CN102517395A - 通用actb基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种操作简单、快速,能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠的ACTB基因表达的DNA荧光定量体外扩增检测试剂盒;其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系,以及标准ACTB模板;其中所用引物和探针序列分别为:上游引物P1(SEQ ID NO:1);下游引物P2(SEQID NO:2);TaqMan探针序列(SEQID NO:3);引物和探针浓度为每条0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5U/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg2+2.5mmol/L、缓冲液1×PCR;标准ACTB基因模板序列为(SEQ ID NO:4)。
Description
技术领域
本发明涉及一种操作简便、快速,且能够定量检测人、大鼠、小鼠三个物种β-肌动蛋白(Beta-actin,ACTB)基因mRNA表达的DNA体外扩增试剂盒,该发明属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是现有的DNA体外扩增技术中最常用、也是最有效的技术;该技术系将耐热DAN聚合酶、特异引物、dNTPs底物、模板DNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中,进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环,从而达到靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中n为热循环次数);荧光定量PCR技术则在PCR反应的基础上,耦合以实时荧光检测和计算机分析技术,即在PCR反应体系中加入特定的荧光物质,通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光变化情况来实时探测DNA的扩增情况,并获得每个标本的荧光定量变化曲线,进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数);同时,在相同的反应体系和反应条件下检测4-5个倍数稀释的已知数量的靶标DNA,获得其Ct值,以起始模板数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标制备标准曲线,据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定;TaqMan探针技术是目前最常用的荧光定量PCR技术;TaqMan探针是一条能够与待扩增检测的靶DNA序列互补配对的寡核苷酸,其5’端标记了一个荧光报告基团(R),其3’端标记了一个荧光淬灭基团(Q);当该探针处于游离状态或者没有发生反应时,R所产生的荧光将被Q淬灭;在PCR退火过程中,该探针可与目标基因发生杂交,并由TaqDNA聚合酶的依赖于聚合的外切活性切断,使得R与Q分离,游离的R发出荧光被荧光检测装置检测;随着PCR反应的进行,游离的R与PCR产物相对应地增加;因此,根据R产生的荧光信号的强弱,即可间接测量出PCR反应产物的数量;再依据标准曲线即可对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
在荧光定量PCR检测中,经常遇到检测基因相对表达量的情况,其中内对照基因常常选择ACTB;有鉴于此,我们通过大量的实验研究优选出了一套能够有效检测人、大鼠、小鼠三个物种ACTB基因表达的引物和探针,优化出了其PCR反应的条件,并组装成通用ACTB基因表达检测荧光定量聚合酶链反应试剂盒,以满足生命科学研究和医学检测的需要。
发明内容
本发明的技术方案是:首先获得人、大鼠、小鼠的ACTB标准序列,进行BLAST同源性比较,再根据比较结果设计相应的引物和探针,最后将引物、探针加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中,在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环;并在中温时检测和记录荧光值。
所优选出的引物和探针的序列分别如下:
上游引物P1:5’-GAA GAT CAA GAT CAT TGC TCC T-3’(SEQ ID NO:1);
下游引物P2:5’-TGG ATC AGC AAG CAG GAG TA-3’(SEQ ID NO:2);
TaqMan探针序列:5’-FAM-CTG TCC ACC TTC CAG CGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO:3)
所优化出的PCR扩增缓冲反应体系是由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+、PCR缓冲液、超纯水等组成的,各个成分的终浓度分别如下:特异的引物和探针每条0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg2+2.5mmol/L、缓冲液1×PCR;其中1×PCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/LTris·HCl PH8.3、0.01%明胶。
该ACTB荧光定量PCR由于引物和探针在人、大鼠、小鼠中完全同源,所以能够有效扩增来源于这些物种的ACTB基因,从而检测ACTB基因的表达量。
根据上述研究结果,将上述引物、探针和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中,并配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板组装成通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒。标准ACTB基因模板的序列为:
5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
实施例:
1、在DNA合成仪上人工合成下述引物和探针各2OD,并用TE缓冲液(其中含10mmol/LTris,1含10mmol/L EDTA)稀释至10umol/L。其中上游引物P1序列为:5’-GAA GATCAA GAT CAT TGC TCC T-3’(SEQ ID NO:1);下游引物P2:5’-TGG ATC AGC AAGCAG GAG TA-3’(SEQ ID NO:2);TaqMan探针序列:5’-FAM-CTG TCC ACC TTC CAGCGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO:3)
2、取各引物、探针各37.5ul,25mmol/L dNTPs 18ul,25mmol/L MgCl2 150ul,10×PCR反应缓冲液150ul,5U/ul Taq DNA聚合酶9ul,超纯水990.5ul加入到2ml的干净无菌试管中,充分混匀,配制1400ul FQ-PCR反应预混液。
3、将预混液成按46.7ul/管分装成30小管(用200ul PCR扩增管),再配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀释度的标准ACTB基因模板5管,每管各20ul,即组装成了通用ACTB基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒;其中标准ACTB基因模板的序列为:
5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
4、FQ-PCR扩增
每个装有46.7ulPCR反应预混液的反应管中分别加入3.3ul待测cDNA,水或标准ACTB基因模板,震荡混匀,瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(如PE9700)中,96℃下变性5分钟,然后按94℃20秒,55℃30秒,60℃30秒热循环45次,并在60℃时检测记录荧光信号;PCR反应结束后,读取各个反应的Ct值用以定量分析;同时于3%琼脂糖凝胶行PCR产物电泳,溴乙锭染色,GelDoc1000下观察,灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。
5、结果
在30个标本的FQ-PCR反应中,经电泳检测,加入待测标本和标准品的反应产物中均检测到了预期大小的111bp左右的PCR产物条带,而未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物;加入标准ACTB基因模板和待测标本的反应均获得了S形的荧光变化曲线,加入标准ACTB基因模板的Ct值与加入模板拷贝数的对数呈线性关系,可以拟合成一条直线,斜率-3.36,截距为41.3,相关系数9.9,说明该反应体系和反应条件均符合精确定量研究的要求。
Claims (4)
1.一种操作简单、快速,能够有效定量扩增检测人、大鼠、小鼠的ACTB基因表达的DNA荧光定量体外扩增检测试剂盒;其中包含ACTB特异的引物、探针和耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系,以及标准ACTB模板。
2.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒,其特征在于:所用引物和探针序列分别为:上游引物P1:5’-GAA GAT CAA GAT CAT TGC TCC T-3’(SEQ ID NO:1);下游引物P2:5’-TGG ATC AGC AAG CAG GAG TA-3’(SEQ ID NO:2);TaqMan探针序列:5’-FAM-CTG TCC ACC TTC CAG CGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO:3)。
3.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒,其特征在于:特异的引物和探针每条0.28umol/L、Taq DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg2+2.5mmol/L、缓冲液1×PCR;其中1×PCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/L Tris·HCl PH 8.3、0.01%明胶。
4.根据权利要求1所述的通用ACTB基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒,其特征在于:标准ACTB基因模板序列为:5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGATTGGTGGCTCTATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3’(SEQID NO:4);其浓度分别为10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML。
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CN2011104485510A CN102517395A (zh) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 通用actb基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN103290134A (zh) * | 2013-06-21 | 2013-09-11 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 牛actb基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101760523A (zh) * | 2008-10-23 | 2010-06-30 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 一种使用actb基因分析arhgdib基因表达量的rt-pcr技术 |
CN101967515A (zh) * | 2010-03-16 | 2011-02-09 | 中国人民解放军第二军医大学 | Pcdh8基因甲基化定量检测方法 |
CN103031362A (zh) * | 2011-09-29 | 2013-04-10 | 成都灵动生物技术有限公司 | 通用actb基因荧光定量聚合酶链反应试剂盒 |
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- 2011-12-29 CN CN2011104485510A patent/CN102517395A/zh active Pending
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