CN103740822A - 一种spf小鼠病原菌核酸荧光定量pcr联合快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种spf小鼠病原菌核酸荧光定量pcr联合快速检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒及检测方法。目的是提供的检测试剂盒应可同时对四种常见SPF动物携带病原进行检测；提供的方法具有操作简单、检测快速的特点。技术方案是：一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH2O，该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；特异性引物如下：金黄色葡萄球菌；肺炎克雷伯菌；沙门氏菌；绿脓杆菌。一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，按以下步骤进行：（1）提取样品DNA；（2）以样品DNA为模板，进行联合PCR检测；（3）反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种SPF小鼠病原菌荧光定量联合快速检测试剂盒，可应用于SPF小鼠病原菌携带的实验室快速检测鉴定。
背景技术
实验动物是生命科学研究的基础和重要支撑条件,也是药品生产检测和新药研究的基础。实验动物按其微生物、寄生虫控制程度,可划分为四个等级,即普通动物、清洁动物、无特定病原体动物(SPF动物)和无菌动物。SPF动物是国际上公认的标准级别的实验动物，适用于所有科研实验。实验动物是否达到了SPF级别,其重要的评价手段就是微生物和寄生虫质量控制,必须建立一套完整的微生物和寄生虫检测体系,来确保实验动物不携带有应排除的病原体。
研究发现，目前我国商品化SPF小鼠的细菌污染主要包括肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和绿脓杆菌。通过采用生物信息学分析手段分析上述病原菌的特异性基因靶点，基于特异性保守基因片段建立病原菌核酸荧光定量联合快速检测方法，可以为SPF小鼠的相关病原菌携带情况调查提供分子生物学检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒；该检测试剂盒应可同时对四种常见SPF动物携带病原进行检测，并具有检测结果准确、使用方便的特点。
本发明的另一目的是提供一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，该方法具有操作简单、检测快速的特点。
本发明采用的技术方案是：
一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH2O（重蒸水）；其特征在于该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；所述特异性引物序列如下：
金黄色葡萄球菌：
上游引物-FP:5’-CAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGC-3’；
下游引物-RP:5’-TAATGACATCTTTTTCTCTTGGCG-3’；
肺炎克雷伯菌：
上游引物-FP:5’-ATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTT-3’；
下游引物-RP:5’-CCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTA-3’；
沙门氏菌：
上游引物-FP:5’-CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTT-3’；
下游引物-RP:5’-TACGCCGTTATCTGTTTGTGATGCA-3’；
绿脓杆菌：
上游引物-FP:5’-TCAAGCCCACGGTCATCAGCCATCG-3’；
下游引物-RP:5’-GCCGCACTGCTCCAGTTGTTCCCAG-3’。
所述荧光定量PCR预混体系的浓度为2×。
一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，按以下步骤进行：
（1）提取待测样品DNA；
（2）以待测样品DNA为模板，4对特异性引物与荧光定量PCR预混体系以及ddH2O混合后分别配制成4个反应体系进行联合PCR检测；
（3）反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；选择荧光检测模式为SYBR荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；PCR反应荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，同时，扩增产物的融解曲线显示为单峰的特异性检测体系判断为阳性，即待测样品含有相应的病原细菌；若无典型的扩增曲线，判断为阴性。
所述步骤（2）中PCR反应体系中各成分的终浓度如下：
荧光定量PCR预混体系 使用浓度为1×
各特异性引物的上游与下游引物的浓度为10pmol/μl，使用量1μl/反应
DNA模板 使用量5μl/反应
ddH2O 用于补足反应体系至50μl。
所述步骤（3）中PCR反应条件如下：95℃10min进行解链；95℃15s，60℃1min后进行荧光检测，共进行40个循环，溶解曲线分析条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15s后进行荧光检测，60℃15s。
本发明的有益效果是：所提供的荧光PCR试剂盒可以在相同扩增条件下对SPF小鼠携带金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌情况同时进行快速核酸检测鉴定。该试剂盒检测操作方便，检测特异性好，灵敏度高，保证了检测结果准确；检测方法操作简单、检测速度显著提高，为SPF动物病原菌携带的检测研究提供了快速多重检测方法。
附图说明
图1是金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测结果示意图；
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1表示PCR反应体系对金黄色葡萄球菌核酸扩增检测结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线2表示扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线3、曲线4分别表示阴性对照的核酸扩增检测结果及溶解曲线分析结果。
图2是沙门氏菌荧光定量PCR检测结果示意图；
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1表示PCR反应体系对肺炎克雷伯菌核酸扩增检测结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线2表示扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线3、曲线4分别表示阴性对照的核酸扩增检测结果及溶解曲线分析结果。
图3是肺炎克雷伯菌荧光定量PCR检测结果示意图；
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1表示PCR反应体系对绿脓杆菌核酸扩增检测结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线2表示扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线3、曲线4分别表示阴性对照的核酸扩增检测结果及溶解曲线分析结果。
图4是绿脓杆菌荧光定量PCR检测结果示意图；
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1表示PCR反应体系对沙门氏菌核酸扩增检测结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线2表示扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线3、曲线4分别表示阴性对照的核酸扩增检测结果及溶解曲线分析结果。
图5是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌荧光定量PCR联合检测特异性分析结果示意图。
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1-4分别表示PCR反应体系依次对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、沙门氏菌核酸扩增检测结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1-4分别在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线6-9表示金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、沙门氏菌核酸扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线5、曲线10分别表示阴性对照的多重核酸扩增检测结果（4个病原菌的核酸扩增结果重合在一条曲线上）及溶解曲线分析结果（4个病原菌的核酸扩增结果重合在一条曲线上）。
图6是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌荧光定量PCR联合检测方法应用结果示意图；
其中的A图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中的横线Y表示阈值线，曲线1-4表示PCR反应体系依次对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、沙门氏菌核酸检测扩增结果，CT值为达到阈值线所需要的循环数（即曲线1-4分别在横线Y相交点的读数）；
其中的B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线6-9表示金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、沙门氏菌扩增产物的溶解曲线分析结果；曲线5、曲线10分别表示阴性对照的核酸扩增检测结果及溶解曲线分析结果。
具体实施方式
本发明的思路是：将不同的病原细菌引物与被检样本以及荧光定量PCR预混体系组成各自独立的PCR反应体系，在相同的反应条件下进行PCR扩增后同时进行检测（即不同的PCR反应体系同时上机进行扩增检测），以期达到准确、高效的目的。
所提供的试剂盒中，荧光定量PCR预混体系的浓度为2×，即2×UltraSYBR Mixture；其中包括：脱氧核糖核苷三磷酸、MgCl2、DNA聚合酶、含有SYBR Green I和ROX染料的PCR缓冲液。该荧光定量PCR预混体系可直接外购获得。各特异性引物的上游与下游引物的浓度为10pmol/μl，使用量1μl/反应（即每个反应体系使用量为1μl）。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.1材料与方法
细菌菌株与待检样本：
金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌菌株为浙江医学高等专科学校保存菌株，其目的DNA片段分别由序列表中的第3、6、9、12序列所示。待检样本来源于小鼠病原菌携带模型，样本采集后带冰运送到实验室备用。1.2引物
从美国的NCBI基因数据库下载金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌株基因组序列。通过对各病原菌的待检目的基因片段进行序列分析和同源性比对后设计特异性引物，具体信息如下(序列表中的第1，2，4，5，7，8，10，11序列)：
本发明使用的引物委托上海英骏生物科技有限公司合成。
1.3病原细菌基因组DNA的提取：
以浙江医学高等专科学校提供的金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌菌株为实验菌株。用磷酸盐缓冲液将不同病原菌稀释至105、104、103、102、101/ml每个反应管。采用宝生物工程有限公司的细菌DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书所述方法提取不同病原菌的基因组DNA，得到不同病原菌DNA作为后续PCR扩增的模板。
1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：
本发明采用的荧光定量PCR预混体系{即2×UltraSYBR Mixture(With ROX)}由北京康为世纪公司提供。4个病原菌的PCR反应体系都为50μl，其中2×UltraSYBR Mixture(With ROX)25ul，上游与下游引物各1μl，模板DNA5μl，ddH2O水补足至50μl。荧光定量PCR反应条件如下：95℃10min进行解链；95℃15s，60℃1min后进行荧光检测，共进行40个循环，融解曲线分析条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15s后进行荧光检测，60℃15s。
体系的优化试验：在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，采用不同引物浓度进行检测，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn），选择最佳引物浓度为10pmol/体系。
结果判断：选择荧光检测模式SYBR，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线并呈良好的对数增长，溶解曲线呈单独峰型，则判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。
1.5荧光PCR特异性、敏感性和重复性试验
提取金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌菌株的基因组DNA为模版，采用SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法在相同PCR扩增条件下检测上述四种病原细菌DNA验证方法的特异性；使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取不同浓度细菌基因组DNA用于SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法的灵敏度评价。此外，对每一个浓度细菌稀释液所提取的基因组DNA模板作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。
2结果
2.1荧光定量PCR反应体系及条件
荧光定量PCR扩增体系由北京康为世纪公司提供。不同病原菌检测荧光定量反应体系都为50μl，其中2×UltraSYBR Mixture(With ROX)25ul，上游与下游引物（10pmol/μl）各1μl，模板DNA5μl，ddH2O水补足至50μl。荧光定量PCR反应条件如下：95℃10min进行解链；95℃15s，60℃1min后进行荧光检测，共进行40个循环，融解曲线分析条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15s后进行荧光检测，60℃15s。阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线并呈良好的对数增长，溶解曲线呈单独峰型，则判断为阳性（图1-图4）。
2.2特异性试验
本发明建立的联合荧光定量PCR方法分别对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌具有较好的特异性，对四种病原的基因组DNA进行检测也显示阳性反应。而且病原菌之间检测无交叉反应（图5）。
2.3敏感性试验
不同病原菌均做稀释梯度：105、104、103、102、101/ml每个反应管，并通过采用宝生物工程有限公司的细菌DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书所述方法提取不同病原菌的基因组DNA。通过以不同稀释梯度病原菌的DNA提取物作为联合荧光定量PCR检测的模板。经荧光定量PCR方法进行检测，结果显示联合荧光定量PCR检测方法的病原菌检测敏感性达到101/ml，具体信息如下：
2.4重复性试验
采用本发明所建立的联合荧光定量PCR检测方法对不同病原菌的不同浓度DNA模版进行检测，反应体系如1.4中所述，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.05～0.15之间，具有较好的重复性。
2.5SPF小鼠病原菌携带模型样本的病原菌检测应用
通过建立SPF小鼠病原菌携带模型，以不同病原菌感染小鼠模型。采集SPF感染小鼠的体液和组织样本直接提取细菌DNA，之后采用本发明提供的联合荧光PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌分别进行检测和应用模拟实验，实验结果均显示本发明的检测方法可以对目的病原菌进行有效检测（图6）。
序列表
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>1
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>金黄色葡萄球菌上游引物
<400>1
CAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGC 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>2
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>金黄色葡萄球菌下游引物
<400>2
TAATGACATCTTTTTCTCTTGGCGC 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>3
<211>核苷酸119
<212>DNA
<213>葡萄球菌属（Staphylococcus）
<220>
<222>核苷酸序列（834443）…（834561）
<223>目的片段
<400>3
cgaaagggca atacgcaaag aggtttttct ttttcgctac tagttgctta gtgttaactt60
tagttgtagt ttcaagtcta agtagctcag caaatgcatc acaaacagat aacggcgta119
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>4
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>肺炎克雷伯菌上游引物
<400>4
ATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTT 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>5
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>肺炎克雷伯菌下游引物
<400>5
CCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTA 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>6
<211>核苷酸111
<212>DNA
<213>克雷伯菌属（Klebsiella）
<220>
<222>核苷酸序列（5118514）…（5118624）
<223>目的片段
<400>6
atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga60
ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg g111
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>7
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>绿脓杆菌上游引物
<400>7
TCAAGCCCACGGTCATCAGCCATCG 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>8
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>绿脓杆菌下游引物
<400>8
GCCGCACTGCTCCAGTTGTTCCCAG 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>9
<211>核苷酸149
<212>DNA
<213>假单胞菌属（pseudomonas）
<220>
<222>核苷酸序列（4298886）…（4299034）
<223>目的片段
<400>9
tcaagcccac ggtcatcagc catcgcctgc atttccccga aggcggcagc ctggccgcgc60
tgaccgcgca ccaggcctgc cacctgccgc tggagacctt cacccgtcat cgccagccgc120
gcggctggga acaactggag cagtgcggc149
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>10
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>沙门氏菌上游引物
<400>10
CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTT 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>11
<211>核苷酸25
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列（1）…（25）
<223>沙门氏菌下游引物
<400>11
TACGCCGTTATCTGTTTGTGATGCA 25
<110>浙江医学高等专科学校
<120>一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒
<160>12
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>12
<211>核苷酸115
<212>DNA
<213>沙门氏菌属（Salmonella）
<220>
<222>核苷酸序列（3060081）…（3060195）
<223>目的片段
<400>12
caacgtatat ctgaagtttt gcagcgtttg ttaagcgaac gtgtttccgt gcgtaatatg60
aagttaatta tggaagcgct cgcattgtgg gcgccaagag aaaaagatgt catta115
Claims (5)
1.一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR预混体系以及ddH2O；其特征在于该试剂盒还包括针对4种病原菌的4对特异性引物；所述特异性引物序列如下：
金黄色葡萄球菌：
上游引物-FP:5’-CAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGC-3’；
下游引物-RP:5’-TAATGACATCTTTTTCTCTTGGCG-3’；
肺炎克雷伯菌：
上游引物-FP:5’-ATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTT-3’；
下游引物-RP:5’-CCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTA-3’；
沙门氏菌：
上游引物-FP:5’-CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTT-3’；
下游引物-RP:5’-TACGCCGTTATCTGTTTGTGATGCA-3’；
绿脓杆菌：
上游引物-FP:5’-TCAAGCCCACGGTCATCAGCCATCG-3’；
下游引物-RP:5’-GCCGCACTGCTCCAGTTGTTCCCAG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR预混体系的浓度为2×。
3.一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，按以下步骤进行：
（1）提取待测样品DNA；
（2）以待测样品DNA为模板，4对特异性引物与荧光定量PCR预混体系以及ddH2O混合后分别配制成4个反应体系进行联合PCR检测；
（3）反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；选择荧光检测模式为SYBR荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；PCR反应荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，同时，扩增产物的融解曲线显示为单峰的特异性检测体系判断为阳性，即待测样品含有相应的病原细菌；若无典型的扩增曲线，判断为阴性。
4.根据权利要求3所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，其特征在于所述步骤（2）中PCR反应体系中各成分的终浓度如下：荧光定量PCR预混体系 使用浓度为1×
各特异性引物的上游与下游引物的浓度为10pmol/μl，使用量1μl/反应
DNA模板 使用量5μl/反应
ddH2O 用于补足反应体系至50μl。
5.根据权利要求3或4所述的一种SPF小鼠病原菌核酸荧光定量PCR联合快速检测方法，其特征在于所述步骤（3）中的PCR反应条件如下：95℃10min进行解链；95℃15s，60℃1min后进行荧光检测，共进行40个循环，溶解曲线分析条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15s后进行荧光检测，60℃15s。
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