CN102382900B - 一种猪圆环病毒2型实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1)首先设计并合成特异性引物和探针；2)目的片段的获得：配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段；3)配制连接反应液；4)转化并提取质粒模板；5)定性PCR检测；6)定量PCR检测。本发明的检测方法简单、快速、灵敏度高、特性性强、重复性好，并且检测的定量极限和检测极限极低，灵敏度高，可准确定量检测出猪圆环病毒2型，达到预防和控制猪圆环病毒2型流行的作用。

Description

一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

目前，常用于检测病毒的方法有酶联免疫吸附反应(ELISA)、定性PCR技术和实时荧光定量PCR技术。ELISA灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性。定性PCR技术成本低、易于操作，但灵敏度比较低，且由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析，极易产生污染。实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏度、高特异性且操作简便而被广泛应用。

实时荧光定量PCR技术是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其化学原理包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

实时荧光定量PCR技术主要有以下三种荧光标记：

1)SYBR Green I：SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，区分非特异扩增，进一步还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响，同时，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。

2)分子信标：分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递(FRET)。由于“黑色”淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

3)TaqMan探针：TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因在3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法。即首先通过DNAstar软件在猪圆环病毒2型基因组内寻找保守序列，在获得的保守区域设计特异性引物和探针，然后通过扩增获得大量的目的片段。将目的片段和pGEM-T easy载体连接，取连接产物做模板，以设计好的特异引物做PCR检测。基于TaqMan探针特异性地结合于目的片段上，所以整个过程中监测到的荧光量的增加代表了目的片段的生成，保证了实验的特异性，以解决猪圆环病毒2型快速、准确检测问题。

本发明所述的猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

1)特异性引物和探针的设计和合成

本发明首先设计并合成了一个探针和两个特异性上、下游引物：分别由invitrogen公司和上海生物工程有限公司合成，即将pGEM-T easy载体的3′-T突出端与扩增得到的目的片段的5′-A突出端配对，引物上没有加酶切位点，目的片段和载体的连接为直接的T-A连接。

所述上、下游引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下：

上游引物5′-CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3′，

下游引物5′-CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3′，

所述探针的序列如SEQ ID No 3所示，具体如下：

FAM-5′-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3′-TAMRA；

2)目的片段的获得

配制PCR反应体系：在0.25ml eppendorf管中加入2×PCR Mix 12.5μl，上下游引物各1μl，基因组DNA 2μl；PCR反应程序为：94℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，72℃10min，35循环。回收并纯化PCR产物，即为目的片段。

3)配制连接反应体系

在0.5ml eppendorf管中加入快速连接缓冲液5μl，pGEM-T easy载体1μl，PCR产物2μl，T₄连接酶1μl，补加去离子水至总体积10μl。室温孵育1h或者4℃孵育过夜。

4)转化并提取质粒模板

将连接产物转化至JM109受体细胞中，涂板，选出阳性质粒克隆，测序。所提取的质粒即可作为后续试验的模板。

5)定性PCR检测

将阳性质粒、去离子水和待测样品作为模板做定性PCR检测。

6)定量PCR检测

将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，取得标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测。

本发明的检测方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好。另外，本发明设计了不同的特异性引物和探针，使实时荧光定量PCR检测检测的定量极限和检测极限极低，大大提高了实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度。

本发明的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法可以制备成试剂盒。使用该试剂盒，就能简单地进行猪圆环病毒2型的快速检测和定量检测。

附图说明

图1是本发明的猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线，横坐标为质粒模板拷贝数的对数，纵坐标为循环阈值。

图2是本发明的猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的定量检测图，横坐标为模板拷贝数量，纵坐标为循环阈值。

图3是本发明的猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的检测极限图，横坐标为循环数，纵坐标为每一时刻的荧光量。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

实验试剂和材料

猪圆环病毒2型、JM109受体细胞、猪流行性腹泻PED、猪传染性胃肠炎TGE、猪轮状病毒RV、猪蓝耳病PRRS和猪圆环病毒1型PCV1均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供，pGEM-T easy载体(Promega公司)，其余试剂均购于TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.。

胶回收试剂盒(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 3730 GeneticAnalyzer型测序仪(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.)，ABI 7500型定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。

实施例1

1)目的片段的获得

在猪圆环病毒2型检测研究中，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl：2×PCR Mix 12.5μl，上下游引物各1μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl。PCR反应程序为：94℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，72℃10min，35循环，通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，并用胶回收试剂盒纯化PCR产物，即得目的片段。

2)配制连接反应体系

在纯化的2μl PCR产物中，pGEM-T easy载体1μl，加入T₄连接酶1μl，快速连接缓冲液5μl，去离子水1μl，组成10μl的连接反应体系。室温孵育1h或者4℃孵育过夜。连接液过柱纯化，以20μl ddH₂O洗脱。

3)转化并提取质粒模板

回收纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接得到的产物转化至JM109受体细胞中，涂板，选出阳性质粒克隆。阳性质粒克隆提交invitrogen公司测序，测序仪为ABI PRISM 3730Genetic Analyzer，采用载体通用引物双向测序。序列BLASTN比对分析，149bp对应猪圆环病毒BJ0804的1094-1242区域。

4)定性PCR检测

分别以待测样品、阳性质粒和去离子水为模板做检测。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液(10×buffer)2.5μl，25mM氯化镁(MgCl₂)2μl，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)2μl，上下游引物各1μl，1.25U DNA聚合酶，模板1μl，去离子水补加至总体积25μl。PCR反应程序为：94℃5min，94℃30S，60℃20S，72℃20S，72℃7min，30循环，被测样品中78.3％为猪圆环病毒2型阳性。

5)定量PCR检测

将提取的阳性质粒梯度稀释(10¹⁰-10⁰)作为标准品，使用ABI 7500定量PCR仪，按以下反应体系和反应程序做定量PCR检测，得出标准曲线(参见图1)。PCR反应体系：10×buffer 2.5μl，25mM MgCl₂4.5μl，dNTP 2.5μl，上下游引物各1μl，探针0.5μl，1.25U DNA聚合酶，模板DNA 1μl，去离子水补加至总体积25μl。PCR反应程序：94℃10min，94℃15S，60℃40S，45循环。

以10⁷，10⁵，10³，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，1拷贝/微升的质粒为模板做定量PCR，PCR反应体系和PCR反应程序同上。结果表明，建立的定量PCR方法的定量极限为100拷贝/微升(参见图2)，检测极限为10拷贝/微升(参见图3)。

6)重复性检测

以10⁷，10⁵，10³拷贝/微升的标准品为模板，每个浓度重复十次进行实验内重复性检测，以同样浓度的标准品做十次实验间重复性检测，结果显示，变异系数分别在0.59％到1.05％和1.9％到4.2％之间。

7)特异性检测

以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴拷贝/微升的标准质粒，PED、TGE、RV、PRRS的cDNA和PCV1的DNA为模板做特异性检测，结果显示，实验过程中非猪圆环病毒2型质粒模板的反应中无荧光量的增加，本发明设计的特异性引物和探针具有很好的特异性。

以建立的荧光定量PCR体系作临床样品检测，结果显示，97.3％的样品为猪圆环病毒2型阳性，比定性PCR检测的检出率提高了18％。

以上实验结果表明，本发明所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法简单、快速、准确、特性性强、重复性好，并且检测的定量极限和检测极限极低，可准确定量检测出猪圆环病毒2型，起到预防和控制猪圆环病毒2型的流行。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (2)

1.一种用于猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于，所述特异性引物包括上、下游引物，所述上、下游引物和探针的序列如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，具体如下：

上游引物  5′-CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3′，

下游引物  5′-CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3′，

探针  FAM-5′-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3′-TAMRA。

2.权利要求1所述的特异性引物和探针在制备荧光定量PCR试剂盒中的应用。

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