CN115754286A

CN115754286A - 一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条

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Publication number: CN115754286A
Application number: CN202211250570.7A
Authority: CN
Inventors: 江湖; 熊勇华; 李响敏; 聂丽娟; 赖卫华; 吴雨豪
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，用于同时快速半定量检测玉米中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B₁。五种真菌毒素的检测抗原分别喷涂固定在NC膜上，作为五条检测线；聚多巴胺黑金纳米粒子分别标记五种真菌毒素的单克隆抗体，作为五条检测线的信号探针。鼠抗兔IgG单克隆抗体与兔IgG作为比色线体系，其中鼠抗兔IgG单克隆抗体喷涂固定在试纸条NC膜上作为比色线，聚多巴胺黑金纳米粒子标记兔IgG作为比色线探针。在检测时通过裸眼观察各条检测线与比色线的黑色深浅，进行比色半定量分析。当某条检测线条带较比色线颜色浅时，说明该真菌毒素含量大于国家标准规定的限量要求。

Description

一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条

技术领域

本发明涉及快速检测技术领域，具体涉及一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条。

背景技术

我国是粮食生产和消费大国，加强粮食的质量控制意义重大。农作物在种植、采收、加工、运输和储藏过程中，容易被真菌污染，在温湿度适宜的条件下，某些真菌的产毒菌株会产生一类小分子次级代谢产物，即真菌毒素，给人类带来严重的健康风险。以玉米为例，玉米是世界主要粮食作物之一，是糖、淀粉、油和蒸馏酒的重要原料。玉米在生长、收获、贮藏和运输过程中易受多种真菌侵染，继而产生多种真菌毒素。近年来，多项研究报道指出多种真菌毒素通过累加效应和协同效应对人体健康造成的危害远大于单一真菌毒素。由于玉米中多种真菌毒素同时污染的情况较为严重，许多国家和地区对玉米中多种真菌毒素的最高水平进行了限制，例如欧盟制定的待加工玉米的限量标准为黄曲霉毒素B₁(AFB₁)5μg/kg，赭曲霉毒素A(OTA)5μg/kg，玉米赤霉烯酮(ZEN)200μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)1750μg/kg和伏马菌素(FB₁和FB₂)2000μg/kg；我国GB2761-2017中对玉米中真菌毒素的限量要求为AFB₁20μg/kg，OTA5μg/kg，ZEN 60μg/kg，DON 1000μg/kg。此外，由于伏马菌素的毒性及在玉米中污染的严重性，2019年食品安全国家标准真菌毒素限量征求意见稿中增加了伏马菌素(FB₁，FB₂和FB₃)在玉米中的限量要求——4000μg/kg。因此，对玉米中多种真菌毒素进行检测非常重要，开发同时检测玉米中多种真菌毒素的方法将提高检测效率，减少检测时间、材料和成本，并且更加环保。目前已经开发了许多同时检测多种真菌毒素的分析方法，包含酶联免疫吸附测定法(ELISA)、薄层色谱法(TLC)以及与紫外、荧光或质谱检测器结合使用的高效液相色谱法(HPLC)等。然而，上述方法操作步骤多，设备昂贵，且需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。

免疫层析方法因具有操作简便、快速、抗基质干扰能力强、价格低廉、无需专业设备及专业技术人员操作等优点，是现场快速筛查的常用方法。免疫层析方法针对真菌毒素等小分子待检物的分析，通常为竞争反应模式。即检测线上固定的检测抗原与待检物共同竞争信号物质上标记的抗体，检测信号强度与待检物含量成反比关系。定性或半定量分析通常以检测线上“信号消失”作为判读标准，当待检物数量较多时才能使信号物质上标记的抗体处于饱和结合状态而不被检测线上的检测抗原“捕获”，实现检测线上的“信号消失”。因此，检测小分子的竞争免疫层析方法的定性或半定量分析灵敏度不高。

玉米基质成分复杂，其中脂类、色素、蛋白质及糖类等成分对免疫学反应的影响较大，需要对样本提取液进行多倍稀释才能进行免疫层析检测。这对检测方法的灵敏度提出了更高的要求。

发明内容

针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，制备聚多巴胺黑金纳米粒子作为多重免疫层析检测的信号物质，构建比色线体系，通过比色进行半定量，实现玉米中AFB₁、OTA、ZEN、DON和FB₁五种真菌毒素快速裸眼检测。

本发明采用的技术方案是：

一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，所述试纸条包括滤纸、样本垫、结合释放垫、NC膜和吸水纸等五部分；其中，结合释放垫上承载黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B₁等五种真菌毒素的单克隆抗体与聚多巴胺黑金形成的五种检测探针，以及兔IgG与聚多巴胺黑金形成的比色线探针；NC膜上分别喷涂固定五种真菌毒素的检测抗原作为五条检测线，喷涂固定鼠抗兔IgG单克隆抗体作为比色线；试纸条装入带有加样孔和观测窗口的塑料卡壳中，与干燥剂一起密封保存。

聚多巴胺黑金纳米粒子的摩尔消光能力高于常规使用的红色胶体金及蓝紫色多枝状金纳米粒子，即相同数量的三种纳米粒子，聚多巴胺黑金纳米粒子具有最强的信号，有利于提高检测灵敏度。此外，黑色和白色是视觉反差最大的颜色，聚多巴胺黑金具有裸眼易于识别深浅的黑色，在以白色为背景的试纸条上是理想的比色信号物质。

进一步的，所述试纸条是基于黑色和白色是视觉反差最大的颜色，选择新型高摩尔消光能力的聚多巴胺黑金纳米材料，在白色背景的免疫层析试纸条上显示黑色条带，提高比色检测的灵敏度，无需仪器，仅通过裸眼观察即可实现玉米样品中多种真菌毒素是否达标的快速检测。

进一步的，所述试纸条是通过筛选得到与五种真菌毒素的检测抗原及单克隆抗体无非特异性吸附的“兔IgG和鼠抗兔IgG单克隆抗体”作为比色线体系，为多种真菌毒素的同时检测提供比色标尺，实现多种真菌毒素的同时比色半定量。

进一步的，所述试纸条使用方法为：玉米样品经粉碎、提取液提取、稀释后，取80μL加入试纸条加样孔，10分钟后，观察检测线和比色线条带，根据各检测线的条带与比色线的黑色深浅程度判断是否有真菌毒素超过国家标准限量要求；在玉米样品中真菌毒素不超标的情况下，各检测线条带与比色线的黑色一致或者更深；当有某种真菌毒素超过国家标准限量要求时，该真菌毒素的检测线黑色浅于比色线。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明选用黑色探针，在白色背景的免疫层析试纸条上形成黑色检测信号，并构建独立的比色线体系，通过检测线条带与比色线条带的深浅比较，实现无需完全阻断检测线信号即可进行半定量判读，即检测线信号无需消失，只要条带的黑色浅于比色线即可判定对应待测物的含量超过某个数值。通过筛选得到与五种真菌毒素检测抗原及单克隆抗体无非特异性吸附的“兔IgG和鼠抗兔IgG单克隆抗体”作为比色线体系，为多种真菌毒素的同时检测提供比色标尺，实现免疫层析试纸条上多种小分子真菌毒素同时、快速、高灵敏的半定量检测。

附图说明

图1为本发明试纸条比色示意图。

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所涉及的五种真菌毒素的检测抗原(真菌毒素-BSA)及单克隆抗体均由本课题组制备；兔IgG与鼠抗兔IgG单克隆抗体购于北京索莱宝科技有限公司；五种真菌毒素标准物质来自山东美正科技有限公司；氯金酸、BSA、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、酪蛋白等试剂来自Sigma公司；多巴胺盐酸盐来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；试纸条相关原材料包括NC膜(型号CN95)、样本垫、结合释放垫、滤纸、吸水纸、粘性卡板及塑料卡壳等来自无锡中德伯尔生物技术有限公司。

实施例1

(1)聚多巴胺黑金纳米粒子制备

在1L体系中调整三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度至10mM，加入50mL浓度为4mg/mL的盐酸多巴胺，室温搅拌至溶液颜色变微黄，持续搅拌下加入100mL浓度为0.1％的氯金酸，反应8至12小时，至溶液变为黑色，12,000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀复溶于100mL水中，待用。

(2)聚多巴胺黑金探针制备

取六份上述制备的聚多巴胺黑金溶液，每份10mL，分别加入0.5mL含抗AFB₁、抗OTA、抗ZEN、抗DON和抗FB₁等五种真菌毒素鼠单克隆抗体以及兔IgG的0.1M硼酸溶液(1MNaOH调pH值至7.0)，室温缓慢搅拌1小时，使五种鼠单克隆抗体及兔IgG与聚多巴胺黑金通过静电吸附方式结合；每份加入3％的酪蛋白溶液10.5mL，室温缓慢搅拌1小时，封闭聚多巴胺黑金表面基团；10,000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀复溶于10mL含有1.5％酪蛋白和0.03％NaN₃的溶液中，4℃保存待用。

国家标准(征求意见稿)对玉米中伏马菌素B₁、B₂和B₃的总量限制，三种伏马菌素为结构类似物，自然条件污染以伏马菌素B₁最为常见，因此本发明选择特异性识别伏马菌素核心结构的单克隆抗体，即与FB₂和FB₃交叉反应率大于85％的抗FB₁的鼠单克隆抗体，由其制备的聚多巴胺黑金探针可以同时有效地捕获FB₁、FB₂和FB₃，以满足国家标准对三种伏马菌素总量的限量要求。

(3)免疫层析试纸条的组装

试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成。

样品垫用50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.03％的叠氮钠)浸润处理，真空干燥。

结合释放垫用10mM pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水(包含0.2％吐温-20和2％BSA)浸润、干燥处理后，将五种真菌毒素检测探针和一种比色探针——即六种聚多巴胺黑金探针混合物以25μL/cm喷涂在结合释放垫上，置于37℃的真空干燥箱中干燥6小时，室温干燥条件保存待用。

NC膜上依次喷涂鼠抗兔IgG单克隆抗体、FB₁检测抗原、DON检测抗原、ZEN检测抗原、OTA检测抗原及AFB₁检测抗原，形成一条比色线及五条检测线；检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，偶联摩尔比为15∶1，喷涂浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL，喷涂量0.75μL/cm；鼠抗兔IgG单克隆抗体喷涂浓度为2mg/mL，喷涂量1.05μL/cm；喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6小时。

商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。

将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分交叠固定在粘性卡板上。组合后，切割成宽度4mm每条，装入试纸条卡壳中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存。试纸条卡壳内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置设有加样孔，在NC膜检测线和比色线区域设有观测口，在观测口的一边按照比色线和五种真菌毒素检测线所在位置印有指示标识。

(4)试纸条使用

称取5.0g粉碎的玉米，置于50mL离心管中，加入25mL甲醇-水溶液(60∶40，v/v)，置于小型旋转振荡器上，振荡提取5分钟后，静置1分钟，吸取0.5mL上清液，加入9.5mL蒸馏水中，混匀，取80μL加入试纸条加样孔，10分钟后观察各条带颜色，如果某条检测线黑色较比色线浅，说明该检测线对应的真菌毒素超过国家标准限量要求。

实施例2

(1)聚多巴胺黑金纳米粒子制备

在36mL体系中调整三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度至10mM，加入1.8mL浓度为4mg/mL的盐酸多巴胺，室温搅拌至溶液颜色变微黄，持续搅拌下加入3.6mL浓度为0.1％的氯金酸，反应8小时，此时溶液变为黑色。12,000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀复溶于3.6mL水中，得到的聚多巴胺黑金纳米粒子粒径为112±5.7nm。

(2)聚多巴胺黑金探针制备

取六份聚多巴胺黑金溶液，每份0.2mL，加入带有磁转子的5mL玻璃容量瓶中，置于磁力搅拌器上，再加入0.8mL超纯水，缓慢搅拌均匀；另准备5μg抗AFB₁单克隆抗体、4.6μg抗OTA单克隆抗体、7.5μg抗ZEN单克隆抗体、12μg抗DON单克隆抗体、12.5μg抗FB₁单克隆抗体和4.5μg兔IgG，分别用0.1mL的硼酸溶液(0.1M，pH值用NaOH调至7.0)稀释，然后于低速搅拌下分别缓慢加入六个容量瓶中，室温缓慢搅拌1小时；每份加入3％的酪蛋白溶液1.1mL，室温缓慢搅拌1小时；10,000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀复溶于0.2mL含有1.5％酪蛋白和0.03％NaN₃的溶液中，4℃保存待用。

(3)结合释放垫的前处理

结合释放垫用10mM pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水(包含0.2％吐温-20和2％BSA)浸润、37℃真空干燥6小时，五种真菌毒素抗体聚多巴胺黑金探针与兔IgG聚多巴胺黑金探针按1∶1∶1∶1∶1∶0.5的比例混合后，以25μL/cm喷涂在结合释放垫上，37℃真空干燥6小时，置于常温干燥柜中保存待用。

(4)NC膜的前处理

NC膜上依次喷涂鼠抗兔IgG单克隆抗体、FB₁检测抗原、DON检测抗原、ZEN检测抗原、OTA检测抗原及AFB₁检测抗原，形成一条比色线及五条检测线。鼠抗兔IgG单克隆抗体喷涂浓度为2mg/mL，喷涂量1.05μL/cm；检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，偶联摩尔比为15∶1(真菌毒素∶BSA)，喷涂浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL，喷涂量0.75μL/cm；喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6小时。

(5)免疫层析试纸条的组装

样品垫用50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.03％的叠氮钠)浸润处理，真空干燥，常温干燥柜中保存待用。

滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。

将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分交叠固定在粘性卡板上。组合后，切割成宽度4mm每条，装入试纸条卡壳中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存。试纸条卡壳内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置设有加样孔，在NC膜检测线和比色线区域设有观测口，观测窗口右侧标识各条检测线及比色线位置。

(6)玉米样本前处理

取一量杯待测玉米(或玉米面，玉米渣)样本(约50g左右)，经小型高速捣碎均质机打成粉末，称取5.0g置于50mL离心管中，加入25mL甲醇-水溶液(60∶40，v/v)，置于小型旋转振荡器上，振荡提取5分钟，静置1分钟，吸取0.5mL上清液，加入9.5mL蒸馏水中，混匀，取80μL加入试纸条加样孔，10分钟后观察各条带颜色，如果某条检测线黑色较比色线浅，说明该检测线对应的真菌毒素超过国家标准限量要求，如果检测线黑色条带和比色线一样或更深，则对应的真菌毒素含量符合国家标准限量要求。

图1为本发明试纸条比色示意图，待测样品溶液从加样孔加入，经滤纸、样本垫，进入结合释放垫，此时聚多巴胺黑金探针被释放出来，在吸水纸毛细作用下随样本溶液进入NC膜，自左向右流动。到达比色线时，兔IgG探针与比色线上鼠抗兔IgG单克隆抗体结合，使比色线显示灰黑色条带(图中比色线)。当玉米样本中没有真菌毒素存在时，真菌毒素的单克隆抗体-聚多巴胺黑金探针流动到对应检测线上，与检测抗原结合，形成黑色条带(图中DON，OTA和AFB₁)。当玉米样本中含有某种真菌毒素，且含量接近或等于国家标准限量要求，该真菌毒素的单克隆抗体-聚多巴胺黑金探针与样本溶液中的真菌毒素优先接触并结合，剩余探针与对应检测线上的检测抗原结合，形成与比色线相似的灰色条带(图中FB₁)。当玉米样本中含有浓度超过国家标准限量的真菌毒素时，大部分的真菌毒素单克隆抗体-聚多巴胺黑金探针与样本溶液中的真菌毒素结合，剩余小部分的探针与对应检测线上的检测抗原结合，形成浅灰色条带(图中ZEN)。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条包括滤纸、样本垫、结合释放垫、NC膜和吸水纸五部分；其中，结合释放垫上承载黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B₁五种真菌毒素的单克隆抗体与聚多巴胺黑金形成的五种检测探针，以及兔IgG与聚多巴胺黑金形成的比色线探针；NC膜上分别喷涂固定五种真菌毒素的检测抗原作为五条检测线，喷涂固定鼠抗兔IgG单克隆抗体作为比色线；试纸条装入带有加样孔和观测窗口的塑料卡壳中，与干燥剂一起密封保存。

2.根据权利要求1所述的基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条选择新型高摩尔消光能力的聚多巴胺黑金纳米材料，在白色背景的免疫层析试纸条上显示黑色条带。

3.根据权利要求1所述的基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条是通过筛选得到与五种真菌毒素的检测抗原及单克隆抗体无非特异性吸附的“兔IgG和鼠抗兔IgG单克隆抗体”作为比色线体系，为多种真菌毒素的同时检测提供比色标尺，实现多种真菌毒素的同时比色半定量。

4.根据权利要求2所述的基于比色线半定量的多重检测免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条使用方法为：玉米样品经粉碎、提取液提取、稀释后，取80μL加入试纸条加样孔，10分钟后，观察检测线和比色线条带，根据各检测线的条带与比色线的黑色深浅程度判断是否有真菌毒素超过国家标准限量要求；在玉米样品中真菌毒素不超标的情况下，各检测线条带与比色线的黑色一致或者更深；当有某种真菌毒素超过国家标准限量要求时，该真菌毒素的检测线黑色浅于比色线。