CN101967510A

CN101967510A - 检测食品中常见致病菌基因芯片和试剂盒

Info

Publication number: CN101967510A
Application number: CN2009101520750A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 喻群芳; 曹勃阳; 王敏; 王海波; 冯露
Original assignee: Tianjin Biochip Corp
Current assignee: Tianjin Biochip Corp
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: CN101967510B

Abstract

本发明提供一种检测食品中常见致病菌基因芯片和试剂盒，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中上述寡聚核苷酸探针包含从金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯菌16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因以及从上述7种细菌的16SDNA中选取的DNA序列，该试剂盒包含上述基因芯片。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测食品中七种常见致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。

Description

检测食品中常见致病菌基因芯片和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测食品中七种常见致病菌的基因芯片和试剂盒。

背景技术

食源性疾病、食品污染仍然是危害公众健康的重要因素。在我国，2000年经官方报道的食物中毒案例有150起，中毒人数6273人，死亡人数150人。2003年的食物中毒案例为379，12876人中毒，323人死亡。每年近万人食物中毒案例中，除意外事故外，大部分均是致病性微生物引起的。如1999年在宁夏发生的沙门氏菌污染肉品引起的食物中毒暴发，发病人数上千人。国际上，由食品微生物引起的食物中毒同样是非常严重的食品安全问题，据不完全统计，1993年至1997年美国爆发的食物中毒事件中，有75％的案例是由致病微生物引起的，其中发病人数占总中毒人数的86％。

食品中常见的致病菌有：

1)阪崎肠杆菌，常引起婴幼儿的脑膜炎，败血症和坏死性小肠结肠炎。阪崎肠杆菌是乳制品中新发现的引起广泛关注的一种致病菌。在某种情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而致死的病例可高达40％～80％。

2) 沙门氏菌属，含有许多种，主要分为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等。能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典由于猪肉引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒，7717人中毒，90人死亡。沙门氏菌病潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤、头痛，病程一般1-2天或者更长，感染剂量为15-20个菌，死亡率达1％-4％。最易感人群是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。

3)志贺氏菌，主要分为弗氏、宋氏、鲍氏和痢疾志贺氏菌.志贺氏菌主要是经过水和食物传播，只需少量病菌(最少10个细菌)进入体内，就可引起细菌性痢疾，严重时可导致毒血症，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者易感染。

4)金黄色葡萄球菌，这是葡萄球菌中毒力最强的细菌。广泛分布于空气、土壤、水及食具。人和动物具有较高的带菌率。健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素的菌株，故易于经手或空气污染食品。金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A，B，C，D，E及F六种血清型。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。

5)化脓性链球菌化脓性链球菌，这是致病力最强的一种链球菌，能产生多种毒素(链球菌溶血素O和S)、M蛋白，脂磷壁酸和酶(链激酶、链道酶、透明质酸酶等)致病因子，可引起急性咽炎、呼吸道感染、丹毒、脓疱病、软组织感染、心内膜炎和脑膜炎等，产毒株还可引起猩红热。

6)副溶血弧菌，这是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性细菌，海产品中常有此菌，它是引起食源性疾病的主要病原之一，是夏、秋季沿海地区食物中毒和急性腹泻的重要病原。副溶血弧菌通过菌毛的粘附，产生耐热性溶血素而致病。

7)肺炎克雷伯菌，这是临床样本中常见的细菌，可引起典型的原发性肺炎.肺炎克雷伯为革兰阴性杆菌，常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内引起肺部的炎症，是肺炎类型中的一种。对一般的抗生素有一定的耐药性。

传统食品微生物检测方法主要包括前增菌、选择性增菌、分离、生化鉴定和血清型鉴定等程序，一般需要5-7天才能完成，对于一些非典型的可疑阳性菌株，需要更长的时间(长达10-15天左右)。而且不同的微生物有各自不同的检测程序，是一项繁琐、重复、费时、费力、相互独立的技术劳动，这样就很难及时地、高通量地对食品进行检测。同时，还存在着严重制约提高致病性微生物检出率的关键问题——检测灵敏度低的问题，这样很容易造成漏检，从而使含有微生物污染的食品流入市场，威胁消费者的安全。

生物芯片检测具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标的同时检测，极大的提高检测效率。本发明将基因芯片技术应用于食品中病原微生物的检测。利用生物芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高食物中致病微生物的检测速度、通量和灵敏度。大大降低成本，缩短检测时间。

发明内容

本发明的一个目的是提供食品中的七种常见致病菌检测的基因芯片，七种致病菌分别为金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌。以弥补传统检测食品中的检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

本发明所述的检测食品中常见致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：

a.从金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因；

b.所述a中选取的DNA序列的互补DNA序列；

c.a或b中所述的DNA序列的互补RNA序列。

本发明的一优选实施例中，上述a中从金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO：2-30所示的核苷酸序列中的一种或多种。

本发明所述的基因芯片，还包括阳性对照探针、阴性探针和荧光探针。

本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针选自上述金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌的16SDNA序列。

本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。

本发明所述的基因芯片可应用于检测金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯或副溶血弧菌，在上述应用中，使用检测引物，该检测引物优选具有SEQ ID NO：34-49所示的核苷酸序列中的至少一种。

本发明还提供一种检测食品中常见致病菌的试剂盒，其包含权利要求1所述的基因芯片。

本发明的一优选实施例中，上述的试剂盒还包含检测引物，该检测引物具有SEQ ID NO：34-49所示的DNA序列或其互补DNA序列中的至少一种。

本发明所述的试剂盒可应用于检测金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯或副溶血弧菌。

由上述的技术方案可见，本发明将特异基因与基因芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的食品中金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测食品中这七种致病菌目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，无论对于如出入境检验检疫部门还是食品加工企业、大型超市对食品中金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌安全检验都有重要的应用价值。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；

图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图；

图3A为利用本发明的基因芯片检测食品中沙门氏菌时的杂交结果；

图3B为利用本发明的基因芯片检测食品中化脓性链球菌时的杂交结果；

图3C为利用本发明的基因芯片检测食品中阪崎肠杆菌时的杂交结果；

图3D为利用本发明的基因芯片检测食品中肺炎克雷伯时的杂交结果；

图3E为利用本发明的基因芯片检测食品中副溶血弧菌时的杂交结果；

图3F为利用本发明的基因芯片检测食品中志贺氏菌时的杂交结果；

图3G为利用本发明的基因芯片检测食品中金黄色葡萄球菌时的杂交结果；

图3H为利用本发明的基因芯片检测食品中致病病菌的正对照杂交结果。

具体实施方式

实施例1探针的设计和制备

1.序列获得：

(1)invA基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌的全部invA基因序列。

(2)speB基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到化脓性链球菌的全部speB基因序列。

(3)zpx基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到阪崎肠杆菌的全部zpx基因序列。

(4)toxR基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到副溶血弧菌的全部toxR基因序列。

(5)16s-23s间区基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到肺炎克雷伯的全部16s-23s间区基因序列。

(6)ipaH基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到阪崎肠杆菌的全部ipaH基因序列。

(7)nuc基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到金黄色葡萄球菌的全部nuc基因序列。

(8)16s基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到七种菌的全部16s rDNA序列。

其中阪崎肠杆菌的zpx基因序列公共数据库中只有两条序列，本实验室对21株阪崎肠杆菌的zpx进行测序。先根据两条序列设计引物扩增zpx基因，切胶回收后进行测序，测序仪ABI3700。测序的结果用Staden Package软件拼接，从而得到zpx的基因序列。

2.探针设计：

(1)特异基因探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGGCCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp±2bp，T_m值68℃±3℃的探针。

(2)阳性对照探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的待检测的七种菌的16SDNA基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTTAAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp±2bp，T_m值68℃±3℃的探针。

3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。

在本发明的一优选实施例中，选择了32条长度在35bp±2bp、T_m75℃±2℃的探针，并通过120次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.31(SEQ ID NO：31)的探针序列选自的七种菌的16s rDNA，作为阳性对照用，编号为NO.32的探针为空白对照探针，编号为NO.33的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO.1的探针为荧光探针，编号NO.2-NO.8的7条探针序列(SEQ ID NO：2-SEQID NO：8)选自沙门氏菌的invA基因，编号NO.9-NO.14的6条探针序列(SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：14)选自化脓性链球菌的speB基因，编号NO.15-NO.17的3条探针序列(SEQ ID NO：15-SEQ ID NO：17)选自阪崎肠杆菌的zpx基因，编号NO.18-NO.21的4条探针序列(SEQ IDNO：18-SEQ ID NO：21)选自肺炎克雷伯的16s-23s间区基因，编号NO.22-NO.23的2条探针序列(SEQ ID NO：22-SEQ ID NO：23)选自副溶血弧菌的toxR基因，编号NO.24-NO.27的4条探针序列(SEQ IDNO：24-SEQ ID NO：27)选自志贺氏菌的ipaH基因，编号NO.28-NO.30的3条探针序列(SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：30)选自金黄色葡萄球菌的nuc基因。

表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌

实施例2引物的设计和制备

1.序列获得：同前设计探针的序列。

2.设计引物：

(1)扩增特异基因序列引物的设计：将上述从GenBank公共数据库下载得到特异基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.Search Ranges：Sense Primer 1to 672，Anti-sense Primer 1to 672，PCR Product Size：100bpto 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic。从输出结果中选取T_m值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含探针序列在内的引物。

(2)扩增16SDNA序列引物的设计：从公共数据库NCBI中下载得到的7种细菌的16S rDNA序列，用序列比对软件Glustal X比对后，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.Search Ranges：Sense Primer 1to 672，Anti-sense Primer 1to 672，PCRProduct Size：100bp to 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic。从输出结果中选取T_m值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含阳性对照探针序列在内的引物。

3.引物合成：将下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京英俊)合成，备用。

4.引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别扩增的金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因以及16SDNA检测引物的扩增性，另一方面，7对引物分为两组对这7种致病菌进行扩增检测引物的相容性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。

在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合同时使用7对引物扩增金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌特异基因和1对扩增16SDNA的引物共16条，为了同时进行两组多重PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。

表2用于食品中常见致病菌特异基因PCR扩增的引物序列

引物编号	SEQID	引物序列(5’-3’)	扩增作用
				P-1	NO：34	CCTTTGACGGTGCGATG	invA
P-2	NO：35	CCTTTRCGAATAACATCCT	invA
				P-3	NO：36	CGCTATCACATTTATCCAA	speB
P-4	NO：37	AATACCAACATCAGCCATC	speB
				P-5	NO：38	TGGACGAAGCCTACGACTATCT	zpx
P-6	NO：39	ACGTCAATGGCGATAGTAAA	zpx
				P-7	NO：40	GCGAAGCAAATTTGAAGAG	16S-23S间区
P-8	NO：41	CCGAAGATGTTTCACTTCTGA	16S-23S间区

P-9	NO：42	CCAAATAGTAATTCGCTCG	toxR
				P-10	NO：43	CAAATCGGTAGTAATAGTGC	toxR
P-11	NO：44	TTCCTTGACCGCCTTTC	ipaH
				P-12	NO：45	GCCAGTACCTCGTCAGTCA	ipaH
P-13	NO：46	AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC	nuc
				P-14	NO：47	GAAAGGGCAATACGCAAAGA	nuc
P-15	NO：48	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	16SDNA
				P-16	NO：49	CCGTCAATTCMTTTRAGTTT	16SDNA

注：M：(A/C)；R：(A/G)

实施例3基因芯片制备——芯片点样

1.溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。

2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。

3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mm×2.25mm，该点阵内点间距250μm，矩阵：12×9，12×250μm＝3mm，9×250μm＝2.25mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。

4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。

5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。

由图2可见，每个点样区内为12(行)×9(列)个探针点。NO.1框区示意的位置为荧光探针，NO.31框区示意的位置为阳性对照探针，NO.32框区示意的位置为空白对照探针，NO.33框区示意的位置为负对照探针，NO.2-NO.30为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。

实施例4利用基因芯片快速检测食品中常见致病菌

1.样品处理：25g食品样品(如猪肉)加入预先配制好的225ml 2YT培养基中，37℃，200rpm振荡培养5h-10h进行前增菌，取10ml前增菌液分别转接到肠道增菌肉汤(Enterobacteria Enrichment Broth EEB)、肉浸液肉汤(Meat Infusion Broth MIB)、碱性蛋白胨水(Alkaline peptone water APW)这三种选择性培养基中，37℃过夜培养14-16h。

2.提取基因组：取1.4ml过夜培养样品，12000rpm离心3分钟沉淀可能存在的致病菌菌体，弃上清(尽量空干)。向沉淀中加入100ul的裂解液(配方如下)，50℃温育1h，100℃沸水浴15分钟，12000rpm离心5分钟，上清即为粗提的DNA模板。

附：裂解液配方：

1×PCR缓冲液(含Mg⁺)

0.5％的NP 40

0.5％的Tween 20

3.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的5ul中层上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应分为三管：A组、B组和阳性对照，混合液配方如下表3所示。其中用EEB和MIB选择性增菌提取的基因组用A组PCR进行扩增，用EEB和APW选择性增菌提取的基因组用B组PCR进行扩增(注：以下表3-表5中的PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)PCR反应混合液配方见表3.1-3.3

表3.1A组PCR反应混合液配方

表3.2B组PCR反应混合液配方

表3.3阳性对照PCR反应混合液配方

注：表中P-1至P-16为表2中所列的引物。

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃5分钟

94℃30秒

50℃30秒

72℃1分钟回到第二步，共35个循环

72℃5分钟

4℃20分钟

纯化：将上述获得的A组和B组PCR扩增产物合管用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：

(1)将A组和B组PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。

(2)1000g室温离心15分钟，丢弃收集管。

(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入28μl的超纯水(MilliQ)，室温放置5分钟。

(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，1000g离心2分钟，收集产物。

4.荧光标记PCR：取24μl纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4.1-4.2所示。

表4.1标记混合液配方

表4.2阳性对照标记混合液配方

注：表中P-1、P-4、P-6、P-8、P-10、P-12、P-13和P-16为表2中所列的引物。

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃5分钟

94℃30秒

50℃30秒

72℃1分钟回到第二步，共35个循环

72℃5分钟

4℃20小时

5.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。

6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH₂O以保持湿度。16μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，40℃水浴锅中杂交16小时。

7.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。

杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE

洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95％乙醇

8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：

软件及版本：GenePix Pro 6.0

official name：575DF35

PMT Gain：650

扫描分辨率：10μm

扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式

用本发明的基因芯片分别检测常见的食品中的金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌时的杂交扫描结果如图3A-3H所示。

9.分析判读：由于细菌数目较少，探针点也较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，判断出现荧光信号的特异探针的位置，invA基因探针有信号说明样品中存在沙门氏菌，speB基因探针有信号说明样品中存在化脓性链球菌，zpx基因探针有信号说明样品中存在阪崎肠杆菌，16S-23S间区基因探针有信号说明样品中存在肺炎克雷伯，toxR基因探针有信号说明样品中存在副溶血弧菌，ipaH基因探针有信号说明样品中存在志贺氏菌，nuc基因探针有信号说明样品中存在金黄色葡萄球菌。对照点阵排布图判断出致病菌。若只有阳性对照探针有信号，其它的探针无信号则不存在以上7种致病菌。

实施例5对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

对实施例3中制备的食品中食品中常见的致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：

总计用167株待检测菌株和近缘菌株来鉴定实施例三中制备的食品中检测食品中常见的致病菌基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。

表5：特异性试验用到的菌株

a.中国兽医微生物菌种保藏管理中心.

b.中国医学微生物菌种保藏管理中心

c.American Type Culture Collection(ATCC).

d.中国科学院微生物所

e.中国军事医学科学院

f.天津出入境检验检疫局

g.临床菌株

对实施例3中制备的食品中常见的致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下：

该基因芯片的检测灵敏度经过84次杂交实验的验证，0.1ng的微量基因组DNA或每25g(ml)食品中有(1-5)cfu就可保证上述四种致泄泻类型的致泻性大肠杆菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。

根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>检测食品中常见致病菌基因芯片和试剂盒

<130>9P13003-CN

<160>46

<170>PatentIn version 3.3

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>2

tttttttttt ttttttattg gcggtatttc ggtggggatg 40

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>3

tttttttttt tttttttgat ggtcttgtcg cccagatccc 40

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>4

tttttttttt ctgttgaaca acccatttgt attggttgtt acg 43

<210>5

<211>45

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>5

tttttttttt ctcttctatt ttaaattccg tgaagcaaaa cgtag 45

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>6

tttttttttt gttgattaat gagatccgtg ttgaacaatt tacgg 45

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>7

tttttttttt gcaacgtcaa tgaatatttc ggtattcagg aaac 44

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>从沙门氏菌的invA基因中选取的DNA序列

<400>8

tttttttttt gaattacgag cagtaatggt atctgctgaa gttg 44

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>9

tttttttttt ttcagcagct atcaaagcag gtgcacgaag 40

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>10

tttttttttt caatatttct actggaggat ttgttatcgt ttcaggag 48

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>11

tttttttttt cgttctccag aaattctagg atactctacc agcgg 45

<210>12

<211>47

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>12

tttttttttt ggtaaccctt acaacctatt gacacctgtt attgaaa 47

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>13

tttttttttt caggtgaaca atcttttgta ggtcaacatg cag 43

<210>14

<211>45

<212>DNA

<213>从化脓性链球菌的speB基因中选取的DNA序列

<400>14

tttttttttt ccatatttca accatcctaa gaacttgttt gcagc 45

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>从阪崎肠杆菌zpx基因中选取的DNA序列

<400>15

tttttttttt tttgaagcct acgactatct gggcgtgacg 40

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>从阪崎肠杆菌zpx基因中选取的DNA序列

<400>16

tttttttttt ttttttgcgc gattcgctcg acaacaaagg 40

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>从阪崎肠杆菌zpx基因中选取的DNA序列

<400>17

tttttttttt tttttttatg gtctttggcg acggcgatgg 40

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>从肺炎克雷伯16S-23S间区中选取的DNA序列

<400>18

tttttttttt ttttcgatgg ggctatagct cagctgggag 40

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>从肺炎克雷伯16S-23S间区中选取的DNA序列

<400>19

tttttttttt ttcgatcccg catagctcca ccatctttac 40

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>从肺炎克雷伯16S-23S间区中选取的DNA序列

<400>20

tttttttttt ttcctgaaaa ggtgcactgc gaagttttgc 40

<210>21

<211>43

<212>DNA

<213>从肺炎克雷伯16S-23S间区中选取的DNA序列

<400>21

tttttttttt aatctggatc aagctgaaaa ttgaaacgac aca 43

<210>22

<211>47

<212>DNA

<213>从副溶血弧菌的toxR中选取的DNA序列

<400>22

tttttttttt agttgtacga ttaggaagca acgaaagccg tatactc 47

<210>23

<211>46

<212>DNA

<213>从副溶血弧菌的toxR中选取的DNA序列

<400>23

tttttttttt aagttttaac ccgtaacgag cttcacgagt ttgttt 46

<210>24

<211>40

<212>DNA

<213>从志贺氏菌的ipaH中选取的DNA序列

<400>24

tttttttttt tttgataatg ataccggcgc tctgctctcc 40

<210>25

<211>40

<212>DNA

<213>从志贺氏菌的ipaH中选取的DNA序列

<400>25

tttttttttt tttgaaatgt tccgcctcga aattctggag 40

<210>26

<211>40

<212>DNA

<213>从志贺氏菌的ipaH中选取的DNA序列

<400>26

tttttttttt agatagaagt ctacctggcc ttccagacca 40

<210>27

<211>40

<212>DNA

<213>从志贺氏菌的ipaH中选取的DNA序列

<400>27

tttttttttt ttttaggaaa tgcgtttcta tggcgtgtcg 40

<210>28

<211>49

<212>DNA

<213>从金黄色葡萄球菌的nuc中选取的DNA序列

<400>28

tttttttttt tttttttttt ttttttgata cacctgaaac aaagcatcc 49

<210>29

<211>49

<212>DNA

<213>从金黄色葡萄球菌的nuc中选取的DNA序列

<400>29

tttttttttt ttttttttt t tttttttgtg tagagaaata tggtcctga 49

<210>30

<211>49

<212>DNA

<213>从金黄色葡萄球菌的nuc中选取的DNA序列

<400>30

tttttttttt tttttttttt ttttttttga caaaggtcaa agaactgat 49

<210>31

<211>49

<212>DNA

<213>从16SDNA中选取的DNA序列

<400>31

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tactcctacg ggaggcagc 49

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>检测沙门氏菌invA基因的引物

<400>34

cctttgacgg tgcgatg 17

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>检测沙门氏菌invA基因的引物

<400>35

cctttrcgaa taacatcct 19

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>检测化脓性链球菌的speB基因的引物

<400>36

cgctatcaca tttatccaa 19

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>检测化脓性链球菌的speB基因的引物

<400>37

aataccaaca tcagccatc 19

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>检测阪崎肠杆菌的zpx基因的引物

<400>38

tggacgaagc ctacgactat ct 22

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>检测阪崎肠杆菌的zpx基因的引物

<400>39

acgtcaatgg cgatagtaaa 20

<210>40

<211>19

<212>DNA

<213>检测肺炎克雷伯16S-23S间区的引物

<400>40

gcgaagcaaa tttgaagag 19

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>检测肺炎克雷伯16S-23S间区的引物

<400>41

ccgaagatgt ttcacttctg a 21

<210>42

<211>19

<212>DNA

<213>检测副溶血弧菌的toxR基因的引物

<400>42

ccaaatagta attcgctcg 19

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>检测副溶血弧菌的toxR基因的引物

<400>43

caaatcggta gtaatagtgc 20

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>检测志贺氏菌的ipaH基因的引物

<400>44

ttccttgacc gcctttc 17

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>检测志贺氏菌的ipaH基因的引物

<400>45

gccagtacct cgtcagtca 19

<210>46

<211>24

<212>DNA

<213>检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的引物

<400>46

agccaagcct tgacgaacta aagc 24

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的引物

<400>47

gaaagggcaa tacgcaaaga 20

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>检测16SDNA的引物

<400>48

agagtttgat cmtggctcag 20

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>检测16SDNA的引物

<400>49

ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims

1.一种检测食品中常见致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：

a.从金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯菌16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因中选取的DNA序列；

b.所述a中选取的DNA序列的互补DNA序列；

c.a或b中所述的DNA序列的互补RNA序列。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述a中从金黄色葡萄球菌的nuc基因、化脓性链球菌的speB基因、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH基因、阪崎肠杆菌zpx基因、肺炎克雷伯菌16S-23S间区、副溶血弧菌的toxR基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO：2-30所示的核苷酸序列中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于还包括阳性对照探针、阴性探针和荧光探针。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针选自权利要求1中a所述金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌、副溶血弧菌的16SDNA序列。

5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。

6.权利要求1所述的基因芯片在检测金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯或副溶血弧菌中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于使用检测引物，该检测引物具有SEQ ID NO：34-49所示的核苷酸序列中的至少一种。

8.一种检测食品中常见致病菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包含检测引物，该检测引物具有SEQ ID NO：34-49所示的DNA序列或其互补DNA序列中的至少一种。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在检测金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌或副溶血弧菌中的应用。