CN103305608B - 牛gapdh基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛GAPDH基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒中各组成成分如下：2×SYBR？Green？MIX；引物混合液：引物18μmol/L、引物28μmol/L；标准GAPDH基因模板；超纯水：纯度超过18.25MΩ.CM。本发明实现了方便快捷的检测GAPDH基因转录水平的目的。本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种牛GAPDH基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。
荧光定量PCR技术是在变通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在变通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数)；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
SYBRGreen是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这性质登基用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
Northernblot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以NorthernBlot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。
SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYBGreen的灵敏度很高。但是，由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到定量结果。
在荧光定量PCR检测基因表达水平时，经常检测某个基因的相对表达量，其中内参基因常常选择GAPDH。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)GAPDH基因表达量的引物和PCR反应的条件，并组装成GAPDH基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、医学和畜牧兽医研究者的检测需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种牛GAPDH基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种牛GAPDH基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒中各组成成分如下：
2×SYBRGreenMIX：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg2+5.0mmol/L、100mmol/LKCl、20mmol/LTris.HClPH8.3、0.02％明胶、和SYBRGreen染料；
引物混合液：引物18μmol/L、引物28μmol/L；
引物1序列为5’-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3’；
引物2序列为5’-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3’；
标准GAPDH基因模板：浓度为0.8μmol/L，GAPDH基因模板序列为
5’-CCACGAGAAGTATAACAACACCCTCAAGATTGTCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGAC-3’。
超纯水：纯度超过18.25MΩ.CM。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明实现了方便快捷的检测GAPDH基因转录水平的目的。
2.本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
附图说明
图1为GAPDH基因转录水平的荧光检测结果。A：扩增曲线，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值(RelativeFluorescenceUnits，RFU)，B：熔解曲线，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量。扩增曲线结果表明GAPGH基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本试剂盒主要由2×SYBRGREENMIX、标准GAPDH基因模板和超纯水组成，各成分的组成如下：
表1试剂盒组成
试剂盒中各组成成分如下：
2×SYBRGreenMIX：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg2+5.0mmol/L、100mmol/LKCl、20mmol/LTris.HClPH8.3、0.02％明胶、和SYBRGreen染料。
引物混合液：引物18μmol/L、引物28μmol/L，引物1序列为
5’-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3’，引物2序列为5’-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3’。
标准GAPDH基因模板：浓度为0.8μmol/L，GAPDH基因模板序列为
5’-CCACGAGAAGTATAACAACACCCTCAAGATTGTCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGAC-3’。
超纯水：纯度超过18.25MΩ.CM。
混合适量的2×SYBRGREENMIX、标准GAPDH基因模板、cDNA模板和超纯水，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。该GAPDH荧光定量PCR由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的GAPDH基因，从而检测GAPDH基因的表达量。
实施例1
1)按比例配制GAPDH荧光定量PCR反应液，20μL反应体系如下表：
表2
在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照。
2)取2×SYBRGREENMIX1000μL、引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制1900μL的FQ-PCR反应预混液。
3)充分混匀以上各种液体，将预混液成按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中。
4)配制以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准GAPDH基因模板5管，每管10μL。
5)FQ-PCR扩增每个装有19μLPCR反应预混液的反应管中分别加入1μL待测cDNA，水或标准GAPDH基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(Bio-RadCFX96TM)中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，56℃20秒热循环40次，并在56℃时检测记录荧光信号。
6)PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3％琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。
参考图1，图1为GAPDH基因转录水平的荧光检测结果。A：扩增曲线。横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值(RelativeFluorescenceUnits，RFU)，B：熔解曲线，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量。扩增曲线结果表明GAPGH基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种牛GAPDH基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中各组成成分如下：
2×SYBRGreenMIX：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg2+5.0mmol/L、100mmol/LKCl、20mmol/LTris.HClPH8.3、0.02％明胶、和SYBRGreen染料；
引物混合液：引物18μmol/L、引物28μmol/L；
引物1序列为5’-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3’；
引物2序列为5’-GTCATAAGTCCCTCCACGAT-3’；
标准GAPDH基因模板：浓度为0.8μmol/L，GAPDH基因模板序列为
5’-CCACGAGAAGTATAACAACACCCTCAAGATTGTCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGAC-3’；
超纯水：纯度超过18.25MΩ.CM。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| HQ231767，Bos grinniens breed Datong glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA,partial cds;Pei，J;《GenBank》;20101129 * |
| Identification of internal control genes for quantitative expression analysis by real-time PCR in bovine peripheral lymphocytes;Veronica Spalenza et al.;《The Veterinary Journal》;20111231;第189卷;第278-283页 * |
Also Published As
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|---|---|
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