CN105039559A

CN105039559A - 牛fabp3基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN105039559A
Application number: CN201510489627.2A
Authority: CN
Inventors: 裴杰; 阎萍; 褚敏; 郭宪; 包鹏甲; 梁春年; 丁学智; 冯瑞林; 王宏博; 朱新书
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2015-08-11
Filing date: 2015-08-11
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，并提供了具体检测方法，试剂盒包括有以下试剂：2×SYBR？GREEN？MIX、标准FABP3基因模板、超纯水和由引物一和引物二组成引物对，引物一如序列表中序列1所示，引物二如序列表中序列2所示。本发明的有益效果为：本发明提供的试剂盒，可以有效检测不同牛种、不同组织、不同时期的FABP3基因的mRNA表达状态和表达量，同时可以鉴定该基因与动物脂肪沉积和肉品质的相关性，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明实现了方便快捷的检测FABP3基因转录水平的目的；2、本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优势。

Description

牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2ⁿ倍扩增（其中n为热循环次数）。

荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术所发展起来的基因定量方法。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的量变情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数）；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

SYBRGreen是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这种性质使其应用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

Northernblot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是RNA容易降解，所以NorthernBlot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等，这使实验过程变得比较繁琐。另外，NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。

基因芯片技术实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。

SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYBGreen的灵敏度很高。但是，由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光值的变化可以帮助降低非特异产物对定量的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到的定量结果。

脂肪酸结合蛋白(Fattyacidbindingprotein，FABP)广泛存在于动物的细胞质内，是脂质结合蛋白超家族成员，已发现9种类型的FABP，各种不同类型的脂肪酸结合蛋白分布具有组织特异性，但都是对脂肪酸具有高亲和力的可溶性蛋白质。脂肪酸结合蛋白3（FattyAcid-BindingProtein3，FABP3）又称为心型脂肪酸结合蛋白（HeartFattyAcid-BindingProtein3，H-FABP），主要在动物的心肌和骨骼肌细胞中表达，是骨骼肌中最主要的一类脂肪酸结合蛋白。FABP3的表达量与动物的肌间脂肪含量存在显著的正相关，因此，对动物FABP3基因的转录水平检测有助于监测其脂肪沉积的过程和解释其机理。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简便、快速，且能够定量检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）脂肪酸结合蛋白3（FattyAcid-BindingProtein3，FABP3）基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于检测牛FABP3基因转录水平的引物对，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。

本发明的第二个目的是提供了一种用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，包括有以下试剂：2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板、上述的引物对和超纯水。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，所述试剂盒中，2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板、上述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，所述2×SYBRGREENMIX由以下试剂组成：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、KCl100mmol/L、Tris.HCl20mmol/L、明胶0.02%、SYBRGreen染料。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，所述标准FABP3基因模板为序列表中序列3所示，标准FABP3基因模板的浓度为0.8μmol/L。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，上述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8μmol/L，引物二的浓度为8μmol/L。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，所述超纯水的纯度大于18.25MΩ.cm。

本发明的第三个目的是提供了一种用于检测牛FABP3基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1）配制荧光定量PCR反应预混液：取2×SYBRGREENMIX1000μL、上述的引物对组成的引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制得到1900μL的荧光定量PCR反应预混液；

2）将步骤1）得到的荧光定量PCR反应预混液按19μL/管分装成100个小管，加至荧光定量专用PCR反应管或反应板中；

3）配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准FABP3基因模板，以及未稀释的标准FABP3基因模板，共6种，每种10μL，用于检测基因的扩增效率；

4）荧光定量PCR反应扩增：每个装有19μL荧光定量PCR反应预混液的反应管或反应板中分别加入1μL待测cDNA、作为阴性对照的超纯水或作为阳性对照和计算扩增效率标准的FABP3基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，54.6℃20秒热循环40次，并在54.6℃时检测记录荧光信号；

5）PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。

进一步的，上述的用于检测牛FABP3基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，所述步骤4）中，装有19μL荧光定量PCR反应预混液的100个小管中，其中1管加入作为阴性对照的超纯水、6管加入作为阳性对照和计算扩增效率标准的FABP3基因模板，其余小管加入待测cDNA。

本发明的有益效果为：本发明提供的牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，可以有效检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）、不同组织、不同时期的FABP3基因的mRNA表达状态和表达量，同时可以鉴定该基因与动物脂肪沉积和肉品质的相关性，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明实现了方便快捷的检测FABP3基因转录水平的目的；2、本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优势。

附图说明

图1为FABP3基因转录水平荧光检测结果的扩增曲线。

其中，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值（RelativeFluorescenceUnits，RFU），扩增曲线结果表明FABP3基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线。

图2为FABP3基因转录水平荧光检测结果的熔解曲线。

其中，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。

具体实施方式

实施例1：

牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒：

本试剂盒主要由2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板、引物混合液和超纯水组成，试剂盒中各成分的组成如表1所示：

表1

试剂盒中各组成成分如下：

2×SYBRGreenMIX：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、100mmol/LKCl、20mmol/LTris.HCl、0.02%明胶、和SYBRGreen染料。

引物混合液：引物A8μmol/L、引物B8μmol/L，引物1序列为5’-GAAGTCACTCGGTGTCGG-3’，引物2序列为5’-TGTTCTTGAAGGTGCTTTG-3’。

标准FABP3基因模板：浓度为0.8μmol/L，FABP3基因模板序列为5’-GAAGTCACTCGGTGTCGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGGCAATATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAGTGAATGGGGACACAGTCATCATAAAAACACAAAGCACCTTCAAGAACA-3’。

超纯水：纯度超过18.25MΩ.CM。

混合适量的2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板/cDNA模板、引物混合液和超纯水，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。该FABP3荧光定量PCR由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的FABP3基因，从而检测FABP3基因的转录水平。

用于检测牛FABP3基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1）按比例配制FABP3荧光定量PCR反应液，20μL反应体系如表2所示。

表2

在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照；

2）取2×SYBRGREENMIX1000μL、引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制1900μL的FQ-PCR反应预混液；

3）充分混匀以上各种液体，将预混液成按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中；

4）配制以10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准FABP3基因模板，加上未稀释的标准FABP3基因模板，共6管，每管10μL；

5）FQ-PCR扩增每个装有19μLPCR反应预混液的反应管中分别加入1μL待测cDNA、水或标准FABP3基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪（Bio-RadCFX96TM）中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，54.6℃20秒热循环40次，并在54.6℃时检测记录荧光信号；

6）PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120>牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaagtcactcggtgtcgg18

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgttcttgaaggtgctttg19

<210>1

<211>119

<212>DNA

<213>牛标准FABP3基因模板

<400>3

gaagtcactcggtgtcggttttgctaccaggcaggtgggcaatatgaccaagcctaccac60

aatcatcgaagtgaatggggacacagtcatcataaaaacacaaagcaccttcaagaaca119

序列表

<110>中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120>牛FABP3基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaagtcactcggtgtcgg18

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgttcttgaaggtgctttg19

<210>1

<211>119

<212>DNA

<213>牛标准FABP3基因模板

<400>3

gaagtcactcggtgtcggttttgctaccaggcaggtgggcaatatgaccaagcctaccac60

aatcatcgaagtgaatggggacacagtcatcataaaaacacaaagcaccttcaagaaca119

Claims

1.用于检测牛FABP3基因转录水平的引物对，其特征在于，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。

2.用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，包括有以下试剂：2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水。

3.根据权利要求2所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，2×SYBRGREENMIX、标准FABP3基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。

4.根据权利要求3所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述2×SYBRGREENMIX由以下试剂组成：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg²⁺5.0mmol/L、KCl100mmol/L、Tris.HCl20mmol/L、明胶0.02%、SYBRGreen染料。

5.根据权利要求4所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述标准FABP3基因模板如序列表中序列3所示，标准FABP3基因模板的浓度为0.8μmol/L。

6.根据权利要求5所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8μmol/L，引物二的浓度为8μmol/L。

7.根据权利要求6所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述超纯水的纯度大于18.25MΩ.cm。

8.用于检测牛FABP3基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）配制荧光定量PCR反应预混液：取2×SYBRGREENMIX1000μL、权利要求1-7任一所述的引物对组成的引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制得到1900μL的荧光定量PCR反应预混液；

9.根据权利要求8所述的用于检测牛FABP3基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤4）中，装有19μL荧光定量PCR反应预混液的100个小管中，其中1管加入作为阴性对照的超纯水、6管加入作为阳性对照和计算扩增效率标准的FABP3基因模板，其余小管加入待测cDNA。