CN103031362A

CN103031362A - 通用actb基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒

Info

Publication number: CN103031362A
Application number: CN2011102908722A
Authority: CN
Inventors: 刘畅
Original assignee: CHENGDU LINGDONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU LINGDONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明涉及一种能够定量检测人、大鼠、小鼠等多个物种的ACTB基因表达的荧光定量体外扩增检测试剂盒；其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准ACTB模板；其中所用引物和探针序列分别为：上游引物：SEQ ID NO 1；下游引物：SEQ ID NO 2；探针序列：SEQ ID NO 3；引物和探针浓度为每条0.25umol/L、Taq DNA聚合酶1.5U/50ul、dNTPs底物0.3mmol/L、模板cDNA若干、Mg++2.5mmol/L、缓冲液1XPCR；标准ACTB模板序列为：SEQ ID NO 4。

Description

通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒

技术领域

本发明涉及一种操作简单、高特异性和能够定量检测人、大鼠、小鼠等多个物种ACTB(actin，beta)基因表达的DNA体外扩增试剂盒，属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。

背景技术

在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是最主要的也是很有效的常用技术。该技术系将耐热DAN聚合酶、特异引物、dNTPs底物、模板DNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温、低温、中温的热循环，以使模板DNA变性、引物与模板复性、引物沿模板DNA延伸反复进行，而达到靶DNA片段在体外呈2ⁿ倍扩增(其中n为热循环次数)。荧光定量PCR技术则在PCR反应的基础上，耦合以实时荧光检测和计算机分析技术，即在PCR反应体系中加入能够反映DNA扩增情况的荧光物质，并通过检测经过每个热循环后的荧光变化情况来实时探测DNA的扩增情况，并通过标准曲线对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。TaqMan探针技术是目前最常用的和应用最成功的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一条能够与待扩增检测的靶DNA序列互补配对的寡核苷酸，其5’端标记了一个荧光报告基团(R)，其3’端标记了一个荧光淬灭基团(Q)。当这条探针处于游离状态或者没有发生反应时，R所产生的荧光将被Q吸收或淬灭；在PCR反应中，该探针可与PCR目标基因发生杂交，并由TaqDNA聚合酶的依赖于聚合的外切活性切断，使得R与Q分离，游离的R发出荧光可被荧光检测装置检测。随着PCR反应的进行，被切断的荧光报告基团(R)与PCR产物相对应的增加。因此，根据荧光报告基团(R)产生的荧光信号的强弱，即可测量出PCR反应产物的数量。再依据标准曲线即可对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

在荧光定量PCR检测中，经常遇到检测基因相对表达量的情况，其中内对照基因常常选择ACTB。有鉴于此，我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、大鼠、小鼠等多个物种ACTB基因表达的引物和探针，优化出了其PCR反应的条件，并组装成通用ACTB基因表达检测荧光定量聚合酶链反应试剂盒。

发明内容

本发明的技术方案是：首先获得人、大鼠、小鼠的ACTB标准序列，进行BLAST同源性比较，再根据比较结果设计相应的引物和探针，最后将引物、探针加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。

所优选出的引物和探针的序列分别如下：

上游引物P1：5’-AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物P2：5’-CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3’(SEQ ID NO：2)；

TaqMan探针序列：5’-FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3’(SEQ ID NO：3)

所优化出的PCR扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下：特异的引物和探针每条0.25umol/L、Taq DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.3mmol/L、模板cDNA若干、Mg++2.5mmol/L、缓冲液1XPCR；其中1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/L Tris.HClPH8.3、0.01％明胶。

该ACTB荧光定量PCR由于引物和探针在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能够有效扩增来源于这些物种的ACTB基因，从而检测ACTB基因的表达量。

根据上述研究结果，将上述引物、探针和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板组装成通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。标准ACTB基因模板的序列为：

5’-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTATGAGGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’(SEQID NO：4)

具体实施方式：

1、在DNA合成仪上人工合成下述引物和探针各20D，并用TE缓冲液(其中含10mmol/LTris，1含10mmol/L EDTA)稀释至10umol/L。其中上游引物P1序列为：5’-AGA TGA CCCAGA TCA TGT TTG-3’(SEQ ID NO：1)；下游引物P2：5’-CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3’(SEQ ID NO：2)；TaqMan探针序列：5’-FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3’(SEQID NO：3)

2、取各引物、探针各37.5ul，25mmol/L dNTPs 18ul，、25mmol/L MgCl₂150ul，10XPCR反应缓冲液150ul，5U/ul Taq DNA聚合酶9ul，超纯水990.5ul加入到2ml的干净无菌试管中，充分混匀，配制1400ul FQ-PCR反应预混液。

3、将预混液成按46.7ul/管分装成30小管(用200ul PCR扩增管)，再配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管，每管各20ul，即组装成了通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。其中标准ACTB基因模板的序列为：

5’-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’(SEQ ID NO：4)

4、FQ-PCR扩增

每个装有46.7ulPCR反应预混液的反应管中分别加入3.3ul待测cDNA，水或标准ACTB基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(如PE9600)中，96℃下变性5分钟，然后按96℃20秒，53℃30秒，60℃30秒热循环45次，并在60℃时检测记录荧光信号；PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于2.5％琼脂糖凝胶行PCR产物电泳，溴乙锭染色，GelDoc1000下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。4.结果

在30个标本的FQ-PCR反应中，经电泳检测，加入待测标本和标准品的反应产物中均检测到了预期大小的192bp左右的PCR产物条带，而未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物。加入标准ACTB基因模板和待测标本的反应均获得了S形的扩增曲线，加入标准ACTB基因模板的Ct值与加入模板拷贝数的对数呈线性关系，可以拟合成一条直线，斜率-3.35，截距为41.3，相关系数9.9，说明该反应体系和反应条件均符合精确定量研究的要求。

Claims

1.一种操作简单、能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠等多个物种的ACTB基因表达的DNA荧光定量体外扩增检测试剂盒；其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系，以及标准ACTB模板。

2.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于：所用引物和探针序列分别为：上游引物P1：5’-AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG-3’(SEQ IDNO：1)；下游引物P2：5’-CCA CCT CCA GAC GCA GGA T-3’(SEQ ID NO：2)；TaqMan探针序列：5’-FAM-CAC CCA CAC TGT GCC CATC-TAMRA-3’(SEQ ID NO：3)。

3.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于：特异的引物和探针每条0.25umol/L、Taq DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.3mmol/L、模板eDNA若干、Mg++2.5mmol/L、缓冲液1XPCR；其中1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.01％明胶。

4.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒，其特征在于：标准ACTB基因模板序列为：5’-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTATGA GGGTTACGCGCTCCCTCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’(SEQ ID NO：4)：其浓度分别为10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML。