CN104388593B - 一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real‑time PCR试剂盒 - Google Patents

一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real‑time PCR试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real‑time PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照以及序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。本发明在PCR的基础上，使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增靶序列上并且PCR上游引物在有效延伸时，报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统才能接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；且该反应始终都是闭管的实时检测可以有效防止反应产物的污染，与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于猪圆环病毒的防控和隐性带毒动物的剔除。

Description

一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及探针法实时-定量聚合酶链反应试剂盒，属于猪圆环病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
背景技术
猪圆环病毒病是以2-型圆环病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）为主要病原、单独或继发/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。其感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的发生密切相关。致死率在1%～30%之间不等(Gillespie J, et al.,2009)，患病猪的主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大、病毒血症和免疫抑制，容易继发感染如PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征)、PPV（猪细小病毒病）、猪肺炎支原体和猪链球菌等病原，造成机体多重感染。猪圆环病的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国外相继有猪圆环病毒的检测诊断试剂盒、但就目前市场供应的各种猪圆环病的抗原检测试剂盒，每头份价格在20～80元人民币之间，高昂的价格严重制约了猪圆环病实验室检测及流行病学的普查工作。目前应用相对较多的检测技术为常规的PCR方法，该方法可直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是结果的观察必须依赖于凝胶电泳，不但耗时长，而且凝胶中的溴化乙锭是一种强的致癌物，对操作人员的健康具有一定的危害；并且猪圆环病是一种具有高度传染性的病毒，其DNA（脱氧核糖核酸）特别容易发生变异。针对现有技术的不足，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格低廉的猪圆环病毒检测试剂盒。
核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定基因片段的检测。自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于 SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数同步进行，因此特异性强、灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。该技术是将常规PCR与荧光检测相结合的技术，不仅具有敏感性高、特异性强、用时短等优点，而且可通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，已成为病原体检测的重要方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确定量的检测需求，从而提供一种能够快速、 敏感、准确地检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ IDNO:3的探针引物的混合物。
所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA，
SEQ ID NO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT。
所述探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
所述扩增引物扩增出的条带序列为：
SEQ ID NO:4（218 bp）：
aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgct。
所述阴性对照为无DNA酶水。
所述阳性对照为含有PCV2基因序列的阳性质粒pGM-218；其构建方式如下：
a. PCV基因组DNA的提取按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit（凯杰公司脱氧核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作，以提取猪圆环病毒灭活疫苗基因组DNA为模板；以SEQID NO:1及SEQ ID NO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性2min；94℃变性50s, 56℃退火50s, 72℃延伸50s, 共30个循环；72℃再延伸10min, 4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
b. PCR产物的克隆及序列分析：
PCR产物用AXYGEN（爱思进）公司的胶回收试剂盒回收，与pGMD-T-Easy克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用AXYGEN质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pGM-218。
其标准曲线制作如下：
对pGM-218阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1～10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。
根据扩增结果从中选取5～6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。如图1所示。
本发明还提供了所述用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a. 使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。
b. 结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求。其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点均优于普通PCR方法。
本发明应用分子生物学技术研制和开发出了特异性、敏感性和准确性高及价格便宜的PCV2 Taqman Real-time PCR试剂盒,一方面可以弥补我国对于PCV2检测的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。本发明在使用过程中无需电泳技术检测，使得检测时间由原来的3～4小时缩短到现在的1～2小时，并且避免了接触溴化乙锭的危险，有利于检测人员的健康；同时本发明使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增的靶序列并能被Taq酶降解时才会检测到荧光信号，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于PCV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染；本发明适用于待测猪的脾脏、全血、淋巴结、肉品及血清等样品，所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明制作标准曲线；
图2为本发明样本检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中一个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、引物的设计和制备：
参照GenBank（基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
扩增引物序列为：
SEQ ID NO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA，
SEQ ID NO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT。
探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并保存。
2、制备试剂盒：
本试剂盒由以下组分组成：
a.2×扩增预混液：12.5μL；
b.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液3μl，218bp上游引物1μl，218bp下游引物1μl，探针引物1μl ；
c.无DNA/RNA酶水6.5μL；
d.阳性对照pGM-218阳性质粒3μl；
e.阴性对照无DNA酶水3μl；
3、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3 μl；c. 无DNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪脾脏中提取的DNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例2
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3 μl；c. 无DNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪全血中提取的DNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例3
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3 μl；c. 无DNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪淋巴结中提取的DNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例4
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测猪圆环病毒的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3 μl；c. 无DNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪肉品中提取的DNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增:94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度56℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:1：上游引物AAGCGGACCCCAACCACATAAA，
SEQ ID NO:2：下游引物AGCGGGCACCCAAATACCACT；
所述探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于：所述扩增引物扩增出的条带序列为：
序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列；
SEQ ID NO:4，218 bp：
aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgct。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于：所述探针引物的5’端标记FAM报告荧光基团、3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
5. 根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为构建的pGM-218阳性质粒，以及利用其制作的标准曲线，该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪圆环病毒基因序列，长度218bp，克隆至pGEM-T Easy克隆载体，筛选为阳性的命名为pGM-218，即阳性对照，利用阳性对照制作标准曲线。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组分的配比为：
a.2×扩增预混液：25份；
b.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，其中，上游引物2份，下游引物2份，探针引物2份；
c.无RNA/DNA酶水13份；
d.阳性对照pGM-218阳性质粒6份，所述阳性对照pGM-218阳性质粒是扩增引物SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪圆环病毒基因序列，长度218bp，克隆至pGEM-T Easy克隆载体，筛选为阳性的命名为阳性对照pGM-218阳性质粒；
e.阴性对照无DNA酶水6份。
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