CN101210922A

CN101210922A - 胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法

Info

Publication number: CN101210922A
Application number: CNA2006101284896A
Authority: CN
Inventors: 杨国宇; 韩立强
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2026-12-29
Also published as: CN101210922B

Abstract

胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，包含下列步骤：1)对每一批制备金探针和微量反应板建立标准曲线算出回归方程：(1)设8个标准孔，每孔各加入50uL0.01M PH＝7.4TBS溶液(含0.1％小牛血清)。(2)加样：从第七孔中吸出50uL弃去，使之体积均为50uL，第八孔为空白对照；(3)在反应孔中加入稀释2－6倍50uL金探针，(4)将反应板充分混匀后置室温下作用20－40分钟。(5)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值；(6)将标准IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数；2)样品测定，包含下列步骤：(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液。(2)在样品孔中加入50uL稀释的金探针，(3)将反应板充分混匀后置室温下作用20－40分钟。(4)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，根据标准曲线回归方程算出相应的IgG量。

Description

胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法

技术领域

本发明属于检测试剂领域，具体就是胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法。

背景技术

免疫球蛋白(IgG)是广泛分布于动物脑脊液和血清中的一种蛋白质，能够促进免疫细胞对病原体的吞噬；促进免疫细胞对肿瘤细胞或受感染细胞的杀伤和破坏；当第二次与相同病原体接触时可与之发生凝集反应；是唯一能通过胎盘传递给胎儿的免疫球蛋白，可增强胎儿和新生儿的免疫力。检测它的含量的对于了解动物机体内的免疫状况，健康情况等都有重要的意义。

现有检测血清中IgG总量的方法很多，如：单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法(ELISA)等是目前应用最多的两种方法，其中单向免疫扩散法是最经典的方法，这一方法的特点为操作简便，设备简单，测定成本较低，因而这一方法多年来一直为国际上所采用，但其准确度和灵敏度都不是很好。另外，还有酶联免疫吸附法，该法虽然准确度和灵敏度较好，但操作复杂、设备较昂贵，成本高，因而只在一些研究中使用。

发明内容

本发明提供了一个新的简便的免疫检测非特异性IgG的方法，本方法使用较少的蛋白质和标记物，一步完成，在很大程度上缩短了分析时间，一次可使用更多的样品，并且具有很高的敏感度，从而可以在生产实践中广泛用于评估动物的非特异性免疫功能及健康状况等。胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，包含下列步骤：

1)对每一批制备胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程，包含下列步骤：

(1)设8个标准孔，每孔各加入50uL0.01M PH＝7.4 TBS溶液(含0.1％小牛血清)；

(2)加样：第一孔加标准IgG溶液50uL，然后倍比稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出50uL弃去，使之体积均为50uL，第八孔为空白对照，每孔中标准IgG含量为160、80、40、20、10、5、2.5、0ug/mL；

(3)在反应孔中加入稀释2-6倍50uL胶体金标记蛋白A；

(4)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

(5)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，每个标准品的吸光度值减去空白孔吸光度值，即为加入标准IgG引起的吸光度值变化量；

(6)将标准IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，将每孔中标准IgG含量取常用对数，用log-logit作图法建立标准曲线算出回归方程为x＝by+a，其中x是标准IgG含量常用对数，y是标准IgG引起的吸光度值的变化量的常用对数，a、b为算回归方程的常数；

2)样品测定，包含下列步骤：

(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液；

(2)在样品孔中加入50uL稀释的胶体金标记蛋白A；

(3)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

(4)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，吸光度值减去该批制备的胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程空白孔吸光度值，即为加入样品IgG引起的吸光度值变化量，将样品IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，根据标准曲线回归方程算出相应的IgG量。

上述对每一批制备胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程中在反应孔中加入稀释4倍50uL胶体金标记蛋白A。

上述样品测定中将反应板充分混匀后置室温下作用30分钟。

附图说明

图1 SPA最小用量的测定

图2金探针的活性鉴定

图3金探针的稳定性检测

图4金探针的吸收曲线，1-胶体金、2-金探针

图5最佳金探针浓度的确定

图6最佳pH值的确定

图7曲线1-4℃，曲线2-15℃，曲线3-25℃，曲线4-37℃

图8剂量反应曲线

图9回归曲线

图10方法对比试验

具体实施方式：

本发明所述金探针就是胶体金标记蛋白A。

本发明是利用胶体金标记技术来建立一种新的快速检测血清中IgG总量的方法。胶体金具有两个主要特性：(1)它们具有特征性鲜明的红色，并且当高分子的大复合物吸附到金颗粒上时这种红色几乎不发生变化；(2)由于颗粒的凝集而导致的吸收光谱的巨大变化(从红→蓝或灰色)，这种吸收光谱的变化能很容易地用分光光度计检测到和用肉眼观察到。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金表面负电荷，与蛋白质的正点荷基团因静电吸附而形成牢固结合。利用胶体金颗粒与蛋白质的相互作用引起的凝集反应，并伴随着溶液颜色的变化的性质，作为发展用比色计来定量检测蛋白质的方法的依据。葡萄球菌蛋白a(SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。SPA具有和人与许多哺乳动物如豚鼠、猪、兔、小鼠、猴等IgG结合的能力。这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，可以一方面同IgG相结合，一方面与标记物相结合，因此可以用胶体金来标记SPA，制得金标SPA即金探针，再根据金标SPA和IgG的生物特异性作用而凝集所产生的吸收光谱的变化来检测IgG的含量。

这种新方法利用微量滴定板和一个酶标仪来完成检测，敏感性高，最低检测限可达0.2ug，而用传统的分光光度计法最小检测量是2ug。这种检测方法使用较少的蛋白质和标记物，一步完成，在很大程度上缩短了分析时间，一次可使用更多的样品，并且可以获得更高的敏感度，为对蛋白质的进行快速敏感地定量检测提供了更多的可能。

胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，包含下列步骤：

1)对每一批制备金探针和微量反应板建立标准曲线算出回归方程，包含下列步骤：

(1)设8个标准孔，每孔各加入50uL0.01M PH＝7.4 TBS溶液(含0.1％小牛血清)。

(2)加样：第一孔加标准IgG溶液50uL，然后倍比稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出50uL弃去，使之体积均为50uL，第八孔为空白对照，每孔中标准IgG含量为160、80、40、20、10、5、2.5、0ug/mL。

(3)在反应孔中加入稀释2-6倍50uL金探针，

(4)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟。

(5)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，每个标准品的吸光度值减去空白孔吸光度值，即为加入标准IgG引起的吸光度值变化量，

2)样品测定，包含下列步骤：

(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液。

(2)在样品孔中加入50uL稀释的金探针，

(3)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟。

(4)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，吸光度值减去该批制备的金探针和微量反应板建立标准曲线算出回归方程空白孔吸光度值，即为加入样品IgG引起的吸光度值变化量，将样品IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，根据标准曲线回归方程算出相应的IgG量。

上述对每一批制备金探针和微量反应板建立标准曲线算出回归方程中在反应孔中加入稀释4倍50uL金探针。

上述样品测定中将反应板充分混匀后置室温下作用30分钟。

附图说明

胶体金标记蛋白A来检测猪血清中IgG总量试验报告

I胶体金探针的制备

II方法条件的的建立

III初步应用

I胶体金探针的制备

1仪器与试剂

微型旋涡混合仪。

UV-2800型紫外可见分光光度计。

硝酸纤维素薄膜(NCM)(浙江黄岩化工厂生产)。

胶体金(10nm)：洛阳华美生物技术有限公司提供。

重组金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)：北京本元正阳公司生产。

1％聚乙烯二醇(PEG，MV20000)(solarbio)。

牛血清白蛋白(BSA)(sigma)。

0.01MTBS(pH＝7.4)

2试验方法

(1)蛋白质的处理：先用0.22um的微孔滤膜过滤，后用去离子水4℃透析过夜。

(2)胶体金pH的调整：胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于胶体金的pH值。一般在蛋白质等电点略偏碱性的条件下二者才能结合，因此，标记之前需用0.1mol/LK₂CO₃或0.1mol/LHCL调至pH＝5.9-6.2。

(3)确定最佳标记蛋白量：本试验选用微量试管目测法，其具体操作步骤如下：在10个1.5ml小离心管内分别加入0.005M的NaCL50ul，于第一管中加入50ulSPA(1mg/mL)，然后倍比稀释，分别加入250ul 10nm胶体金，作用10min，再分别加入10％NaCL250ul，混匀后观察颜色变化，以颜色不变者的最大稀释度为SPA与胶体金的最佳结合比。根据待标记的胶体金的量推算出所需SPA的量，并在此基础上再添加10-20％即为最佳标记蛋白量(实际用量)。

(4)标记：将所需SPA的量及胶体金(pH＝5.9-6.2)在微型旋涡混合仪上混合，作用10min后加入一定量的1％PEG，使其终浓度为0.05％。

(5)金探针的纯化：用超速离心法纯化金探针，以除去其中未充分稳定的胶体金和多余的蛋白质以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。1500rpm离心15min，吸取上清，弃去沉淀，以除去大的聚合物，超速离心40min，弃去上清，疏松沉淀物用0.1％BSA pH＝7.4TBS重新悬浮至原体积，再重复离心1-2次，所得沉淀用0.1％BSA pH＝7.4TBS重新悬浮至原体积的10-20分之一，4℃保存备用。

(6)金探针的生物学活性鉴定：采用两点法鉴定金探针的活性，将去离子水，人IgG分别点在硝酸纤维素薄膜(NCM)上，洗涤，封闭，直接加金探针检测。

(7)金探针稳定性鉴定：将已标记好的金探针置4℃下保存四个月，每月对同一份-20℃保存的人IgG用两点法进行检测。

3结果

(1)最佳标记蛋白量的确定：本试验测得胶体金和SPA的最佳结合比为1∶64(如图1所示)，故通过公式X＝50*2^-n/250可以计算出稳定1ml胶体金所需SPA的最小用量为3.125ug，实际用量增加20％为3.75ug/mL.(注：因每批胶体金有差异，故每次标记前都要确定蛋白质的用量。)

(2)金探针的生物学活性鉴定：采用两点法对金探针的活性进行检测，结果为：加去离子水的点为阴性(不显红色)，而加人IgG的点显红色表现为阳性，说明金探针有活性。(如图2所示)

(3)金探针稳定性试验：将已标记好的金探针置4℃下保存四个月，每月对同一份-20℃保存的人IgG用两点法进行检测：结果前两个月没有明显变化，而第三个月活性开始变差。(如图3所示)

(4)金探针的吸收曲线：以去离子水为空白，用分光光度计从400nm至800nm进行扫描，其吸收曲线如图4所示，可以看出胶体金的最大吸收峰为520nm，而金探针的最大吸收峰在522nm左右，另外，在620nm处其吸光度值(ΔA)变化最大，故此吸收曲线可作为定量检测的依据。

II方法条件建立

1.试验材料：

酶标仪：美国伯乐

(96孔)微量滴定板(购于河南华美生物公司)

金探针即金标蛋白A：(自制)

标准IgG溶液：猪IgG标准品用含0.1％小牛血清的0.01M PH＝7.4TBS溶液稀释成0.32mg/mL。(猪IgG标准品由北京博奥森生物公司提供)

样品稀释液：0.01M PH＝7.4TBS溶液

待检样品：1∶1000稀释的猪血清

2.最佳检测条件的确定：

(1)最佳金探针浓度的确定：一般来说，金探针浓度越大，检测的敏感度越高，但因其黏度过大，灵敏度反而降低。我们选用斜率法来确定其浓度的大小，具体操作如下：取50uL金探针在微量板的孔穴中倍比稀释成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32后，再分别加入等量的10ug/mL标准IgG溶液，作用30分钟后在酶标仪上测其OD值。然后根据其OD值的大小作图，找出其斜率最大点，该点所对应的稀释倍数即为金探针的最佳稀释倍数。

(2)最佳pH值的确定：在室温下，把10ug/mLI gG标准溶液和一定的金探针浓度(1∶4)用pH4.0-9.00.01M TBS缓冲液，孵育2小时，在620nm下测其吸光度，并作出吸收曲线图。

(3)温度和作用时间的确定：取0.32mg/mLIgG标准溶液分别在37℃、25℃、15℃、4℃下和1∶4稀释的金探针作用，观察2小时，并作出各自随时间变化的吸收曲线。

3.结果

(1)最佳金探针浓度的确定：从图5中我们可以看出，1∶4稀释的金探针在曲线上的斜率最大，故金探针的最佳稀释倍数为1∶4。

(2)最佳pH值的确定：从图6中我们可以清楚地看出，缓冲液pH＝7.4时测定值最大，因此，pH＝7.4是最佳测定pH值。

(3)温度和作用时间的确定：从图7可以看出在4℃时检测最好，但此时非特异性反应增大，而37℃时由于分子运动剧烈反而不易金颗粒的凝集，致使测定值偏低，因此，我们检测时最好在室温下进行，并要求室温波动不大(±0.5℃)的条件下进行检测。另外，我们还可以从图7看出作用时间在30分钟左右吸光度值已经达到较高数值，30分钟后曲线逐渐变得平稳，故金探针与血清中IgG反应的最佳作用时间为30分钟。

III具体应用及方法评价

(一)方法检测模式的建立

1.对每一批制备的金探针和微量反应板建立标准曲线算出回归方程：

(3)在反应孔中加入50uL金探针(1∶4)。

(4)将反应板充分混匀后置室温下作用30-40分钟。

(6)将标准IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，将每孔中标准IgG含量取常用对数，用log-logit作图法建立标准曲线算出回归方程为x＝by+a，其中x是标准IgG含量常用对数，y是标准IgG引起的吸光度值的变化量的常用对数，

2.样品测定

(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液。

(2)在样品孔中加入50uL稀释的金探针，

(3)将反应板充分混匀后置室温下作用30-40分钟。

(二)方法评价试验

1.线性范围试验：把0.32mg/mLIgG标准溶液倍比稀释后和一定浓度的金探针作用30分钟，在620nm处测其OD值，以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，即可绘制一条曲线，即剂量反应曲线，从而求出检测范围(即测定上限和下限)。并对测定范围的线性进行评价：对线性范围内的浓度与对应吸光度值作直线回归分析，求出此直线的截距a和斜率b，建立直线回归方程x＝by+a；并作相关分析，求出相关系数(r)。

2.回收试验：回收试验是发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。通过测定IgG的回收率，能较确切地判断该方法比例系统误差的有无或大小，可以对方法的准确性作出可靠的评价。

其具体操作如下：(1)血清样品的采集：收集健康的、无溶血、无脂浊的猪混合血清，用我们建立的新检测方法进行测定求得其IgG的含量，将其1∶1000稀释后作为基础样品。

(2)回收样品的建立：回收样品I：基础样品990uL+标准品(0.32mg/mLIgG)10uL

回收样品II：基础样品985uL+标准品(0.32mg/mLIgG)15uL

(3)回收率的计算：回收率＝回收量/加入量×100

3.重复性试验：(1)批内重复性试验：取健康的、无溶血、无脂浊的猪混合血清，用新建方法在同一实验室、由同一个人在较短的时间内用相同的试剂连续进行5轮，每轮重复4次检测。并计算出其批内平均数，批内标准差及批内变异系数。

(2)批间重复性试验：取猪混合血清，连续测10天，并计算出其批间平均数，批间标准差及批间变异系数。

4.方法对比试验：方法对比试验是将侯选方法与准确度已知的方法作对比分析，以评价侯选方法的准确度，是考核侯选方法是否可被采用的重要试验。

4.1材料与试剂：猪免疫球蛋白G定量ELISA试剂盒，金探针(金标蛋白A)，猪血清样本(1∶1000倍稀释)

4.2操作步骤：(1)选择高低不同的血清样本20份，作1∶1000倍稀释。

(2)将每份样本分别用两种方法各测定两次，并计算两法各自的测定结果。

(三)结果

3.1标准曲线：从图8中我们可以看出，剂量反应曲线为一动态二次曲线，当IgG浓度为116.67ug/mL时，曲线有极大值，故其最大检测上限为116.67ug/mL，通过公式“空白值+2.6S”可以计算出其最小检测限为2.1ug/mL。用log-logit作图法作出其校正曲线(图9)，并求出其回归方程为y＝0.9741x-2.9342，R²＝0.9907.对其系数b进行t检验：

tb＝20.7299＞t0.01(4)，P＜0.01，故直线回归方程与剂量反应曲线方程之间有极显著的相关关系。

3.2样品回收试验：

表1样品回收率

样品	测得浓度(ug/mL)	加入浓度(ug/mL)	回收浓度(ug/mL)	回收率(％)
样品	测得浓度(ug/mL)	加入浓度(ug/mL)	回收浓度(ug/mL)	回收率(％)	基础样品	20.2056	/	/	/
回收样品I	23.3109	3.2	3.2549	101.71％	基础样品	20.2056	/	/	/
回收样品I	23.3109	3.2	3.2549	101.71％	回收样品II	24.7479	4.8	4.5423	94.65％
平均回收率	/	/	/	98.18％	回收样品II	24.7479	4.8	4.5423	94.65％

由表1可知，用此方法测得样品回收率为98.18％，符合要求。

3.3重复性试验：

(1)批内重复性试验结果如下表：

批内标准差Sw＝1.0935批内均数＝98.986/5＝19.7972批内变异系数CV％＝5.52％

(2)批间重复性试验结果如下表：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均数	标准差	变异系数
天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均数	标准差	变异系数	测得值	22.3542	21.3959	20.444	19.4906	20.9218	19.9678	18.5384	19.9672	19.2585	18.8707	20.1209	1.18392	5.88％

4.方法对比试验：以夹心ELISA方法测得值为横坐标，以金标法测得值为纵坐标作散点图，并求出回归直线方程为：y＝0.9636+1.7047且R²＝0.989，对其进行t检验：

tr＝383.562＞t0.001，故P＜0.001，说明：r与0之间有极显著的差异，这两种方法的测定值之间存在着高度相关关系。图10

Claims

1.胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，包含下列步骤：

(3)在反应孔中加入稀释2-6倍50uL胶体金标记蛋白A；

(4)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

2)样品测定，包含下列步骤：

(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液；

(2)在样品孔中加入50uL稀释的胶体金标记蛋白A；

(3)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

(4)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，吸光度值减去该批制备的胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程空白孔吸光度值，即为加入样品IgG引起的吸光度值变化量，将样品IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，根据标准曲线回归方程算出相应的IgG量；

2.如权利要求1所述的胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，其特征在于：对每一批制备胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程中在反应孔中加入稀释4倍50uL胶体金标记蛋白A。

3.如权利要求1所述的胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，其特征在于：样品测定中将反应板充分混匀后置室温下作用30分钟。