 이전에 ω-시아노카르복실산 암모늄염을 함유하는 수성 생성물 혼합물에 수산화암모늄, 암모니아 기체 또는 메틸아민을 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제34항에 있어서, 수성 생성물 혼합물에 첨가되는 수산화암모늄, 암모니아 기체 또는 메틸아민의 양이, 존재하는 ω-시아노카르복실산 암모늄염의 양에 대해 0 내지 4 몰당량인 방법.
- 제35항에 있어서, 단계 (b) 이전에 ω-시아노카르복실산 암모늄염을 함유하는 수성 생성물 혼합물에 메틸아민이 첨가되며, 단계 (b)의 생성물이 N-메틸락탐인 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (b)에서 수성 생성물 혼합물의 온도가 45℃ 내지 200℃인 방법.
- 제30항에 있어서,지방족 α,ω-디니트릴이 화학식또는(식 중, R1및 R2는 둘 다 H이고,R3, R4, R5및 R6은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 또는 알케닐 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3과 R4가 함께 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴이거나, 또는 독립적으로 R5와 R6이 함께 알킬리덴 또는 치환된 알킬리덴임)의 화합물인, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 고리 락탐 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법.
- 제30항 또는 제38항에 있어서, 효소 촉매가 불용성 지지체 내에 또는 그 위에 고정된 미생물 전세포 형태인 방법.
- (i) 제한 엔도뉴클레아제를,a) 천연 미생물 유전자,b) 상기 (i)(a)의 천연 미생물 유전자의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 제1 뉴클레오티드 단편 집단, 및c) 상기 (i)(a)의 천연 미생물 유전자의 뉴클레오티드 서열과 혼성화되지 않을 제2 뉴클레오티드 단편 집단을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 혼합물과 접촉시켜, 제한 단편의 혼합물을 수득하는 단계,(ii) 단계 (i)의 제한 단편 혼합물을 변성 (denaturation)시키는 단계,(iii) 단계 (ii)의 변성된 제한 단편 혼합물을 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계, 및(iv) 단계 (i), (ii) 및 (iii)을 충분한 회수로 반복하여, 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 비활성 및(또는) 니트릴라제의 증가된 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 니트릴라제 활성에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는 돌연변이화 미생물 유전자를 수득하는 단계를 포함하는, 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 비활성 및(또는) 니트릴라제의 증가된 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 니트릴라제 활성에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는 돌연변이화 미생물 유전자를 얻기 위한, 니트릴 함유 기질에 대한 니트릴라제 활성이 있음을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 천연 미생물 유전자의 이용 방법.
- 제40항에 있어서, 천연 미생물 유전자가 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis) 72W이며, 니트릴 함유 기질이 2-메틸글루타로니트릴인 방법.
- 니트릴 함유 기질에 대한 증가된 니트릴라제 비활성 및(또는) 니트릴라제의 증가된 안정성이 있음을 특징으로 하는 (상기 특징 중 하나 또는 둘 다가 천연 미생물 유전자의 니트릴라제 활성에 비해 증가된 것임) 단백질을 코딩하는, 제40항의 방법에 의해 생성된 돌연변이화 미생물 유전자.
- 제16항에 있어서, 숙주 미생물이 이. 콜라이 균주 MG1655 (ATCC 47076), W3110 (ATCC 27325), MC4100 (ATCC 35695) 또는 W1485 (ATCC 12435)인 형질전환된 미생물.
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