CN107858421A - 用荧光rt‑pcr技术检测半滑舌鳎fabp2基因的特异性引物及其用途 - Google Patents

用荧光rt‑pcr技术检测半滑舌鳎fabp2基因的特异性引物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用荧光RT‑PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，上游引物：FABP2‑F：5'‑CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC‑3'，下游引物：FABP2‑R：5'‑ATGTGGCAATCACCGTCTGT‑3'；还包括一对用于实时荧光PCR内对照的引物对，上游引物：C‑β‑actin‑F：5'‑CTATGTCGCCTTGGACTTCG‑3'，下游引物：C‑β‑actin‑R：5'‑TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA‑3'。本发明当FABP2基因相对表达量增高时，半滑舌鳎可能处于病原感染状态，通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并根据判断采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。

Description

用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及 其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体说，是一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途。
背景技术
水产养殖的发展面临着许多困难，但种质和种苗、养殖环境和病害是三大主要问题，其中病害对水产养殖业发展的阻碍日益严重。伴随鱼类养殖业的快速发展，养殖密度和集约化程度的不断提高，养殖病害已成为限制鱼类养殖业可持续健康发展难以逾越的瓶颈，各种传染性疾病给水产养殖业带来了灾难性甚至是毁灭性的打击。病害的防治和控制已经成为发展水产养殖业应该解决的首要问题。许多传染性的鱼病，在其发病过程中都可能出现肠道充血、发炎等炎性症状，但由肠道致病菌引起的细菌性肠炎病发生更为普遍，我国各养殖地区的海水及淡水鱼均有发生。但目前对鱼类肠炎病或有并发肠炎疾病的诊断基本上是解剖之后基于肠道病症以及组织病理学特征。
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是一种广泛分布于我国沿海地区的底栖鱼类，尤其在黄海和渤海分布较多。半滑舌鳎出肉率高，营养丰富，味道鲜美，具有较高的经济价值。随着半滑舌鳎人工繁殖及养殖技术的日渐成熟，近年来逐渐成为我国最具吸引力的海水养殖鱼类之一。由于目前半滑舌鳎的养殖模式大多为室内工厂化养殖，养殖密度大，而造成疾病频繁发生。半滑舌鳎常见病原菌为副溶血弧菌、鳗弧菌、鳗利斯顿氏菌、发光杆菌、海藻希瓦氏菌等。近年来，天津市养殖半滑舌鳎出现了大量死亡的现象，病鱼往往腹部隆起，严重时整个腹腔由于大量积水而呈半透明状，部分消化道从泄殖孔中凸出，打开腹腔后，发现病鱼胃肠道中或腹腔内有大量无色或淡黄色的液体，解剖后可见明显肠炎症状，临床上一般称其为“腹水病”。
肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)是脂肪酸结合蛋白超家族中的重要成员，主要参与机体对脂肪酸的吸收、转运、以及在细胞器内的再分布及利用。近年研究表明，FABP2与代谢性疾病、炎症性疾病、肠组织缺血损伤等密切相关，不但是肠组织损伤的敏感性标志，而且可以作为炎症严重程度的评价指标。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。近年来出现的实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。一方面实时荧光PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，这将有助于对疾病的诊断和治疗。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。
肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)是脂肪酸结合蛋白超家族中的重要成员，主要参与机体对脂肪酸的吸收、转运、以及在细胞器内的再分布及利用。近年研究表明，FABP2与代谢性疾病、炎症性疾病、肠组织缺血损伤等密切相关，不但是肠组织损伤的敏感性标志，而且可以作为炎症严重程度的评价指标。FABP2于肠道粘膜上皮细胞的表达情况，能提示炎症严重程度及愈后情况。FABP2能够提示肠道功能失调以及肠道的吸收障碍。研究证明，FABP2在肠道炎症中有明显的提高,推测可作为预测炎症严重程度的一个指标。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途，具有灵敏度高，特异性好的特点。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，其核苷酸序列如下：
上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQ ID NO.1
下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQ ID NO.2。
还包括一对用于实时荧光PCR内对照的引物对，其核苷酸序列如下：
上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'SEQ ID NO.3
下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'SEQ ID NO.4。
上述用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物用于检测半滑舌鳎肠道炎症的用途。
本发明的有益效果是：当FABP2基因相对表达量增高时，半滑舌鳎可能处于病原感染状态，但此时还不能从临床症状观察到半滑舌鳎有任何感染症状。因此通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并根据判断采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。
附图说明
图1是利用引物FABP2-F和FABP2-R扩增FABP2基因的PCR产物的电泳图。
图2是利用引物C-β-actin-F和C-β-actin-R扩增β-actin基因的PCR产物的电泳图。
图3是健康和感染半滑舌鳎FABP2基因相对于β-actin基因的表达量图。
图4是感染半滑舌鳎FABP2基因相对于健康半滑舌鳎FABP2基因的表达量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
1.引物设计：
根据FABP2基因的全长序列，使用primer 6软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQ ID NO.1
下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQ ID NO.2
FABP2基因的PCR产物预计长度为107bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物特异性强，适合用于实时荧光PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
同时，根据NCBI里提供的半滑舌鳎β-actin基因的cds的序列(KP033459)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：
上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'SEQ ID NO.3
下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'SEQ ID NO.4
半滑舌鳎β-actin基因的PCR产物预计长度为191bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
本发明所述的每条引物分别配制成浓度为25μl/L的贮存液，工作浓度为0.5μl/L。
2.半滑舌鳎感染试验：
未使用过疫苗的健康半滑舌鳎(19±0.5cm；130±5g)18尾，暂养于水族箱内，每尾腹腔注射海藻希瓦氏菌活菌0.2mL或者注射0.2mL PBS用作对照，继续养殖，于0h和12h处死半滑舌鳎解剖并分离肠道组织。
3.总RNA提取与纯化：
采用各种通用的提取方法和纯化方法，从半滑舌鳎肠道中提取得到纯化的半滑舌鳎肠道组织总RNA。
4.cDNA第一链合成：
cDNA第一链合成采用Thermo Scientific公司的RevertAid Premium ReverseTranscriptase试剂盒，反转录引物使用试剂盒提供的随机合成引物，以肠道组织总RNA为模板合成cDNA第一链，RNA按照800ng反转录，反应体系为20μl。操作步骤如下：
(1)在冰浴的无核酸酶的PCR管中加入以下试剂：
(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。
(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
4.0μl 5*RT缓冲液
0.5μl Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)
1.0μl RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)
(4)轻轻混匀后离心3～5s
(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应
①25℃孵育10min
②cDNA合成50℃ 30min
③终止反应 85℃ 5min，处理后，置于冰上放置
(6)将上述溶液-20℃保存。
5.实时荧光定量PCR
以上述合成的cDNA样品稀释10倍作为模板，上述FABP2-F、FABP2-R、C-β-actin-F、C-β-actin-R为特异性引物，采用BBI公司的SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)试剂盒，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增产物。每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均值。
实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR扩增参数如下：
6.感染半滑舌鳎肠道组织中FABP2基因相对表达量计算：
实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算半滑舌鳎病原感染0h和12h的△Ct、2-(△Ct)、2-(△△Ct)值。
计算方式如下：
△Ct＝Ct-Ct内对照(β-actin)
△△Ct＝△Ct-△Ct(0时健康半滑舌鳎)
以2-(△Ct)数值表示半滑舌鳎肠道中基因相对于β-actin基因的表达量。
以2-(△△Ct)数值表示半滑舌鳎中FABP2基因相对于健康半滑舌鳎FABP2基因的表达量。
实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。FABP2基因特异地表达于肠粘膜细胞，具有广泛生物学效应，能对多种代谢酶、细胞内信号传导和受体产生影响，如参与细胞内信号调控，调节功能蛋白的转录和表达，参与调控细胞增殖，维持稳定生物膜等，还通过调控脂肪酸介导的基因表达来调控脂肪酸的代谢。实时荧光定量PCR检测方法操作简捷，提高了敏感性及特异性，为早期诊断肠粘膜损伤及肠道炎症提供了更精准的方法。
肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)是脂肪酸结合蛋白超家族中的重要成员，主要参与机体对脂肪酸的吸收、转运、以及在细胞器内的再分布及利用。近年研究表明，FABP2与代谢性疾病、炎症性疾病、肠组织缺血损伤等密切相关，不但是肠组织损伤的敏感性标志，而且可以作为炎症严重程度的评价指标。FABP2于肠道粘膜上皮细胞的表达情况，能提示炎症严重程度及预后情况。研究证明，FABP2在肠道炎症中表达升高，可作为预测炎症严重程度的一个指标。所以，采用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因表达，当FABP2基因相对表达量增高时，半滑舌鳎可能处于病原感染状态，但此时还不能从临床上观察到半滑舌鳎有任何感染症状。因此通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并及时采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。所以一旦发现表达量升高，立即采取广谱预防措施，赢取时间并做进一步详细诊断和治疗。
实施例1
半滑舌鳎感染实验：
海藻希瓦氏菌(由天津农学院水产学院水产动物病害及免疫学实验室提供)接种于液体培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L NaCl，0.01g/L磷酸铁)中，于28℃恒温振荡(150r/min)培养24h。在550nm下测定值OD值，计算菌体浓度及细胞总数。离心收集菌体，并用PBS离心洗涤菌体三次，配制成1.0×108CFU/ml浓度的海藻希瓦氏菌菌液。
未使用过疫苗的健康半滑舌鳎(19±0.5cm；130±5g)18尾，暂养于水族箱内，每尾腹腔注射海藻希瓦氏菌活菌0.2mL或者注射0.2mL PBS用作对照，继续养殖，于0h和12h处死半滑舌鳎解剖分离肠道组织，置于液氮中保存。
实施例2
总RNA提取与纯化：
采用Takara RNAiso Plus Total RNA提取试剂提取各样品总RNA，具体步骤如下：
1.将液氮中冷冻的肠道组织称量(2g)后迅速转移至研磨管中，并立即加入1mLRNAiso Plus，充分匀浆。
2.将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。
3. 12000g，4℃离心5min。小心吸取上清液，移入新的离心管中。
4.向上清液中加入200mL氯仿，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。
5.室温静置5min。
6. 12000g，4℃离心15min。吸取上清液转移至另一新的离心管中。
7.向上清中加入1mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10min。
8. 12000g，4℃离心10min。小心弃去上清。
9.加入1mL 75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g，4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀。
10.打开离心管盖，室温干燥沉淀10分钟。沉淀干燥后，加入50μL无RNase的水溶解RNA沉淀。
实施例3
FABP2基因的实时荧光RT-PCR检测
1.引物设计：
根据FABP2的全长序列，使用primer 6软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'
下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'
FABP2的PCR产物预计长度为107bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
同时，根据NCBI里提供的半滑舌鳎β-actin的cds的的序列(KP033459)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：
上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'
下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'
半滑舌鳎β-actin的PCR产物预计长度为191bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
2.cDNA第一链合成：
cDNA第一链合成采用Thermo Scientific公司的RevertAid Premium ReverseTranscriptase试剂盒，反转录引物使用试剂盒提供的随机合成引物，以实施例2中肠道总RNA为模板合成cDNA第一链，RNA按照800ng反转录，反应体系为20μl。操作步骤如下：
(1)在冰浴的无核酸酶的PCR管中加入以下试剂：
(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。
(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
4.0μl 5*RT缓冲液
0.5μl Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)
1.0μl RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)
(4)轻轻混匀后离心3～5s
(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应
①25℃孵育10min
②cDNA合成50℃ 30min
③终止反应85℃ 5min，处理后，置于冰上放置
(6)将上述溶液-20℃保存。
3.实时荧光定量PCR
以上述合成的cDNA样品稀释10倍作为模板，上述FABP2-F、FABP2-R、C-β-actin-F、C-β-actin-R为特异性引物，采用BBI公司的SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)试剂盒，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增产物。每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均值。
实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR扩增参数如下：
4.感染半滑舌鳎肠道组织中FABP2基因相对表达量计算：
实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算半滑舌鳎病原感染后的△Ct、2-(△Ct)、2-(△△Ct)值，计算方式如下：
△Ct＝Ct-Ct内对照(β-actin)
△△Ct＝△Ct-△Ct(0时健康半滑舌鳎)
以2-(△Ct)数值表示半滑舌鳎肠道中FABP2基因相对于β-actin基因的表达量。以2-(△△Ct)数值表示半滑舌鳎肠道中FABP2基因相对于健康半滑舌鳎FABP2基因的表达量。
β-actin基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中当2-(△Ct)或2-(△△Ct)数值越大，表明FABP2基因的表达量越高。
图3和图4为腹腔注射病原菌后，半滑舌鳎肠道组织中FABP2基因的表达变化。从图3中看出，基因FABP2的表达量总是低于看家基因β-actin的表达量；未感染时的健康半滑舌鳎FABP2基因的表达量是看家基因β-actin的0.46倍，腹腔注射海藻希瓦氏菌后半滑舌鳎肠道组织中FABP2基因表达量升高，是看家基因β-actin的0.53倍(图3)。从图4中看出，感染海藻希瓦氏菌后半滑舌鳎FABP2基因表达量是健康半滑舌鳎FABP2基因表达量的1.23倍(图4)。
因此通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并及时采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。所以一旦发现表达量升高，立即采取广谱预防措施，赢取时间并做进一步详细诊断和治疗。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttcctcttg cttcttacct gc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtggcaat caccgtctgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctatgtcgcc ttggacttcg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttgtaggt ggtctcgtgg a 21

Claims (3)

1.一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，其特征在于，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，其核苷酸序列如下：
上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQ ID NO.1
下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，其特征在于，还包括一对用于实时荧光PCR内对照的引物对，其核苷酸序列如下：
上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'SEQ ID NO.3下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'SEQ ID NO.4。
3.如权利要求1或2所述用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物用于检测半滑舌鳎肠道炎症的用途。
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