CN103290134B - 牛actb基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛ACTB基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由2×SYBR GREEN MIX、引物混合液、标准ACTB基因模板和超纯水组成。本发明可以准确的测定ACTB基因的转录水平，并具有高度的特异性(图1)。扩增曲线结果表明ACTB基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。

Description

牛ACTB基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种操作简便、快速，且能够定量检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)肌动蛋白-β(β-actin，ACTB)基因转录水平的试剂盒，该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2ⁿ倍扩增(其中n为热循环次数)。

荧光定量PCR技术是在变通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在变通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数)；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这种性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

Northern blot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以Northern Blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。

SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYB Green的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。通过解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到定量结果的准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种牛ACTB基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种牛ACTB基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由2×SYBR GREENMIX、引物混合液、标准ACTB基因模板和超纯水组成，试剂盒中各组成成分如下：

2×SYBR Green MIX：Taq DNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、100mmol/L KCl、20mmol/L Tris·HCl PH8.3、0.02％明胶、和SYBR Green染料；

引物混合液：引物1为8μmol/L、引物2为8μmol/L，引物1序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，引物2序列为5’-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3’；

标准ACTB基因模板：浓度为0.8μmol/L，ACTB基因模板序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAATCCTGCGGCATTCACGAAACTACCTTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTCGACATCCGCAAGGACCTCTACGCCAACACGG-3’；

超纯水：纯度超过18.25MΩ·CM。

本发明可以准确的测定ACTB的表达水平，并具有高度的特异性(图1)。扩增曲线结果表明ACTB基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。

附图说明

图1为ACTB基因转录水平的荧光检测结果。A：扩增曲线。横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值(Relative Fluorescence Units，RFU)，B：熔解曲线。横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

本试剂盒由2×SYBR GREEN MIX、引物混合液、标准ACTB基因模板和超纯水组成，试剂盒组成：

表1

试剂盒中各组成成分如下：

2×SYBR Green MIX：Taq DNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、100mmol/L KCl、20mmol/L Tris·HCl PH8.3、0.02％明胶、和SYBR Green染料。

引物混合液：引物1为8μmol/L、引物2为8μmol/L，引物1序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，引物2序列为5’-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3’。

标准ACTB基因模板：浓度为0.8μmol/L，ACTB基因模板序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAATCCTGCGGCATTCACGAAACTACCTTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTCGACATCCGCAAGGACCTCTACGCCAACACGG-3’。

超纯水：纯度超过18.25MΩ·CM。

混合适量的2×SYBR GREEN MIX、标准ACTB基因模板、cDNA模板和超纯水，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。该ACTB荧光定量PCR由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的ACTB基因，从而检测ACTB基因的表达量。

实例1

1)按比例配制ACTB荧光定量PCR反应液，20μL反应体系如下表：

表2

在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。

2)取2×SYBR GREEN MIX1000μL、引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制1900μL的FQ-PCR反应预混液。

3)充分混匀以上各种液体，将预混液成按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中。

4)配制以10E+8/mL、10E+7/mL、10E+6/mL、10E+5/mL、10E+4/mL等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管，每管10μL。

5)FQ-PCR扩增每个装有19μL PCR反应预混液的反应管中分别加入1μL待测cDNA(此处用以上各浓度的标准品代替)，水或标准ACTB基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TM)中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，56℃20秒热循环40次，并在56℃时检测记录荧光信号。

6)PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值，绘制标准曲线，用以定量分析；同时于3％琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。

结果：根据ACTB基因模板标准品绘制出的标准曲线，求出待测样品的ACTB基因浓度。根据标准曲线测出的已知浓度的标准品与其实际浓度相同(误差在1％到5％之间)。本发明可以准确的测定ACTB的表达水平，并具有高度的特异性(图1)。扩增曲线结果表明ACTB基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。

实例2

1)按比例配制ACTB荧光定量PCR反应液，20μL反应体系如下表：

表3

在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。

2)取2×SYBR GREEN MIX1000μL、引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制1900μL的FQ-PCR反应预混液。

3)充分混匀以上各种液体，将预混液成按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中。

4)配制以10E+8/mL、10E+7/mL、10E+6/mL、10E+5/mL、10E+4/mL等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管，每管10μL；同时，配制10E+4/mL稀释度的标准ACTB基因模板90管。

5)FQ-PCR扩增每个装有19μLPCR反应预混液的反应管中分别加入1μL稀释的标准ACTB基因模板(阴性对照管加超纯水)，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TM)中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，56℃20秒热循环40次，并在56℃时检测记录荧光信号。

6)PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析绘制标准曲线。

结果：实验对低浓度(10E+4/mL)标准ACTB基因模板的检出率为100％，根据标准曲线所计算出的ACTB基因浓度之间的误差为±5％。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种牛ACTB基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒由2×SYBR GREEN MIX、引物混合液、标准ACTB基因模板和超纯水组成，试剂盒中各组成成分如下：

2×SYBR Green MIX：Taq DNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、100mmol/L KCl、20mmol/L Tris·HCl PH8.3、0.02％明胶和SYBR Green染料；

引物混合液：引物1为8μmol/L、引物2为8μmol/L，引物1序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，引物2序列为5’-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3’；

标准ACTB基因模板：浓度为0.8μmol/L，ACTB基因模板序列为5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAATCCTGCGGCATTCACGAAACTACCTTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTCGACATCCGCAAGGACCTCTACGCCAACACGG-3’；

超纯水：纯度超过18.25MΩ·CM。