CN114015808A - 一种猪圆环病毒2型的荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种猪圆环病毒2型的荧光定量pcr检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，对猪圆环病毒2型即PCV2的ORF2基因设计了相应的特异性引物和探针，与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV不发生交叉反应，检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，循环阈值(Ct)与标准DNA模板在102～106拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系，相关系数为1；重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％，为猪圆环病毒Ⅱ型的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的诊断方法。

Description

一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于猪圆环病毒的检测技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus Type，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus genus)的成员，具有两个血清型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。通常认为，PCV1不具致病性，PCV2具有致病性，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。
PCV2主要破坏猪的免疫系统，造成机体免疫抑制，抵抗力降低，导致被感染的猪产生其他病原微生物的继发感染。PCV2与猪的其他多种临床疾病也密切相关。自1997年在加拿大首次报道PMWS以来，PCV2在全世界养猪国家和地区迅速传播，并且流行范围不断扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失，引起了各国养猪业的高度重视。对PCV2感染猪的初期诊断与病猪的淘汰是PMWS防治的关键，有必要开发出一种PCV2的定性、定量快速检测方法用于PMWS的防控。
目前，对PCV2的检测技术主要有免疫学检测方法和分子生物学检测方法。免疫学检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、单层过氧化物酶试验(IPMA)等。其中，ELISA、IFA和IPMA主要用于PCV2血清的检测。
PCV2的分子生物学检测技术中最常见的是PCR技术，但常规PCR一般只能定性，不能定量。基因芯片通过荧光染料信号强度来推算每个探针对应的样品量，基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，局限性是嵌合体或部分特殊变异检出率低。
实时荧光定量PCR技术是以定性PCR技术为基础发展起来的，由美国AppliedBiosystems公司于1996年推出的一种新定量实验技术是在定性PCR技术基础上发展起来的，是到目前为止敏感性最高的核酸检测和定量技术。
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR/qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和特异性TaqMan探针法。特异性TaqMan荧光定量法的发光机理是以TaqMan荧光探针为基础，TaqMan荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。
常用的荧光基团有FAM、VIC、TAMRA、HEX、ROX、JOE和TET等。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，从而实现定量。qPCR技术是以荧光共振能量转移原理为基础，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值(Cycle threshold，循环阈值)和标准曲线对未知模板的起始浓度进行定量的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，灵敏度高，特异性强，稳定性好，既能定性、又能定量的实现检测PCV2的存在，建立的标准曲线在102－106拷贝/μL的浓度范围内呈极好的线性关系，回归系数可达1；重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1)设计引物
对PCV2的ORF2基因，GenBank登录号为EU921257.1，设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，具体序列如下：
PCV2-P1:5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2:5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；
PCV2-Probe:FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMR A；
2)配制PCR反应体系
在无PCV2阳性模板或PCR反应产物的独立空间内进行荧光定量PCR总体系的配置：向离心管中加入预混物，包含10×Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、UDG酶、Rox矫正染料；加入引物P1、P2和探针Probe，余量为灭菌双蒸水；
涡旋混匀、瞬离，然后将配置好的总体系进行分装，空白对照加入双蒸水，所有的荧光定量PCR反应均做3次平行重复；
3)加入模板
在独立空间内将配好的PCR体系加入阳性质粒或待检样品模板DNA，得到PCR反应液，加好立即盖严管盖，瞬离，避免产生气泡；模板要按照拷贝数从低到高的顺序依次加入，且此空间内不能放置用于PCR体系配制的原料；
4)荧光定量PCR扩增
将配好的PCR反应液进行荧光定量PCR扩增，延伸阶段收集荧光信号，反应结束后进行荧光定量PCR扩增结果分析，以浓度梯度为2×102-2×106拷贝/μL的10倍梯度稀释的PCV2阳性质粒为模板的扩增结果制作标准曲线，线性系数R2为1；以待测样品模板的扩增结果带入标准曲线，获得定量结果。
优选地，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1和P20.24-0.4μM、探针probe 0.16-0.24μM，10×buffer、dNTP 0.25mM、Mg2+0.3-0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL、UDG酶0.1-0.2μL、ROX 0.2-0.5μL。
进一步，步骤4)中，荧光定量PCR扩增程序为：37℃保温5min，94℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸31s，共45个循环。
一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，包括针对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，PCR反应体系，阳性质粒模板DNA；
其中，特异性引物P1、P2和探针probe的具体序列如下：
PCV2-P1:5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2:5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；
PCV2-Probe:FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMR A。
进一步，所述试剂盒中含有的PCR反应体系包括：引物P1和P2、探针probe、10×buffer、dNTP、2.5mM Mg2+、Taq DNA聚合酶、UDG酶和ROX矫正染料。
又，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P10.24-0.4μM、引物P20.24-0.4μM、探针probe 0.16-0.24μM，10×buffer、dNTP 0.25mM、Mg2+0.3-0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL、UDG酶0.1-0.2μL、ROX0.2-0.5μL。
优选地，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1和P20.36μM、探针probe0.16μM，10×buffer 2.5μL、dNTP 0.25mM、Mg2+0.6mM、Taq DNA聚合酶0.3μL、UDG酶0.1μL、ROX 0.5μL。
进一步，所述试剂盒中还含有阳性对照及阳性参考品。
本发明中，首先对猪圆环病毒2型特异性基因组序列进行分析，通过多次的筛选得到了一个猪圆环病毒2型特异性基因所在的区域，即ORF2是PCV2的主要保守区域，可以作为检测PCV2的参考区域，这段区域与PCV1具有很大的差异性。针对PCV2的特异性序列，本发明中设计了不同的引物和探针，扩增了PCV2的149bp的序列来检测PCV2，检测结果具有较高的灵敏度和特异性。
在试剂盒的研发过程中以含病毒样品、病毒DNA或者质粒设置阳性参考品用于质控。阳性对照指试剂盒组装后给用户试验的，一般是含病毒目的片段的质粒。
利用本发明，将PCV2的检测率相对于普通PCR提高了18％，本发明对涉及荧光定量PCR检测方法的重复性、灵敏度和特异性分别进行了鉴定。其中的重复性实验检测结果显示：本发明中所建立的检测方法是稳定的并且是可靠的。也将其他病毒作为模板同时进行实验，实验结果显示：本发明所建立的方法具有很好的特异性，而且没有与其他病毒发生交叉反应。实验也对临床样品进行检测，这样评价了其作为特异性基因在猪圆环病毒2型实际样品的Taqman荧光定量PCR检测中的应用性。
Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。荧光阈值是在荧光扩增曲线指数扩增阶段设定的一个值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，且起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品进行扩增可以获取标准曲线，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR克服了普通PCR法进入平台期后定量的较大误差，实现了对未知模板的精确定量。该技术不仅实现了对未知模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，在临床检验及生命科学研究方面有着重要的意义。
本发明具有如下有益效果：
利用本发明对猪圆环病毒2型进行荧光定量检测，灵敏度高，特异性强，稳定性好，与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV不发生交叉反应，检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。
利用本发明，既能定性、又能定量的实现检测PCV2的存在，建立的标准曲线在102－106拷贝/μL的浓度范围内呈极好的线性关系，回归系数可达1；重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％
本发明将PCV2的检测率相对于普通PCR提高了18％，建立的方法和开发的试剂盒不仅可以提供一种快速的检测PCV2的方法，补充了PCV2检测和定量方法，也可能被应用于评价抗PCV2疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例2中猪圆环病毒2型荧光定量PCR原理示意图。
图2为本发明实施例2中浓度为2×106、2×105、2×104、2×103和2×102拷贝/μL阳性质粒的PCV2荧光定量PCR扩增曲线图。
图3为本发明实施例2中2×102-2×106拷贝/μL浓度范围的标准曲线。横坐标为模板浓度，纵坐标对应的Ct值。
图4为本发明实施例3中PCV2荧光定量PCR特异性实验结果。
图5为本发明实施例4中PCV2荧光定量PCR灵敏度实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备PCV2扩增产物重组质粒及标准品
利用NCBI数据库找出PCV2的ORF2基因，以PCV2(BJ0804株)ORF2基因作为靶序列，GenBank登录号为EU921257.1，全长149bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示，进行设计引物和探针，使用软件Primer Premier 5.0进行引物和探针的设计，Oligo DNA man 4.0和PrimerAnalysis进行比对分析，具体序列如下：
PCV2-P1：5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2：5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；
PCV2-Probe：FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMRA。
采用天根生化科技(北京)有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取PCV2的病毒基因组DNA。
以猪圆环病毒2型BJ0804株为标准模板，引物P1和P2为上、下游引物，按照PCR体系进行扩增，PCR反应体系为25μL体积，包括：ddH2O16.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，引物P11.0μL，引物P21.0μL，Taq ploymerase(Takara Corp.)1.0μL，1.0μL提取的DNA。
反应程序：95℃预变性5分钟，进入PCR反应循环：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃总延伸5分钟。设立阴性对照,进行常规PCR。反应结束后取5μL PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得149bp的扩增产物。
PCR产物的回收与纯化按照Omega公司E.Z.N.A.GelExtraction Kit说明书进行。回收产物与载体连接反应参照pMD18-T vector的使用说明进行，连接产物转化感受态细胞，采用菌落PCR法筛选阳性重组质粒。
制备标准品：参照3S Spin Plasmid MiniprepKit V3.1的说明书小量制备质粒，将上述阳性重组质粒做100倍稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数：拷贝数＝质粒浓度×阿氏常数/(一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度)，标准品作10倍梯度稀释。
用紫外分光光度计测定阳性质粒的OD值，计算其浓度，并依次稀释成含质粒数量分别为108、107、106…101、100个拷贝共9个样品梯度作为标准品，-40℃保存备用。
实施例2一种猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量实时检测方法
1.设计引物
利用NCBI数据库找出PCV2的ORF2基因，基于PCV2(BJ0804株)ORF2基因作为靶序列，GenBank登录号为EU921257.1，全长149bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示，进行设计引物和探针，使用软件Primer Premier 5.0进行引物和探针的设计，Oligo DNA man 4.0和Primer Analysis进行比对分析，具体序列如下：
PCV2-P1：5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2：5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；
PCV2-Probe：FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMRA。
2.配制反应体系
为了获得高效、灵敏的定量PCR反应系统，需要对反应体系中不同引物、探针(或染料)浓度、Mg2+浓度、或者退火温度进行优化，通过相同的定量的PCR反应条件，筛选出荧光信号在指数期上升较快，监测到的荧光信号强并且反应重复性好对应的体系作为定量PCR检测反应的条件。
本发明的荧光定量PCR反应体系中，各成分合适的终浓度为：引物P1和P2各0.24-0.4μM、探针probe 0.16-0.24μM，10×buffer 2.5-3μL、dNTP0.25-0.5mM、Mg2+0.3-0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL、UDG酶0.1-0.2μL、ROX 0.2-0.5μL。
本发明的TaqMan荧光定量PCR检测中，最优的25μL反应总体系中，各成分的终浓度为：引物P1和P20.36μM、探针probe 0.16μM，10×buffer2.5μL、dNTP 0.25mM、Mg2+0.6mM、TaqDNA聚合酶0.3μL、UDG酶0.1μL、ROX 0.5μL；所有的定量PCR中每个反应进行3次，每次每个样品含有3个重复；定量PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，进入PCR反应循环：95℃变性15秒，60℃退火和延伸40秒，共进行45个循环，在延伸阶段收集荧光信号。
在无PCV2阳性模板或PCR反应产物的独立空间内进行荧光定量PCR总体系的配置：于1.5mL离心管中加入预混物Premix11.9μL，预混物Premix内含10×Buffer、dNTPs、2.5mMMg2+、Taq酶、UDG酶和Rox矫正染料；加入引物P1和P2各0.9μL，探针Probe 0.4μL，其余使用灭菌双蒸水补足，每管20μL。
涡旋混匀，瞬离，然后将配置好的总体系分装至8连PCR排管中，空白对照加入5μL双蒸水，所有的荧光定量PCR反应均做3次平行重复。
3.加入模板
在模板间(未放置配制PCR体系原料的独立空间)内将配好的PCR体系加入阳性质粒模板DNA、阳性参考品、阳性对照品或待检样品模板5μL，加好立即盖严管盖，瞬离，避免产生气泡。注意：为防止高浓度模板感染低浓度模板造成定量结果不准确，要按照拷贝数从低到高的顺序依次加入模板。
4.荧光定量PCR扩增
将配好的PCR反应液进行荧光定量PCR扩增，延伸阶段收集荧光信号，反应结束后进行荧光定量PCR扩增结果分析，以浓度梯度为2×102-2×106拷贝/μL的10倍梯度稀释的PCV2阳性质粒为模板的扩增结果制作标准曲线。
分别以浓度梯度为2×106、2×105、2×104、2×103和2×102拷贝/μL的质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，重复验证PCV2的荧光定量PCR标准曲线。
图2为以2×106、2×105、2×104、2×103和2×102拷贝/μL的质粒的PCV2荧光定量PCR扩增曲线图，可见，100拷贝/μL的模板可以得到可信的定量结果，当模板数降至100以下，Ct值开始偏离线性范围，因此定量极限为10拷贝/μL，检测极限为1拷贝/μL。
标准曲线如图3所示，横坐标为模板浓度，纵坐标对应的Ct值，标准曲线在2×102-2×106拷贝/μL浓度范围内呈现出极好的线性关系，线性系数R2为1，效能E接近于100％。
再以待测样品模板的扩增结果Ct值带入标准曲线公式，获得获得待测样品的浓度。
实施例3PCV2的荧光定量PCR检测方法特异性验证
按照实施例2的方法分别对PCV2质粒、PCV2病毒样品、猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的cDNA为模板和双蒸水进行荧光定量PCR检测，测定该检测方法的特异性。
检测结果如图4所示，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1-3：PCV2质粒3个重复实验，4-6：PCV2病毒样品3个重复实验，7：CSFV病毒样品3个重复实验，8：PRRSV病毒样品3个重复实验，9：PRV病毒样品3个重复实验，10：阴性对照3个重复实验。
由图4可见，引物P1、P2和探针Probe在非PCV2病毒样品中均未出现荧光信号增幅，而在所有供试PCV2病毒样品中均有明显的荧光增幅，说明引物和探针特异高，与其他病毒无交叉反应。
实施例4PCV2的荧光定量PCR检测方法灵敏度验证
将实施例1中的重组质粒做倍比稀释，并用相应的引物P1、P2和探针Probe进行real-time PCR扩增，采用实施例2中的扩增条件，测试其灵敏度。
对PCV2质粒按拷贝数10倍梯度稀释的样品6组：100、101、102、103、104、105进行10倍梯度稀释，PCV2荧光定量PCR检测方法灵敏度检测结果见图5，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1：1×105拷贝/μL；2：1×104拷贝/μL，3：1×103拷贝/μL；4：1×102拷贝/μL；5：1×101拷贝/μL；6：1×100拷贝/μL，7：阴性对照。
由图5可见，6个10倍梯度稀释样品均有明显荧光增幅，最低DNA浓度为100拷贝，即建立的PCV2实时荧光PCR方法检测下限为100拷贝(5μL模板)，符合日常检测要求。
实施例5PCV2的荧光定量PCR检测方法重复性试验
将含有107、105和103copy/μL的质粒溶液作为模板，采用实施例2中的扩增条件进行扩增，每个样品十个重复，试验十次。计算每次试验同一浓度各样品和各次试验同一浓度各样品的Ct值的变异系数CV％，结果参见表1。
表1:实时荧光定量PCR试验内和试验间的变异系数
Figure BDA0003371496080000101
注：SD:标准偏差；CV:变异系数
由表1可见，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％。若是变异系数CV值大于5％，不符合国家的规定要求。
实施例6临床样品检测
委托上海博满生物科技有限公司、上海斯高勒生物科技有限公司、上海珺珏生物科技有限公司在江苏省、浙江省、上海市畜牧养殖场进行了推广应用，获得1000份临床样本，具体实验条件参考实施例2，将标准品和临床样品分别作为模板在同一次试验中进行定量PCR扩增，用建立的实时荧光定量PCR方法对1000份临床样品进行检测。
用本发明的荧光定量检测试剂盒检测上述1000个血清样品，结果检出其中有710个临床样品感染PCV2，本发明对PCV2的检测率相对于普通PCR检测方法提高了18％。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒
<130> 2111177
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 149
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2 strain)
<400> 1
cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 60
tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc catagctgat ttcttttgtt gtttggttgg 120
aagtaatcaa tagtggaatc taggacagg 149

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1)设计引物
对PCV2的ORF2基因，GenBank登录号为EU921257.1，设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，具体序列如下：
PCV2-P1:5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2:5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；
PCV2-Probe:FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMRA；
2)配制PCR反应体系
在无PCV2阳性模板或PCR反应产物的独立空间内进行荧光定量PCR总体系的配置：向离心管中加入预混物，包含10×Buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、UDG酶、Rox矫正染料；加入引物P1、P2和探针Probe，余量为灭菌双蒸水；
涡旋混匀、瞬离，然后将配置好的总体系进行分装，空白对照加入双蒸水，所有的荧光定量PCR反应均做3次平行重复；
3)加入模板
在独立空间内将配好的PCR体系加入阳性质粒或待检样品模板DNA，得到PCR反应液，加好立即盖严管盖，瞬离，避免产生气泡；模板要按照拷贝数从低到高的顺序依次加入，且此空间内不能放置用于PCR体系配制的原料；
4)荧光定量PCR扩增
将配好的PCR反应液进行荧光定量PCR扩增，延伸阶段收集荧光信号，反应结束后进行荧光定量PCR扩增结果分析，以浓度梯度为2×102-2×106拷贝/μL的10倍梯度稀释的PCV2阳性质粒为模板的扩增结果制作标准曲线，线性系数R2为1；以待测样品模板的扩增结果带入标准曲线，获得定量结果。
2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1 0.24-0.4μM、引物P2 0.24-0.4μM、探针probe 0.16-0.24μM，10×buffer、dNTP 0.25mM、Mg2+0.3-0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL、UDG酶0.1-0.2μL、ROX 0.2-0.5μL。
3.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤4)中，荧光定量PCR扩增程序为：37℃保温5min，94℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸31s，共45个循环。
4.一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，包括：针对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，PCR反应体系，阳性质粒模板DNA；
其中，特异性引物P1、P2和探针probe的具体序列如下：
PCV2-P1:5’-CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA-3’；
PCV2-P2:5’-CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT-3’；；
PCV2-Probe:FAM-5’-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3’-TAMRA。
5.根据权利要求4所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有的PCR反应体系包括：引物P1和P2、探针probe、10×buffer、dNTP、2.5mM Mg2+、Taq DNA聚合酶、UDG酶和ROX矫正染料。
6.根据权利要求4所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1 0.24-0.4μM、引物P2 0.24-0.4μM、探针probe0.16-0.24μM，10×buffer、dNTP 0.25mM、Mg2+0.3-0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL、UDG酶0.1-0.2μL、ROX 0.2-0.5μL。
7.根据权利要求4所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1和P2 0.36μM、探针probe 0.16μM，10×buffer2.5μL、dNTP 0.25mM、Mg2+0.6mM、Taq DNA聚合酶0.3μL、UDG酶0.1μL、ROX 0.5μL。
8.根据权利要求4所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性对照及阳性参考品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382900A (zh) * 2010-08-31 2012-03-21 上海市农业科学院 一种猪圆环病毒2型实时荧光定量pcr检测方法

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Title
姜海军等: "猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用", 《福建农林大学学报(自然科学版)》 *

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