CN101290322A - 一种牛乳中乳铁蛋白含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测乳铁蛋白含量的检测方法。属于检测技术领域。本发明毛细管电泳仪检测乳铁蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数，编辑报告等步骤。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出乳铁蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。

Description

一种牛乳中乳铁蛋白含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种分析检测乳中蛋白的方法，特别是一种检测牛乳中乳铁蛋白含量的方法。属于检测技术领域。

背景技术

乳铁蛋白是一种分子量为70～80kD的糖蛋白，广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。牛乳中乳铁蛋白的含量为0.7g/L。乳铁蛋白是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。

目前，国内尚未有乳铁蛋白含量检测方法的国家标准和行业标准。国内相关标准有GB/T 5413.1、2-1997婴幼儿配方食品和乳粉-乳清蛋白的测定。国外，相关国标有DIN-10466-2001牛奶和牛奶制品的全部蛋白中乳清蛋白含量的测定、DIN-10470-1999牛奶和牛奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定、DIN-10472-1996牛奶和乳制品总蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量测定.电泳法。国内科研院所常用乳铁蛋白的检测方法是分光光度计法、酶联免疫法和高效液相色谱法。免疫酶联吸附法灵敏度高，最小检测限低，适合于乳铁蛋白分离纯化的全程分析；高效液相色谱法快速准确，操作简便，可实现乳铁蛋白初步分离时的同步分析；分光光度法快速简便，准确性稍差，适合于纯化后具有较高浓度的乳铁蛋白的在线分析。鉴于三种方法的优缺点，本专利发明了将使用毛细管电泳仪快速检测乳铁蛋白含量的方法。毛细管电泳仪是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离技术。它能快速精确检测出牛奶中的掺假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加剂和其他小分子的含量。该方法操作简便、准确，检测到出结果时间仅为1h左右。

目前，毛细管电泳仪的应用前景非常广泛。许多国际官方权威机构，如FDA、U.S.P、CBER、CDER等均已认可毛细管电泳方法。权威机构欧洲药典中认可勒沃卡-贝斯庭盐酸盐中杂质的CE测定；欧洲药典中还认可促红细胞生成素(EPO)的毛细管电泳仪测定等。毛细管电泳仪已成为化学、农业、医学、生物工程、药学等众多领域的一个常规科研工具。

目前，国内毛细管电泳仪检测技术逐渐应用到乳品领域里，如产品开发和控制质量问题等领域中。但毛细管电泳技术尚未开发检测乳铁蛋白的方法。本发明成功弥补了乳品领域中的缺点，能准确测定乳铁蛋白的含量，从而有利于产品开发和质量控制当中。

发明内容

本发明的目的：一种牛乳中乳铁蛋白含量的检测方法。

本发明的一种检测乳铁蛋白含量的检测方法，其中，包括如下步骤：1)将乳铁蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量乳铁蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到乳铁蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中乳铁蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。

上述步骤1)中标准曲线的制定的方法优选如下：配制乳铁蛋白标准溶液，在样品缓冲液中溶解乳铁蛋白标准物质配制成分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到乳铁蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算：按峰面积计算出平均校正因子。

上述的标准溶液或待检测样品的处理方法为：把标准溶液或待检测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心5-15min，将样品与缓冲液按照1∶4-20的比例加入冻存管(或其他容器)，并摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1～10min，使用毛细管电泳仪测定。

上述的样品缓冲液为：能够使蛋白质分散的缓冲液，优选如下缓冲液：

160m mol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.05％，pH值为8.5

上述的摇匀步骤采用漩涡混合器。

上述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下：毛细管电泳检测检测的温度控制在15～40℃之间，毛细管柱直径25～75μm、长度20～600mm，DAD(或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0～1psi，进样时间为1s～20s，分离温度为15～40℃，工作电压为10～30kV。

上述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。

上述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳缓冲液为pH2.0～9.0，主要成分为无机盐缓冲液，优选：磷酸盐、硼酸或柠檬酸。

上述的检测结果的处理方法如下：检测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。

常乳里乳铁蛋白的含量20mg～350mg/L，其分子量为12000。毛细管电泳仪检测最低浓度能达到10^-5～10^-8mol/L。所以毛细管电泳仪能检测出其含量。使用毛细管电泳仪开发检测乳铁蛋白含量的方法包括样品性质的了解、分离模式、建立缓冲体系、优化缓冲体系和换分离模式等步骤。开发出的方法能应用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。

本发明主要使用毛细管电泳仪能准确测定乳铁蛋白的含量，从而应用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。

本发明在在传统的电泳和色谱的原理的基础上，使用高压毛细管电泳仪检测乳铁蛋白的含量，达到准确检测出乳制品中乳铁蛋白的含量。通过试验，最终确定检测方法的最佳参数条件。具体如下：

检测乳铁蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数等步骤。毛细管电泳检测检测的温度控制在15～40℃之间，毛细管柱直径50～75μm、长度20～600mm的石英毛细管柱，DAD(或紫外光)检测器，压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s～20s，分离温度为20～40℃，工作电压为15-25kV。

校准曲线的制定：配制乳铁蛋白标准溶液浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.051mg/ml。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，按峰高计算出平均校正因子。

检测步骤为：

把原料奶样品装入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰高(或峰面积)，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。

有益效果

本发明方法现行回归方程相关系数＞0.98，其线性范围在0.01mg/ml～2mg/ml，最低检出线为0.15ng，最低检出浓度为0.005mg/ml。精确度达90％以上，柱子回收率达到90％以上，样品回收率达70％以上。能有效检测出样品中的乳铁蛋白的含量。

具体实施方式

实施例1一种牛乳中乳铁蛋白含量的检测方法

毛细管电泳温度控制在25℃，使用直径为50μm、长度为20mm的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0.5psi，进样时间为13s，工作电压为15kV。

校准曲线的制定：利用乳铁蛋白标准品配制浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为120408、62151、33070、16172、7829，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9993，最低检出线为0.005ug，最低检出含量为0.01mg/ml，标准样品回收率达90％。

处理样品缓冲液配置方法：160m mol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.05％，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.5。

电泳缓冲液的配置方法：0.32mol/L柠檬酸，20m mol/L柠檬酸三钠，7mol/L尿素，羟丙基甲基纤维素0.05％。

检测步骤为：把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容器)。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分乳铁蛋白的峰面积为4752，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.0098mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为0.049mg/ml，所以该奶样含有的乳铁蛋白浓度为0.049g/L。

实施例2一种牛乳中乳铁蛋白含量的检测方法

毛细管电泳温度控制在30℃，使用直径为75μm、长度为600mm的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，工作电压为25kV。

校准曲线的制定：利用乳铁蛋白标准品配制浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml的标准溶液。摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为，157203、78413、38450、18625、9512利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.998，最低检出线为0.01ug，最低检出含量为0.01mg/ml，标准样品回收率达95％。

处理样品缓冲液配置方法：160m mol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.4％。使用0.1M氢氧化钠调至pH值为8.5。

电泳缓冲液的配置方法：0.32mol/L柠檬酸，20m mol/L柠檬酸三钠，6mol/L尿素，羟丙基甲基纤维素0.4％。

检测步骤为：把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容器)。提取400ul样品缓冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。

样品定量读数：根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分乳铁蛋白的峰面积为4856，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为0.0308mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为0.154mg/ml，所以该奶样含有的乳铁蛋白浓度为0.154g/L。

Claims (9)

1.一种检测乳铁蛋白含量的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将乳铁蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量乳铁蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到乳铁蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中乳铁蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中标准曲线的制定的方法优选如下：配制乳铁蛋白标准溶液，在样品缓冲液中溶解乳铁蛋白标准物质配制成分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml，制备得到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到乳铁蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测结果按照如下方法计算：按峰面积计算出平均校正因子。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：把标准溶液或待检测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心5-15min，将样品与缓冲液按照1∶4-20的比例加入冻存管(或其他容器)，并摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1～10min，使用毛细管电泳仪测定。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的样品缓冲液为：能够使蛋白质分散的缓冲液，优选如下缓冲液：

160m mol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0.05％，pH值为8.5

5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述的摇匀步骤采用漩涡混合器。

6.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下：毛细管电泳检测检测的温度控制在15～40℃之间，毛细管柱直径25～75μm、长度20～600mm，DAD(或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0～1psi，进样时间为1s～20s，分离温度为15～40℃，工作电压为7～30kV。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。

8.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳缓冲液为pH2.0～9.0，主要成分为无机盐缓冲液，优选：磷酸盐、硼酸或柠檬酸。

9.根据权利要求2中所述的检测方法，其特征在于：所述的检测结果的处理方法如下：检测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。