CN101339197B - 葡萄球菌蛋白a定量检测试剂盒及定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒。该试剂盒采用类似双抗体夹心的ELISA方法定量检测微量葡萄球菌蛋白A，并通过采用生物素-亲和素系统，使其灵敏度达到pg级。该葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒可适用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱在使用过程中脱落的微量葡萄球菌蛋白A的定量检测，以及其他有关葡萄球菌蛋白A含量的定量检测，具有灵敏度高、准确性和稳定性好等优点。

Description

葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒及定量检测方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

葡萄球菌蛋白A的发现从一开始就与IgG(免疫球蛋白G)相关联，早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀的物质。Jensen(1959)也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与糖相区别，Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称葡萄球菌蛋白A或SPA。1978年，有研究者将加热灭活并经福尔马林固定的金黄色葡萄球菌用于一种癌症的治疗，显示出一定的疗效，这是世界上第一次利用葡萄球菌蛋白A的抗体吸附性治疗相关疾病的报道。Uhlen等在1984年阐明了葡萄球菌蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。2003年，L.Yang等应用表面张力探针证明每个葡萄球菌蛋白A分子可结合两个IgG分子。

葡萄球菌蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成(若加上氨基端信号肽序列则为1572个碱基)，共编码488个氨基酸，分子量约42KD。整个葡萄球菌蛋白A分子包含六个结构域：E、D、A、B、C和X(从氨基端至羧基端)，其中，E、D、A、B、C这五个结构域均具备结合IgG的能力。X结构域的作用是将葡萄球菌蛋白A嵌合入金黄色葡萄球菌的细胞壁。

葡萄球菌蛋白A可与人类和哺乳动物血清中的免疫球蛋白分子Fc段结合，特别是IgG和含IgG的免疫复合物，这是一种非免疫反应性结合，具有高度的亲和力。葡萄球菌蛋白A的应用主要基于其抗体结合能力。将葡萄球菌蛋白A通过化学方法交联至各种支架结构上，如与琼脂糖凝胶共价耦合，能耐受温度、pH变化和变性剂的作用而不脱失。这种由葡萄球菌蛋白A和琼脂糖凝胶合成的填料可用于抗体的分离纯化。随着免疫吸附血液净化治疗技术的快速发展，这种合成填料逐渐被应用于自身免疫疾病、恶性肿瘤、移植排斥等疾病的治疗，当患者血浆通过时，基质中葡萄球菌蛋白A可与血浆中致病性抗体，特别是IgG型抗体结合，这是一种可逆性、pH敏感的结合，将pH降至2.3～2.5时，葡萄球菌蛋白A与所结合抗体解离，抗体被洗脱清除，将pH恢复至7.0时，葡萄球菌蛋白A又恢复吸附能力，这样可不断重复循环吸附致病性抗体，从而达到治疗疾病的目的，这种免疫吸附的方法称为葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Protein AImmunoadsorption，PAIA)。

在葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的使用过程中，吸附柱内结合不牢固的葡萄球菌蛋白A可能会随着血浆的流动从吸附柱上脱落，如果这些脱落的葡萄球菌蛋白A通过血液进入人体并积累到一定量时很可能会对人体造成伤害并引发免疫系统的相关症状，因此对脱落葡萄球菌蛋白A含量的检测是葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱产品的质量保证和在临床上使用的安全保证。

本发明利用ELISA技术建立了可定量检测微量葡萄球菌蛋白A的试剂盒，该试剂盒适用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱脱落的微量葡萄球菌蛋白A的检测，具有灵敏度高、准确性和稳定性好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，该试剂盒通过使用人工重组的葡萄球菌蛋白A(SPA)作为标准品以及用人IgG作为包被ELISA板的抗体，使试剂盒的原料来源方便，制造成本和推广成本更低。

本发明所述的一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，包括：

包被有人IgG的ELISA板；

葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋白具有如序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，分子量约27kd，纯度95％以上；

生物素标记的抗SPA抗体；

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin/HRP)；

常规的样品稀释液，例如，稀释液的组分为：1×PBS，0.1％BSA，0.05％Tween-20，pH 7.2±0.2；

常规的洗涤液，例如，洗涤液的组分为：1×PBS，0.05％Tween-20；

常规的显色液，例如TMB显色液；

常规的终止液，例如，终止液的组分为：2mol/L H₂SO₄。

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的使用方法。

本发明所述的一种定量检测葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步骤：

1)将葡萄球菌蛋白A标准品及待测样品用样品稀释液稀释至适合浓度，加入包被有人IgG的ELISA板，100μL/孔，37℃60min；所述的葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋白具有如序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，分子量约27kd，纯度95％以上；

2)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的生物素标记抗SPA抗体，100μL/孔，37℃60min；

3)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，100μL/孔，37℃60min；

4)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入显色液，100μL/孔，37℃孵育15-30min；

5)加入终止液终止反应，在酶标仪上测定OD₄₅₀值。

本发明采用类似双抗体夹心的方法建立了一种有效的定量检测微量葡萄球菌蛋白A的ELISA试剂盒，具有以下有益效果：

1、采用人工重组的葡萄球菌蛋白A(SPA)作为标准品，使试剂盒的原料来源方便，制造成本和推广成本更低。

2、采用生物素-亲和素系统，使所述试剂盒的灵敏度达到pg级，可检测微量的葡萄球菌蛋白A。

3、准确性高。检测结果便于由酶标仪来进行定量分析，检测结果误差在5％以内。

4、稳定性好。检测结果的批内CV小于5，批间CV5～10。

本发明所述的葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，可适用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的葡萄球菌蛋白A脱落量的检测，以及其他有关葡萄球菌蛋白A含量的定量检测，具有灵敏度高、准确性和稳定性好等优点。

附图说明

图1是本发明的原理示意图。图中1.酶联反应板  2.包被人IgG  3.SPA4.生物素标记的抗SPA抗体  5.辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。

图2是利用葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒检测葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脱落葡萄球菌蛋白A含量的标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例一：葡萄球菌蛋白A标准品的制备

1、重组葡萄球菌蛋白A基因单体的获取

设计三条单链DNA引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5(见序列表)，交由专业公司合成，通过PCR反应进行拼接获得重组葡萄球菌蛋白A基因单体，在该单体5’端含有BamHI酶切位点，3’端含有HindIII酶切位点，再通过酶切连接将该基因单体连接入载体pQE_TriSystemHisStrep 1中，获得含重组葡萄球菌蛋白A基因单体的重组载体pQE-spa-b。

这里所采用的表达载体是pQE_TriSystemHisStrep1，该载体是德国Qiagen公司的商品化的pQE系列载体的一种，pQE系列载体属于pDS载体家族成员(Bujard，H.，Gentz，R.，Lanzer，M.，Stüber，D.Müller，M.，Ibrahimi，I.

M.T.，and Dobberstein，B.(1987)A T5promotor based transcription-translation system forthe analysis of proteins in vivo and in vitro.Methods Enzymol.155，416-433.)，在载体pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS的基础上构建而成(Stüber，D.，Matile，H.，and Garotta，G.(1990)System for high-level production in Escherichia coli andrapid purification of recombinant proteins：application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis.In：Immunological Methods，Lefkovits，I.and Pernis，B.，eds.，vol.IV，Academic Press，New York，pp.121-152.)，其载体图谱和序列详见http://www1.qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx。

本发明也可采用其他表达载体，只需相应地调整与表达载体相连的酶切位点即可。

2、重组葡萄球菌蛋白A基因的获取及含重组葡萄球菌蛋白A基因的表达载体的构建

设计第一对引物：

CL1：5’-gggCCATGGGTGcggataacaaattcaacaaag-3’

CL2：5’-cccGTCGACttttggtgcttgCgcatc-3’

设计第二对引物：

CL3：5’-cccGTCGACaacaaattcaacaaagaac-3’

CL4：5’-gggCTCGAGttttggtgcttgCgc-3’

用这两对引物分别扩增基因单体，扩增产物CL1-2的5’端和3’端分别具有NcoI和SalI的识别位点，CL3-4的5’端和3’端分别具有SalI和XhoI的识别位点。CL1-2和CL3-4经SalI酶切后进行连接，获得2个基因单体串联而成的重组葡萄球菌蛋白A基因，命名为spa-b2。spa-b2经NcoI和XhoI酶切并与载体pQE_TriSystemHisStrep1连接，获得包含2个基因单体串联而成的重组葡萄球菌蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b2。经SalI和XhoI酶切的CL3-4和经XhoI酶切的载体pQE-spa-b2连接，获得包含3个基因单体串联而成的重组葡萄球菌蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b3。以此类推，可获得含4个基因单体串联而成的重组葡萄球菌蛋白A基因的重组载体pQE-spa-b4。

上述含spa-b4的大肠杆菌表达载体由本发明制备的重组葡萄球菌蛋白A基因(spa-b4)与大肠杆菌表达载体pQE_TriSystemHisStrep1构建而成，命名为pQE-spa-b4。

3、能高效表达重组葡萄球菌蛋白A的大肠杆菌重组株pQE-spa-b4-BL21(DE3)的构建

将重组载体pQE-spa-b4转化大肠杆菌BL21(DE3)，按常规方法筛选具有氨苄青霉素抗性的重组菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)。

4、利用大肠杆菌重组株pQE-spa-b4-BL21(DE3)生产重组葡萄球菌蛋白A

1)将甘油保种的工程菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)按体积比1∶100接入3mL LB培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇12h。

2)上述培养液按1∶100接入100mL LB培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇12h以进一步扩大培养。

3)上述培养液按1∶25接入2L加富培养基(Amp，100μg/mL)，37℃振摇3.5h至OD600＝1.5。

4)加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃继续振摇5h。

5)10000g、10min离心收集细菌沉淀，细菌沉淀可放置于-20℃--80℃冰箱保存备用。

6)将上述细菌沉淀的重新混匀于100mL PBS溶液中，超声破碎细胞(相关参数为：超声时间4s，间隔时间4s，功率200W，总时间100min)。

7)10000g，15min离心，收集上清。

8)在缓慢搅拌的同时将硫酸铵固体粉末缓慢加入上清溶液至饱和度为70％，4℃放置1h，10000g，15min离心收集沉淀并重新溶于PBS溶液。

9)取Ni NTA Agarose(Qiagen公司生产)约7.5mL填装柱子，先后用5～10个柱床体积的双蒸水和PBS冲洗填料并平衡，将蛋白样品流经填料以吸附目标蛋白。

10)先以含20mmol/L咪唑的PBS冲洗填料至OD280不再下降，用含100mmol/L咪唑的PBS洗脱目标蛋白并收集，最后再用含200mmol/L咪唑的PBS洗脱一遍。

11)含100mmol/L咪唑的PBS洗脱液经硫酸铵沉淀后可获得纯度在95％以上的SPA-B4蛋白。

经测序，该基因由732个脱氧核苷酸组成，编码244个氨基酸。该基因序列见序列表SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

5、重组葡萄球菌蛋白A的活性测定

1)分别将本发明的重组葡萄球菌蛋白A(SPA-B4)、本元正阳基因技术有限公司生产的重组葡萄球菌蛋白A(国产SPA)和美国Sigma公司生产的天然葡萄球菌蛋白A(进口SPA)用包被液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH9.6)配成浓度依次为100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.25ng/mL，3.125ng/mL的溶液。

2)各取上述溶液100μL加入96孔板，阴性对照以包被液代替样品，空白对照除底物外，其余反应成分均不加入，每个浓度做2个重复。置于37℃1h。

3)甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液(含0.02％Tween-20的PBS溶液)200μL，振荡3min，甩干，重复洗涤4次，最后一次彻底甩干液体。

4)每孔加入封闭液(含1％BSA和10％蔗糖的PBS溶液)100μL，置于37℃1h。

5)洗涤，步骤同3)。

6)每孔加入人IgG溶液(20μg/mL)100μL，置于37℃1h。

7)洗涤，步骤同3)。

8)每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀释20000倍)100μL，置于37℃1h。

9)洗涤，步骤同3)。

10)每孔加入TMB显色液(武汉博士德公司生产)100μL，置于37℃15min。

11)每孔加入终止液(2mol/LH₂SO₄)100μL，终止反应。

12)于酶标仪中测定A₄₅₀。

检测结果表明，本发明的重组葡萄球菌蛋白A对人IgG具有强吸附能力，其活性高于本元正阳基因技术有限公司生产的重组葡萄球菌蛋白A，略低于美国Sigma公司生产的天然葡萄球菌蛋白A。

实施例二：葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒的制备

本发明所述的一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，其原理见图1，该试剂盒包括：包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋白的制备方法见实施例一；生物素标记的抗SPA抗体；辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；常规的样品稀释液；常规的洗涤液；常规的显色液；和常规的终止液。

1)制备葡萄球菌蛋白A标准品

葡萄球菌蛋白A标准品的分子量约27kd，纯度在95％以上。经试验证明，定量检测葡萄球菌蛋白A时，葡萄球菌蛋白A标准品的浓度在0～1000pg/mL的范围内，OD₄₅₀与相应的浓度成正比关系。所以，进行检测时，用样品稀释液将葡萄球菌蛋白A标准品配成浓度依次为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，使用量为100μL/孔。

2)制备包被有人IgG的ELISA板，其制作过程是：用本发明申请单位制备的葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶吸附填料从人血浆中分离纯化人IgG，纯度在90％以上。

用包被缓冲液(35mmol/LNaHCO₃，15mmmol/LNa₂CO₃，PH 9.6)将人IgG配成浓度为5μg/mL溶液，在ELISA板中每孔加入100μL，4℃放置过夜；取出，置于37℃30min；甩去液体，洗涤液洗涤4次，拍干；加入封闭液(1×PBS，1％BSA)，200μL/孔，37℃2hr；甩去液体，洗涤液洗涤4次；干燥，放于4℃，备用。

3)制备生物素标记的抗SPA抗体，制备方法是：先制备抗SPA抗体，用本发明申请单位研发生产的重组葡萄球菌蛋白A免疫鸡，分离脾细胞并制备杂交瘤细胞，筛选能产生高特异性和强结合力的葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，再通过体外培养筛选出的杂交瘤细胞株，产生并纯化获得高纯度的单克隆抗体，即抗SPA抗体。葡萄球菌蛋白A不能识别来源于鸡的抗体的Fc段。

将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS)。BNHS分子酯健中的-C＝O基团与抗SPA抗体分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而制备生物素标记的抗SPA抗体。

4)制备下述溶液：

样品稀释液：1×PBS，0.1％BSA，0.05％Tween-20，PH 7.2±0.2

洗涤液：1×PBS，0.05％Tween-20

终止液：2mol/L H₂SO₄

5)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和TMB显色液分别购自北京博奥森生物技术有限公司和武汉博士德生物工程有限公司。

葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒由上述试剂组成。

实施例三：利用葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒检测葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脱落葡萄球菌蛋白A的含量

1)将重组葡萄球菌蛋白A与琼脂糖凝胶交联，制成葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱。用一定量的人血浆流经吸附柱，收集从柱子中流出的血浆，沸水煮10min(葡萄球菌蛋白A不会变性)，离心后取上清溶液作为待测样品1。然后，用洗脱液(pH1-3的柠檬酸-氯化钠溶液)洗脱吸附在柱子上的抗体，收集洗脱下来的溶液，同样经煮沸、离心后作为待测样品2。另外，在人血浆中加入已知量的葡萄球菌蛋白A，经同样处理后制成已知葡萄球菌蛋白A浓度的待测样品3(2ng/mL)和待测样品4(10ng/mL)。

2)用样品稀释液将SPA标准品配成浓度依次为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，用样品稀释液将待测样品分别稀释10倍、20倍和100倍。各取上述溶液以100μL/孔的体积加入包被有人IgG的ELISA板，阴性对照以包被液代替样品，空白对照除底物外，其余反应成分均不加入，每个浓度做2个重复。置于37℃1h。

3)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干。

4)用样品稀释液将生物素标记的抗SPA抗体溶解至浓度为1～3μg/mL，100μL/孔，37℃60min。

5)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干。

6)加入稀释好的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，100μL/孔，37℃60min；

7)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干。

8)加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育15-30min；

9)加入终止液中止反应，在酶标仪上测定OD₄₅₀。

通过不同浓度SPA标准品的OD值绘制的标准曲线见图2

。各待测样品不同稀释度的测定值及其平均值见下表。

经计算得出，待测样品3和待测样品4的SPA浓度分别是2.051ng/mL和9.867ng/mL，误差分别为2.55％和1.33％。待测样品1的SPA浓度为4.353ng/mL，待测样品2的SPA浓度为54.910ng/mL，结果与预期相符。

上述实验操作与结果表明，本发明的葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒的灵敏度达到pg级，且准确度高(误差在5％以内)，所需仪器(主要是酶标仪等)简单，易于操作和推广。

实施例四：葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒检测葡萄球菌蛋白A浓度的结果稳定性测定

1)制备低、中、高三个浓度的葡萄球菌蛋白A样品，按照上述方法分别在同一次检测中多次(n＝10)测定其浓度，其测定值及差异系数(批内CV)如下表：

2)制备低、中、高三个浓度的葡萄球菌蛋白A样品，按照上述方法分别在多次(n＝5)检测中测定其浓度，其测定值及差异系数(批间CV)如下表：

上述结果表明，用本发明的葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒检测葡萄球菌蛋白A浓度的结果的批内CV低于5，批间CV在5～10之间，显示出较高的稳定性。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>广州康盛生物科技有限公司

<120>葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒及定量检测方法

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>244

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Gly Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

1               5                   10                  15

Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe

            20                  25                  30

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala

        35                  40                  45

Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys

    50                  55                  60

Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro

65                  70                  75                  80

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp

                85                  90                  95

Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn

            100                 105                 110

Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln

        115                 120                 125

Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln

    130                 135                 140

Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala

145                 150                 155                 160

Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

                165                 170                 175

Leu Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

            180                 185                 190

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

        195                 200                 205

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

    210                 215                 220

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His

225                 230                 235                 240

His His His His

<210>2

<211>732

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgggtgcgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat    60

ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat ggtttcatcc aaagcctgaa agatgaccca    120

agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcgca agcaccaaaa    180

gtcgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct    240

aacttaaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagcc tgaaagatga cccaagccaa    300

agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cgcaagcacc aaaactcgac    360

aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct ttctatgaaa tcttacattt acctaactta    420

aacgaagaac aacgcaatgg tttcatccaa agcctgaaag atgacccaag ccaaagcgct    480

aaccttttag cagaagctaa aaagctaaat gatgcgcaag caccaaaact cgacaacaaa    540

ttcaacaaag aacaacaaaa tgctttctat gaaatcttac atttacctaa cttaaacgaa    600

gaacaacgca atggtttcat ccaaagcctg aaagatgacc caagccaaag cgctaacctt    660

ttagcagaag ctaaaaagct aaatgatgcg caagcaccaa aactcgagca ccaccatcac    720

catcaccatc ac                                                        732

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gcggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct    60

aacttaaacg                                                           70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ctttggcttg ggtcatcttt caggctttgg atgaaaccat tgcgttgttc ttcgtttaag    60

ttaggtaaat                                                           70

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

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Claims (2)

1.一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，其特征在于，包括：

包被有人IgG的ELISA板；

葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，分子量约27kd，纯度95％以上；

生物素标记的抗SPA抗体；

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

常规的样品稀释液；

常规的洗涤液；

常规的显色液；和

常规的终止液。

2.一种定量检测葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步骤：

1)将葡萄球菌蛋白A标准品及待测样品用样品稀释液稀释至适合浓度，加入包被有人IgG的ELISA板，100μL/孔，37℃60min；所述的葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，分子量约27kd，纯度95％以上；

2)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的生物素标记抗SPA抗体，100μL/孔，37℃60min；

3)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，100μL/孔，37℃60min；

4)甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入显色液，100μL/孔，37℃孵育15-30min；

5)加入终止液终止反应，在酶标仪上测定OD₄₅₀值。

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