CN102507958A - 一种IgG含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种IgG含量的检测方法，属于医药分析检测领域。它包括样品处理、样品与SPA产生免疫复合物以及补体结合检测步骤。本发明所述的IgG含量的检测方法检测结果精确，成功弥补了IgG检测领域中不同检测方法误差大的缺点，能精确地检测初乳IgG的含量，对产品的开发和品质有着至关重要的作用，同样此方法可以应用到其他免疫蛋白的检测中，对其他生物制药行业及保健品行业有着重要的推动作用。

Description

一种IgG含量的检测方法

技术领域

本发明涉及医药分析检测领域，特别涉及一种牛初乳中IgG含量的检测方法。

背景技术

牛初乳是母牛产仔后72小时内分泌的乳汁，在以往生产实践中，往往被当成没有作用的东西抛弃，在现今科学研究中证明，初乳中的IgG含量非常的高，可到达59-80mg/ml，有很高的利用价值。

目前国内主要的检测IgG含量的方法有：单项免疫扩散法、HPLC法、电泳法，但是精确度并不高，有着较大的误差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精确度高、操作简单的IgG含量的检测方法。

一种IgG含量的检测方法，它包括如下步骤：

1、将标准IgG溶于缓冲液中配制成多个浓度的标准溶液，并分别检测每个标准溶液中的红细胞基数后制作标准曲线图；

2、将样品IgG与过量浓度的SPA混合反应，制备IgG-SPA复合物；

3、将IgG-SPA复合物与过量猪血清补体反应，产生的补体结合物与红细胞发生溶血反应，计算红细胞基数，与标准曲线对照即得样品IgG含量。

其中，优选地，所述步骤1中标准曲线图的制作方法如下：首先制备IgG标准溶液：在缓冲液中溶解IgG标准物质分别配制成为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液，然后通过IgG-SPA结合反应及补体结合反应得到红细胞数量，从而制备标准曲线图。

其中，优选地，步骤2中制备IgG-SPA复合物的方法为：首先采用缓冲液配制与步骤1中标准溶液对应浓度的样品溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul样品备用；然后采用缓冲液配制5倍以上IgG样品溶液浓度的SPA溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul SPA备用；将备用的IgG与备用的SPA溶液进行对应混合，反应生成IgG-SPA复合物。

其中，优选地，步骤3中将IgG-SPA复合物与过量猪血清补体反应，产生的补体结合物与红细胞发生溶血反应的步骤为：首先采用缓冲液配制5倍以上IgG样品溶液浓度的血清补体溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul血清补体溶液备用；然后将步骤2中的IgG-SPA复合物与备用的血清补体溶液反应生成补体结合物；再精确吸取20-200ul补体结合物与标准红细胞发生溶血反应。

其中，优选地，所述的缓冲液为PH6.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer，PB)。

有益效果：本发明通过IgG分子的Fc段与SPA(Staphylococcal protein A)葡萄球菌A蛋白发生结合，产生的复合物可与标准猪血清中的补体发生补体结合反应，使特定浓度的红细胞标准液发生溶血反应，通过红细胞计数对比来检测IgG含量，该检测方法检测结果精确，成功弥补了IgG检测领域中不同检测方法误差大的缺点，能精确的检测初乳IgG的含量，对产品的开发和品质有着至关重要的作用，同样此方法可以应用到其他免疫蛋白的检测中，对其他生物制药行业及保健品行业有着重要的推动作用。

附图说明

图1为实施例1的标准曲线图，其以标准液浓度C(mg/ml)为横坐标，以红细胞基数N(个)为纵坐标，

其中，A点为实施例1中红细胞基数与对应浓度的坐标点；

图2为实施例2的标准曲线图，其以标准液浓度C(mg/ml)为横坐标，以红细胞基数N(个)为纵坐标，

其中，B点为实施例2中红细胞基数与对应浓度的坐标点；

图3为实施例3的标准曲线图，其以标准液浓度C(mg/ml)为横坐标，以红细胞基数N(个)为纵坐标，

其中，C点为实施例3中红细胞基数与对应浓度的坐标点。

具体实施方式

下述实施例中缓冲液的配制方法：0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.2mol/L磷酸二氢钠，按照7∶1的体积比混合成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，PH值调至6.0。

标准IgG采用Sigma公司提供的纯度≥95％的IgG标准品。

IgG标准溶液采用标准IgG与磷酸盐缓冲液按照浓度1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml分别配置。

实施例1

一种IgG含量的检测方法，其包括如下步骤：

标准曲线的制定：将标准IgG溶于缓冲液中配制IgG标准溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，采用IgG-SPA补体结合法测定，红细胞基数分别为177、403、742、1632、2980。最低检出含量为0.005mg。

将样品IgG用缓冲液精确配制成1mg/ml的IgG样品溶液，精确吸取100ul置于样品管中，放入超声波清洗器中混合15min。配制5倍IgG样品溶液浓度的SPA溶液，在样品管中与IgG样品溶液充分混合，进行IgG-SPA复合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合10min生成IgG-SPA复合溶液。同时配制5倍IgG样品溶液浓度的猪血清补体液，与上述IgG-SPA复合溶液混合，进行补体结合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合8min，精确吸取100ul补体结合反应后溶液与标准红细胞检测液发生溶血反应，并进行红细胞基数为611，对照图1中的标准曲线图，基数611对应的标准品浓度为0.3mg/ml，即1mg/ml的IgG样品溶液与0.3mg/ml的IgG标准溶液中IgG含量相同，即0.3mg/ml*0.95＝0.285mg/lm，0.285/1*100％＝28.50％，即待测样品液中IgG含量为28.5％。

实施例2

一种IgG含量的检测方法，其包括如下步骤：

标准曲线的制定：将标准IgG溶于缓冲液中配制IgG标准溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，采用IgG-SPA补体结合法测定，红细胞基数分别为204、398、750、1666、3202。最低检出含量为0.008mg。

将样品IgG用缓冲液精确配制成0.5mg/ml的IgG样品溶液，精确吸取200ul置于样品管中，放入超声波清洗器中混合5min。配制7倍IgG样品溶液浓度的SPA溶液，在样品管中与IgG样品溶液充分混合，进行IgG-SPA复合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合20min生成IgG-SPA复合溶液。同时配制7倍IgG样品溶液浓度的猪血清补体液，与上述IgG-SPA复合溶液混合，进行补体结合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合10min，精确吸取100ul补体结合反应后溶液与标准红细胞检测液发生溶血反应，并对红细胞基数为1140，对照图2中的标准曲线图，基数1140对应的标准品浓度为0.152mg/ml，即0.5mg/ml的IgG样品溶液与0.152mg/ml的IgG标准溶液中IgG含量相同，即0.152mg/ml*0.95＝0.1444mg/lm，0.1444/0.5*100％＝28.88％，即待测样品液中IgG含量为28.88％。

实施例3

一种IgG含量的检测方法，其包括如下步骤：

标准曲线的制定：将标准IgG溶于缓冲液中配制IgG标准溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，采用IgG-SPA补体结合法测定，红细胞基数分别为Ig1、377、756、1647、3120。最低检出含量为0.007mg。

将样品IgG用缓冲液精确配制成0.25mg/ml的IgG样品溶液，精确吸取20ul置于样品管中，放入超声波清洗器中混合10min。配制10倍IgG样品溶液浓度的SPA溶液，在样品管中与IgG样品溶液充分混合，进行IgG-SPA复合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合5min生成IgG-SPA复合溶液。同时配制10倍IgG样品溶液浓度的猪血清补体液，与上述IgG-SPA复合溶液混合，进行补体结合反应，为了加快反应，可以放入超声波清洗器中混合2min，精确吸取20ul补体结合反应后溶液与标准红细胞检测液发生溶血反应，并对红细胞基数为1855，对照图3中的标准曲线图，基数1855对应的标准品浓度为0.076mg/ml，即0.25mg/ml的IgG样品溶液与0.076mg/ml的IgG标准溶液中IgG含量相同，即0.076mg/ml*0.95＝0.0722mg/lm，0.0722/0.25*100％＝28.88％，即待测样品液中IgG含量为28.88％。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.一种IgG含量的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将标准IgG溶于缓冲液中配制成多个浓度的标准溶液，并分别检测每个标准溶液中的红细胞基数后制作标准曲线图；

(2)将样品IgG与过量浓度的SPA混合反应，制备IgG-SPA复合物；

(3)将IgG-SPA复合物与过量猪血清补体反应，产生的补体结合物与红细胞发生溶血反应，计算红细胞基数，与标准曲线对照即得样品IgG含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中标准曲线图的制作方法如下：首先制备IgG标准溶液：在缓冲液中溶解IgG标准物质分别配制成为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液，然后通过IgG-SPA结合反应及补体结合反应得到红细胞数量，从而制备标准曲线图。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中制备IgG-SPA复合物的方法为：首先采用缓冲液配制与步骤(1)中标准溶液对应浓度的样品溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul样品备用；然后采用缓冲液配制5倍以上IgG样品溶液浓度的SPA溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul SPA备用；将备用的IgG与备用的SPA溶液进行对应混合，反应生成IgG-SPA复合物。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中将IgG-SPA复合物与过量猪血清补体反应，产生的补体结合物与红细胞发生溶血反应的步骤为：首先采用缓冲液配制5倍以上IgG样品溶液浓度的血清补体溶液，放入超声波清洗机中超声2-20min，精确吸取20-200ul血清补体溶液备用；然后将步骤(2)中的IgG-SPA复合物与备用的血清补体溶液反应生成补体结合物；再精确吸取20-200ul补体结合物与标准红细胞发生溶血反应。

5.根据权利要求1至4任一项所述的检测方法，其特征在于：所述的缓冲液为PH＝6.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。

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