CN101281203A

CN101281203A - 一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法

Info

Publication number: CN101281203A
Application number: CNA2008100889848A
Authority: CN
Inventors: 孙国庆; 康小红; 胡新宇; 刘卫星
Original assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2008-10-08

Abstract

本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测a－乳白蛋白含量的检测方法。属于分析技术领域。本发明毛细管电泳仪检测a－乳白蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数等步骤。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出a－乳白蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。

Description

一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种分析检测乳中蛋白的方法，特别是一种检测牛乳中a-乳白蛋白含量的方法。属于分析技术领域。

背景技术

目前，国内没有α-乳白蛋白含量的检测方法的国家标准和行业标准。国内相关标准有GB/T 5413.2-1997婴幼儿配方食品和乳粉-乳清蛋白的测定。国外，相关国标有DIN-10466-2001牛奶和牛奶制品的全部蛋白中乳清蛋白含量的测定、DIN-10470-1999牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定、DIN-10472-1996牛奶和乳制品总蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量测定.电泳法。常用α-乳白蛋白的检测方法是液相色谱法。该方法试验步骤较繁杂，检测到出结果时间需3-4h。毛细管电泳仪是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离技术，它能快速精确检测出牛奶中的掺假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加剂和其他小分子的含量。该方法操作简便、准确，检测到出结果时间仅为1h左右。

目前，毛细管电泳仪的应用前景非常广泛。许多国际官方权威机构，如FDA、U.S.P、CBER、CDER等均已认可毛细管电泳方法。权威机构European Pharmacopoeia中认可勒沃卡-贝斯庭盐酸盐中杂质的CE测定；欧洲药典中还认可促红细胞生成素(EPO)的CE测定等。它已成为化学、农业、医学、生物工程、药学等众多领域的一个常规科研工具。

发明内容

本发明的目的是得到一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法。

本发明的一种检测a-乳白蛋白含量的检测方法，其中，包括如下步骤：1)将a-乳白蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量a-乳白蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到a-乳白蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中a-乳白蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。

上述步骤1)中标准曲线的制定的方法如下：配制a-乳白蛋白标准溶液，在样品缓冲液中溶解a-乳白蛋白标准物质配制成分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到a-乳白蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算：按峰面积计算出平均校正因子。

上述的标准溶液或待检测样品的处理方法为：把标准溶液或待检测样品装入离心管中，在2000-5000r/min离心条件下离心5-15min，将样品与缓冲液按照1∶4-10的比例加入冻存管，并摇匀，精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1～10min，使用毛细管电泳仪测定。上述的样品缓冲液为：能够使蛋白质分散的缓冲液，优选如下缓冲液：

160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.4％。使用0.1M氢氧化钠调至pH值为8.5。

上述的摇匀步骤采用漩涡混合器。

上述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下：毛细管电泳检测检测的温度控制在20～40℃之间，毛细管柱直径25～75μm、长度20～600mm，DAD(或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0～1psi，进样时间为1s～20s，分离温度为20～40℃，工作电压为15～30kV。

上述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。

上述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳缓冲液为pH3.0～8.0，主要成分为无机盐缓冲液，优选：磷酸盐、硼酸或柠檬酸。

上述的检测结果的处理方法如下：检测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。

常乳里α-乳白蛋白含量0.8g～2g/L，质量百分比约0.2％。毛细管电泳仪检测限制浓度10^-5～10^-8mol/L。所以毛细管电泳仪能检测出其含量。使用毛细管电泳仪开发检测a-乳白蛋白含量的方法包括：样品性质的了解、分离模式、建立缓冲体系、优化缓冲体系和换分离模式等步骤。

本发明使用毛细管电泳仪能准确测定a-乳白蛋白的含量，从而应用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。

本发明在在传统的电泳和色谱的原理的基础上，使用高压毛细管电泳仪检测a-乳白蛋白的含量，达到准确检测出乳制品中a-乳白蛋白的含量。通过试验，最终确定检测方法的最佳参数条件。具体如下：

检测a-乳白蛋白含量的检测方法，包括：样品前处理、上样检测，还包括校准读数等步骤。毛细管电泳检测检测的温度控制在30～40℃之间，毛细管柱直径50～75μm、长度50～600mm的石英毛细管柱，DAD(或紫外光)检测器，压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s～10s，分离温度为30～40℃，工作电压为25kV。

检测步骤为：

把原料奶样品装入15ml的离心管中，在3000r/min离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰高(或峰面积)，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。

有益效果

目前，国内毛细管电泳仪检测技术逐渐应用到乳品领域里，如产品开发和控制质量问题等领域中。但毛细管电泳技术尚未开发检测a-乳白蛋白的方法。本发明成功弥补了乳品领域中的缺点，能准确测定a-乳白蛋白的含量，从而有利于产品开发和质量控制当中。

本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出a-乳白蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。

本发明方法现行回归方程相关系数＞0.99，其线性范围在0.01mg/ml～2mg/ml，最低检出线为0.04ng，最低检出浓度为0.001mg/ml。精确度达90％以上，柱子回收率达到90％以上，样品回收率达70％以上。能有效检测出奶样中的a-乳白蛋白的含量。

具体实施方式

实施例1一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法

毛细管电泳温度控制在30℃，使用直径为50μm、长度为600mm的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，工作电压为25kV。

校准曲线的制定：利用a-乳白蛋白标准品配制浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的封面积分别为282154、140793、66924、16810、3520，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9993，最低检出线为0.08ug，最低检出含量为0.02mg/ml，标准样品回收率达94％。

处理样品缓冲液配置方法：160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.5％，pH值为8.5。

电泳缓冲液的配置方法：0.32mol/L柠檬酸，20m mol/L柠檬酸三钠，7mol/L尿素，羟丙基甲基纤维素0.5％。

检测步骤为：把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容器)。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分a-乳白蛋白的峰面积为24186，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.17mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为0.85mg/ml，所以该奶样含有的a-乳白蛋白浓度为0.85g/L。

实施例2一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法

毛细管电泳温度控制在40℃，使用直径为75μm、长度为50mm的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为25kV。

校准曲线的制定：利用a-乳白蛋白标准品配制浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的封面积分别为292457、151022、71042、18245、3700，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9982，最低检出线为0.09ug，最低检出含量为0.025mg/ml，标准样品回收率达93％。

处理样品缓冲液配置方法：160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.4％。使用0.1M氢氧化钠调至pH值为8.5。

电泳缓冲液的配置方法：0.32mol/L柠檬酸，20mmol/L柠檬酸三钠，6mol/L尿素，羟丙基甲基纤维素0.4％。

检测步骤为：把奶样品加入15ml的离心管中，在2000r/min离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容器)。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分a-乳白蛋白的峰面积为29865，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.21mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为1.05mg/ml，所以该奶样含有的a-乳白蛋白浓度为1.05g/L。

Claims

1.一种检测a-乳白蛋白含量的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将a-乳白蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量a-乳白蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到a-乳白蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中a-乳白蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中标准曲线的制定的方法如下：配制a-乳白蛋白标准溶液，在样品缓冲液中溶解a-乳白蛋白标准物质配制成分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到a-乳白蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算：按峰面积计算出平均校正因子。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的标准溶液或待检测样品的处理方法为：把标准溶液或待检测样品装入离心管中，在2000-5000r/min离心条件下离心5-15min，将样品与缓冲液按照1∶4-10的比例加入冻存管，并摇匀，精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1～10min，使用毛细管电泳仪测定。

4.如权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于：所述的样品缓冲液为：能够使蛋白质分散的缓冲液，优选如下缓冲液：160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.4％，使用0.1M氢氧化钠调至pH值为8.5。

5.如权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于：所述的摇匀步骤采用漩涡混合器。

6.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下：毛细管电泳检测检测的温度控制在20～40℃之间，毛细管柱直径25～75μm、长度20～600mm，DAD(或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0～1psi，进样时间为1s～20s，分离温度为20～40℃，工作电压为15～30kV。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。

8.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳缓冲液为pH3.0～8.0，主要成分为无机盐缓冲液，优选：磷酸盐、硼酸或柠檬酸。

9.根据权利要求2中所述的检测方法，其特征在于：所述的检测结果的处理方法如下：检测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。