CN111721934B - 一种改良型特异性生长因子检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改进型特异性生长因子检测试剂盒，属于生物化学技术领域。所述的试剂盒包括R1试剂、R2试剂和校准品，其中R1试剂主要为缓冲液成分，R2试剂主要为反应液。本发明的试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，且对肿瘤样本的检测具有早期性和广谱性，可适用于多种肿瘤的早期筛查。

Description

一种改良型特异性生长因子检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种改良型特异性生长因子检测试剂盒，及其在肿瘤样本检测中的应用。
背景技术
特异性生长因子(TSGF)是不同于其他肿瘤标志物的一类独立物质，是恶性肿瘤形成和生长时促使肿瘤及其周边毛细血管大量增殖并释放到外周血液中的一系列因子的总称。这些因子是肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生的，主要由糖类物质(如糖脂、糖蛋白、寡聚糖等)构成，包括表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤生长因子α和β(TGF-α、TGF-β)，人骨骼生长因子(HSGF)以及促血管生成素(ANG)等。
当肿瘤产生时，血液中TSGF含量升高，是肿瘤的早期发现、术后及放、化疗、转移、复发的重要标志。临床试验证明，测定血清中TSGF的含量，将为肿瘤的筛查、早期辅助诊断、疗效评价，以及复发监测提供有效的参考依据。目前，市场上TSGF的检测产品种类有限，而且测定准确度还有待提高。
发明内容
为此，需要提供一种准确度高、操作简便的TSGF检测试剂盒。
为实现上述目的，发明人提供的技术方案如下：
一种改良型特异性生长因子检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品；所述的R1试剂为缓冲液，包括磷酸盐缓冲液；所述的R2试剂为反应液，包括显色剂或者胶乳微球；所述的校准品的成分包括表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤生长因子α、肿瘤生长因子β、促血管生成素，以及人骨骼生长因子其中的一种或多种。
所述的R1试剂包括以下组分：磷酸盐1.0-3.5g/100mL，乙二胺四乙酸二钠0.5-0.8g/100mL，Proclin3000.05-0.5g/100mL，氯化钠0.3-1.2g/100mL。
进一步的，所述的R1试剂还包括硫酸乙酰肝素0.1-1.0g/100mL与聚乙二醇60000.5-1.5g/100mL其中的一种。
所述的R2试剂包括以下组分：显色剂0.01-0.15g/100mL，Proclin3000.05-0.5g/100mL，枸橼酸0.5-1.5g/100mL，甘油0.1-0.5mL/100mL。此原理是利用硫酸乙酰肝素特异性结合特异性生长因子形成复合物A，反应剩余的硫酸乙酰肝素与显色剂结合生成复合物B，导致溶液中显色减弱，从而间接反映特异性生长因子的水平。
进一步的，所述的显示剂包括天青I、中性红、亚甲基蓝、甲苯胺蓝，以及灿烂甲酚蓝其中的一种。
所述的R2试剂包括以下组分：抗碱性成纤维细胞生长因子抗体偶联的胶乳微球0.01-0.03g/100mL，抗肿瘤生长因子β抗体偶联的胶乳微球0.01-0.03g/100mL，Proclin3000.05-0.5g/100mL，柠檬酸0.5-1.5g/100mL，甘油0.1-0.5mL/100mL，BSA0.2-1.0g/100mL。此原理是利用肿瘤相关生长因子等抗原与偶联有单克隆抗体的胶乳微粒发生凝集反应，形成抗原-抗体复合物，从而反应特异性生长因子的水平。
所述的校准品的配方优化为：碱性成纤维细胞生长因子1.7-1.8g/100mL，肿瘤生长因子β1.4-1.6g/100mL，人骨骼生长因子0.5-0.6g/100mL，Proclin3000.05-0.5g/100mL，小牛血清10mL/100mL。
进一步的，所述的改良型特异性生长因子检测试剂盒在肿瘤样本检测中的应用。
区别于现有技术，上述技术方案的优点在于：
(1)反应迅速，常温下5分钟反应稳定，吸光值可稳定12小时；可特异性结合恶性肿瘤形成早期释放至外周血中的数种微量相关肿瘤生长因子，稳定性好。
(2)本发明的试剂盒对肿瘤样本的检测具有广谱性，且对乳腺癌和肺癌的检出率较高，检测灵敏度可达83％以上，特异性可达92％以上。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
实施例1
本试剂盒采用可见光分光光度法，在37℃检测体系下使样本中异常生成的肿瘤特异性生长因子，如bFGF、TGF-β、HSGF，与硫酸乙酰肝素特异性结合形成复合物A，该复合物A的形成降低了硫酸乙酰肝素与显色剂结合生成复合物B的浓度，导致体系吸光度值出现大幅下降，通过标准曲线与公式换算定量检测复合物B的浓度，从而间接反映出TSGF在样本中的水平。
1.试剂配制
(1)R1试剂的配制
称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000031
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为R1试剂。
(2)R2试剂的配制
称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000041
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为R2试剂。
(3)校准品溶液的配制
校准品A称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000042
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为校准品A(200当量浓度)溶液。其中，所述的1当量浓度对应的吸光度值为0.00011，即每单位校准品反应后标准吸光度值为0.00011。
校准品B(0当量浓度)为10％小牛血清。
当量浓度可按公式(1)换算为临床浓度：
TSGF临床浓度(U/mL)＝100-0.18TSGF当量浓度……………(1)
所以，校准品A(200当量浓度)的临床浓度＝64U/mL；
校准品B(0当量浓度)的临床浓度＝100U/mL。
(4)质控品溶液的配制
以10％小牛血清为基质，加入一定量的bFGF、TGF-β、HSGF，分别配制成50±5U/mL的低值质控品，75±7U/mL的高值质控品。
2.检测方法
采用东芝-40全自动生化分析仪进行检测，仪器参数设置如下：
主波长：604nm
副波长：不设(若仪器要求必须设定，则在700nm～800nm范围内设定)
反应方法：速率法
反应方向：向下
温度：37℃
标本量：10μL
R1：160μL
R2：40μL
延迟时间：60S
测定时间：120S
说明：主波长根据显色剂的种类进行设置。本实施例为灿烂甲酚蓝，波长选择590-610nm。若显色剂为甲苯胺蓝，则波长可设为620-640nm；若显色剂为亚甲基蓝，则波长可设为660-670nm；若显色剂为中性红，则波长可设为520-530nm；若显示剂为天青I，则波长可设为500-510nm。具体可根据不同生化分析仪上的可选波长设置。
标准曲线的制作：以校准品A(64U/mL)和校准品B(100U/mL)测定吸光度值(A)，以校准品的浓度值为X轴，吸光度值为Y轴，在全自动分析仪上，采用线性模式建立标准曲线。计算时根据样本的A值在标准曲线上找到相应的浓度。
3.检测结果
3.1准确度
用本试剂盒对低值质控品和高值质控品平行检测5次,取平均值，用相对偏差(B)表示测定结果的不准确度，结果见表1。
表1准确度-相对偏差试验结果
Figure BDA0002554472050000051
Figure BDA0002554472050000061
从上表可知，本试剂盒的准确度较好，相对偏差小于2％。
3.2分析灵敏度
用浓度接近50U/mL样品做检测，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，按公式(2)换算成50U/mL浓度的吸光度变化率(ΔA/min)，检测结果见表2。由表2可知，本试剂盒的分析灵敏度(ΔA/min)为0.1360。
Figure BDA0002554472050000062
式中：ΔA校准品——校准品吸光度改变值；
C校准品——校准品浓度。
表2分析灵敏度实验结果
Figure BDA0002554472050000063
3.3精密度
在重复性条件下，用质控品测试本试剂盒，重复测试至少20次(n≥20)分别计算测量值的平均值
Figure BDA0002554472050000064
与标准差(S)。按公式(3)计算变异系数CV(％)值，结果见表3。
Figure BDA0002554472050000065
表3精密度实验结果
Figure BDA0002554472050000066
Figure BDA0002554472050000071
由表3可见，本试剂盒的精密度较好，变异系数＜0.5％。
3.4试剂空白吸光度变化率
用指定空白样品测试本试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(t)后的吸光度(A2)，计算出吸光度变化值(|A2-A1|/t)，即为试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)，记录5次测定结果，得出其均值，见表4。
表4试剂空白吸光度变化率测定结果
Figure BDA0002554472050000072
由表4可知，本试剂盒吸光度变化率≤0.007。
3.5线性范围
用接近线性范围上限的高浓度血清样品，按表5用纯化水混合成9个稀释浓度(U/mL)。用本试剂盒对每一稀释浓度样本平行测试3次，分别求得测定均值。以稀释浓度为自变量，以测定结果均值为因变量，求出线性回归方程和线性相关系数r。
表5线性范围测定结果
Figure BDA0002554472050000073
Figure BDA0002554472050000081
从表5可知，线性在[0-100]U/mL范围内满足r＞0.999；浓度为[0,20]U/mL时，绝对偏差在±3U/mL范围内；浓度为(20,100]U/mL时，相对偏差在±3％范围内。
3.6试剂盒的特异性和灵敏度
用本试剂盒对51例正常人血清样本，33例乳腺癌患者血清样本，43例肺癌患者血清样本进行检测，考察本试剂盒的特异性和灵敏度。以TSGF临床浓度≥64U/mL为阳性，TSGF临床浓度＜64U/mL为阴性，对检测结果进行判断，检测结果汇总见表6。对肺癌不同分期样本的检测结果汇总见表7。
表6试剂盒的特异性和灵敏度的结果汇总
Figure BDA0002554472050000082
由表6可知，本试剂盒的特异性为94.1％，对乳腺癌的检测灵敏度为87.9％，对肺癌的检测灵敏度为86.0％，且对乳腺癌样本的检测灵敏度略高于肺癌样本。
表7肺癌样本不同分期的检出率
Figure BDA0002554472050000083
Figure BDA0002554472050000091
由表7可知，对于肺癌不同分期的样本，一期、二期的检出率高于三期、四期，说明本试剂盒对肿瘤样本的检测具有早期性，可较早提示肿瘤风险。
3.7试剂盒对其他肿瘤样本的检测结果
分别用本试剂盒和市售试剂盒对30例癌症病人(包括肠癌、胃癌、肝癌和食管癌)的血清样本进行检测，检测结果见表8。
表8不同样本的检测结果
Figure BDA0002554472050000092
Figure BDA0002554472050000101
由表8可得，在30例癌症样本中，市售试剂盒有4例样本检测为阴性，本试剂盒只有1例检测为阴性，说明本试剂盒具有较高的准确性，且对癌症样本的检测具有广谱性。
实施例2
本试剂盒采用免疫比浊法，在37℃检测体系下使样本中的肿瘤特异性生长因子与偶联有对应单克隆抗体的胶乳微粒发生凝集反应，形成抗原-抗体复合物，在570nm波长处(也可选择550nm～580nm范围内的波长)测定该复合物的吸光度值，通过标准曲线及公式换算定量检测产物的生成量，可间接反映出待测样本中TSGF的水平。
1.试剂配制
(1)R1试剂的配制
称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000102
Figure BDA0002554472050000111
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为R1试剂。
(2)R2试剂的配制
称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000112
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为R2试剂。
其中，抗体与胶乳微球偶联的方法如下：
以300nm胶乳微球2mL与bFGF多抗(或单抗)50mg混匀，室温下搅拌反应1小时后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)3mg，搅拌反应2小时后，离心洗涤，并以2％BSA封闭液重悬，封闭2小时，离心洗涤，收集沉淀，以纯水配制成0.02g/100mL的抗bFGF抗体偶联的胶乳微球溶液。
以100nm胶乳微球2mL与TGF-β多抗(或单抗)80mg混匀，室温下搅拌反应1小时后，加入EDC8mg，搅拌反应2小时后，离心洗涤，并以2％BSA封闭液重悬，封闭2小时，离心洗涤，收集沉淀，以纯水配制成0.02g/100mL抗TGF-β抗体偶联的胶乳微球溶液。
(3)校准品溶液的配制
校准品称取如下成分：
Figure BDA0002554472050000121
用纯化水溶解，配制成100mL的溶液，即为临床浓度64U/mL的校准品溶液。
2.检测方法
采用东芝-40全自动生化分析仪进行检测，仪器参数设置如下：
主波长：570nm
副波长：不设(若仪器要求必须设定，则在700nm～800nm范围内设定)
反应方法：终点法
反应方向：向上
温度：37℃
标本量：5μL
R1：160μL
R2：40μL
延迟时间：60S
测定时间：120S
标准曲线的制作：以纯化水定值为0U/mL，校准品定值为64U/mL，测定校准品吸光度值，以A校准(吸光度值)为Y轴，校准品的浓度值为X轴，在全自动分析仪上，采用线性模式建立标准曲线。计算时根据样本的A值在标准曲线上找到相应的浓度。
3.检测结果
3.1准确度
用本试剂盒对低值质控品和高值质控品平行检测5次,取平均值，用相对偏差(B)表示测定结果的不准确度，结果见表9。
表9准确度-相对偏差试验结果
Figure BDA0002554472050000131
从上表可知，本试剂盒的相对偏差小于1％。
3.2分析灵敏度
用浓度接近50U/mL样品做检测，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，按公式(2)换算成50U/mL浓度的吸光度变化率(ΔA/min)，检测结果见表10。
表10分析灵敏度实验结果
Figure BDA0002554472050000132
由上表可知，本试剂盒的分析灵敏度(ΔA/min)为0.1350。
3.3精密度
在重复性条件下，用质控品测试本试剂盒，重复测试至少20次(n≥20)分别计算测量值的平均值
Figure BDA0002554472050000134
与标准差(S)。按公式(3)计算变异系数CV(％)值，结果见表11。
表11精密度实验结果
Figure BDA0002554472050000133
Figure BDA0002554472050000141
由上表可知，本试剂盒的精密度较好，CV(％)值＜0.6％。
3.4试剂空白吸光度变化率
用指定空白样品(纯化水)测试本试剂盒，在测试主波长570nm下，记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(t)后的吸光度(A2)，计算出吸光度变化值(|A2-A1|/t)，即为试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)，记录5次测定结果，得出其均值，见表12。
表12试剂空白吸光度变化率测定结果
Figure BDA0002554472050000142
由上表可知，本试剂盒吸光度变化率均值≤0.008。
3.5线性范围
用接近线性范围上限的高浓度血清样品，按表13用纯化水混合成9个稀释浓度(U/mL)。用试剂盒对每一稀释浓度样本平行测试3次，分别求得测定均值。以稀释浓度为自变量，以测定结果均值为因变量，求出线性回归方程和线性相关系数r。
表13线性范围测定结果
Figure BDA0002554472050000143
Figure BDA0002554472050000151
从上表可知，线性在[0-100]U/mL范围内满足r＞0.998；浓度为[0,20]U/mL时，绝对偏差在±4U/mL范围内；浓度为(20,100]U/mL时，相对偏差在±3％范围内。
3.6试剂盒的特异性和灵敏度
用本试剂盒对51例正常人血清样本，33例乳腺癌患者血清样本，43例肺癌患者血清样本进行检测，考察本试剂盒的特异性和灵敏度。以TSGF临床浓度≥64U/mL为阳性，TSGF临床浓度＜64U/mL为阴性，对检测结果进行判断，检测结果汇总见表14。对乳腺癌不同分期样本的检测结果汇总见表15。
表14试剂盒的特异性和灵敏度的结果汇总
Figure BDA0002554472050000152
由上表可知，本试剂盒的特异性为92.2％，对乳腺癌的检测灵敏度为90.9％，对肺癌的检测灵敏度为83.7％，且对乳腺癌样本的检测灵敏度高于肺癌样本。
表15乳腺癌样本不同分期的检出率
Figure BDA0002554472050000153
Figure BDA0002554472050000161
由表15可知，对于乳腺癌不同分期的样本，一期、二期、三期的检出率高于四期，说明本试剂盒对肿瘤样本的检测具有早期性，可较早提示肿瘤风险。
3.7试剂盒的广谱性
分别用本试剂盒和市售试剂盒对30例癌症病人(包括肠癌、胃癌、肝癌和食管癌)的血清样本进行检测，检测结果见表16。
表16不同样本的检测结果
Figure BDA0002554472050000162
Figure BDA0002554472050000171
由上表可得，在30例癌症样本中，市售试剂盒有4例样本检测为阴性，本试剂盒有2例检测为阴性，说明本试剂盒的准确性略好于市售试剂盒，且对癌症样本的检测具有广谱性。
综上，本发明的试剂盒可特异性结合恶性肿瘤形成早期释放至外周血中的数种微量肿瘤相关生长因子，具有早期性；并且对于肺癌和乳腺癌的检测具有较高的灵敏度和特异性；也适用于多种肿瘤样本的检测，具有广谱性。在临床上，可作为肿瘤早期筛查及复发监测的辅助参考指标。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (1)

1.一种改良型特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括R1试剂、R2试剂和校准品；所述的R1试剂为缓冲液，配方为：磷酸盐3.0g，乙二胺四乙酸二钠0.6g，Proclin 300 0.1g，氯化钠0.9g，硫酸乙酰肝素0.25g，纯化水100mL；所述的R2试剂为反应液，配方为：灿烂甲酚蓝0.01g，Proclin 300 0.1g，柠檬酸1.5g，甘油0.25mL，纯化水100mL；所述的校准品的配方为：碱性成纤维细胞生长因子1.72g，肿瘤生长因子β 1.5g，人骨骼生长因子0.56g，Proclin 300 0.2g，小牛血清10mL，纯化水100mL。
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