CN114487385A - 甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠以及包含标记物的凝集素；其中，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种。本发明技术方案有效消除了抗体Fc片段糖基化造成的干扰，能够防止出现假阳性，实现快速、灵敏地检测AFP‑L3。

Description

甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用。
背景技术
甲胎蛋白(AFP)是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。但是早期肝癌AFP的检出率只有30％-40％，而且在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现AFP升高。其较低的特异性，对AFP轻度升高的肝癌和慢性肝病的鉴别诊断造成较大困难。
AFP是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA)的亲和力从低到高依次分为AFP-L1、AFP-L2和甲胎蛋白异质体(AFP-L3)。AFP-L1主要见于良性肝病，AFP-L2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而AFP-L3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。甲胎蛋白异质体对肝癌是高特异性的指标，特异性可达到95％以上，也是诊断肝癌特异性最强的肿瘤标记物。美国食品与药品监督管理局(FDA)已于2005年批准甲胎蛋白异质体检测试剂和方法用于临床肝癌预警。
目前，用于甲胎蛋白异质体的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、免疫电泳法、亲和离心柱法、化学发光法等。植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法等方法操作繁琐，耗时，步骤复杂，对操作人员素质要求高，无法实现高通量检测。亲和吸附离心管法同样采用手工操作，步骤繁琐，无法实现自动化，对配套试剂及设备要求多，且需要结合其他AFP检测试剂进行测定。日本和光μTASWako i30检测系统采用荧光电泳的方法，一次进样即可得出甲胎蛋白异质体百分比的结果，但是该方法系统复杂，试剂昂贵，临床使用成本高。化学发光法中，热景生物在其CN201510002936.3的专利申请中公开了一种可实现甲胎蛋白异质体的自动化检测的双磁珠系统，该双磁珠系统由分离磁珠和检测磁珠构成，其中分离磁珠利用LCA和甲胎蛋白异质体的亲和力从样本中分离出甲胎蛋白异质体，检测系统则采用常规的双抗夹心的方法检测分离磁珠所分离的甲胎蛋白异质体。这种方法由于分离步骤的引入，且甲胎蛋白异质体分离步骤需要在37℃孵育20min，并进行清洗和洗脱，检测所需时间较长，且多一次分离环节，不利于提高整个检测的精密度。此外，目前市面上，还有其他基于抗体和LCA夹心法的检测试剂盒，但这些试剂盒在进行检测时普遍易产生假阳性的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用，旨在解决现有的基于抗体和LCA夹心法的检测方法存在的假阳性问题。
为实现上述目的，本发明提出一种甲胎蛋白异质体检测组合物，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠以及包含标记物的凝集素；
其中，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种。
可选地，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及甲苯磺酰基磁珠中的任意一种。
可选地，所述标记物包括吖啶酯。
可选地，所述凝集素包括小扁豆凝集素。
可选地，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有F(ab’)2片段的羧基磁珠以及吖啶酯标记的小扁豆凝集素。
本发明进一步提出一种甲胎蛋白异质体检测试剂盒，所述甲胎蛋白异质体检测试剂盒包括如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物。
此外，本发明还提出一种如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法，所述甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法包括以下步骤：
获取甲胎蛋白抗体物质；
将所述甲胎蛋白抗体物质包被到磁珠表面，得到包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠；
将凝集素和标记物混合，反应得到包含标记物的凝集素。
可选地，获取甲胎蛋白抗体物质的步骤包括：
采用F(ab’)2制备试剂盒对鼠抗人甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab’)2片段。
可选地，将所述甲胎蛋白抗体物质包被到磁珠表面，得到包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠的步骤包括：
采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式，按每毫克磁珠投料8～12μgF(ab’)2片段的比例，将F(ab’)2片段包被到羧基磁珠的表面。
此外，本发明还提出一种如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物、如上文所述的甲胎蛋白异质体检测试剂盒以及如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法制得的甲胎蛋白异质体检测组合物在检测甲胎蛋白异质体中的应用。
本发明技术方案中，采用包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种，这几种抗体片段以及处理后的抗体中均不含有糖基化基团，从而有效消除了抗体Fc片段糖基化造成的干扰，能够防止出现假阳性，实现快速、灵敏地检测AFP-L3。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的甲胎蛋白异质体检测组合物用于AFP-L3检测时的流程示意图；
图2为实施例3中理论浓度与测试浓度的相关性测试图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，用于甲胎蛋白异质体的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、免疫电泳法、亲和离心柱法、化学发光法等。植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法等方法操作繁琐，耗时，步骤复杂，对操作人员素质要求高，无法实现高通量检测。亲和吸附离心管法同样采用手工操作，步骤繁琐，无法实现自动化，对配套试剂及设备要求多，且需要结合其他AFP检测试剂进行测定。日本和光μTASWako i30检测系统采用荧光电泳的方法，一次进样即可得出甲胎蛋白异质体％的结果，但是该方法系统复杂，试剂昂贵，临床使用成本高。化学发光法中，热景生物在其CN201510002936.3的专利申请中公开了一种可实现甲胎蛋白异质体的自动化检测的双磁珠系统，该双磁珠系统由分离磁珠和检测磁珠构成，其中分离磁珠利用LCA和甲胎蛋白异质体的亲和力从样本中分离出甲胎蛋白异质体，检测系统则采用常规的双抗夹心的方法检测分离磁珠所分离的甲胎蛋白异质体。这种方法由于分离步骤的引入，且甲胎蛋白异质体分离步骤需要在37℃孵育20min，并进行清洗和洗脱，检测所需时间较长，且多一次分离环节，不利于提高整个检测的精密度。此外，目前市面上，还有其他基于抗体和LCA夹心法的检测试剂盒，但这些试剂盒在进行检测时普遍存在假阳性的问题。
鉴于此，本发明提出一种甲胎蛋白异质体检测组合物，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠以及包含标记物的凝集素；其中，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种。
目前市面上基于抗体的检测方法中，其采用的抗AFP抗体的Fc片段都是被糖基化修饰的，这些糖基化基团与LCA同样具有高结合性，在进行检测时，难免与LCA结合，从而导致背景异常，这正是导致假阳性，影响检测结果准确性的原因。本发明技术方案中，采用包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种，其中，F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段以及Fv片段这几种抗体片段不含糖基化修饰的Fc片段，去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中不含有糖基化基团，这样一来，自然不会出现糖基化基团与凝集素结合而导致背景异常的问题，从而有效消除了抗体Fc片段糖基化造成的干扰，能够防止出现假阳性，实现快速、灵敏地检测AFP-L3。
如上文所述，甲胎蛋白抗体物质有多种选择，例如F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体，前三种抗体片段均可采用市面上已有的，相应的制备试剂盒获取，去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体则可以通过NaIO4氧化等方法制备，上述提及的制备方法均可参考本领域常规的制备工艺进行，在此不做详述；其中，作为优选实施例，甲胎蛋白抗体物质优选为F(ab’)2片段，一方面，市面上已有F(ab’)2制备试剂盒，使用该试剂盒制备F(ab’)2片段，操作简便，且制备工艺简单，另一方面，相较其他三种抗体片段来说，F(ab’)2片段作为二价抗体片段，与抗原结合更佳，同时，保留相对更加完整的抗体结构，有助于在磁珠封闭时不被BSA等封闭分子覆盖，有助于暴露抗原结合位点。基于该片段制得的甲胎蛋白异质体检测组合物，在用于AFP-L3检测时，灵敏度更高。
磁珠可以有多种选择，例如，羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、链霉亲和素磁珠等，本发明不做限制。具体地，本实施例磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及甲苯磺酰基磁珠中的任意一种，使用包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠可以捕获甲胎蛋白，便于通过进一步清洗，除去样本中其他干扰物质。进一步地，本发明优选生产技术最为成熟，稳定性高、价格相对更低的羧基磁珠。氨基磁珠、环氧基磁珠及甲苯磺酰磁珠均可采用其他反应条件与抗体偶联，其详细偶联方法可参考现有技术，在此不做详述。另外，甲胎蛋白抗体物质为去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体时，磁珠还可以包括链霉亲和素磁珠。
标记物可以有多种选择，例如荧光标记物、放射性物质标记物、吖啶酯等，本发明不做限制；进一步地，本实施例优选吖啶酯作为标记物，基于吖啶酯标记的直接化学发光检测准确性和稳定性更高，成本更低且标记效果较好。
此外，凝集素也可以有多种选择，例如，小扁豆凝集素(LCA)、橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)、刀豆凝集素等，本发明不做限制。作为优选，本发明凝集素优选为小扁豆凝集素，其与磁珠上捕获的AFP-L3具有高度亲和力，检测灵敏度更高。
进一步地，在本发明的一优选实施例中，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有F(ab’)2片段的羧基磁珠以及吖啶酯标记的小扁豆凝集素，本组合物不仅检测灵敏度和准确性更高，而且稳定性好，制备工艺简单且成本更低。
基于上述实施例，本发明还提出一种甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法。
参阅图1，所述甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法包括以下步骤：
步骤S10，获取甲胎蛋白抗体物质。
所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种。其中，甲胎蛋白抗体物质为F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段或Fv片段时，可以采用市面上已有的制备试剂盒从抗AFP抗体(IgG)中截取，其制备方法可以参考对应试剂盒的说明书；甲胎蛋白抗体物质为去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体时，可以通过NaIO4氧化等方法对抗AFP抗体(IgG)进行去除Fc片段的糖基化修饰，其制备步骤可以参考本领域常规的制备工艺进行，在此不做详述。
具体地，以F(ab’)2片段为例，在进行步骤S10时，步骤S10可以包括：
步骤S11，采用F(ab’)2制备试剂盒对鼠抗人甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab’)2片段。
步骤S20，将所述甲胎蛋白抗体物质包被到磁珠表面，得到包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠。
其中，磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及甲苯磺酰基磁珠中的任意一种。当磁珠选用羧基磁珠时，可以参考如下步骤S21具体实施；当磁珠选用氨基磁珠、甲苯磺酰基磁珠或环氧基磁珠时，可以参考本领域常规方法进行包被，在此不做详述。
具体地，以羧基磁珠为例，步骤S20可以按照如下步骤实施：
步骤S21，采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式，按每毫克磁珠投料8～12μgF(ab’)2片段的比例，将F(ab’)2片段包被到羧基磁珠的表面。
其中，EDC是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。二者作为偶联剂，均可以在市面上购得，能够将F(ab’)2片段偶联到磁珠表面。
步骤S30，将凝集素和标记物混合，反应得到包含标记物的凝集素。
其中，凝集素可以为LCA，标记物可以为商业化的NHS活化的吖啶酯。具体实施时，将LCA和NHS活化的吖啶酯混合后，避光室温反应即可实现对凝集素的标记。
本发明方法工艺简单，易于操作。
进一步地，参阅图1，上述甲胎蛋白异质体检测组合物进行AFP-L3的化学检测时，先将包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠和被测样本混合，在37℃左右孵育捕获甲胎蛋白。由于抗体不能区分甲胎蛋白的亚型AFP-L1/AFP-L2/AFP-L3，样本中的这三种亚型均被磁珠捕获。经洗涤后，将包含标记物的凝集素与捕获有总甲胎蛋白的磁珠混合，并进一步孵育，由于凝集素与AFP-L3的高亲和力，将主要与AFP-L3结合，形成抗体F(ab’)2-AFP-L3-凝集素的夹心结构。洗涤后，在预激发液和激发液作用下，吖啶酯产生化学发光，产生光子的数量与样本中AFP-L3的量成正比。该方法采用两步孵育法，有效消除抗体Fc片段糖基化造成的干扰，从而实现快速、灵敏的检测AFP-L3。
此外，基于上述甲胎蛋白异质体检测组合物的所有实施例，本发明还进一步提出了一种甲胎蛋白异质体检测试剂盒，所述甲胎蛋白异质体检测试剂盒包括如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物，由于本甲胎蛋白异质体检测试剂盒采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
此外，本发明还提出一种如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物、如上文所述的甲胎蛋白异质体检测试剂盒以及如上文所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法制得的甲胎蛋白异质体检测组合物在检测甲胎蛋白异质体中的应用。在将上述甲胎蛋白异质体检测组合物、甲胎蛋白异质体检测试剂盒以及甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法制得的甲胎蛋白异质体检测组合物用于AFP-L3检测时，只需要两步孵育，检测步骤简单且快速，检测结果准确且灵敏度高。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1甲胎蛋白异质体检测组合物的制备
(1)抗体F(ab’)2片段的制备及纯化：采用Thermo Fisher Pierce F(ab’)2制备试剂盒，并依照该试剂盒的使用说明书对鼠抗人甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，经超滤离心后，将F(ab’)2片段溶于PBS缓冲液，备用。具体地，将F(ab’)2片段制备试剂盒中配备的0.8mL离心柱下端塞子折断后置于2.0mL离心管中。将固定有胃蛋白酶的树脂充分悬浮分散后，取0.25mL至离心柱中，并于5000g离心1分钟，结束后用0.5mL酶切缓冲液清洗上述树脂一次。
另一边，将脱盐柱下端塞子折断后置于15mL离心管中，以1500g离心2分钟去除保护液，并清洗2次。加0.5mL待酶切甲胎蛋白抗体于脱盐柱进行脱盐纯化。将纯化后的抗体加入到固定有胃蛋白酶的树脂中，并在37℃孵育4h，孵育结束后在5000g离心1分钟收集处理的抗体片段，并0.5mL PBS缓冲液清洗2次，收集洗脱液。
将试剂盒中的protein A纯化柱、及IgG洗脱缓冲液平衡至室温。纯化离心柱在1000g离心1分钟去除保护液，并用2mL PBS缓冲液清洗平衡2次。加入收集的酶切产物，并充分悬浮纯化柱中填料，室温上下颠倒混匀10分钟。孵育结束后，1000g离心1分钟，收集滤液，并用PBS清洗2次，收集洗脱液。所收集的溶液采用超滤离心(MWCO＝50K)进行纯化，去除Fc片段，并通过280nm处紫外吸收光谱进行浓度测定。
(2)磁珠包被：采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式，按照投料比例为每毫克磁珠投料10μgF(ab’)2片段，将制备的F(ab’)2片段包被到羧基磁珠表面。具体地，将10mg羧基磁珠采用20mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液(pH 5.5)清洗3次后，磁分离。然后加入0.5mL含50mg/mL EDC的MES缓冲液、及0.5mL含50mg/mL NHS的MES缓冲液，并在室温孵育30分钟。磁分离并去上清后，采用20mM MES缓冲液清洗一次，加入1.0mL MES缓冲液将磁珠充分分散，并加入100μg F(ab’)2片段。充分混匀后在室温震荡孵育3小时。孵育结束后，磁分离、去上清，并将磁珠分散在20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液(pH 7.4)中，孵育15分钟后磁分离，去上清。将磁珠分散在0.5wt％Blockmaster DB1130水溶液中，在室温下震荡孵育1小时进行封闭。封闭结束后，采用20mM Tris缓冲液(pH 7.4)进行清洗，并分散保存在含1％BSA的20mM Tris缓冲液(pH 7.4)中，得到磁珠标记物，即包被有F(ab’)2片段的羧基磁珠。
(3)凝集素标记：采用10mM PBS(pH 7.4)将LCA稀释至2mg/mL，并按照LCA与吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)的质量比为20:1混合。混合均匀后，置于旋转混匀仪上，避光室温反应30分钟，得到标记反应混合物。反应结束后，加入浓度为10mg/mL的赖氨酸水溶液，进行终止。加入赖氨酸溶液的体积为标记反应混合物的10％，混匀后在室温避光反应30分钟。终止结束后，采用Thermo Fisher Zeba Spin Desalting Columns(旋转脱盐柱)进行纯化。收集脱盐后的产物，加入等体积的甘油，得到吖啶标记的小扁豆凝集素(LCA-AE)，保存于-20℃备用。
实施例2对照的制备
参考实施例1中的步骤(1)和(2)，采用同一抗体和相同的羧基磁珠，所述抗体不做片段化处理，按照每毫克磁珠投料10μg抗体的比例，将抗体包被至羧基磁珠表面，得到磁珠标记物对照组。
实施例3 AFP-L3检测
(1)磁珠工作液(M)：将实施例1和实施例2制得的磁珠标记物分别分散于10mM PBS缓冲液(pH 7.4)至浓度为0.2mg/mL，得到完整抗体包被磁珠工作液和F(ab’)2包被磁珠工作液。
(2)标记物工作液(R1)：将制备的吖啶标记的小扁豆凝集素(LCA-AE)用含1mMCaCl2,1mM MnCl2的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至LCA浓度为1.0μg/mL。
(3)免疫检测过程：50μL磁珠工作液(M)与50μL样本混匀后在37℃孵育5分钟后，磁分离并清洗3次；随后加入50μL标记物工作液(R1)，磁珠充分分散后在37℃孵育15分钟，磁分离，并清洗2次后，加入预激发液、激发液各100μL，并读取光电值分别采用对照试剂和本发明的试剂测试空白样本(PBS缓冲液)，和同一血清样本。空白样本和血清样本分别用两种试剂各重复测试5次，结果如表1所示。
表1完整抗体和F(ab’)2包被磁珠测试空白背景及血清样本对比
Figure BDA0003441711520000101
上述结果显示，本发明的方法检测PBS缓冲液的背景信号显著低于试验采用完整抗体的对照检测试剂；而由于对照试剂采用完整抗体包被的磁珠，抗体Fc片段可能与吖啶酯标记的LCA存在一定程度的结合，从而导致背景较高，且重复性较差。检测AFP-L3阳性临床样本，本发明的检测方法虽然光电值信号低于对照，但是精密度显著优于对照。
将商业化AFP-L3纯品(≥95％)稀释后经罗氏电化学发光甲胎蛋白测定试剂盒测定浓度为3.1ng/mL的样品作为低值校准品，以PBS为零浓度校准品，对采用本发明甲胎蛋白异质体检测组合物进行的AFP-L3检测的最低检测限进行测定。重复测定20次PBS，得出20次结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD；另测试3次低值校准品，取平均值。根据PBS和低值校准品测试均值之间的浓度—RLU值结果进行两点线性回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限，具体结果如表2所示。完整抗体包被磁珠对照的结果如表3所示。
表2 F(ab’)2包被磁珠对应的检测方法的最低检测限
Figure BDA0003441711520000111
由上述对零浓度校准品及浓度为3.1ng/mL的校准品的测试结果，结合空白限LOB的计算方法得，本发明的试剂空白限为0.212ng/mL。
表3完整抗体包被磁珠对应的检测方法的最低检测限
Figure BDA0003441711520000112
Figure BDA0003441711520000121
上述结果显示，采用本发明的甲胎蛋白异质体检测组合物进行AFP-L3检测，在相同检测条件下，检测灵敏度提高10倍。尤其是对照方法采用含有糖基化修饰的Fc片段的完整抗体进行磁珠包被，在检测AFP-L3中产生较大干扰，背景出现跳值。相较而言，本发明检测灵敏度更高，准确性更高。
将商业化AFP-L3纯品抗原(≥95％)稀释至300ng/mL，并分别用完整抗体和F(ab’)2包被磁珠制备的工作液组成的试剂进行精密度测试。两种试剂分别测试10次，分析统计均值，标准差及变异系数，结果如表4所示。
表4精密度测试结果对比
Figure BDA0003441711520000122
测试结果显示，对高值抗原的测试中，虽然对照方法测试信号高于本发明的AFP-L3检测方法，但后者变异系数CV＝5.2％，显著优于对照方法的17.5％。
将1000ng/mL的AFP-L3纯品分别稀释成500ng/mL，150ng/mL，50ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.5ng/mL。用本发明甲胎蛋白异质体检测组合物对各浓度样品分别测试3次，取平均值，并与理论浓度做相关性分析，相关结果如表5所示。
表5基于本发明甲胎蛋白异质体检测组合物的AFP-L3检测方法的线性范围测试
理论浓度(ng/mL) 测试浓度(ng/mL)
1000 943.42
500 479.51
150 141.32
50 46.86
10 9.14
2 2.13
0.5 0.542
将理论浓度与测试浓度进行线性相关性拟合，结果如图2所示。结果显示在0.5-1000ng/mL范围内，理论浓度与测试浓度相关性稀释R2＝0.9999，表明此方法线性范围可达0.5-1000ng/mL。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种甲胎蛋白异质体检测组合物，其特征在于，包括包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠以及包含标记物的凝集素；
其中，所述甲胎蛋白抗体物质包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修饰的甲胎蛋白抗体中的任意一种。
2.如权利要求1所述的甲胎蛋白异质体检测组合物，其特征在于，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及甲苯磺酰基磁珠中的任意一种。
3.如权利要求1所述的甲胎蛋白异质体检测组合物，其特征在于，所述标记物包括吖啶酯。
4.如权利要求1所述的甲胎蛋白异质体检测组合物，其特征在于，所述凝集素包括小扁豆凝集素。
5.如权利要求1所述的甲胎蛋白异质体检测组合物，其特征在于，所述甲胎蛋白异质体检测组合物包括包被有F(ab’)2片段的羧基磁珠以及吖啶酯标记的小扁豆凝集素。
6.一种甲胎蛋白异质体检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至5任意一项所述的甲胎蛋白异质体检测组合物。
7.一种如权利要求1至5任意一项所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取甲胎蛋白抗体物质；
将所述甲胎蛋白抗体物质包被到磁珠表面，得到包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠；
将凝集素和标记物混合，反应得到包含标记物的凝集素。
8.如权利要求7所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法，其特征在于，获取甲胎蛋白抗体物质的步骤包括：
采用F(ab’)2制备试剂盒对鼠抗人甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab’)2片段。
9.如权利要求7所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法，其特征在于，将所述甲胎蛋白抗体物质包被到磁珠表面，得到包被有甲胎蛋白抗体物质的磁珠的步骤包括：
采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式，按每毫克磁珠投料8～12μgF(ab’)2片段的比例，将F(ab’)2片段包被到羧基磁珠的表面。
10.一种如权利要求1至5任意一项所述的甲胎蛋白异质体检测组合物、如权利要求6所述的甲胎蛋白异质体检测试剂盒以及如权利要求7至9任意一项所述的甲胎蛋白异质体检测组合物的制备方法制得的甲胎蛋白异质体检测组合物在检测甲胎蛋白异质体中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115494233A (zh) * 2022-09-21 2022-12-20 深圳市国赛生物技术有限公司 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法
CN115716874A (zh) * 2022-11-04 2023-02-28 深圳市卓润生物科技有限公司 针对afp-l3与凝集素复合物的单克隆抗体及其试剂盒和应用
CN115825429A (zh) * 2022-12-30 2023-03-21 和沺生物技术常州有限公司 一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104714026A (zh) * 2014-12-31 2015-06-17 北京热景生物技术有限公司 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用
CN108333361A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用
CN108627653A (zh) * 2018-06-28 2018-10-09 热景（廊坊）生物技术有限公司 用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒
CN110320370A (zh) * 2019-07-31 2019-10-11 万东山 肝癌肿瘤标志物afp、甲胎蛋白异质体、gp73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用
CN113433318A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 山东中鸿特检生物科技有限公司 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104714026A (zh) * 2014-12-31 2015-06-17 北京热景生物技术有限公司 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用
CN108333361A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用
CN108627653A (zh) * 2018-06-28 2018-10-09 热景（廊坊）生物技术有限公司 用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒
CN110320370A (zh) * 2019-07-31 2019-10-11 万东山 肝癌肿瘤标志物afp、甲胎蛋白异质体、gp73抗原同步免疫检测试剂盒、方法及应用
CN113433318A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 山东中鸿特检生物科技有限公司 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115494233A (zh) * 2022-09-21 2022-12-20 深圳市国赛生物技术有限公司 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法
CN115716874A (zh) * 2022-11-04 2023-02-28 深圳市卓润生物科技有限公司 针对afp-l3与凝集素复合物的单克隆抗体及其试剂盒和应用
CN115716874B (zh) * 2022-11-04 2024-02-02 深圳市卓润生物科技有限公司 针对afp-l3与凝集素复合物的单克隆抗体及其试剂盒和应用
CN115825429A (zh) * 2022-12-30 2023-03-21 和沺生物技术常州有限公司 一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒
CN115825429B (zh) * 2022-12-30 2023-10-27 和沺生物技术常州有限公司 一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒

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