CN101793865A - 一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法，属于检测技术领域。本发明是用高压毛细管电泳分析仪检测人血清白蛋白的含量，包括(a)配制标准溶液，制订标准曲线；(b)检测待测人乳；(c)样品定量读数、计算结果等步骤。本发明是样品在高压毛细管电泳分析仪上跑电泳，从而高压毛细管电泳分析仪的色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出人乳中人血清白蛋白的含量，为人乳成分分析提供技术支持。本发明所使用的样品缓冲液其刺激性气味小、毒性低，且检测结果更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测人血清白蛋白含量的方法，特别是一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人血浆中含量最高的蛋白质，它是一个由585个氨基酸组成的单肽链分子，分子量67kDa。整个人血清白蛋白分子富含半胱氨酸(6％)，除了一个半胱氨酸以外，其他的半胱氨酸形成17个二硫键，是构建人血清白蛋白分子二维、三维结构的重要力量。人血清白蛋白有维持血液渗透压、运输和解毒、抗休克作用，能促进肝细胞的修复和再生，对防止和减轻脑组织的水肿亦有显著的疗效。
目前，国内外检测人血清白蛋白主要方法为ELISA法、SDS电泳法。这些方法均有操作复杂、时间较长、准确度低等缺点。鉴于以上方法的缺点，本发明提供了一种利用毛细管电泳技术快速检测人血清白蛋白含量的方法。高压毛细管电泳分析仪是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离设备。它能快速精确检测出人乳中的微量蛋白。该方法操作简便、准确，检测到出结果时间仅为1h左右。
目前，毛细管电泳技术逐渐应用到蛋白检测领域中，但毛细管电泳技术尚未开发检测人乳中人血清白蛋白含量的方法。本发明成功弥补了乳品领域中的缺点，能准确测定人血清白蛋白的含量，且检出率高，从而有利于人乳的分析检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法，该方法所使用的样品缓冲液其刺激性气味小、毒性低，且该方法检出率高、检测结果更加准确。
本发明提供了一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法，该检测方法采用高压毛细管电泳分析仪进行检测，包括如下步骤：
(a)配制不同浓度的人血清白蛋白标准溶液，根据标准溶液，制定人血清白蛋白浓度与高压毛细管电泳分析仪输出的人血清白蛋白的峰面积之间对应关系的标准曲线；
(b)在高压毛细管电泳分析仪中以与标准溶液相同的高压毛细管电泳分析仪的检测参数检测待测人乳；
(c)利用得到的标准曲线和待测人乳的检测结果，确定待测人乳中人血清白蛋白的含量。
在本发明的再一种具体实施方式中，标准溶液的浓度在8mg/ml至0.01mg/ml之间。
在本发明的另一种具体实施方式中，标准溶液的浓度在4mg/ml至0.125mg/ml之间。
在本发明的还一种具体实施方式中，标准溶液的浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml和0.125mg/ml。
上述检测方法的步骤(a)中制定标准曲线时，标准溶液的检测条件为：精确提取标准溶液加入样品管中，超声波清洗1至10min后用高压毛细管电泳分析仪进行测定。
上述检测方法的步骤(b)中待测人乳的检测条件为：装入1.5ml至2ml的离心管中，在2000至5000r/min的离心条件下离心8至12min，离心温度在5至20℃之间，得到检测样品，在检测样品中按1∶1至1∶10的体积比加入样品缓冲液，摇匀之后精确提取10至100μl加入样品管中，超声波清洗1至10min后用高压毛细管电泳分析仪进行测定。
上述样品缓冲液能够使蛋白质分散，它是在1体积份的140至160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加入浓度为40至60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、6至8mol/L的尿素、2至4mg/ml的二硫基苏糖醇、0.02％至0.1％(即2至10mg/ml)的甲基羟乙基纤维素，加入的所述乙二胺四乙酸二钠、尿素、二硫基苏糖醇、甲基羟乙基纤维素的体积份相同，均为1至10体积份，pH值为8.5±0.3。
上述高压毛细管电泳分析仪的检测参数为：检测温度在20至40℃之间，毛细管柱直径在20至75μm之间、长度在200至600mm之间，紫外光检测器或DAD检测器的进样压力在0.1至1psi之间，进样时间在1s至15s之间，分离温度在20至40℃之间，工作电压在10至30kV之间。
上述毛细管柱是涂层或未涂层的。
上述高压毛细管电泳分析仪中电泳缓冲液的pH值在2.0至3.0之间，主要成分为柠檬酸。
上述检测结果的处理方法如下：检测结果为样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。
人乳中人血清白蛋白的含量在300mg/L至400mg/L之间。高压毛细管电泳分析仪检测的最低浓度能达到10-5至10-8mol/L，所以高压毛细管电泳分析仪能检测出其含量。使用高压毛细管电泳分析仪检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括样品性质的了解、分离模式、建立缓冲体系、优化缓冲体系和换分离模式等步骤，此方法能用于分析检测领域中。
本发明的检测方法线性回归方程相关系数＞0.98，其线性范围在0.01mg/ml～4mg/ml，最低检出限为0.1ng，最低检出浓度为0.01mg/ml。精确度达90％以上，柱子回收率达到90％以上，样品回收率达70％以上。已公开的发明中，有的样品缓冲液里使用β-巯基乙醇，本发明的检测方法中所使用的样品缓冲液，用二硫基苏糖醇替代了β-巯基乙醇。与β-巯基乙醇相比，本发明使用的二硫基苏糖醇低毒、检出率高，能把人乳中的人血清白蛋白充分变性分散于缓冲体系中。国内许多研究证明，β-巯基乙醇其毒性为：LD50(大鼠)300mg/kg，LD50(小鼠)345mg/kg；而二硫基苏糖醇毒性为：LD50(大鼠)35mg/kg，LD50(小鼠)50mg/kg。后者较前者低7倍左右。两种物质的检出率差距为10％，因此本发明的检测方法更加准确。
具体实施方式
以下所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明的检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.125mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗3min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为1126587、575380、281421、136854、31120，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9998，最低检出限为0.1ng，最低检出含量为0.01mg/ml，标准样品回收率达90％。
(b)检测待测人乳：
把奶样品加入1.5ml的离心管中，在3000r/min离心条件下离心8min，离心温度为18℃，然后准确提取100μl置于2ml离心管中(或其他容器)，提取100μl样品缓冲液加入2ml离心管中稀释2倍，使用漩涡混合器混匀。精确提取40μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份140mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入1体积份40mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、1体积份6mol/L的尿素、1体积份3mg/ml的二硫基苏糖醇、1体积份0.05％的甲基羟乙基纤维素，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.5。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在25℃，使用直径为50μm、长度为200mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0.8psi，时间为5s，分离温度为20℃，工作电压为15kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为3.0。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为50656，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.18mg/ml，再乘稀释倍数2，即得实际浓度为0.36mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.36g/L。
实施例2：
本发明的检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.0125mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗1min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为1036841、561235、263254、123254、3119，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9976，最低检出限为0.002μg，最低检出含量为0.02mg/ml，标准样品回收率达91％。
(b)检测待测人乳：
把人乳样品加入1.5ml的离心管中，在3000r/min离心条件下离心10min，离心温度为5℃，然后准确提取100μl置于2ml离心管(或其他容器)，提取200μl样品缓冲液加入2ml离心管，稀释3倍，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机4min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份150mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入2体积份50mmol/L的乙二胺四乙酸、2体积份7mol/L的尿素、2体积份2mg/ml的二硫基苏糖醇、2体积份0.08％的甲基羟乙基纤维素，使用0.1M氢氧化钠调至pH值为8.5。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在35℃，使用直径为75μm、长度为400mm的未涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0.6psi，时间为8s，分离温度为30℃，工作电压为25kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为2.5。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为32459，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.1233mg/ml，再乘稀释倍数3，即得实际浓度为0.3699mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.3699g/L。
实施例3：
本发明的检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为8mg/ml、4mg/ml、1mg/ml、0.25mg/ml、0.01mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗10min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为2365154、1126587、281421、62356、3012，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9987，最低检出限为0.2ng，最低检出含量为0.01mg/ml，标准样品回收率达91％。
(b)检测待测人乳：
把奶样品加入1.8ml的离心管中，在2000r/min离心条件下离心12min，离心温度为20℃，然后准确提取10μl置于1.8ml离心管中(或其他容器)，提取100μl样品缓冲液加入1.8ml离心管中稀释11倍，使用漩涡混合器混匀。精确提取10μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份160mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入10体积份60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、10体积份8mol/L的尿素、10体积份2mg/ml的二硫基苏糖醇、10体积份0.02％的甲基羟乙基纤维素，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.2。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在20℃，使用直径为20μm、长度为500mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为1psi，时间为1s，分离温度为35℃，工作电压为10kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为2.0。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为9005，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.032mg/ml，再乘稀释倍数11，即得实际浓度为0.352mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.352g/L。
实施例4：
本发明的检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.0125mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗5min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为1326587、595380、301421、126854、2521，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9982，最低检出限为0.2ng，最低检出含量为0.01mg/ml，标准样品回收率达91％。
(b)检测待测人乳：
把奶样品加入2ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min，离心温度为15℃，然后准确提取200μl置于2ml离心管中(或其他容器)，提取200μl样品缓冲液加入2ml离心管中稀释2倍，使用漩涡混合器混匀。精确提取100μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机10min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份150mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入1体积份60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、1体积份7mol/L的尿素、1体积份4mg/ml的二硫基苏糖醇、1体积份0.1％的甲基羟乙基纤维素，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.8。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在40℃，使用直径为75μm、长度为600mm的未涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0.1psi，时间为15s，分离温度为40℃，工作电压为30kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为3.0。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为57269，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.19mg/ml，再乘稀释倍数2，即得实际浓度为0.38mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.38g/L。
实施例5：
检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.0125mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗5min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为1241541、536741、243852、135421、2569，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9939，最低检出限为0.2ng，最低检出含量为0.02mg/ml，标准样品回收率达90％。
(b)检测待测人乳：
使用与实施例4相同的待测人乳。把奶样品加入2ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min，离心温度为15℃，然后准确提取200μl置于2ml离心管中(或其他容器)，提取200μl样品缓冲液加入2ml离心管中稀释2倍，使用漩涡混合器混匀。精确提取100μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机10min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份150mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入1体积份60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、1体积份7mol/L的尿素、1体积份4mg/ml的二硫基苏糖醇、1体积份0.1％的甲基羟乙基纤维素，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.8。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在40℃，使用直径为75μm、长度为600mm的未涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0.1psi，时间为15s，分离温度为40℃，工作电压为30kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为5.0。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为48227，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.16mg/ml，再乘稀释倍数2，即得实际浓度为0.32mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.32g/L。
同样的待测人乳样品，本发明所使用的检测方法，在实施例4中能检测出0.38mg/ml，而按已公开的专利方法电泳缓冲液pH大于3.0时，例如本实施例将pH值设定为5.0，则只能检测出0.32mg/ml，检出率降低15.79％，因此本发明更加准确。
实施例6：
检测人乳中人血清白蛋白含量的方法包括如下步骤：
(a)配制标准溶液，制订标准曲线：
将人乳血清白蛋白标准品溶于样品缓冲液，配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.0125mg/ml的标准溶液。精确提取40μl标准溶液加入样品管中，超声波清洗5min后使用高压毛细管电泳分析仪分析。积分后的峰面积分别为1124573、501235、248672、123241、2391，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9974，最低检出限为0.2ng，最低检出含量为0.02mg/ml，标准样品回收率达90％。
(b)检测待测人乳：
使用与实施例4相同的待测人乳。把奶样品加入2ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min，离心温度为15℃，然后准确提取200μl置于2ml离心管中(或其他容器)，提取200μl样品缓冲液加入2ml离心管中稀释2倍，使用漩涡混合器混匀。精确提取100μl上述处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机10min，之后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
上述步骤(a)和(b)中，处理样品缓冲液配置方法：在1体积份150mmol/L的三甲基氨基甲烷缓冲液中加入1体积份60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、1体积份7mol/L的尿素、1体积份5ul/ml的β-巯基乙醇、1体积份0.1％的甲基羟乙基纤维素，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.8。
上述步骤(a)和(b)中，高压毛细管电泳分析仪的电泳温度控制在40℃，使用直径为75μm、长度为600mm的未涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0.1psi，时间为15s，分离温度为40℃，工作电压为30kV。
上述步骤(a)和(b)中，电泳缓冲液的配置方法：柠檬酸缓冲液，pH值为3.0。
(c)样品定量读数：
根据样品分离的图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件，积分人乳血清白蛋白的峰面积为26110，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.105mg/ml，再乘稀释倍数2，即得实际浓度为0.21mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳血清白蛋白浓度为0.21g/L。
同样的待测人乳样品，本发明所使用的检测方法，在实施例4中能检测出0.38mg/ml，而按已公开的专利方法使用含有β-巯基乙醇的样品缓冲液，只能检测出0.21mg/ml，检出率降低44.74％，因此本发明的检测结果更加准确。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测人乳中人血清白蛋白含量的方法，其特征在于：该检测方法采用高压毛细管电泳分析仪进行检测，且所述的方法包括如下步骤：
(a)配制不同浓度的人血清白蛋白标准溶液，根据所述的标准溶液，制定人血清白蛋白浓度与所述高压毛细管电泳分析仪输出的人血清白蛋白的峰面积之间对应关系的标准曲线；
(b)在所述高压毛细管电泳分析仪中以与所述标准溶液相同的所述高压毛细管电泳分析仪的检测参数检测待测人乳；
(c)利用得到的所述标准曲线和所述待测人乳的检测结果，确定所述待测人乳中人血清白蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标准溶液的浓度在8mg/ml至0.01mg/ml之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述标准溶液的浓度在4mg/ml至0.125mg/ml之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述标准溶液的浓度分别为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml和0.125mg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)中制定所述标准曲线时，所述标准溶液的检测条件为：精确提取所述标准溶液加入样品管中，超声波清洗1至10min后用所述高压毛细管电泳分析仪进行测定。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)中所述待测人乳的检测条件为：装入1.5ml至2ml的离心管中，在2000至5000r/min的离心条件下离心8至12min，离心温度在5至20℃之间，得到检测样品，在所述检测样品中按1∶1至1∶10的体积比加入样品缓冲液，摇匀之后精确提取10至100μl加入样品管中，超声波清洗1至10min后用所述高压毛细管电泳分析仪进行测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述样品缓冲液能够使蛋白质分散，它是在1体积份的140至160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加入浓度为40至60mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、6至8mol/L的尿素、2至4mg/ml的二硫基苏糖醇、0.02％至0.1％的甲基羟乙基纤维素，加入的所述乙二胺四乙酸二钠、尿素、二硫基苏糖醇、甲基羟乙基纤维素的体积份相同，均为1至10体积份，pH值为8.5±0.3。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压毛细管电泳分析仪的所述检测参数为：检测温度在20至40℃之间，毛细管柱直径在20至75μm之间、长度在200至600mm之间，紫外光检测器或DAD检测器的进样压力在0.1至1psi之间，进样时间在1s至15s之间，分离温度在20至40℃之间，工作电压在10至30kV之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述毛细管柱是涂层或未涂层的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压毛细管电泳分析仪中电泳缓冲液的pH值在2.0至3.0之间，主要成分为柠檬酸。
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