CN104685070A - 检测braf和pi3k突变的方法 - Google Patents

检测braf和pi3k突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是基于在怀疑含有一种或多种BRAF突变V600E和V600K以及PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R的样品中所述突变的检测方法，所述方法基于用本发明的引物对样品进行扩增。另外，本发明涉及用于患者病理状态尤其是癌症的诊断/预后的(i)试剂盒，所述试剂盒在其成分中包含扩增试剂，所述扩增试剂包括一种或多种本发明的引物；(ii)引物本身；和(iii)上述方法、试剂盒和引物的用途。

Description

检测BRAF和PI3K突变的方法
发明背景
B-raf(或BRAF)是Ras/Raf/MEK/MAP信号转导通路的部分并在调节MAP激酶/ERK信号通路中发挥作用。该基因的突变与多种癌症相关，比如结直肠癌(CRC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，恶性黑色素瘤和腺癌。
在结肠癌中，已经报道了BRAF中的致癌突变，其几乎所有都是V600E突变(Davies H，等人，2002，Nature 417：949-54；Rajagopalan H，等人，2002，Nature 418：934)。V600E突变位于BRAF基因的外显子15上：在BRAF编码序列的位置1799，T变为A，其导致从存在于野生型BRAF蛋白中的缬氨酸(V)，变为与突变基因对应的蛋白中的谷氨酰胺(E)。还检测到V600K突变(1798-1799 GT＞AA)，但不那么大量，并且构成病理学比如黑素瘤中量第二大的突变(Rubinstein等人，2010，Journal of TranslationalMedicine 8，未给出页数)。其它鉴定的BRAF基因突变是V600D，V600M和V600A。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路在很多细胞过程中发挥重要作用，所述细胞过程包括细胞增殖、粘附、存活和运动性。已经在很多类型的人恶性疾病中观察到此通路的失调并且通常与通路成分的遗传改变相关。此种遗传改变包括在PI3K、PIK3CA的p110亚单位中激活突变(Hurst等人，2009，BMC Research Notes 2：66)。多数PI3K突变或者存在于PIK3CA的外显子9(其编码螺旋结构域)中，或者存在于PIK3CA的外显子20(其编码激酶结构域)中(Engelman，2009，Nat.Rev.Cancer 9：550-562)。上文提及的外显子中的四种常见PI3K突变是E542K，E545D，E545K(它们中三个位于外显子9中)和H1047R(外显子20)。
近期的出版物提示，BRAF和PI3K中的突变可能对抗-EGFR治疗产生抗性(Lurkin等人，2010，PLoS ONE，5，(1)；De Roock等人，2010，LancetOncol.11：753-62；De Roock等人，2011，Lancet Oncol.12：594-603；Bardelli& Sienna，2010，J Clin Oncol；28(7)：1254-1261)。特别是显示，BRAF中突变损害患有mCRC的患者中对帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)的响应(Di Nicolantonio F等人，2008，J.Clin.Oncol.26：5705-5712)，突变BRAF的存在表示对mCRCs的消极预后因素。当前的数据还提示，BRAF和PI3K改变的评价可能用于选择不可能响应抗-EGFR-靶向的抗体的患有mCRC的患者(Bardelli & Sienna，2010，J Clin Oncol；28(7)：1254-1261)。
存在高的对于检测PI3K和BRAF基因突变的方法的需求。近来，已经公开了与对抗-EGFR治疗的响应相关的同时检测基因突变的方法(Lurkin等人，2010，PLoS ONE，5，(1))。所述方法包括分析外显子9和20中的PI3K突变，以及分析外显子15中的BRAF突变。总的来说，设计两个多重PCRs；第一个包含一对扩增BRAF外显子15的引物；并且第二个包含两对扩增PI3K外显子9和20的引物。接着，将获得的PCR产物进行纯化、变性并与探针孵育，所述探针与相应扩增产物的一条链在临近突变位点的位置杂交。随后在热循环仪中进行延伸反应，其中仅互补于样品中存在的突变的ddNTP被整合入延伸产物，并且用自动测序仪检测。
这些基因的中的其它突变检测方法，包括实时ARMS(amplificationrefractory mutation system，扩增阻碍突变系统)测定，比如在Ellison等人，2010，Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 29：132中公开的那些。
ARMS是基于等位基因-特异性的PCR扩增起始原理的检测点突变的方法(EP0332435；Newton等人，1989，Nucleic Acid Research 17，2503-2516)。该系统基于这样的策略，其中设计各个寡核苷酸引物或引物，从而只有当它与其相应特异性靶标DNA序列退火时，其才作为用于PCR的引物发挥作用。该技术需要所述PCR引物的末端3’-核苷酸是等位基因特异性的。这意味着，所述末端3’-核苷酸对应于点突变的那个。因此，以两种形式设计引物：阻碍“突变”DNA模板PCR扩增的“正常”形式，和阻碍“正常”DNA PCR扩增的“突变”形式。
在一些情况中，当有对应于另一个点突变的DNA作为靶点时，单个3’-错配碱基不完全阻止寡核苷酸引物的非特异性延伸，并且扩增继续。在这种情况中，在等位基因-特异性的适当引物的3’末端附近故意引入错配(在从引物3’末端数第二、第三或甚至第四个核苷酸处)使得增强引物的特异性。
ARMS技术包括，在一种反应混合物中可能发生至少两种PCR，各自对应于使用一种ARMS引物的扩增。任意ARMS引物还需要第二引物(通常被称为“普通引物”，并且其在下文将被称为“扩增引物”)来产生等位基因-特异性的产物。
样品中特异性靶序列的存在通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后产物的可视化来显示。备选地，结果可以以实时、封闭管的形式通过整合荧光探针诸如Taqman，Scorpions，分子信标(Molecular beacons)或插入荧光染料诸如Yo-Pro或Sybr绿(Sybr green)来分析。
当前工艺水平常处理检测BRAF突变V600E和V600K，以及PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R的问题。然而，就我们所知，当前工艺水平中已有的检测方法中，没有一个允许通过其与特异性探针的杂交检测获自这些突变的任意扩增产物。这是由于这样的事实：由于它们之间的序列相似性，可能设计用于与对应于这些基因之一一种突变的任意扩增产物杂交的任意探针，也会非特异性结合相同基因中临近突变的扩增产物。由此，当前工艺水平的BRAF和PI3K突变检测方法具有这样的缺点：获得的任意扩增产物的检测不能通过将前者与突变-特异性的探针，并且特别是与含有这种探针的微阵列杂交来进行。
该缺点适用于多重ARMS扩增方法，以及个体ARMS扩增方法，其中来自各个突变的特异性扩增产物在独立的反应容器中获得。
另一个相关问题是，可以作为肿瘤分期、转移、发展、细胞异质性或等位基因异质性的预后因素存在的BRAF和PI3K突变，就野生型而言，在样品中常常以低丰度被发现。并且，尽管很多诊断方法对于突变检测是可用的，但多数不能准确地检测低丰度突变。Sanger测序是突变鉴定的金标准，尽管其仅可以检测丰度超过大约20％的突变(Ogino等人，2005，J.Mol.Diagn.7：413-421；Li等人，2008，Nat.Med.14：579-584)。
因此，高度需要提供这样的方法，该方法不同于当前工艺水平的方法，该方法允许通过将相应扩增产物与靶标特异性的探针杂交，特异性检测获自样品中存在的任意BRAF突变V600E和V600K，以及PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R的任意扩增产物。还需要，所述方法允许检测样品内以低百分数存在的突变。因此，本文描述的发明旨在提供强的和可靠的检测BRAF和PI3K突变的方法，并且因此旨在减轻现有技术中的缺陷。
发明概述
本发明提供存在于样品中的2种BRAF突变V600E和V600K中任一种，和/或4种PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中任一种的检测方法，所述方法通过将获自具有这些突变中任一种的核酸的扩增产物与靶标特异性的探针杂交进行。
本发明基于以一种或多种本发明的ARMS引物扩增样品中存在的2种BRAF突变V600E和V600K中的一种或多种和/或4种PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中的一种或多种。
本发明的ARMS引物特征在于：各引物具有36至50个核苷酸的总长度，其3’末端根据ARMS扩增方法(扩增阻碍突变系统，基于PCR扩增的等位基因-特异性引发的原理检测点突变的方法)设计，并且该3’末端在BRAF V600E和V600K突变的情况中分别构成选自SEQ ID N°1和SEQ IDN°2的靶标特异性序列，和在PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R的情况中分别构成选自SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14，和SEQID N°15的靶标特异性序列，各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列。
因此，本发明方法中使用的ARMS引物在3’末端包含靶标特异性序列，所述靶标特异性序列能够以等位基因特异性的方式杂交于包含如上所述的突变的靶标核酸。该引物还包含5’序列，所述5’序列不是靶标特异性的并且因此不互补于所述靶标核酸。该序列是标签序列，其用于通过接着与特别设计以杂交于扩增产物中与所述标签序列互补的区域的探针杂交检测扩增产物。这允许通过本文描述的方法特异性检测扩增产物。
本发明的方法允许通过将这种产物与一种或多种探针杂交，所述探针在由特异性引物提供的标签对应的区域特异性与所述产物杂交，特异性检测获自样品中存在的2种BRAF突变V600E和V600K和/或PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中的任一种的任意扩增产物。
不同引物的5’标签序列彼此间均是不同的。该差异是使得不同的扩增产物特异性结合于其相应探针的原因，对于特异性于扩增产物之一的任意探针，必须具有能够至少杂交于产物中对应于相应标签的区域的核苷酸序列。
整个本专利说明书中，根据ARMS扩增方法在其3’末端设计的这些突变-特异性引物将命名为“ARMS引物”。另外，用于靶标DNA扩增的引物或与ARMS引物组合的引物，通常也被称为普通引物，将在下文中命名为“扩增引物”。用于本发明BRAF和PI3K突变的特异性ARMS引物，可以如表1中指出的描述。
标签1，标签2，标签3，标签4，标签5和标签6，是长度为15至20个核苷酸并且最优选17至19个核苷酸的核苷酸序列，均彼此不同。换句话说，标签序列之间无实质同源性。无实质同源性意味少于50％(即，两条标签序列必须不共有多于其核苷酸的50％)。
在一个优选的实施方案中，所述标签的GC-含量为11-71％，最优选为40-60％。在另一个优选的实施方案，标签的Tm为39-70℃。优选地，ARMS引物的总长度介于39和47个核苷酸之间。
特别优选的ARMS引物是SEQ ID N°3和SEQ ID N°4的那些，分别对应于BRAF突变V600E和V600K，和SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQID N°18和SEQ ID N°19的那些，分别对应于PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R。
除ARMS引物以外，本发明的扩增混合物还包含一种或多种扩增引物，所述扩增引物与ARMS引物组合，产生扩增产物。
因此，本发明的方法包括在一种或多种扩增引物、适当的三磷酸核苷酸和用于聚合的试剂的存在下，在适当条件下，将包含核酸的测试样品与一种或多种特异性于一种或多种上述BRAF和/或PI3K突变的诊断ARMS引物相接触，从而只有在相应突变存在于样品中时，各个诊断ARMS引物才延伸；各个突变的存在或缺少通过参考相应诊断引物延伸产物的存在或缺少来检测。优选地，任意此种产物的存在或缺少将通过将获得的任意扩增产物与标签特异性的探针杂交来确定。
在本文描述的ARMS引物的使用方面，本发明的BRAF和PI3K突变的扩增和检测方法不同于当前工艺水平中的那些。用这些引物扩增允许后续扩增产物与序列-特异性探针的特异性杂交。
特别是，与当前工艺水平中BRAF和PI3K检测方法相比，用表1中展示的本发明的一种或多种相应ARMS引物对2种BRAF突变V600E和V600K中的一种或多种，和/或4种PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中的一种或多种的扩增，允许通过与序列-特异性的探针杂交检测任意产生的扩增产物。优选地，靶标特异性的探针可以设置在微阵列中。
允许扩增产物和其相应探针之间的特异性结合的关键事实是，检测探针在对应于由相应ARMS引物提供的标签1，标签2，标签3，标签4，标签5或标签6的区域中特异性杂交于其相应扩增产物。该标签区域在不同引物之间无实质同源性。由此获得任意扩增产物和其相应探针之间杂交的特异性。
为了更容易理解本发明的方法，图1展示了它的方案。作为实例，选择对BRAF突变V600E的检测。
本发明的方法相对于当前工艺水平的方法构成相对优势，原因是，与当前工艺水平用于检测BRAF和PI3K突变的方法相比，扩增产物与特异性探针的特异性杂交产生一个步骤的、简单的多的检测方法。
本发明的检测方法展现出其中在野生型背景中1％BRAF或PI3K突变可以被检测的灵敏度值。
Lurkin等人，2010，PLoS ONE，5，(1)，公开了基于DNA扩增随后进行探针杂交的检测方法。特别是设计了两种多重PCRs，第一种允许检测BRAF外显子15，并且第二种允许检测PI3K外显子9和20。对于各个基因获得的扩增产物非特异性杂交于探针，所述探针在临近研究的突变位点的位置与相应产物杂交。仅当由探针和扩增产物形成的杂交链(hybrid)延伸时，实现特异性检测。处理获得的产物并接着在自动测序仪上分析，以整合的ddNTP上的荧光标记表明突变存在或缺少。由此，在Lurkin等人中，获得的扩增产物非特异性结合于提供的探针，并且仅在由探针和扩增产物形成的杂交链延伸时，实现特异性检测。这意味着，需要至少扩增反应之外的反应来实现检测。与Lurkin等人的相比，根据本发明的方法，检测通过获得的任意扩增产物对其序列-特异性的探针的直接杂交而发生。
本发明的方法也允许两种或多种本发明的ARMS引物的多重PCR扩增。此外，本发明的方法允许检测以低百分比存在于样品中的突变。
本发明的一个方面对应于一种检测一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-将包含核酸的测试样品用包含一种或多种ARMS引物的扩增混合物进行扩增，其特征在于各个ARMS引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，
各个ARMS引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，
所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物；和
-通过将获得的任意扩增产物与一种或多种探针杂交检测任意此种产物，其中各探针与扩增产物中对应于相应ARMS引物的5’标签序列的区域特异性杂交。
本发明的另一方面涉及一种用于检测包含核酸的测试样品中一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种用于核酸扩增的试剂混合物，各个混合物包含：
-一种或多种ARMS引物，其特征在于各引物具有36至50个核苷酸的长度，包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，和
-一种或多种扩增引物，
所述试剂盒还包含微阵列，其中一种或多种探针被固定，各探针特异性杂交于相应ARMS产物中与相应ARMS引物的5’标签序列互补的区域。
本发明的另一方面对应于一种具有一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的核酸的扩增方法，其中所述方法包括将包含核酸的样品与包含一种或多种ARMS引物的扩增混合物接触，其特征在于各个ARMS引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，各个ARMS引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物。
除了ARMS和扩增引物以外，所述扩增混合物还包含用于核酸扩增的另外的试剂，比如DNA聚合酶和dNTPs。
优选地，所述5’标签可以选自以下序列之一：SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25。
因此，本发明的探针可以包含选自SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ IDN°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25的序列，并且可以含有特异性于标签区域的那些之外的核苷酸。
优选地，与扩增产物接触的一种或多种探针具有15至45个核苷酸的长度，特异性杂交于产物中对应于ARMS引物的5’标签序列的区域的探针区域，具有15至20个核苷酸的长度。甚至更优选地，一种或多种探针包含选自SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25的序列。
优选地，本发明的探针选自SEQ ID N°8(BRAF V600E)，SEQ ID N°9，SEQ ID N°10，SEQ ID N°11(BRAF V600K)，SEQ ID N°26(PI3K E542K)，SEQ ID N°27(PI3K E545D)，SEQ ID N°28(PI3K E545K)，SEQ ID N°29和SEQ ID N°30(PI3K H1047R)。
所述探针可以固定在固体支持物上。微阵列的探针组和固体支持物还可以包含一种或多种对照探针。
本发明的另一方面对应于一种36至50个核苷酸的ARMS引物，其特征在于，所述引物包含选自SEQ ID N°1和SEQ ID N°2的3’BRAF靶标特异性序列，或选自SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ IDN°15的3’PI3K靶标特异性序列，以及15至20个核苷酸的非靶标特异性5’标签序列。优选地，所述5’标签序列长为17至19个核苷酸。在一个优选的方面，所述一种或多种ARMS引物选自包含SEQ ID N°3，SEQ ID N°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°19的组。
本发明的另一方面对应于本文中描述的检测和扩增方法、试剂盒、或ARMS引物用于诊断和/或预后患者中病理状况的用途。优选地，所述病理状况是癌症。最优选，所述癌症是结直肠癌。
另一方面涉及检测/诊断患者中癌症的方法，所述方法包含本文中描述的检测或扩增方法。另外，本发明的另一方面对应于通过本发明方法和试剂盒的性能预测患者对用抗-EGFR抗体治疗的响应。
附图简述
图1.
图1是显示将扩增产物(其用与对应于BRAF突变V600E的本发明的ARMS引物获得)与相应特异性的探针的特异性杂交的方案。如在图中表明的，仅BRAF V600E突变的ARMS产物特异性结合对应于V600E的探针，而V600K的ARMS产物不结合。类似地，仅V600K的扩增产物特异性结合对应于V600K的探针，而V600E的ARMS产物不结合(未显示)。
图2.
图2显示根据实施例1(多重1)用本发明的ARMS和扩增引物进行的BRAF突变V600E和V600K的多重ARMS扩增的产物，在2％琼脂糖凝胶中的可视化，并且指出的样品/细胞系/克隆对应于指出的BRAF突变V600E或V600K。
图3.
图3显示根据本发明实施例1的多重ARMS扩增产生的产物与包含本发明的探针的微阵列的杂交的可视化。(a)包含V600E BRAF突变的样品P：位置标志物；圆圈：IC/EC扩增产物；正方形：与对应于V600EBRAF突变的多重ARMS扩增产物，和其特异性探针的杂交对应的点。
(b)10e3拷贝的克隆/5ul V600K BRAF突变。P：位置标志物；圆圈：IC/EC扩增产物；长方形：与对应于V600K BRAF突变的多重ARMS扩增产物和其特异性探针的杂交相对应的点。命名为“P”的点对应于位置标志物；由圆圈围绕的点，对应于IC或EC扩增产物之一；由正方形围绕的点((a)中)，对应于V600E BRAF ARMS扩增产物与其特异性探针的特异性结合；由长方形围绕的点((b)中)，对应于V600K BRAF ARMS扩增产物与其特异性探针的特异性结合。IC：内部对照；EC：提取对照
图4.
图4显示根据本发明实施例2的多重ARMS扩增产生的产物与包含本发明探针的微阵列的杂交的可视化。
(a)含有H1047R PI3K突变的细胞系HTC 116；(b)包含E542K PI3K突变的临床样品。命名为“P”的点对应于位置标志物；由圆圈围绕的点，对应于IC或EC扩增产物之一；由正方形围绕的点对应于H1047R PI3KARMS扩增产物与其特异性的探针的特异性结合((a)中)或E542K PI3KARMS扩增产物与其特异性的探针((b)中)的特异性结合。
发明详述
在以下段落中，详细限定本发明的不同方面。这样限定的各个方面可以与任意其它一种方面或多种方面组合，除非有明确相反指示。特别是，表明为优选的或特别有利的任意特征可以与任意其它优选或有利的一种特征或多种特征组合。
本发明的第一个方面是检测包含核酸的测试样品中一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的方法，其中所述方法包括：
-将样品用包含一种或多种ARMS引物的扩增混合物进行扩增，其特征在于各引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ IDN°1，SEQ ID N°2，或SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQID N°15的3’靶标特异性序列，各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，
所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物，并且
-通过获得的任意扩增产物与一种或多种特异性的探针的杂交，检测任意此种产物，其中任意BRAF或PI3K突变的特异性探针至少在对应于由相应特异性ARMS引物提供的5’标签序列的产物区域与产物特异性杂交。
本发明的第二方面对应于用于检测样品中存在的一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的试剂盒。具体地，本发明涉及检测包含核酸的测试样品中的任意此种突变的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种用于核酸扩增的试剂混合物，各个混合物包含：
-一种或多种ARMS引物，其特征在于各引物36至50个核苷酸的长度，分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，和
-一种或多种扩增引物，
所述试剂盒还包含微阵列，其中一种或多种特异性探针被固定。各个特异性探针特异性杂交于相应ARMS产物中与相应ARMS引物的5’标签序列互补的区域。
本发明的第三方面涉及用于扩增测试样品中核酸的方法，所述核酸包含一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变，其中所述方法包括将所述样品与一种或多种ARMS引物接触，其特征在于各引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物。
最优选，各个ARMS引物具有39至47个核苷酸的总长度；所述3’靶标特异性序列具有21至30核苷酸的长度；所述5’标签序列具有17至19个核苷酸的长度；检测探针具有18至38个核苷酸的长度。
在上述方法或试剂盒的一个实施方案中，所述方法或试剂盒涉及检测或扩增一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变。在另一个实施方案中，所述方法或试剂盒涉及检测或扩增一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变。例如，选自E542K，E545D，E545K和H1047R的单突变可以被检测或扩增，选自E542K，E545D，E545K和H1047R的两种或三种突变的任意组合可以被检测或扩增，或E542K，E545D，E545K和H1047R全部可以被检测或扩增。在另一个实施方案中，一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变和一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变可以被检测或扩增。V600E和/或V600K可以与E542K，E545D，E545K和H1047R中的一种或多种组合。在一个实施方案，V600E，V600K，E542K，E545D，E545K和H1047R全部被检测或扩增。
根据本发明的方法和试剂盒，进一步根据所述ARMS和扩增引物，技术人员已知对于核酸扩增并且特别是对于PCR扩增必需的任意其它额外组分也可以存在于所述扩增混合物中。由此，DNA聚合酶和dNTPs也可以存在于所述扩增混合物中。
优选地，在与相应探针杂交之前，扩增产物转化为单链DNA。最优选单链DNA通过扩增产物的变性，最优选，通过热变性而获得。探针特异性杂交于产物中与特异性ARMS引物的5’标签序列互补的区域。优选地，所述探针包含在微阵列中，并且最优选，所述探针固定在固体支持物上。
定义：
“引物”意为“核酸扩增反应的引物”。
整个本公开内容中，除非另有说明，术语“ARMS引物”是指BRAF和PI3K突变-特异性引物，在其3’末端根据ARMS扩增方法设计，并且其包含非靶标特异性5’-标签序列；并且术语“扩增引物”是指与ARMS引物组合用于靶标DNA扩增的引物。
用于本发明的不同方面的ARMS引物可以如上表1中显示的那样来体现，其中5’标签序列或标签的特征也被指出。
所述标签赋予探针对扩增产物的特异性。优选地，所述5’标签可以选自以下序列之一：SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25。
本发明的这些方面的一个特定实施方案，包括用一种或多种选自SEQID N°3，SEQ ID N°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQID N°19的组的ARMS引物扩增一种或多种BRAF和/或PI3K突变：
GGTGATTTTGGTCTAGCTTCAGA(SEQ ID N°3)(BRAFV600E)
GGTGATTTTGGTCTAGCTACTAA(SEQ ID N°4)(BRAFV600K)
AAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTGTCTA(SEQ ID N°16)(PI3KE542K)
CCTCTCTCTGAAATCAGTGAT(SEQ ID N°17)(PI3K E545D)
GATCCTCTCTCTGAAATCAGTA(SEQ ID N°18)(PI3K E545K)
GAAACAAATGAATGATGCTCGT(SEQ ID N°19)(PI3K H1047R)。
粗体显示的核苷酸对应于5’标签。
作为扩增引物，可以使用当与一种或多种上述ARMS引物组合用于扩增时，产生1000bp或更短的扩增产物的任意可能引物。
在一个优选的实施方案中，与上述ARMS引物组合的扩增引物产生500bp或更短的扩增产物，在另一个优选的实施方案中，产生大约200bp的扩增产物，并且在最优选的实施方案中，产生介于200bp和100bp之间的扩增产物。优选地，所述扩增引物具有18至24个核苷酸的长度，并且最优选，21到22个核苷酸的长度。
优选地，包含SEQ ID N°5的扩增引物，并且最优选，由序列SEQ IDN°5组成的引物，用于与一种或多种以下ARMS引物组合：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物包含选自SEQ ID N°1和SEQ IDN°2的3’靶标特异性序列，
所述引物还包含15至20个核苷酸的非靶标特异性5’标签序列；以及
-SEQ ID N°3和SEQ ID N°4的引物。
同样，优选包含SEQ ID N°20的扩增引物，并且最优选由序列SEQ IDN°20组成的扩增引物，用于与任意以下ARMS引物组合：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物在其3’位置包含选自SEQ ID N°12，SEQ ID N°13和SEQ ID N°14的靶标特异性序列，所述引物还在其5’末端包含15至20个核苷酸的非靶标特异性标签序列；以及
-SEQ ID N°16，SEQ ID N°17和SEQ ID N°18的引物。
同样，优选包含SEQ ID N°21的扩增引物，和最优选由序列SEQ ID N°21组成的扩增引物，用于与任意以下ARMS引物组合：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物在其3’位置包含靶标特异性序列SEQ ID N°15，所述引物还在其5’末端包含15至20个核苷酸的非靶标特异性标签序列；以及
-SEQ ID N°19的引物。
在一个优选的方面，任意特异性检测探针具有15至45个核苷酸的长度，在对应于5’-标签序列的区域中与相应ARMS产物特异性杂交的区域介于15和20个核苷酸之间。在5’和/或3’末端中，各探针还可以包含另外的核苷酸，直到15至45个核苷酸的总探针长度。
优选地，用于检测BRAF突变V600E和V600K，或PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中任一个的特异性探针，分别包含SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25的核苷酸序列。
一种或多种不同的探针可以用于检测各个BRAF或PI3K突变。
用于各个突变的最优选的探针显示于表2中。
特别是，所述探针固定在微阵列上。微阵列是微观寡核苷酸点的集合。DNA微阵列(通常也称为基因芯片，DNA芯片，或生物芯片)是连接在固体表面的微观DNA点的集合。合成探针并随后经表面改造通过与化学基质(通过环氧硅烷，氨基硅烷，赖氨酸，聚丙烯酰胺或其它)的共价键连接于固体表面。固体表面是本领域已知的并且包括微珠以及固体支持物。
特别是，本发明的探针可以固定在固体支持物上。
由此，除了用于扩增的混合物以外，本发明的试剂盒还包含微阵列，其中特异性杂交于一种或多种BRAF或PI3K突变的产物的一种或多种探针被固定。
一种或多种对照可以包括在本发明的方法和试剂盒中。优选地，对应于技术人员已知的任何构成型和变在人基因的扩增引物对，可以包括在扩增混合物中。最优选，使用对应于β-肌动蛋白基因的引物。使用此引物的扩增使得确认测试样品中存在的核酸的正确提取，并且构成“内源对照”或“提取对照”。此外，具有扩增它的能力的DNA质粒和引物对，优选包括在扩增混合物中，并且构成“扩增对照”或“内部对照”。优选地，所述微阵列可以包含一种或多种杂交于相应对照DNA序列，特别是杂交于提取和扩增对照的产物能力的对照探针。
优选地，本发明的试剂盒还包含用于任意扩增产物和探针微阵列之间杂交的可视化的试剂。
本发明的另一个方面对应于一种或多种36至50个核苷酸长度的ARMS引物，其特征在于，各个引物在其3’末端包含选自SEQ ID N°1和SEQ ID N°2的BRAF靶标特异性序列，或选自SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的PI3K靶标特异性序列，各引物还在其5’末端包含15至20个核苷酸的非靶标特异性标签序列。优选地，ARMS引物的5’位置的标签含有15，16，17，18，19或20个核苷酸。具体优选的ARMS引物是选自包含SEQ ID N°SEQ ID N°3，SEQ ID N°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°19的组的那些。
而本发明的另一个方面对应于本文所述方法，或本文所述试剂盒，或本文所述引物，用于诊断和/或预后患者中病理状态，特别是癌症，以及用于预测患者对用抗-EGFR抗体治疗的响应的用途。
本发明还涉及用于针对适当化疗诊断受试者或评价受试者的体外方法，所述方法包括：
(i)提供来自受试者的肿瘤样品；
(ii)使用上述方法确定BRAF和/或PI3K突变是否存在于样品中。
因此上述步骤(ii)包括检测一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变，其中所述方法包括以下步骤：
-将包含核酸的所述肿瘤样品用包含一种或多种ARMS引物的扩增混合物进行扩增，其特征在于各个ARMS引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ IDN°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，
各个ARMS引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，
所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物；和
-通过将获得的任意扩增产物与一种或多种探针杂交来检测任意此种产物，其中各探针与扩增产物中对应于相应ARMS引物的5’标签序列的区域特异性杂交。
使用的引物的优选实施方案在本文他处陈述。
在一个实施方案中，进一步的步骤包括选择与BRAF或PI3K突变的存在或缺少相关联的适当治疗。
在一个优选的实施方案中，可以在本发明内被处理的测试样品类型是拭子、石蜡包埋的活体组织、血液、痰、结肠灌洗物、支气管灌洗物、以及盐水、血浆、和脑脊液、和获自个体的任意其它体液、或组织。所述个体是人。
所述测试样品可以同样是与测试样品中存在的序列对应的核酸序列。在其用于本发明的方法之前，存在于核酸样品中的研究区域的全部或部分可以使用任意常规技术比如PCR扩增。
在另一个优选的实施方案，遗传物质的提取可以通过当前工艺水平的自动以及手动提取技术进行。
特别优选的从组织或其它样品的DNA提取方法，是QIAGEN的DNA组织试剂盒。还优选的是QIAGEN的产物DNA/RNA FFPE，其意在从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片同时纯化基因组DNA和总RNA。同样，技术人员可以了解的任何用于手动或自动处理样品以提取DNA和其它核酸的技术和方法可以在本发明中使用。
在本发明的一个优选的实施方案中，除了一种或多种ARMS引物和一种或多种扩增引物以外，本发明方法发生所在的容器包含用于扩增样品中存在的DNA的其它组分。特别是，适当的三磷酸核苷酸，比如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，和用于聚合的适当酶也包括在扩增试剂的混合物中。
可以使用用于聚合的任意方面的酶。特别是，具有区分正常和突变模板序列到任意显著程度能力的任意DNA聚合酶。方便的酶的实例包括热稳定酶，其不具有显著的3′-5′核酸外切酶活性，并且具有约10个核苷酸/秒的聚合速率，由此在标准延伸步骤中获得600-1000bp的扩增片段。优选可以使用QIAGEN的HotStarTaq DNA聚合酶。也可以使用当前工艺水平中已知具有这些特征的任何其它酶。例如，PE Applied Biosystems的“AmpliTaq Gold”DNA聚合酶。
本发明不同突变的ARMS扩增可以分别或在两种或更多突变的多重扩增反应中进行。在两种情况中，在本发明方法和试剂盒中，QIAGEN多重PCR试剂盒最优选用于ARMS扩增。
本发明的方法可以在一个或多个反应容器中进行，各个容器包含至少一种ARMS引物，和至少一种扩增引物，与用于扩增的其它试剂一起存在。
用于聚合的试剂和适当条件可有技术人员选择。标准热循环条件可以用于扩增根据本发明的突变。
被证明特别适用于样品和可以根据本发明的不同实施方案的热循环条件如下：
本发明ARMS引物的任意可能组合可以用于样品中存在的一种或多种BRAF或PI3K突变的多重检测。
因此，本发明方法发生所在的反应容器，可以包含表1的ARMS引物、选自SEQ ID N°3，SEQ ID N°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°19的引物中的1，2，3，4，5或6种，以及可能与上述引物组合用于扩增存在于样品中的一种或多种BRAF和/或PI3K突变的一种或多种扩增引物。另外的引物对，优选对应于提取和/或内部对照的那些，和/或用于扩增其它突变的引物对，也可以包括在扩增混合物中。
具体优选的ARMS引物组合是包含以下各项的引物混合物：
-SEQ ID N°3(BRAF V600E)和SEQ ID N°4(BRAF V600K)的ARMS引物(扩增混合物1的组分)；
-SEQ ID N°16(PI3KE542K)和SEQ ID N°19的ARMS引物(PI3KH1047R)(扩增混合物2的组分)；
-SEQ ID N°17(PI3KE545D)和SEQ ID N°18(PI3KE545K)的ARMS引物(扩增混合物3的组分)；
-SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°19的ARMS引物(分另为PI3KE542K，PI3KE545D，PI3KE545K和PI3KH1047R，)(扩增混合物4的组分)。
ARMS和扩增引物的具体优选组合为以下包含各项引物混合物：
-SEQ ID N°3(BRAF V600E)的ARMS引物，SEQ ID N°4(BRAFV600K)的ARMS引物，SEQ ID N°5的扩增引物(对应于SEQ ID N°3和SEQ ID N°4的ARMS引物的普通扩增“引物”)(扩增混合物1的组分)；
-SEQ ID N°16(PI3KE542K)和SEQ ID N°19(PI3KH1047R)的ARMS引物，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21的扩增引物(分别对应于SEQ ID N°16和SEQ ID N°19的ARMS引物的扩增“引物”)(扩增混合物2的组分)；
-SEQ ID N°17(PI3KE545D)和SEQ ID N°18(PI3K E545K)的ARMS引物和SEQ ID N°20的扩增引物(对应于SEQ ID N°17和SEQ ID N°18的ARMS引物的普通扩增“引物”)(扩增混合物3的组分)；
-SEQ ID N°16(PI3KE542K)，SEQ ID N°17(PI3K E545D)，SEQ ID N°18(PI3KE545K)和SEQ ID N°19(PI3KH1047R)的ARMS引物，SEQ ID N°20的扩增引物(对应于SEQ ID N°16，SEQ ID N°17和SEQ ID N°18的ARMS引物的普通扩增“引物”)和SEQ ID N°21(对应于SEQ ID N°19的ARMS引物的扩增“引物”)(扩增混合物4的组分)。
不同扩增混合物的剩余组分包括DNA聚合酶，dNTPs和用于扩增发生的任意其它必需组分。另外，不同的扩增混合物可以另外含有用于扩增内部和提取对照的正向和反向引物，以及用于扩增其它突变的引物对。
本发明的方法证明容易检测1ng至1μg的BRAF和PI3K突变DNA量。特别是，已经显示，本发明的方法以200ng/μl BRAF或PI3K突变DNA，以及前者系列稀释直到0.2ng/μl，检测5μl的细胞系是没问题。本发明试剂盒的检测极限是5μl样品中1,000拷贝的突变BRAF或PI3K。本发明试剂盒对于不同BRAF或PI3K突变的检测值的灵敏度是1％。关于诊断参数，本发明试剂盒对于BRAF和PI3K突变的诊断灵敏度值高于98％。
在ARMS扩增过程中，标签可以引入DNA扩增产物以允许进一步检测；特别是提供可以由比色方法，由荧光方法，或由本领域中已知的任意标记方法检测的信号的标记。标记可以使放射性、化学发光、发光和荧光试剂。在优选的方面，使用的标记是生物素。然而，可以使用本领域中已知的任意类型的标记(例如地高辛)。在优选的方面，至少一种使用的引物在5’末端用生物素标记。优选地，扩增引物是被标记的。此外，扩增的DNA的标记可以备选地通过将带有标记的修饰的核苷酸(例如生物素化的或地高辛dUTP衍生物)加入PCR混合物中实现。在某些实施方案中，可以使用放射性标记，以及荧光团。
可以使用可以使任意扩增产物和其相应探针之间相互作用能够被检测的，技术人员已知的替代方法(包括使用探针标记的方法)。
在本发明的一个优选的实施方案中，将之前变性的扩增产物和与扩增产物至少在对应于特异性引物提供的核苷酸5’标签的区域杂交的靶标特异性探针孵育。
优选地，扩增的DNA的变性可以通过加热进行。也可以使用扩增后制备单链DNA的其它方式；例如，化学手段。
在优选的方面，将要分析的包含核酸的测试样分为两个或更多等分部分，其中：
-将一个等分部分用包含SEQ ID N°3，SEQ ID N°4和SEQ ID N°5的引物的混合物(扩增混合物1)进行扩增；
-将另一等分部分用包含SEQ ID N°16，SEQ ID N°19，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21的引物的混合物(扩增混合物2)进行扩增，并且
-将另一等分部分用包含SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°20的引物的混合物(扩增混合物3)进行扩增，
或者，
-将一个等分部分用上述混合物1进行扩增；并且
-将另一等分部分用包含SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18，SEQ ID N°19，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21的引物的混合物(扩增混合物4)进行扩增。
所述方法还包括获得的任意扩增产物的变性，和其后续的与包含一种或多种选自SEQ ID N°8，SEQ ID N°9，SEQ ID N°10，SEQ ID N°11，SEQID N°26，SEQ ID N°27，SEQ ID N°28，SEQ ID N°29和SEQ ID N°30的探针的微阵列的杂交。
在本发明的一个优选实施方案中，用于检测扩增产物的探针设置在微阵列中。微阵列技术使能够在需要用来保证结果的可靠性的任何对照的存在下，同时检测对应于样品中存在的一种或多种突变的不同的扩增产物。
因此，本发明还涉及微阵列，所述微阵列包含选自SEQ ID N°8，SEQID N°9，SEQ ID N°10，SEQ ID N°11，SEQ ID N°26，SEQ ID N°27，SEQ IDN°28，SEQ ID N°29和SEQ ID N°30的一种或多种探针。
在本发明的一个优选实施方案中，将获自一种或多种扩增产物的单链DNA微阵列上设置的多个靶标特异性探针孵育。至少一种，但优选多于一种具有与各个靶序列杂交的能力的探针设置在微阵列上。在本发明的某些实施方案中，单链DNA可以与溶液中提供的靶标特异性探针孵育；然而，优选所述探针排列在微阵列上。
本文所述的是微阵列中含有的探针，其可以被置于载玻片上或包含在反应容器中，其随后被称为阵列容器。阵列容器可以具有不同形式的表现，包括个体阵列容器，比如孔或管，或以孔或管的带，或平板排列的阵列容器组。通常，板由阵列容器带的组组成。因此，本发明的微阵列可以包含在个体阵列容器中。备选地，两种或多种微阵列可以包含在容器的带中。在一个优选的实施方案中，容器带由8个容器构成。此外，三个或更多阵列容器可以以容器带的组排列。在另一个优选的实施方案，容器带的组是微量滴定板。在另一个优选的实施方案中，微量滴定板由96个阵列容器组成。
在优选的实施方案中，微阵列的探针可以固定在固体支持物上，其中该固体支持物可以是阵列容器的底部或连接于阵列容器底部的不同的固体支持物。这意为，微阵列的表面可以是阵列容器的平底。备选地，微阵列的表面可以连接与阵列容器底部的固体支持物。
在本发明的实施方案中，所述反应容器具有实验室反应容器的典型尺寸。典型的填充体积在100μl至2.5ml的范围内，但在具体实施方案中也可以更低或更高。所述反应容器可以具有多至1.5ml的标准Eppendorf管的正常填充体积。最优选的填充体积是多至0.4ml，多至0.5ml，多至0.7ml，多至1.0ml或多至2.0ml。
样品分子无论在哪里与微阵列表面上的探针分子相互作用，由于扩增的DNA的标记，报告试剂结合标记并产生可视信号，所述可视信号可以被检测装置检测。
通过定位微阵列表面上的信号，鉴定相互作用探针和样品分子。在样品扩增产物用生物素标记的特定情况中，报告试剂可以是辣根过氧化物酶共价连接的链霉亲和素。后者特异性结合生物素，并且过氧化物酶引起底物如四甲基联苯胺(TMB)的沉淀。
同样可以使用根据本发明，造成阵列元件上沉淀，和可以用于检测靶和探针分子之间的相互作用的任何其它反应。当前工艺水平中已知的任何其它检测方法，比如荧光，可以用于检测扩增产物和相应探针之间的相互作用。所述方法将依赖于扩增产物的正确标记。
本发明的探针可通过不同的方法获得，比如化学合成(例如通过常规的磷酸三酯方法)或遗传工程技术，例如通过重组质粒的分子克隆，其中相应核苷酸序列被插入并且后者可以通过用核酸酶消化来获得。
对各个突变特异性的探针的个别探针或混合物，可以固定在固体支持物的单一位置，固定在固体支持物的两个不同位置和固体支持物的三个或更多不同位置。
另外，一种或多种对照探针也设置在不同位置。
在一个优选的实施方案中，扩增产物和其相应特异性或对照探针之间相互作用的可视化，由以下步骤组成：
-首先，使用光学装置捕获阵列图象；
-然后，分析图象；
-最后，提供含有结果解释的报告。
优选地，图象通过适当的软件手段分析。可以使用适于该处理的任何装置。
用本发明的方法对BRAF和PI3K突变的检测与这些相同基因中的其它突变，以及癌症中关联的其它基因的突变的检测是一致的。
事实上，本发明的方法可以与检测突变的其它方法组合，在BRAF和PI3K基因和/或癌症中相关的任何其它基因方面，用于癌症的仔细诊断和/或预后。
本发明的检测种BRAF突变V600E和V600K中的一种或多种，和/或4种PI3K突变E542K，E545D，E545K和H1047R中的一种或多种的方法，可以应用于怀疑与BRAF或PI3K突变相关的任意病理学和任意样品。
下文提供的实施例仅说明本发明并且不以任何方式限制所附权利要求的范围。
实施例
实施例1.
制备以下试剂混合物，用于样品/细胞系/克隆中BRAF突变V600E和V600K的多重ARMS扩增：
接着，将30μl获自石蜡包埋组织切片(样品)，或获自不同的细胞系或克隆的总洗脱物的5μl加入，到50μl最终的反应体积。
PCR的热循环条件是：
BRAF ARMS多重扩增的结果显示在图2和图3中。
将图2的表3中表明的样品/克隆或细胞系的不同ARMS产物在2％琼脂糖凝胶中可视化，其中分析不同的扩增反应的产物。
不同的扩增产物的长度如下：
-对应于突变V600E和V600K的突变-特异性条带的长度：144bp；
-IC条带的长度：101bp(β-肌动蛋白基因的扩增产物)；
-EC条带的长度：112bp(质粒ppg25的扩增产物)。
尽管事实是不同的扩增产物的长度相似，在含有一些突变-特异性条带与对照条带一起的孔，和仅含有对照条带的孔之间，可以鉴别差异。该差异对应于突变-特异性的扩增产物。
在这些实验中，已经核实，ARMS扩增仅在进行扩增的样品是对应于在用于多重扩增的试剂混合物中包括的ARMS引物所用于的一种突变的样品/克隆/细胞系的样品时发生。
已经通过DNA测序证实，各个孔中获得的ARMS产物的确由用相应ARMS引物特异性扩增样品/克隆/细胞系而产生。各个多重中的ARMS扩增是特异性的。
已经确认，扩增循环数量的小的改变(2-3个额外的或更少的扩增循环)不改变获得的结果。
将不同的多重ARMS扩增产物变性并与探针的微阵列杂交。相应结果的可视化显示在图3中。
实施例2.
对应于PI3K的扩增混合物2和3的组成显示如下。剩余的反应条件与实施例1中对于BRAF所显示的那些相同。
在其各自与扩增混合物2试剂的扩增、和之后获得的产物与探针微阵列的杂交、以及后续的可视化之后，对应于5μl含有PI3K突变H1047R的细胞系HTC 116(0.2ng/μl)(a)，或5μl含有20ng/μl浓度的DNA的临床样品(b)的结果分别显示在图4a)和4b)中。
实施例3.
扩增混合物中的内含物，对于内部对照和提取对照扩增必需的正向和反向引物，以及对于内部对照扩增所必需的质粒比如具有插入物的pBSK，在下示浓度，不改变获得的结果：
ARMS多重试剂 储存浓度(μM) μl/管
EC正向引物 40 0.13-0.25
EC反向引物(生物素标记) 40 0.13-0.25
IC正向引物 40 0.13-0.25
IC反向引物(生物素标记) 40 0.13-0.25
具有插入物的质粒pBSK 10e4拷贝 0.25-0.5
IC：内部对照；EC：提取对照。
序列表
SEQ ID N°1
用于扩增BRAF突变V600E的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
ggtgattttggtctagcttcaga
SEQ ID N°2
用于扩增BRAF突变V600K的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
ggtgattttggtctagctactaa
SEQ ID N°3
用于扩增BRAF突变V600E的ARMS引物
gattagcgcagtgcactacggtgattttggtctagcttcaga
SEQ ID N°4
用于扩增BRAF突变V600K的ARMS引物
agatcgttat caatcgcatg gtgattttgg tctagctact aa
SEQ ID N°5
与以下各项任一项组合使用的扩增引物：
包含SEQ ID N°1和2的ARMS引物，或
由SEQ ID N°3和4组成的ARMS引物。
ggccaaaaatttaatcagtgga
SEQ ID N°6
用于扩增BRAF突变V600E的ARMS引物的5’序列，所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于BRAF突变V600E的检测探针中。
gattagcgcagtgcactac
SEQ ID N°7
用于扩增BRAF突变V600K的ARMS引物的5’序列，所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于BRAF突变V600K的检测探针中。
agatcgttatcaatcgcat
SEQ ID N°8
用于检测BRAF突变V600E的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggagtctcgattagcgcagtgcactac
SEQ ID N°9
用于检测BRAF突变V600K的ARMS扩增产物的探针
agatcgttatcaatcgcatggtgat
SEQ ID N°10
用于检测BRAF突变V600K的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggagatcgttatcaatcgcat
SEQ ID N°11
用于检测BRAF突变V600K的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggagtctcagatcgttatcaatcgcat
SEQ ID N°12
用于扩增PIK3CA突变E542K的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
aagcaatttctacacgagatcctctgtcta
SEQ ID N°13
用于扩增PIK3CA突变E545D的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
cctctctctgaaatcagtgat
SEQ ID N°14
用于扩增PIK3CA突变E545K的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
gatcctctctctgaaatcagta
SEQ ID N°15
用于扩增PIK3CA突变H1047R的ARMS引物的3′序列，所述序列是靶标特异性的
gaaacaaatgaatgatgctcgt
SEQ ID N°16
用于扩增PIK3CA突变E542K的ARMS引物
agaccttagcatagcttaagcaatttctacacgagatcctctgtcta
SEQ ID N°17
用于扩增PIK3CA突变E545D的ARMS引物
actatagccgagtacggccctctctctgaaatcagtgat
SEQ ID N°18
用于扩增PIK3CA突变E545K的ARMS引物
taactggctatccggaggatcctctctctgaaatcagta
SEQ ID N°19
用于扩增PIK3CA突变H1047R的ARMS引物
cgatatgatatgctagttgaaacaaatgaatgatgctcgt
SEQ ID N°20
与包含SEQ ID N°12，13和14的ARMS引物，或由SEQ ID N°16，17和18组成的ARMS引物中任一种组合使用的扩增引物。
acatgctgagatcagccaaat
SEQ ID N°21
与包含SEQ ID N°15的ARMS引物，或由SEQ ID N°19组成的ARMS引物中任一个组合使用的扩增引物。
tggaatccagagtgagctttc
SEQ ID N°22
用于扩增PIK3CA突变E542K的ARMS引物的5’序列；所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于PIK3CA突变E542K的检测探针中
agaccttagcatagctt
SEQ ID N°23
用于扩增PIK3CA突变E545D的ARMS引物的5’序列；所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于PIK3CA突变E545D的检测探针中
actatagccgagtacggc
SEQ ID N°24
用于扩增PIK3CA突变E545K的ARMS引物的5’序列；所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于PIK3CA突变E545K的检测探针中
taactggctatccggag
SEQ ID N°25
用于扩增PIK3CA突变H1047R的ARMS引物的5’序列，所述序列是非靶标特异性的。该序列也存在于PIK3CA突变H1047R的检测探针。
cgatatgatatgctagtt
SEQ ID N°26
用于检测PIK3CA突变E542K的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggagtctcagaccttagcatagctt
SEQ ID N°27
用于检测PIK3CA突变E545D的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggactatagccgagtacggc
SEQ ID N°28
用于检测PIK3CA突变E545K的ARMS扩增产物的探针
cgggttacccgggagtctctaactggctatccggag
SEQ ID N°29
用于检测PIK3CA突变H1047R的ARMS扩增产物的探针
cgatatgatatgctagtt
SEQ ID N°30
用于检测PIK3CA突变H1047R的ARMS扩增产物的探针
CGGGTTACCCGGGCGATATGATATGCTAGTT

Claims (15)

1.检测一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-将包含核酸的测试样品用扩增混合物扩增，所述扩增混合物包含一种或多种ARMS引物，特征在于各ARMS引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，
各ARMS引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，
所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物；和
-通过将获得的任何扩增产物与一种或多种探针杂交来检测任何所述产物，其中各探针与所述扩增产物中对应于相应ARMS引物的5’标签序列的区域特异性杂交。
2.权利要求1所述的方法，其中一种或多种ARMS引物选自SEQ IDN°3，SEQ ID N°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ IDN°19。
3.权利要求1和2所述的方法，其中与一种或多种ARMS引物组合的一种或多种扩增引物包含18至24个核苷酸，并且当与所述一种或多种ARMS引物组合时，扩增产生一种或多种1000bp或更短的产物。
4.权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述扩增引物是：
-包含SEQ ID N°5或由SEQ ID N°5组成的引物，其用于与一种或多种以下ARMS引物一起扩增：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物包含选自SEQ ID N°1和SEQ IDN°2的3’靶标特异性序列，所述引物还包含15至20个核苷酸的非靶标特异性5’标签序列；和
-SEQ ID N°3和SEQ ID N°4的引物；
-包含SEQ ID N°20或由SEQ ID N°20组成的引物，所述引物用于与一种或多种以下ARMS引物一起扩增：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物包含选自SEQ ID N°12，SEQID N°13和SEQ ID N°14的3’靶标特异性序列，所述引物还包含15至20个核苷酸的非靶标特异性5’标签序列；和
-SEQ ID N°16，SEQ ID N°17和SEQ ID N°18的引物；
-包含SEQ ID N°21或由SEQ ID N°21组成的引物，所述引物用于与一种或多种以下ARMS引物一起扩增：
-36至50个核苷酸的引物，所述引物包含3’靶标特异性序列SEQ ID N°15，所述引物还包含15至20个核苷酸的非靶标特异性5’标签序列；和
-SEQ ID N°19的引物。
5.权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述扩增混合物包含DNA聚合酶和dNTPs。
6.权利要求1至5任一项所述的方法，其中使用以下引物组合中的一、二、三或四种：
-SEQ ID N°3，SEQ ID N°4和SEQ ID N°5；
-SEQ ID N°16，SEQ ID N°19，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21；
-SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°20；
-SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18，SEQ ID N°19，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21。
7.权利要求1至6任一项所述的方法，其中与扩增产物杂交的一种或多种探针具有15至45个核苷酸的长度，并且包含选自SEQ ID N°6，SEQID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25的组的序列。
8.权利要求1至7任一项所述的方法，其中一种或多种探针选自SEQID N°8，SEQ ID N°9，SEQ ID N°10，SEQ ID N°11，SEQ ID N°26，SEQ IDN°27，SEQ ID N°28，SEQ ID N°29和SEQ ID N°30。
9.一种检测包含核酸的测试样品中一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种用于核酸扩增的试剂的混合物，各混合物包含：
-一种或多种ARMS引物，其特征在于各引物具有36至50个核苷酸的长度，分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ IDN°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，
各引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，和
-一种或多种扩增引物，
所述试剂盒还包含微阵列，其中一种或多种探针被固定，各探针与相应ARMS产物中与相应ARMS引物的5’标签序列互补的区域特异性杂交。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中一种或多种探针具有15至45个核苷酸的长度，并且包含选自SEQ ID N°6，SEQ ID N°7，SEQ ID N°22，SEQ ID N°23，SEQ ID N°24和SEQ ID N°25的序列。
11.权利要求9和10所述的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种以下扩增混合物：
-包含SEQ ID N°3，SEQ ID N°4和SEQ ID N°5的引物的扩增混合物；
-包含SEQ ID N°16，SEQ ID N°19，SEQ ID N°20和SEQ ID N°21的引物的扩增混合物；
-包含SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°20的引物的扩增混合物；和
-包含SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18，SEQ ID N°19，SEQID N°20和SEQ ID N°21的引物的扩增混合物；
所述试剂盒还包含
-微阵列，所述微阵列包含一种或多种选自SEQ ID N°8，SEQ ID N°9，SEQ ID N°10，SEQ ID N°11，SEQ ID N°26，SEQ ID N°27，SEQ ID N°28，SEQ ID N°29和SEQ ID N°30的探针。
12.对应于一种或多种选自V600E和V600K的BRAF突变，和/或一种或多种选自E542K，E545D，E545K和H1047R的PI3K突变的核酸的扩增方法，其中所述方法包括将含有核酸的样品与扩增混合物相接触，所述扩增混合物包含一种或多种ARMS引物，特征在于各个ARMS引物具有36至50个核苷酸的总长度，并且分别包含选自SEQ ID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的3’靶标特异性序列，
各个ARMS引物还包含15至20个核苷酸的不同的非靶标特异性5’标签序列，
所述扩增混合物还包含一种或多种扩增引物。
13.一种36至50个核苷酸长度的ARMS引物，其特征在于，所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID N°1和SEQ ID N°2的BRAF靶标特异性序列，或选自SEQ ID N°12，SEQ ID N°13，SEQ ID N°14和SEQ ID N°15的PI3K靶标特异性序列，
和在其5’末端的15至20个核苷酸的非靶标特异性标签序列。
14.权利要求13所述的引物，所述引物选自包含SEQ ID N°3，SEQ IDN°4，SEQ ID N°16，SEQ ID N°17，SEQ ID N°18和SEQ ID N°19的组。
15.权利要求1至8所述的检测BRAF和/或PI3K突变的方法，或权利要求9至11所述的试剂盒，或权利要求12所述的扩增方法，或权利要求13和14所述的引物，用于患者中病理状况的诊断和/或预后，或用于预测患者对用抗-EGFR抗体治疗的响应的用途。
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