CN111896732B - 一种胶体金标记方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶体金标记方法，包括以下步骤：制备待用胶体金溶液并调节pH值满足：pI+0.4<pH<pI+0.6，获得标准胶体金溶液；向标准胶体金溶液中添加表面活性剂；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液；再添加封闭剂，得到包含有待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液；将包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液离心，弃去上清液，取沉淀物；将沉淀物经胶体金复溶液复溶后得到金标复合物溶液；筛选金标复合物溶液的最佳稀释倍数；将所述金标复合物溶液按照最佳稀释倍数进行稀释，得到金标复合物稀释液，采用所述金标复合物稀释液制备金垫；本发明所提供的方法减少了由胶体金粒径大小、pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响。

Description

一种胶体金标记方法及其产品

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胶体金标记方法及其产品。

背景技术

胶体金标记技术是指以胶体金作为显色示踪粒子的标记技术。胶体金对待标记蛋白或待标记抗体的吸附主要取决于其pH值。其中，当胶体金的pH值接近待标记蛋白(或待标记抗体)的等电点(pI)或略偏碱性的条件下，胶体金和待标记蛋白容易形成牢固的结合物；当胶体金的pH值低于待标记蛋白的等电点时，则胶体金和待标记蛋白会发生聚集而失去结合能力；当胶体金的pH值远大于待标记蛋白的等电点时，则胶体金和待标记蛋白的结合能力变弱，胶体金和待标记蛋白均呈游离状态，难以形成金标复合物。

此外，由于胶体金颗粒粒径的不一致，在标记蛋白的时候，即使将不同粒径的胶体金溶液调整至相同的pH条件下，但是由于各胶体金颗粒的粒径差异太大，则会出现以下情况：一部分胶体金在标记蛋白后可以很稳定；一部分胶体金在标记蛋白后，蛋白构象因为胶体金粒径的影响而产生翻转等变化，使得胶体金颗粒与待标记蛋白相互吸附聚集，导致标记蛋白的胶体金溶液状态很不稳定，则标记蛋白的胶体金溶液快速会逐步变色变暗甚至产生沉淀，最终导致胶体金标记失败。此外，在制备待标记蛋白溶液时，需要添加一些蛋白保护剂来提高待标记蛋白的稳定性及活性。蛋白保护剂常为离子型化合物，其产生的电荷作用会给胶体金溶液的稳定性带来很大程度的负面影响。具体而言，这类蛋白保护剂在胶体金溶液中会破坏胶体金胶粒表面的水化膜、双离子层结构，导致胶体金溶液状态很不稳定。

鉴于上述问题，为保证胶体金标记效果，需要不断的优化和摸索标记工艺，以保证最终产品的质量。

因此，亟需研制一种胶体金标记方法，以减少由胶体金粒径大小、pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响，从而提高胶体金标记过程的稳定性，并降低胶体金标记失败的风险。

发明内容

鉴于现有技术中的不足，本发明提供了一种胶体金标记方法及其产品。本发明所提供的胶体金标记方法减少了由胶体金粒径大小、pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响，此外还提高了胶体金标记过程的稳定性，并降低了胶体金标记失败的风险。

本发明用于实现上述目的的技术方案如下：

在本发明的一个方面，提供了一种胶体金标记方法，其包括以下步骤：

制备待用胶体金溶液；

调节所述待用胶体金溶液的pH值，获得标准胶体金溶液；

向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，搅拌混匀；再添加封闭剂，搅拌混匀；得到包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液；

将所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液离心，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶后得到金标复合物溶液；

筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数；

将所述金标复合物溶液按照所述最佳稀释倍数进行稀释，得到金标复合物稀释液，采用所述金标复合物稀释液制备金垫；

其中，所述调节所述待用胶体金溶液的pH值，包括：调节所述待用胶体金溶液的pH值至满足：pI+0.4<pH<pI+0.6；并且其中，所述pI为所述待标记蛋白或待标记抗体的等电点。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数，包括以下步骤：

将所述金标复合物溶液稀释成至少三种浓度，得到不同浓度的金标复合物溶液稀释液；

将所述不同浓度的金标复合物溶液稀释液分别制备成金垫，分别用于待测质控品的测试，后根据所述待测质控品的测试结果，确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述待标记蛋白或待标记抗体的溶液可以为：含有所述待标记蛋白或待标记抗体的缓冲溶液；其中所述缓冲溶液可以选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或者硼酸盐缓冲溶液中的一种或两种以上；所述缓冲溶液的浓度可以为0.005mol/L至0.2mol/L。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述将所述金标复合物溶液分别稀释成至少三种浓度，包括：将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍和7倍；或者将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍、7倍、8倍和9倍。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述制备待用胶体金溶液，包括：

烧制一定批次的胶体金溶液；

分别测定各批次的所述胶体金溶液的特征波长值；

将所述各批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，得到所述待用胶体金溶液；

其中，所述特征波长值相近是指各所述特征波长值之间的差值在1～10nm范围内。

在本发明的一些实施方式中，对各批次胶体金溶液进行分组分类，并将各批次中的特征波长值相近的胶体金溶液合并，所述特征波长值相近还可以指特征波长值之间的差值为5nm，或者所述特征波长值相近还可以指特征波长值之间的差值为3nm。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述烧制胶体金溶液，可以包括：将加热至沸腾的质量分数为0.01～0.04％的氯金酸水溶液与质量分数为10％的柠檬酸钠溶液混合，继续煮沸，冷却后得到待用胶体金溶液；其中，所述氯金酸与所述柠檬酸钠的质量比为1:1.2。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，采用碳酸钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液中的一种或两种以上来调节所述待用胶体金溶液的pH；其中，所述碳酸钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液的浓度为0.05～1.0M。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，采用碳酸钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液中的一种或两种以上来调节所述待用胶体金溶液的pH；其中，所述碳酸钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.5M。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述表面活性剂(向所述标准胶体金溶液中添加的表面活性剂)选自Triton X-45、TRITON X-100、TRITON X-305、吐温20、吐温60、吐温80、Brij-35、Tetronic 1307、ON-870、PEG20000或PVP中的一种或两种以上；

按质量分数计，所述标准胶体金溶液包含：所述表面活性剂0.001％～0.1％。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述待标记蛋白或待标记抗体的质量与所述标准胶体金溶液的体积的比例为：(1～100)ug:1ml。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述封闭剂(向所述标准胶体金溶液中添加的封闭剂)选自BSA、PEG20000、酪蛋白、酪蛋白钠盐、脱脂奶粉、胎牛血清、明胶或蛋白胨中的一种或两种以上；

所述封闭剂的质量与所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液的体积的比例为：(1～50)mg:1ml。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述金标复合物溶液与所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液的体积比为(1～50):50；优选1:10。

在本发明的另一个方面，提供了本发明所述的胶体金标记方法制备得到的检测用试剂盒。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述烧制一定批次的胶体金溶液，包括：所述一定批次是指2批次以上；优选地，所述一定批次是指5批次；

所述胶体金溶液的各批次的体积≤1500ml；优选1000ml。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述测定各批次的所述胶体金溶液的特征波长值，可以包括：用分光光度计测定所述各批次的所述胶体金溶液的最大OD值，并测定所述最大OD值所对应的特征波长值。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述调节所述待用胶体金溶液的pH值，获得标准胶体金溶液，可以包括：调节所述待用胶体金溶液的pH值，后磁力搅拌混匀10～15min，获得标准胶体金溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，搅拌混匀；再添加封闭剂，搅拌混匀，可以包括：向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀10～15min；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，快速搅拌混匀2～5min，然后缓慢搅拌混匀45～55min；再添加封闭剂，快速搅拌混匀2～5min，然后缓慢搅拌混匀45～55min。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述将所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液离心，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶后得到金标复合物溶液，可以包括：将所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液在转速为10000～12000rpm下离心10～110min(具体离心时间可以基于上述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液的体积进行调整)，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶后，超声分散2～5min，得到所述金标复合物溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述金标复合物溶液于温度为2～8℃下保存备用。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述胶体金复溶液为含有表面活性剂的缓冲溶液，其中所述表面活性剂选自Triton X-45、TRITON X-100、TRITON X-305、吐温20、吐温60、吐温80、Brij-35、Tetronic1307、ON-870、PEG20000或PVP中的一种或两种以上；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液或Tris-HCL缓冲液中的一种或两种以上；按质量分数计，所述所述胶体金复溶液包含所述表面活性剂0.001％～0.5％。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述胶体金复溶液为还含有封闭剂的缓冲溶液，所述封闭剂选自BSA、PEG20000、酪蛋白、酪蛋白钠盐、脱脂奶粉、胎牛血清、明胶、蛋白胨、EDTA、蔗糖、海藻糖、壳聚糖、HPMC或CMC中的一种或两种以上；按质量分数计，所述所述胶体金复溶液包含所述封闭剂0.01％～10％。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述待标记蛋白或待标记抗体的等电点的测定方法可以包括：浊度分光光度计法、等电聚集法；

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述待标记蛋白或待标记抗体的等电点的测定方法还可以包括：根据所述待标记蛋白或待标记抗体的供应商提供的数据来测定等电点，或者根据所述待标记蛋白或待标记抗体的蛋白序列来计算等电点。

在本发明的一些实施方式中，所述测得的等电点均需要通过胶体金标识实验来验证其偏差大小。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述将所述金标复合物溶液按照所述最佳稀释倍数进行稀释，得到金标复合物稀释液，采用所述金标复合物稀释液制备金垫，包括：将所述金标复合物溶液按照所述最佳稀释倍数进行稀释，将所述稀释后的金标复合物溶液喷涂在玻璃纤维垫上，在温度为40～55℃下烘干2～3小时，得到所述金垫。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数的过程中，所述将所述不同浓度的金标复合物溶液稀释液分别制备成金垫，分别用于待测质控品的测试，包括：将所述不同浓度的金标复合物溶液稀释液分别喷涂在玻璃纤维垫上，在温度为40～55℃下烘干2～3小时，分别制备成金垫，分别用于待测质控品的测试。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数的过程中，所述根据所述待测质控品的测试结果，确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数，包括：根据所述待测质控品的测试结果，获得所述不同浓度的金标复合物溶液稀释液所制备的金垫的检测灵敏度(将所述金垫进一步制备为检测试剂盒后进行检测)；将符合胶体金标记技术要求的检测灵敏度所对应的金标复合物溶液稀释倍数作为所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数。

本发明所述的一个或多个技术实施方式，至少具有如下技术效果或优点：

(1)本发明提供的胶体金标记方法，调节所述待用胶体金溶液的pH值满足pI+0.4<pH<pI+0.6，并向胶体金溶液中添加特定的表面活性剂，从而使得本发明所提供的胶体金标记方法减少了由胶体金pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响。

(2)发明人发现，均一粒径的胶体金颗粒，是胶体金标记质量控制的关键性指标。现有技术中的胶体金制备过程中，由于生产过程反应条件控制手段的精度问题，经常出现同一个参数下制备的胶体金颗粒的粒径显著不一样，从而产生对胶体金标记效率的不利影响。而本发明提供的胶体金标记方法，通过采用特定方法来制备所述待用胶体金溶液，从而可有效地保障所得到的胶体金溶液中胶体金颗粒的粒径均一性。在制备所述待用胶体金溶液的过程中，包括按照胶体金溶液的特征波长值来分组，并将特征波长值相近的胶体金溶液合并为一个组，从而使得本发明所提供的胶体金标记方法减少了由胶体金粒径大小等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响，从而提高了胶体金标记过程的稳定性，并降低了胶体金标记失败的风险。

(3)本发明提供的胶体金标记方法中，在胶体金标记的过程中引入了特定种类的表面活性剂；基于这些表面活性剂的分散性，能够显著提高胶体金溶液的稳定性，并有效降低胶体金溶液的胶粒与待标记蛋白或待标记抗体的碰撞吸附强度和碰撞吸附速度，从而提高了胶体金溶液在标记过程中的稳定性；这些表面活性剂降低了在标记过程中胶体金溶液对待标记蛋白或待标记抗体的强烈吸附所产生的蛋白构象改变程度，减缓了蛋白变性影响，并降低了由于标记产生的蛋白非特异性反应的强度及概率；同时，本发明提供的胶体金标记方法无需使用蛋白保护剂(现有技术中通常添加蛋白保护剂)，避免了蛋白保护剂对胶体金溶液的破坏作用，从而在整体上提高了胶体金标记的成功概率，并显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量。

(4)相比于现有技术中的常规胶体金标记方法，本发明提供的胶体金标记方法节省了标记步骤工作量的至少2倍以上，显著简化了胶体金标记的工艺步骤，显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，显著地降低了调试胶体金标记参数的摸索次数，并降低了生产胶体金试剂盒的成本金和工作量。

(5)相比于现有技术中的常规胶体金标记方法，本发明提供的胶体金标记方法无需对待标记蛋白进行透析处理，简化了胶体金标记的工艺步骤，并同时提高了检测灵敏度。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本发明提供了一种胶体金标记方法，其包括以下步骤：

制备待用胶体金溶液；

调节所述待用胶体金溶液的pH值，获得标准胶体金溶液；

向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，搅拌混匀；再添加封闭剂，搅拌混匀；得到包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液；

将所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液离心，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶后得到金标复合物溶液；

筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数；

将所述金标复合物溶液按照所述最佳稀释倍数进行稀释，得到金标复合物稀释液，采用所述金标复合物稀释液制备金垫；

其中，所述调节所述待用胶体金溶液的pH值，包括：调节所述待用胶体金溶液的pH值至满足：pI+0.4<pH<pI+0.6。

发明人研究发现，胶体金标记技术是指以胶体金作为显色示踪粒子的标记技术。而胶体金对待标记蛋白或待标记抗体的吸附主要取决于pH值，在接近待标记蛋白或待标记抗体的等电点pI或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物；如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力；如果胶体金的pH值远大于蛋白质的等电点时，则待标记蛋白或待标记抗体与胶体金的结合能力变弱，胶体金和待标记蛋白或待标记抗体均呈游离状态，难以形成金标复合物。本发明人经过大量筛选，本发明提供的胶体金标记方法，调节所述待用胶体金溶液的pH值满足pI+0.4<pH<pI+0.6，并向胶体金溶液中添加特定的表面活性剂，从而使得本发明所提供的胶体金标记方法减少了由pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数，包括以下步骤：

将所述金标复合物溶液稀释成至少三种浓度，得到不同浓度的金标复合物溶液稀释液；

将所述不同浓度的金标复合物溶液稀释液分别制备成金垫，分别用于待测质控品的测试，后根据所述待测质控品的测试结果，确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数。

本发明提供的胶体金标记方法，还包括筛选出金标复合物溶液的最佳稀释倍数，从而使得本发明所提供的胶体金标记方法不仅减少了由胶体金粒径大小、pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响，此外还节省了标记步骤工作量，简化了胶体金标记的工艺步骤，提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，从而降低生产胶体金试剂盒的复杂性及工作量。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述将所述金标复合物溶液分别稀释成至少三种浓度，包括：将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍和7倍；或者将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍、7倍、8倍和9倍。

本发明人通过大量的摸索试验，确定了如本发明一些实施方式中所述的将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍和7倍；或者将所述金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释5倍、6倍、7倍、8倍和9倍，从而节省了标记步骤工作量的至少2倍以上，显著简化了胶体金标记的工艺步骤，显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述制备待用胶体金溶液，包括：

烧制一定批次的胶体金溶液；

分别测定各批次的所述胶体金溶液的特征波长值；

将所述各批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，得到所述待用胶体金溶液；

其中，所述特征波长值相近是指各所述特征波长值之间的差值在1～10nm范围内。

本发明基于胶体金粒径与特征波长的关系，将所述各批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，得到所述待用胶体金溶液用于后续的标记步骤，从而实现了对胶体金粒径的筛选，减少了由胶体金粒径大小、pH等因素而对胶体金标记效率产生的不利影响。具体而言，本发明人研究发现，胶体金溶液的最大吸收峰和其粒径之间存在一定的线性关系；本发明采用紫外/可见光分光光度计对胶体金颗粒的光学吸收特性进行表征，实现对各批次胶体金溶液进行分组分类，并将各批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，提高了胶体金溶液的粒径均一性，从而在整体上提高了单次生产胶体金试剂盒的产量。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述表面活性剂选自Triton X-45、TRITON X-100、TRITON X-305、吐温20、吐温60、吐温80、Brij-35、Tetronic1307、ON-870、PEG20000或PVP中的一种或两种以上；

按质量分数计，所述标准胶体金溶液包含：所述表面活性剂0.001％～0.1％。

本发明人发现，通过本发明所限定的特定表面活性剂在胶体金微粒表面的自组装，减缓了胶体金微粒间相互吸附聚集，从而在整体上提高了胶体金标记的成功概率，并显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量；此外，本发明提供的胶体金标记方法无需对待标记蛋白进行透析处理，简化了胶体金标记的工艺步骤，并同时提高了检测灵敏度。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述待标记蛋白或待标记抗体的质量与所述标准胶体金溶液的体积的比例为：(1～100)ug:1ml。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述封闭剂选自BSA、PEG20000、酪蛋白、酪蛋白钠盐、脱脂奶粉、胎牛血清、明胶或蛋白胨中的一种或两种以上；

所述封闭剂的质量与所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液的体积的比例为：(1～50)mg:1ml。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述金标复合物溶液与所述包含有所述待标记蛋白或待标记抗体的胶体金溶液的体积比为(1～50):50；优选1:10。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，搅拌混匀；再添加封闭剂，搅拌混匀，包括：向所述标准胶体金溶液中添加表面活性剂，搅拌混匀10～15min；后添加待标记蛋白或待标记抗体的溶液，快速搅拌混匀2～5min，然后缓慢搅拌混匀45～55min；再添加封闭剂，快速搅拌混匀2～5min，然后缓慢搅拌混匀45～55min。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述胶体金复溶液为含有表面活性剂的缓冲溶液，其中所述表面活性剂选自Triton X-45、TRITON X-100、TRITON X-305、吐温20、吐温60、吐温80、Brij-35、Tetronic1307、ON-870、PEG20000或PVP中的一种或两种以上；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液或Tris-HCL缓冲液中的一种或两种以上；

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金标记方法中，所述胶体金复溶液还可以包含BSA、PEG20000、酪蛋白、酪蛋白钠盐、脱脂奶粉、胎牛血清、明胶、蛋白胨、EDTA、蔗糖、海藻糖、壳聚糖、HPMC或CMC中的一种或两种以上。

发明人认识到，在常规的胶体金标记过程中，单批次烧制胶体金溶液的体积不易过大，以避免胶体金溶液的受热不均匀等因素导致胶体金的粒径不够均一。在现有技术中，常规的做法是对每一次烧制的每瓶胶体金溶液进行胶体金标记待标记蛋白或待标记抗体的最适pH的参数摸索，然后再摸索待标记蛋白或待标记抗体的添加量参数，随后摸索金标复合物溶液的最佳稀释倍数。这种情况下，如果单批次生产制备金标复合物溶液所需胶体金溶液的体积远大于单次烧制胶体金溶液的体积，则需要多次摸索各瓶胶体金溶液的标记参数(即：胶体金标记待标记蛋白或待标记抗体的最适pH、待标记蛋白或待标记抗体的添加量、金标复合物溶液的最佳稀释倍数)，然后制备成相应的金垫，再验证混匀后的金标复合物溶液稀释液的性能是否满足胶体金标记标准。而本发明的一些实施例提供的的胶体金标记方法，所制备得到的检测用试剂盒的检测灵敏度比现有技术中常规的胶体金标记方法所制备得到的检测用试剂盒的检测灵敏度显著偏高。本发明的一些实施例提供的的胶体金标记方法可以显著改善胶体金标记的生产工艺步骤，显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，显著地降低了调试胶体金标记参数的摸索次数，并降低了生产胶体金试剂盒的成本金和工作量。

下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请所述胶体金标记方法及其产品进行详细说明。

实施例1：

在本发明的实施例中，本发明所述胶体金标记方法包括以下步骤：

(1)烧制5批次的胶体金溶液，每批次1000ml，分别标识A、B、C、D、E瓶；用分光光度计分别测试A、B、C、D、E瓶中的胶体金溶液的最大OD值，并测定所述最大OD值所对应的特征波长值；测定结果为：A瓶特征波长值为524nm，OD524＝1.81；B瓶特征波长值为526nm，OD526＝1.83；C瓶特征波长值为525nm，OD525＝1.78；D瓶特征波长值为534nm，OD534＝1.86；E瓶特征波长值为545nm，OD545＝1.73。将所述5批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，故将A瓶、B瓶、C瓶中的胶体金溶液混合成一瓶共3000ml的溶液，标识其为G瓶，即得到所述待用胶体金溶液。

(2)查阅供应商提供的抗人IgG抗体的等电点pI，并用0.05M碳酸钾溶液调接步骤(1)得到的G瓶中待用胶体金溶液的Ph为8.0，其满足pI+0.4<pH<pI+0.6，然后磁力搅拌混匀10min，获得标准胶体金溶液。

(3)向步骤(2)得到的标准胶体金溶液中添加Triton X-45，搅拌混匀10min；后添加待标记抗人IgG抗体的溶液，快速磁力搅拌混匀2min，然后缓慢磁力搅拌混匀45min；再添加BSA，快速磁力搅拌混匀2min，然后缓慢磁力搅拌混匀45min；其中，按质量分数计，包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液包含所述Triton X-45 0.001％；待标记抗人IgG抗体的溶液的质量与所述包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液的体积的比例为1ug:1ml；封闭剂的质量与包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液的体积的比例为1mg:1ml。

(4)将步骤(3)得到的包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液3000ml分装成6个试管500ml，将这6个试管分别在转速为10000rpm下离心10min，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶至300ml，超声分散2min，然后再涡旋混匀，得到所述金标复合物溶液，于温度为2～8℃下保存备用；

其中，胶体金复溶液为含有Triton X-45的磷酸盐缓冲液，胶体金复溶液还可以包含BSA。

(5)筛选步骤(4)得到的金标复合物溶液的最佳稀释倍数：将步骤(4)得到的金标复合物溶液1000ul分装到5个试管，每个试管200ul，编号为a、b、c、d、e管；a管中用胶体金复溶液稀释至1000ul，b管用胶体金复溶液稀释至1200ul，c管用胶体金复溶液稀释至1400ul，d管用胶体金复溶液稀释至1600ul，e管用胶体金复溶液稀释至1800ul；每个试管中均取1ml胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备5个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成5个检测用试剂盒；将5个试剂盒用于测试待测质控品，根据5测试结果，可以看出d管中的胶体金复溶液稀释液制备得到的检测用试剂盒的反应灵敏度满足技术要求，故确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数为将金标复合物溶液用胶体金复溶液稀释8倍。

(6)按照步骤(5)得到的最佳稀释倍数为8倍来稀释步骤(4)得到的金标复合物溶液，然后将胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成检测用试剂盒。

实施例2：

在本发明的实施例中，本发明所述胶体金标记方法包括以下步骤：

(1)烧制5批次的胶体金溶液，每批次1000ml，分别标识A、B、C、D、E瓶；用分光光度计分别测试A、B、C、D、E瓶中的胶体金溶液的最大OD值，并测定所述最大OD值所对应的特征波长值；测定结果为：A瓶特征波长值为524nm；B瓶特征波长值为534nm；C瓶特征波长值为540nm；D瓶特征波长值为545nm；E瓶特征波长值为560nm。将所述5批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，故将A瓶、B瓶中的胶体金溶液混合成一瓶共2000ml的溶液，标识其为G瓶，即得到所述待用胶体金溶液。

(2)查阅供应商提供的抗人IgG抗体的等电点pI，并用1.0M氢氧化钾溶液调接步骤(1)得到的G瓶中待用胶体金溶液的Ph为7.9，其满足pI+0.4<pH<pI+0.6，然后磁力搅拌混匀10min，获得标准胶体金溶液。

(3)向步骤(2)得到的标准胶体金溶液中添加Brij-35，搅拌混匀15min；后添加待标记抗人IgG抗体的溶液，快速磁力搅拌混匀5min，然后缓慢磁力搅拌混匀55min；再添加胎牛血清，快速磁力搅拌混匀5min，然后缓慢磁力搅拌混匀55min；其中，按质量分数计，包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液包含Brij-35 0.1％；待标记抗人IgG抗体的溶液的质量与所述包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液的体积的比例为100ug:1ml；胎牛血清的质量与包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液的体积的比例为50mg:1ml。

(4)将步骤(3)得到的包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液2000ml分装成5个试管400ml，将这5个试管分别在转速为11000rpm下离心90min，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶至800ml，超声分散5min，然后再涡旋混匀，得到所述金标复合物溶液，于温度为2～8℃下保存备用；

其中，胶体金复溶液为含有Brij-35的磷酸盐缓冲液，胶体金复溶液还可以包含胎牛血清。

(5)筛选步骤(4)得到的金标复合物溶液的最佳稀释倍数：将步骤(4)得到的金标复合物溶液1000ul分装到5个试管，每个试管200ul，编号为a、b、c、d、e管；a管中用胶体金复溶液稀释至1000ul，b管用胶体金复溶液稀释至1200ul，c管用胶体金复溶液稀释至1400ul，d管用胶体金复溶液稀释至1600ul，e管用胶体金复溶液稀释至1800ul；每个试管中均取1ml胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备5个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成5个检测用试剂盒；将5个试剂盒用于测试待测质控品，根据5测试结果，可以看出c管中的胶体金复溶液稀释液制备得到的检测用试剂盒的反应灵敏度满足技术要求，故确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数为将金标复合物溶液用胶体金复溶液稀释7倍。

(6)按照步骤(5)得到的最佳稀释倍数为7倍来稀释步骤(4)得到的金标复合物溶液，然后将胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成检测用试剂盒。

实施例3：

在本发明的实施例中，本发明所述胶体金标记方法包括以下步骤：

(1)烧制5批次的胶体金溶液，每批次1000ml，分别标识A、B、C、D、E瓶；用分光光度计分别测试A、B、C、D、E瓶中的胶体金溶液的最大OD值，并测定所述最大OD值所对应的特征波长值；测定结果为：A瓶特征波长值为524nm；B瓶特征波长值为534nm；C瓶特征波长值为540nm；D瓶特征波长值为545nm；E瓶特征波长值为560nm。将所述5批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，故将A瓶、B瓶中的胶体金溶液混合成一瓶共2000ml的溶液，标识其为G瓶，即得到所述待用胶体金溶液。

(2)查阅供应商提供的新冠S重组蛋白的等电点pI，并用0.5M氢氧化钾溶液调接步骤(1)得到的G瓶中待用胶体金溶液的Ph为7.7，其满足pI+0.4<pH<pI+0.6，然后磁力搅拌混匀10min，获得标准胶体金溶液。

(3)向步骤(2)得到的标准胶体金溶液中添加PEG20000，搅拌混匀15min；后添加待标记新冠S重组蛋白溶液(包含咪唑、氯化钠和甘油)，快速磁力搅拌混匀5min，然后缓慢磁力搅拌混匀55min；再添加酪蛋白钠盐，快速磁力搅拌混匀5min，然后缓慢磁力搅拌混匀55min；其中，按质量分数计，包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液包含PEG200000.1％；待标记新冠S重组蛋白的质量与所述包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液的体积的比例为100ug:1ml；酪蛋白钠盐的质量与包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液的体积的比例为50mg:1ml。

(4)将步骤(3)得到的包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液2000ml分装成5个试管400ml，将这5个试管分别在转速为11000rpm下离心60min，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶至800ml，超声分散5min，然后再涡旋混匀，得到所述金标复合物溶液，于温度为2～8℃下保存备用；

其中，胶体金复溶液为含有PEG20000的磷酸盐缓冲液，胶体金复溶液还可以包含酪蛋白钠盐和明胶。

(5)筛选步骤(4)得到的金标复合物溶液的最佳稀释倍数：将步骤(4)得到的金标复合物溶液1000ul分装到5个试管，每个试管200ul，编号为a、b、c、d、e管；a管中用胶体金复溶液稀释至1000ul，b管用胶体金复溶液稀释至1200ul，c管用胶体金复溶液稀释至1400ul，d管用胶体金复溶液稀释至1600ul，e管用胶体金复溶液稀释至1800ul；每个试管中均取1ml胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备5个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成5个检测用试剂盒；将5个试剂盒用于测试待测质控品，根据5个测试结果，可以看出a管中的胶体金复溶液稀释液制备得到的检测用试剂盒的反应灵敏度满足技术要求，故确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数为将金标复合物溶液用胶体金复溶液稀释5倍。

(6)按照步骤(5)得到的最佳稀释倍数为5倍来稀释步骤(4)得到的金标复合物溶液，然后将胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成检测用试剂盒。

对比例1：

现有技术中胶体金标记方法包括以下步骤：

(1)烧制5批次的胶体金溶液，每批次1000ml，分别标识A、B、C、D、E瓶；

(2)取A瓶，并取5个1.5mL离心管，分为第1、2、3、4和5组，各组中装1mL的A瓶胶体金溶液；各组按照顺序依次加入5uL、7uL、9uL、11uL、13uL 0.05M碳酸钾溶液，涡旋混匀10min。

(3)各组中依次加入待标记的抗人IgG抗体，加入量为10ug/mL胶体金溶液，加入后快速涡旋混匀3分钟，然后静置观察胶体金溶液颜色变化。静置10分钟，碳酸钾加入量为7ul/ml、9ul/ml、11ul/ml、13ul/ml的第2、3、4和5组中的胶体金溶液略微变红变紫一点，溶液没有出现沉淀等；而碳酸钾加入量为5ul/ml的第1组胶体金出现沉淀，即标记失败；取此四组(分别编号为第2、3、4、5组)进入后续步骤操作。

(4)快速加入封闭剂10％BSA溶液，加入量为10uL/mL胶体金溶液；快速磁力搅拌混匀3分钟，然后慢速磁力搅拌混匀反应10分钟，得到包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液。

(5)包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液在转速为10000rpm下离心80min，后观察第5组严重贴壁，即由于标记参数主要是碳酸钾用量不合适，导致标记失败，其余第2、3、4组正常；将第2、3、4组弃去上清液，取沉淀物；将沉淀物用胶体金复溶溶液复溶，涡旋混匀后超声分散3分钟，然后再涡旋混匀，得到金标复合物溶液放置2-8℃备用。

(6)取100uL复溶后的第2、3、4组金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释至1400uL。

(7)将第2、3、4组分别取1mL出来各自均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备3个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成3个检测用试剂盒。

(8)测试质控品，分析第2、3、4组的检测灵敏度，结果得出第3组试剂盒及灵敏度最好，即确定胶体金标记中的最佳参数为碳酸钾加入量为9ul/ml，待标记的抗人IgG抗体加入量为10ug/ml胶体金溶液。

(9)依次按照步骤(2)～(8)分别标记B、C、D、E瓶胶体金。结果B、C、D、E组中胶体金标记中的最佳参数分别为碳酸钾加入量为7ul/ml、9ul/ml、5ul/ml、11ul/ml；待标记的抗人IgG抗体的加入量为10ug/ml。灵敏度各组略有差异。

(10)将A、B、C、D、E各瓶按胶体金标记中的最佳参数制备成胶体金复合物，将五瓶的胶体金复合物混合搅拌混匀。

(11)取1000uL步骤(10)得到的复金标复合物溶液分成5支，每支200uL，编号为A1、B1、C1、D1、E1管；A1管用胶体金复溶液稀释至1000uL，B1管用胶体金复溶液稀释至1200uL，C1管用胶体金复溶液稀释至1400uL，D1管用胶体金复溶液稀释至1600mL，E1管用胶体金复溶液稀释至1800uL。

(12)将步骤(11)稀释得到的胶体金复合物溶液稀释溶液各自均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备5个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成5个检测用试剂盒，用于测试待测质控品，根据5个测试结果，可以看出B1管中的胶体金复溶液稀释液制备得到的检测用试剂盒的反应灵敏度满足技术要求。

对比例2：

现有技术中胶体金标记方法包括以下步骤：

(1)将待标记新冠S重组蛋白(包含咪唑、氯化钠和甘油)用0.01M PB ph 7.4的缓冲液透析4次，每次透析6小时，累计透析24小时；

(2)6支1.5mL离心管，分为第6、7、8、9、10和11组，每组装1mL胶体金，各组按照顺序依次加入3uL、5uL、7uL、9uL、11uL和13uL 0.1M碳酸钾溶液，涡旋混匀10min。

(3)各组中依次加入待标记新冠S重组蛋白，加入量为10ug/mL胶体金溶液，加入后快速涡旋混匀3分钟，然后静置观察胶体金溶液颜色变化。静置10分钟，碳酸钾加入量为5uL、7uL、9uL、11uL的第7、8、9和10组中的胶体金溶液略微变红变紫一点，溶液没有出现沉淀等；而碳酸钾加入量为3ul/ml的第1组胶体金出现沉淀，即标记失败；取此五组(分别编号为第7、8、9、10和11组)进入后续步骤操作。

(4)快速加入封闭剂10％BSA溶液，加入量为10uL/mL胶体金溶液；快速磁力搅拌混匀3分钟，然后慢速磁力搅拌混匀反应10分钟，得到包含有待标记抗人IgG抗体的胶体金溶液。

(5)包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液在转速为10000rpm下离心80min，后观察第11组严重贴壁，即由于标记参数主要是碳酸钾用量不合适，导致标记失败，其余第7、8、9和10组正常；将第7、8、9和10组弃去上清液，取沉淀物；将沉淀物用胶体金复溶溶液复溶，涡旋混匀后超声分散3分钟，然后再涡旋混匀，得到金标复合物溶液放置2-8℃备用。

(6)取100uL复溶后的第7、8、9和10组金标复合物溶液分别用胶体金复溶液稀释至1400uL。

(7)将第7、8、9和10组分别取1mL出来各自均匀喷涂在一根7mm*300mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备3个成金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸等组件，制备成4个检测用试剂盒。

(8)测试质控品，分析第7、8、9和10组的检测灵敏度。

检测上述实施例1～2以及对比例1的检测灵敏度，结果如表1所示：

表1：实施例1～2以及对比例1的检测灵敏度

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备注：“－”表示未出现检测线；“+/-”表示出现模糊不清检测线；“+”表示出现清晰的检测线。“++”表示出现比“+”清晰但比“+++”弱的检测线。“+++”表示出现很清晰的检测线。

从表1可以看出，本发明的一些实施例提供的的胶体金标记方法，所制备得到的检测用试剂盒的检测灵敏度比现有技术中常规的胶体金标记方法所制备得到的检测用试剂盒的检测灵敏度显著偏高。其中，由于现有技术中常规的胶体金标记方法需要分别对数瓶胶体金逐个进行调试标记并制备成胶体金复合物，然后再混匀得到胶体金复合混合物；由于数瓶胶体金的差异，可能导致部分瓶的胶体金复合混合物的反应强度偏弱，从而导致混匀后的胶体金复合混合物的整体免疫反应强度偏低，因此所制备的检测用试剂盒的检测灵敏度偏低。还可以看出，现有技术中常规的胶体金标记方法所采用标记步骤是本发明的一些实施例提供的的胶体金标记方法所采用标记步骤的工作量的至少2倍以上。由此，本发明的一些实施例提供的的胶体金标记方法可以显著改善胶体金标记的生产工艺步骤，显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，显著地降低了调试胶体金标记参数的摸索次数，并降低了生产胶体金试剂盒的成本金和工作量。

检测上述实施例3以及对比例2的检测灵敏度，结果如表2所示：

表2：实施例3以及对比例1的检测灵敏度

备注：“－”表示未出现检测线；“+/-”表示出现模糊不清检测线；“+”表示出现清晰的检测线。“++”表示出现比“+”清晰但比“+++”弱的检测线。“+++”表示出现很清晰的检测线。

从表2可以看出，由于新冠S重组蛋白中含有咪唑、氯化钠及甘油等成分，导致常规标记失败，因而新冠S重组蛋白通常需经过透析。但是，透析过程中新冠S重组蛋白处于非原始溶液状态，从而新冠S重组蛋白的活性及稳定性会受到显著影响，导致透析后的新冠S重组蛋白经胶体金标记后所制备得到的检测用试剂盒的检测灵敏度显著下降。而本发明的一些实施例提供的胶体金标记方法，所得到的金标复合物溶液在放置60分钟依旧稳定没有出现显著变色及沉淀等现象，即显示出较好的稳定性。此外，本发明的一些实施例提供的胶体金标记方法能够直接标记未经透析的新冠S重组蛋白，所制备得到的试剂盒在检测阳性样本的时候，其检测灵敏度比通过现有技术中常规的胶体金标记方法标记透析后的新冠S重组蛋白而制备的试剂盒的灵敏度显著偏高。因此，本发明的一些实施例提供的胶体金标记方法显著简化了胶体金标记的工艺步骤，并显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，显著地降低了调试胶体金标记参数的摸索次数，并减少了生产胶体金试剂盒的成本和工作量。

此外，通过上述本发明实施例和对比例之间的对比，可以看出，本发明在胶体金标记的过程中引入了特定种类的表面活性剂；基于这些表面活性剂的分散性，能够显著提高胶体金溶液的稳定性，并有效降低胶体金溶液的胶粒与待标记蛋白或待标记抗体的碰撞吸附强度和碰撞吸附速度，从而提高了胶体金溶液在标记过程中的稳定性；这些表面活性剂降低了在标记过程中胶体金溶液对待标记蛋白或待标记抗体的强烈吸附所产生的蛋白构象改变程度，减缓了蛋白变性影响，并降低了由于标记产生的蛋白非特异性反应的强度及概率；同时，本发明提供的胶体金标记方法无需使用蛋白保护剂(现有技术中通常添加蛋白保护剂)，避免了蛋白保护剂对胶体金溶液的破坏作用，从而在整体上提高了胶体金标记的成功概率，并显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量。

进一步而言，通过上述本发明实施例和对比例之间的对比，可以看出，在常规的胶体金标记过程中，单批次烧制胶体金溶液的体积不易过大，以避免胶体金溶液的受热不均匀等因素导致胶体金的粒径不够均一。从本申请对比例可以看出，常规的做法是对每一次烧制的每瓶胶体金溶液进行胶体金标记待标记蛋白或待标记抗体的最适pH的参数摸索，然后再摸索待标记蛋白或待标记抗体的添加量参数，随后摸索金标复合物溶液的最佳稀释倍数。这种情况下，如果单批次生产制备金标复合物溶液所需胶体金溶液的体积远大于单次烧制胶体金溶液的体积，则需要多次摸索各瓶胶体金溶液的标记参数(即：胶体金标记待标记蛋白或待标记抗体的最适pH、待标记蛋白或待标记抗体的添加量、金标复合物溶液的最佳稀释倍数)，然后制备成相应的金垫，再验证混匀后的金标复合物溶液稀释液的性能是否满足胶体金标记标准。而本发明在胶体金标记的过程中：(1)调节所述待用胶体金溶液的pH值满足pI+0.4<pH<pI+0.6；(2)采用特定方法来制备所述待用胶体金溶液，从而可有效地保障所得到的胶体金溶液中胶体金颗粒的粒径均一性；(3)采用简便而高效地方法筛选所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数；(4)在胶体金标记的过程中引入了特定种类的表面活性剂；从而在整体上提高了胶体金标记的成功概率，节省了标记步骤工作量的至少2倍以上，显著简化了胶体金标记的工艺步骤，显著提高了单次生产胶体金试剂盒的产量，显著地降低了调试胶体金标记参数的摸索次数，并降低了生产胶体金试剂盒的成本金和工作量。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种胶体金标记方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）烧制5批次的胶体金溶液，每批次1000 ml，分别标识A、B、C、D、E瓶；用分光光度计分别测试A、B、C、D、E瓶中的胶体金溶液的最大OD值，并测定所述最大OD值所对应的特征波长值；测定结果为：A瓶特征波长值为524 nm；B瓶特征波长值为534 nm；C瓶特征波长值为540nm；D瓶特征波长值为545 nm；E瓶特征波长值为560 nm，将所述5批次中的特征波长值相近的所述胶体金溶液合并，故将A瓶、B瓶中的胶体金溶液混合成一瓶共2000 ml的溶液，标识其为G瓶，即得到待用胶体金溶液；

（2）查阅供应商提供的新冠S重组蛋白的等电点pI，并用0.5 M氢氧化钾溶液调接步骤（1）得到的G瓶中待用胶体金溶液的Ph为7.7，其满足pI+0.4 < pH < pI+0.6，然后磁力搅拌混匀10 min，获得标准胶体金溶液；

（3）向步骤（2）得到的标准胶体金溶液中添加PEG20000，搅拌混匀15 min；后添加包含咪唑、氯化钠和甘油的待标记新冠S重组蛋白溶液，快速磁力搅拌混匀5 min，然后缓慢磁力搅拌混匀55 min；再添加酪蛋白钠盐，快速磁力搅拌混匀5 min，然后缓慢磁力搅拌混匀55min；其中，按质量分数计，包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液包含PEG20000 0.1%；待标记新冠S重组蛋白的质量与所述包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液的体积的比例为100 ug : 1 ml；酪蛋白钠盐的质量与包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液的体积的比例为50 mg : 1 ml；

（4）将步骤（3）得到的包含有待标记新冠S重组蛋白的胶体金溶液2000 ml分装成5个试管400 ml，将这5个试管分别在转速为11000 rpm下离心60 min，弃去上清液，取沉淀物；将所述沉淀物经胶体金复溶液复溶至800 ml，超声分散5 min，然后再涡旋混匀，得到金标复合物溶液，于温度为2~8℃下保存备用；

其中，胶体金复溶液为含有PEG20000的磷酸盐缓冲液，胶体金复溶液还包含酪蛋白钠盐和明胶；

（5）筛选步骤（4）得到的金标复合物溶液的最佳稀释倍数：将步骤（4）得到的金标复合物溶液1000μl分装到5个试管，每个试管200μl，编号为a、b、c、d、e管；a管中用胶体金复溶液稀释至1000μl，b管用胶体金复溶液稀释至1200μl，c管用胶体金复溶液稀释至1400μl，d管用胶体金复溶液稀释至1600μl，e管用胶体金复溶液稀释至1800μl；每个试管中均取1 ml胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7 mm*300 mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备成5个金垫；然后配对制备NC膜、样品垫、吸水纸组件，制备成5个检测用试剂盒；将5个试剂盒用于测试待测质控品，根据5个测试结果，看出a管中的胶体金复溶液稀释液制备得到的检测用试剂盒的反应灵敏度满足技术要求，故确定所述金标复合物溶液的最佳稀释倍数为将金标复合物溶液用胶体金复溶液稀释5倍；

（6）按照步骤（5）得到的最佳稀释倍数为5倍来稀释步骤（4）得到的金标复合物溶液，然后将胶体金复溶液稀释液均匀喷涂在一根7 mm*300 mm尺寸的玻璃纤维垫上，在45℃下烘干2小时，制备成金垫。

2.采用权利要求1所述的胶体金标记方法制备得到的检测用试剂盒。