CN109425580A - 一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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李小冬
李福生
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    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
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Abstract

本发明涉及一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1的成分含量包括：缓冲液1 10‑300mmol/L、乙二胺四乙酸二钠1‑20g/L、稳定剂1 0.1‑10g/L、表面活性剂0.1‑10ml/L、偶联识别物5‑100mmol/L，溶剂为纯化水，试剂R1的pH为5.0‑9.0；试剂R2的成分含量包括：显色剂0.05‑8mmol/L、稳定剂2 0.1‑10g/L、缓冲液2 10‑300mmol/L、甘露醇1‑200g/L，溶剂为纯化水，试剂R2的pH为3.0‑7.0。本发明试剂盒稳定性好，同时去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响，使得检测的精准度高。

Description

一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
肿瘤的早期发现是国内外肿瘤界共同关注的课题和追寻的目标，常用的方法有B超、CT的物理手段和各种酶类，肿瘤标记物等生化、免疫学检测方法。现有方法尚有一些缺陷和不足。例如，物理手段不能在早期发现肿瘤。免疫学方法虽然具有测试灵敏度高等优点，但测试时间长，特异性依赖特异性的抗体，干扰因素多，不能对样本进行批量测试。而我们现在使用的一些肿瘤标记物如：AFP、CEA、CA-125、CA-199、CA-153等，因其敏感性或特异性不高等原因，尚不能成为理想的广谱性肿瘤标志物。传统意义的肿瘤标志物除AFP外基本都不能发现早期肿瘤，因而即使进行常规的健康体检仍有60％-80％的恶性肿瘤被漏诊；另外，因为肿瘤多态性的存在，没有一种传统的肿瘤标志物适用于所有肿瘤。生化方法更适用于肿瘤的早期检测，检测方法简便快捷，结果稳定，可应用于自动化分析。
特异性生长因子(Tumor Supplied Group of Factors，TSGF)是恶性肿瘤形成和生长时促使肿瘤及其周边毛细血管大量增殖并释放到外周血液中的一系列因子的总称。这些一系列生长因子是肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生的，包括表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤生长因子α(TGF-α)和促血管生成素(angiopoietin，ANG)等许多因子。生长因子进入血液循环，成为血清特异性生长因子(specific growth factors，SGF)。病人血液中存在TSGF，对恶性肿瘤血管增生起重要作用，能不断刺激肿瘤生长、转移和血管生成，加快肿瘤的发展。而不断增大的肿瘤组织又进一步分泌更多的生长因子，进一步刺激肿瘤生长和转移，形成恶性循环，因此，体内血清特异性生长因子的表达水平与肿瘤的生长转移和恶性程度密切相关。
TSGF作为一种新型的肿瘤标志物，它为细胞增殖过程中产生的一类小分子肽，因此在肿瘤的早期就有TGSF的升高，它已成为一种新的、敏感性和特异性较高的广谱肿瘤标志物参考指标。对恶性肿瘤的初筛、早期辅助诊断、疗效评价和预示肿瘤复发具有重要临床意义和应用价值。
当前，市场上检测特异性生长因子的产品种类有限，操作复杂，需对样品进行前处理，耗时长，不能应用于全自动生化分析仪，不能大批量的检测，而且市场上的检测特异性生长因子的产品的测定准确度不高，需要进行改进。
发明内容
本发明主要提供了一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒及其使用方法，通过在试剂中加入稳定剂、保护剂、表面活性剂，提高试剂稳定性，同时去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响，使得检测的精准度提高，灵敏度更高。其技术方案如下：
一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1的成分含量包括：
其溶剂为纯化水，试剂R1的pH为5.0-9.0；
试剂R2的成分含量包括：
其溶剂为纯化水，试剂R2的pH为3.0-7.0。
优选的，所述缓冲液1为磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液(3-(N-吗啉)丙磺酸)、HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、CAPSO缓冲液、Good’s缓冲液、MES(2-吗啉代乙磺酸)、二(2-羟乙基)亚氨基三羟甲基氨基甲烷、PIPES缓冲液或N,N-二(2-羟乙基)-2氨基乙磺酸。
优选的，所述稳定剂1选自氯化镁、氯化钾、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇和甘露醇类中的一种或几种。
优选的，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、Brij35和曲拉通-100中的一种或几种。
优选的，所述偶联识别物为含苯甲醛基团的芳香醛化合物或香草醛。
优选的，所述偶联识别物为4-二甲基氨基苯甲醛、4氯苯甲醛或3氯苯甲醛。
优选的，所述显色剂为茚三酮。
优选的，所述稳定剂2选自氯化镁、氯化钾、海藻糖、蔗糖、甘油、二硫苏糖醇和聚乙二醇类中的一种或几种。
优选的，所述缓冲液2为磷酸盐缓冲液、丁二酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、CAPSO缓冲液或Good’s缓冲液。
一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
(2)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
(3)根据吸光度变化值计算出样本中的特异性生长因子TSGF的浓度。
本试剂所依据的原理是通过特殊的识别物在37℃检测条件下与血清样本中的肿瘤特异性生长因子进行反应，反应后的剩余识别物再与试剂2中的特定显色剂在同样的条件下进行显色反应，生成复合物，于波长570nm处测定该生成的显色产物的吸光度数值，通过校准浓度曲线及公式计算出样本中的TSGF含量。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
(1)本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器，试剂具有足够的稳定性及易于操作等优点，可在全自动生化分析仪上检测，检测效率大为提高；
(2)本发明在试剂中加入稳定剂、保护剂、表面活性剂，提高试剂稳定性，同时去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响，使得检测的精准度提高，灵敏度更高，线性范围更广，同时可以减少主要反应物料的用量，减少了试剂的成本。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
具体实施例
实施例1
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为4.5。
实施例2
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为5.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6。
实施例3
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为7.0；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为4.5。
实施例4
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为5.0。
实施例5
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为5.0。
实施例6
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为7.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为4.0。
实施例7
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.0；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.0。
实施例8
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为7.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为4.0；
实施例9
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为5.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.0。
实施例10
按照下列组分含量配制试剂：
试剂R1：
其溶剂为纯化水，
调整pH为6.5；
试剂R2：
其溶剂为纯化水，
调整pH为5.0。
实施例1-10中的试剂盒使用方法如下：
1.设置全自动生化分析仪参数
(a)检测温度：37℃；
(b)检测波长：主波长570nm、副波长700nm；
(c)反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后混匀，37℃恒温孵育120秒，再读取之后180秒内吸光度变化率ΔA/min；
(d)反应方向：正反应。
2.检测步骤
(a)取150μl试剂R1与20μl待测样本混匀；
(b)将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
(c)加入50μl试剂R2，混匀，37℃恒温孵育120秒，再读取之后180秒内吸光度变化率ΔA/min；
(d)通过校准浓度曲线及下列公式计算出样本中的TSGF含量。
实验结果
1.表1为实施例1-10所制得的测定特异性生长因子试剂盒分别对两种质控品(质控品1和2)进行测定的结果，其中质控品1中的特定生长因子的浓度为108U/mL，质控水平2中的特定生长因子的浓度为234U/mL，测定结果见下表：
表1实施例1-10测试质控品测试结果
由表1可知，本发明所制得的测定特异性生长因子的试剂盒对质控品1和质控品2的测定结果偏差较小，因而测定准确度高(-10％≤偏差≤10％)，符合要求。
2.表2为选取实施例1、实施例3、实施例9制得的测定特异性生长因子试剂盒分别对同一待测样本1和同一待测样本2进行的多次反复测定的结果，测定结果见下表：
表2样本测定结果
由表2可知，本发明制备的试剂盒在精密度方面较好，检测精准度高。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1的成分含量包括：
其溶剂为纯化水，试剂R1的pH为5.0-9.0；
试剂R2的成分含量包括：
其溶剂为纯化水，试剂R2的pH为3.0-7.0。
2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液1为磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、CAPSO缓冲液、Good’s缓冲液、MES缓冲液、二(2-羟乙基)亚氨基三羟甲基氨基甲烷、PIPES缓冲液或N,N-二(2-羟乙基)-2氨基乙磺酸。
3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂1选自氯化镁、氯化钾、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇和甘露醇类中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、Brij35和曲拉通-100中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述偶联识别物为含苯甲醛基团的芳香醛化合物或香草醛。
6.根据权利要求5所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述偶联识别物为4-二甲基氨基苯甲醛、4氯苯甲醛或3氯苯甲醛。
7.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂为茚三酮。
8.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂2选自氯化镁、氯化钾、海藻糖、蔗糖、甘油、二硫苏糖醇和聚乙二醇类中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液2为磷酸盐缓冲液、丁二酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、CAPSO缓冲液或Good’s缓冲液。
10.权利要求1所述肿瘤特异性生长因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
(2)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
(3)根据吸光度变化值计算出样本中的特异性生长因子TSGF的浓度。
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