CN113025755B

CN113025755B - 一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用

Info

Publication number: CN113025755B
Application number: CN202110341777.4A
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 吕殿红; 温肖会; 翟颀
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113025755A

Abstract

本发明公开了一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物序列。通过对引物与荧光探针的设计，引物探针序列结合位点特异性好，可准确将猪圆环病毒2e型与其他分型区别开来，本发明制备的试剂特异性强、敏感性高、省时省力，能够快速对猪圆环病毒2e型进行分型检测。

Description

一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。根据抗原性与致病性的差异，猪圆环病毒被分为猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型。猪圆环病毒1型一般被认为不致病。猪圆环病毒3型被认为能与猪圆环病毒2型协同感染。感染猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型的发病猪通常会出现猪圆环病毒相关疾病，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及猪呼吸道疾病综合征等。其中猪圆环病毒2型仍在不断突变与进化中，猪圆环病毒2型的优势基因型也从之前的猪圆环病毒2b型转为猪圆环病毒2d型。

猪圆环病毒2e型是一种相对较晚发现的基因型，致病性尚未有相关实验证明，该基因型在美国、墨西哥和我国均有发现。因此对猪圆环病毒2e型进行监测显得尤为重要。对于猪圆环病毒2型基因型分型，目前常见的检测主要是通过聚合酶链式反应后进行第一代DNA测序完成，但检测周期较长。TaqMan探针荧光定量PCR具有快速、特异性高、灵敏度好、可定量等优点，相比传统PCR能很好地区别相似性高的序列，尤其适合针对猪圆环病毒2e型基因型的分型检测。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测猪圆环病毒2e型的试剂，能够快速检测猪圆环病毒2e分型。

本发明还提出一种上述试剂的应用。

本发明还提出一种用于猪圆环病毒2e型检测的试剂盒。

本发明还提出一种用于猪圆环病毒2e型的检测方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种检测猪圆环病毒2e型的试剂，所述试剂包括包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和序列如SEQ ID No.2所示的反向引物序列。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括序列如SEQ ID No.3所示荧光探针。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针独立地于5’端结合荧光基团，3’端结合淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针的5’端标记的荧光报告基团选自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述荧光探针的3’端标记的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTM RQ或LowaBlackTM FQ。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ。

根据本发明第二方面实施方式的应用，所述试剂在制备猪圆环病毒2e型检测的试剂盒中的应用。

根据本发明第三方面实施方式的一种用于猪圆环病毒2e型检测的试剂盒包括上述试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括FastFireqPCRPreMix(反应混合液)和ddH₂O。

根据本发明第四方面实施方式的一种猪圆环病毒2e型的检测方法，包括以下步骤：

S1、提取样品病毒总核酸，逆转录成CDNA；

S2、使用上述的试剂配制荧光定量PCR反应体系，根据反应结果是否有S曲线的生成判定是否为猪圆环病毒2e型，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中所述荧光定量PCR反应体系为：引物PCV2e-117-F 1.0μl，引物PCV2e-117-R 1.0μl，探针PCV2e-117-probe 1.0μl，2×FastFireqPCRPreMix 12.5μl，ddH₂O 7.5μl，模板DNA 2.0μl，总体积为25μL。其中PCV2e-117-F、PCV2e-117-R和PCV2e-117-probe初始浓度为10μmol/l，加入反应体系后终浓度皆为μmol/l。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3所述荧光定量PCR的扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s，58℃退火延伸15s，采集FAM通道荧光信号，共计45个循环。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用，通过本发明方案的对引物和荧光探针的设计，引物探针序列结合位点特异性好，可准确将猪圆环病毒2e型与其他分型区别开来(如猪圆环病毒2a型、猪圆环病毒2b型、猪圆环病毒2c型和猪圆环病毒2d型等)，专门用于猪圆环病毒2e型的分型检测，能够实现快速对猪圆环病毒2e型进行分型，特异性强、敏感性高、省时省力，为猪圆环病毒2e型的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中的各基因型与猪圆环病毒2e型(PCV2e)相似性比对曲线图；

图2为本发明实施例中的PCV2e-117引物探针序列与各基因型序列的比对图；

图3为本发明实施例中的PCV2e-81引物探针可行性实验结果图，其中，曲线①为PCV2e质粒作为模板，曲线②为将PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d质粒作为模板；

图4为本发明实施例中的PCV2e-117引物探针可行性实验结果图，其中，曲线①为PCV2e质粒作为模板，曲线②为将PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d质粒作为模板；

图5为本发明实施例中的猪圆环病毒2e型荧光PCR检测特异性试验结果图，其中，曲线①为猪圆环病毒2e型阳性对照；曲线②为猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2a型、猪圆环病毒2b型、猪圆环病毒2c型、猪圆环病毒2d型、猪圆环病毒3型、伪狂犬病毒和猪细小病毒；

图6为本发明实施例中的猪圆环病毒2e型荧光PCR检测试剂盒敏感性试验结果图；曲线直接用各梯度稀释液所含质粒拷贝数(拷贝/μl)来表示，分别为猪圆环病毒2e型阳性质粒的10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl、10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10¹拷贝/μl、10⁰拷贝/μl的稀释液；

图7为本发明实施例中的猪圆环病毒2e型荧光PCR检测试剂盒临床样品检测结果图，其中，曲线①为猪圆环病毒2e型阳性对照，曲线②为临床样品与阴性对照。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。下述实施例中各原料若无特殊说明，则均为商业途径购买的本领域常用规格成分。

实验材料：

猪圆环病毒2a型、猪圆环病毒2b型、猪圆环病毒2c型、猪圆环病毒2d型和猪圆环病毒2e型阳性重组质粒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒3型、伪狂犬病毒和猪细小病毒重组质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

主要试剂：

2×FastFire qPCRPreMix试剂、ddH₂O购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例一种检测猪圆环病毒2e型的试剂

一种检测猪圆环病毒2e型的试剂的制备方法与应用，步骤如下：

1、荧光定量PCR引物和探针的设计与合成

根据猪圆环病毒2e型基因序列(NCBI GenBank登录号为KT795287.1)设计出扩增猪圆环病毒2e型基因序列的引物对PCV2e-117-F、PCV2e-117-R、TaqMan探针PCV2e-117-probe和PCV2e-81-F、PCV2e-81-R、TaqMan探针PCV2e-81-probe，引物对和荧光探针的核苷酸序列如表1所示。

通过对猪圆环病毒2e型与其他2型猪圆环病毒的核苷酸序列进行比对，图1为各基因型与猪圆环病毒2e型(PCV2e)相似性比对曲线图，从图中可以看出，通过具体位点相似性分析，发现猪圆环病毒2e的ORF2基因与其他基因型同区域的相似性相对较低，介于70％-90％，故将猪圆环病毒2e(NCBI GenBank登录号为KT795287.1)的ORF2基因作为设计模板，图2为PCV2e-117引物序列和探针序列与各基因型序列的比对图，从图中可以看出，通过比对猪圆环病毒2e型与其他2型猪圆环病毒的核苷酸序列ORF2基因，结合比对的具体突变位点(如图2所示)，设计并筛选得到特异性良好的引物对和探针序列。

表1

引物名称	核苷酸序列
		PCV2e-117-F	GGTCTTTCATATTAAATTCTCTAAA(SEQ ID NO.1)
PCV2e-117-R	CTGGTAATGTGGACCATA(SEQ ID NO.2)
		PCV2e-117-probe	FAM-TTCAACACAGTACCACTGCC-BHQ1(SEQ ID NO.3)
PCV2e-81-F	TCTCCAATATTAAATCTCATCA(SEQ ID NO.4)
		PCV2e-81-R	CTCCTATGTATATACTGTTGTAA(SEQ ID NO.5)
PCV2e-81-probe	FAM-TCCACAGTCACACCGCCATC-BHQ1(SEQ ID NO.6)

2、引物和荧光探针的筛选

将PCV2e、PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d质粒分别作为DNA模板，其中PCV2e质粒作为阳性对照模板，PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d质粒分别作为阴性对照模板，分别进行两套特异性探针的可行性实验，配制如下反应体系：引物PCV2e-117-F 1.0μl，引物PCV2e-117-R1.0μl，探针PCV2e-117-probe 1.0μl，2×FastFire qPCRPreMix 12.5μl，ddH₂O 7.5μl，模板DNA 2.0μl，总体积为25μL。荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，58℃退火延伸15s，采集FAM通道荧光信号，共计45个循环。

实验结果如图3和图4所示，图3为PCV2e-81引物探针可行性实验结果图，图4为PCV2e-117引物探针可行性实验结果图，从图中可以看出，PCV2e-81引物探针的信号强度较弱，无标准S曲线产生；PCV2e-117引物探针在阳性对照有标准S曲线产生，阴性对照无曲线产生的情况下，待检样品出现典型的S曲线且Ct值≤36，判定为猪圆环病毒2e型核酸阳性；36<Ct值≤40判定为可疑；Ct值>40或是无Ct值则判定为猪圆环病毒2e型核酸阴性。

3、特异性试验

实验选取PCV2e-117作为荧光探针，对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2a型、猪圆环病毒2b型、猪圆环病毒2c型、猪圆环病毒2d型和猪圆环病毒2e型、猪圆环病毒3型、伪狂犬病毒和猪细小病毒的重组质粒按上述方法分别进行荧光PCR扩增，来检测本发明方案制备的试剂的特异性。

检测结果如图5所示，从图5中可以看出，只有猪圆环病毒2e型阳性对照出现S曲线并有Ct值，而猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2a型、猪圆环病毒2b型、猪圆环病毒2c型、猪圆环病毒2d型、猪圆环病毒3型、伪狂犬病毒和猪细小病毒未呈现S曲线且无Ct值，表明本申请方案制备的试剂具有良好的特异性。

4、敏感度试验

选取猪圆环病毒2e型阳性质粒为模板(浓度为40ng/μl，换算为拷贝数为10¹⁰拷贝/μl)，进行倍比稀释(稀释后浓度分别为10⁹拷贝/μl、10⁸拷贝/μl、10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl、10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10¹拷贝/μl、10⁰拷贝/μl 10个梯度)，选取10⁰拷贝/μl至10⁷拷贝/μl 8个稀释梯度来测定该方法的敏感性。

实验结果如图6所示，从图中可以看出，产生扩增曲线的最高稀释浓度为10²拷贝/μl，即优化后的试剂在稀释到100拷贝/μl(模板浓度)即4×10^-4pg/μl(模板浓度)时仍然能够检出扩增曲线，说明该方法具有良好的敏感性。

5、重复性试验

用6种浓度的阳性标准品质粒分别进行3次重复性试验，其重复性试验数据如下表2所示，实验结果显示，重复性试验的标准差在0.13至0.59之间，变异系数在0.8至4.3之间，用本发明方案制备的试剂采用荧光定量PCR检测进行检测得到的结果具有极高的稳定性和可重复性。

表2

6、猪圆环病毒2e型荧光定量PCR方法的临床检测

抽取从广东省地区采集的临床猪源样本100份，用本发明方案制备的试剂进行荧光PCR检测。实验结果如图7所示，经检测，100份临床样本中未发现猪圆环病毒2e型阳性样本。

由于猪圆环病毒2型基因组存在遗传多样性。研发一种用于检测猪圆环病毒2e型的荧光PCR试剂或试剂盒，需要大量进行基因序列比对，进而甄选出既特异且广谱的引物和探针。猪圆环病毒2e型的荧光PCR试剂盒有助于猪圆环病毒2e型的精准检测，便于我国各地猪场开展猪圆环病毒2e型的监测与净化，进而促进养猪业健康发展。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtctttcat attaaattct ctaaa 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctggtaatgt ggaccata 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcaacacag taccactgcc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctccaatat taaatctcat ca 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcctatgta tatactgttg taa 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccacagtca caccgccatc 20

Claims

1.一种检测猪圆环病毒2e型的试剂，其特征在于，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1所示的正向引物PCV2e-117-F、序列如SEQ ID No.2所示的反向引物PCV2e-117-R和序列如SEQID No.3所示荧光探针PCV2e-117-probe。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，荧光探针独立地于5’端结合荧光基团，3’端结合淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记的荧光报告基团选自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述荧光探针的3’端标记的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black^TM RQ或Lowa Black^TM FQ。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM。

5.根据权利要求1~4任一项所述的试剂在制备猪圆环病毒2e型检测的试剂盒中的应用。

6.一种用于猪圆环病毒2e型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~4任一项所述的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括FastFire qPCRPreMix和ddH₂O。

8.一种猪圆环病毒2e型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取样品病毒总核酸，逆转录成CDNA；

S2、使用权利要求1~4任一项所述的试剂配制荧光定量PCR反应体系，根据反应结果是否有S曲线的生成判定是否为猪圆环病毒2e型，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中使用权利要求4所述的试剂配制荧光定量PCR反应体系，根据反应结果是否有S曲线的生成判定是否为猪圆环病毒2e型。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光定量PCR反应体系为：引物PCV2e-117-F 1.0μl，引物PCV2e-117-R 1.0μl，荧光探针PCV2e-117-probe 1.0μl，2×FastFire qPCR PreMix 12.5μl，ddH₂O 7.5μl，模板DNA 2.0μl，总体积为25µl。

11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光定量PCR的扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s，58℃退火延伸15s，采集FAM通道荧光信号，共计45个循环。