CN101168769B - 基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法。dU或dI寡核苷酸探针序列特征是：全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待检SNP位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI，dU或dI距离待检SNP位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待检SNP位点两侧核苷酸完全配对。反应组份包括dU或dI寡核苷酸探针，待测单链DNA，热稳定性mutS蛋白，报告DNA模板分子、报告DNA特异性的引物，dNTPs，pfu DNA聚合酶及其反应缓冲液。dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交后，若SNP位点处形成错配碱基，则PCR可扩增出报告DNA，若SNP位点处形成正确配对碱基，则不能扩增出报告DNA。根据报告DNA扩增结果，可推定待测SNP位点碱基种类。

Description

基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法

技术领域

本发明涉及一种新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测方法，尤其涉及一种基于dU或dI寡核苷酸探针的SNP检测方法，可以用于基因多态性分析和物种分型等，属于生物检测技术领域。

背景技术

SNP作为一种在基因组水平上由单个核苷酸的变异而导致的DNA序列多态性，在遗传病致病基因关联分析、连锁不平衡分析、药物基因组学、患者个性化治疗、法医鉴定、农作物遗传育种等领域有着重要应用。鉴于SNP在现代生命科学中的重要地位，开发了多种SNP测定方法。但是现有SNP测定方法或检测成本高[BMC Genomics，2006，7：291-291]，或操作繁琐，结果不准确，重现性差[Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，1994，91：2674-2678.]，或需要昂贵设备[Nucleic Acids Res.，2005，33：e38.]。现在看来，还没有一种SNP检测技术能够达到结果准确、操作简便、成本低廉、检测通量高的标准。

MutS蛋白特异性结合含有错配碱基的双链DNA，是一种极具潜力的SNP检测工具蛋白。其中来源于嗜热微生物Thermus thermophilus的错配修复蛋白TthMutS，能在高达60℃的温度下有效识别所有8种类型的碱基错配和1到3个碱基缺失/插入引起的错配。

pfu DNA聚合酶广泛应用于聚合酶链式反应(PCR)，用于扩增目标核酸。然而基于pfu DNA聚合酶的SNP检测技术报导很少。这主要是因为pfu DNA聚合酶具有3’外切酶活性，因此引物的3’末端碱基与模板DNA待测SNP位点的碱基不论配对与否，pfu DNA聚合酶均能延伸引物合成全长DNA片段。因此pfu DNA聚合酶不适合于3’末端引物延伸法检测SNP。最近研究表明pfu DNA聚合酶特异性紧密结合DNA中的脱氧尿嘧啶dU核苷酸与dI核苷酸，并停滞在dU或dI处，造成DNA合成反应不能顺利进行。

发明内容

本发明的目的在于针对现有SNP检测技术的不足，提供一种新的SNP检测方法。该SNP检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。

为实现这样的目的，在本发明中，用于测定SNP的dU或dI寡核苷酸探针具有如下特征：全长30-40个核苷酸，其中5’端第15-25位的一个核苷酸为待检SNP位点，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检SNP位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对。SNP测定体系含有dU或dI寡核苷酸探针、待测单链DNA、报告DNA模板分子、报告DNA的正向引物与反向引物、热稳定性mutS蛋白(例如Thermus thermophilus的热稳定性MutS蛋白)和pfu DNA聚合酶等组分。若dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交形成的DNA双链含有错配碱基，则pfu DNA聚合酶不能结合错配碱基附近的dU或dI核苷酸，使得pfuDNA聚合酶能够催化报告DNA的PCR；若dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交形成的DNA双链不含有错配碱基，则热稳定性mutS蛋白不结合在该双链DNA上，而pfu DNA聚合酶可以牢牢结合寡核苷酸探针的dU或dI核苷酸，使得pfu DNA聚合酶不能够去催化报告DNA的PCR。

本发明的具体步骤如下：

1)设计合成测定单核苷酸多态性的dU或dI寡核苷酸探针，dU或dI寡核苷酸探针的序列特征是：探针全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待测单链DNA的待检单核苷酸多态性位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检单核苷酸多态性位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；

2)设计合成用于扩增报告DNA的特异性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整条引物与报告DNA模板分子中报告DNA两端的碱基序列配对；

3)采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，聚合酶链式反应体系组成：热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测单链DNA模板分子、待测单链DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶，其中待测单链DNA特异性引物中的一条采用5’端生物素标记；扩增双链DNA后，将双链DNA变性，与采用链亲和素包被的磁珠温育，在变性条件下洗涤磁珠，再用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的待测单链DNA；

4)在pfu DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应缓冲液中，加入待测单链DNA、dU或dI寡核苷酸探针、热稳定性mutS蛋白、报告DNA特异性的正向引物与反向引物、报告DNA模板分子、dNTPs和pfu DNA聚合酶，配制单核苷酸多态性测定反应混合物；

5)将单核苷酸多态性测定反应混合物进行聚合酶链式反应，扩增报告DNA，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性；

6)将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，水平电泳检测报告DNA扩增结果；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点处正确配对，则扩增不出报告DNA；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点为错配碱基，则可以扩增出报告DNA；根据报告DNA扩增结果，推定待测单链DNA待测位点单核苷酸多态性。

本发明与现有SNP测定技术相比有显著的进步。主要优点如下：(1)操作简便、结果稳定，只需要进行简单可靠的PCR反应；(2)操作通量大，每次可以做96/384个反应；(3)不需要大型昂贵设备，整个操作过程中仅需要热循环仪与水平凝胶电泳仪装置。本发明可用于测定各种SNP，包括微生物、植物、动物、人的SNP。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

在本发明中，利用3’端第5位为dU或dI核苷酸的寡核苷酸探针、待测单链DNA、报告DNA模板分子、报告DNA特异性的正向引物与反向引物、pfu DNA聚合酶、热稳定性mutS蛋白，测定待测单链DNA特定位点的SNP。

实施例  衣原体内切核酸酶IV基因第21位核苷酸种类的测定

本实施例中，待测SNP位点为衣原体内切核酸酶IV基因第21位核苷酸种类，热稳定性mutS蛋白为TthmutS，报告DNA为氨苄青霉素抗性基因，报告DNA模板分子为pUC18质粒，检测探针为dU或dI寡核苷酸探针，此实施例为dU寡核苷酸探针。具体实施步骤如下：

第一步，设计合成用于测定衣原体内切核酸酶IV基因第21位核苷酸种类的dU寡核苷酸探针。4条寡核苷酸探针分别为CpendoIV-21-T、CpendoIV-21-A、CpendoIV-21-C、CpendoIV-21-G。4条dU寡核苷酸探针碱基序列如下：

CpendoIV-21-T：5’agtaagggaa tggatggagg aggaagtact xtcat

CpendoIV-21-A：5’agtaagggaa tggaaggagg aggaagtact xtcat

CpendoIV-21-C：5’agtaagggaa tggacggagg aggaagtact xtcat

CpendoIV-21-G：5’agtaagggaa tggagggagg aggaagtact xtcat

其中，探针全长35个核苷酸，符号x表示dU核苷酸，5’端第15位的斜黑体碱基与衣原体内切核酸酶IV基因的单链DNA的待测SNP位点配对，整条寡核苷酸探针与衣原体内切核酸酶IV基因5’端的35个碱基互补配对。寡核苷酸探针可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第二步，设计合成用于扩增报告DNA的特异性引物。正向、反向引物分别为pUC18-amp-F、pUC18-amp-R。引物碱基序列如下：

pUC18-amp-F：5’atgagtattc aacatttccg t

pUC18-amp-R：5’cgtcaatacg ggataatacc

引物分别与报告DNA模板分子pUC18质粒的氨苄青霉素抗性基因5’端的一段250bp的DNA序列的两端互补配对，报告DNA长250bp。引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第三步，衣原体内切核酸酶IV基因单链DNA的制备。首先采用Taq DNA聚合酶催化的PCR制备双链形式的衣原体内切核酸酶IV基因，然后用链亲和素包被的磁珠制备单链DNA。衣原体内切核酸酶IV基因的PCR反应混合物组成(50微升)：正向引物(CpendoIV-F：5’^Batgaaagtac ttcctcctcc，引物采用5’端生物素标记，用于回收单链DNA)与反向引物(CpendoIV-R：5’gtttctttga gcgctgctttg)，0.5μM；DNA模板分子，50纳克衣原体基因组DNA；dNTPs，200μM；Taq DNA聚合酶，2.5单位；10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液，5微升；补加去离子水至总体积为50微升。PCR反应条件：95℃×5分钟；(95℃×30秒，50℃×30秒，72℃×15秒)×30循环；72℃×2分钟。扩增DNA片段长度为200bp，SNP检测位点为生物素标记引物(长20nt)延伸的第一个核苷酸，即衣原体内切核酸酶IV基因5’端的第21个核苷酸。将扩增的双链DNA变性，然后与磁珠温育，并在变性条件下洗涤磁珠，最后用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的衣原体内切核酸酶IV基因单链DNA。

第四步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)：dU寡核苷酸探针(CpendoIV-21-T或CpendoIV-21-A或CpendoIV-21-C或CpendoIV-21-G，共四个反应管，每个反应管只加入一种探针)，0.1μM；衣原体内切核酸酶IV基因单链DNA，100纳克；TthmutS蛋白，5微克；报告DNA特异性的正向引物与反向引物(pUC18-amp-F和pUC18-amp-R)，0.3μM；报告DNA模板分子，1纳克pUC18质粒；dNTPs，200μM；pfu DNA聚合酶，0.25单位；10×pfu DNA聚合酶反应缓冲液，1.0微升；补加去离子水至总体积为10微升。

第五步，PCR检测衣原体内切核酸酶IV基因21位SNP。衣原体内切核酸酶IV21位SNP测定反应混合物在下列条件下进行PCR，扩增报告DNA。PCR条件：95℃×5分钟；(95℃×30秒，50℃×30秒，72℃×30秒)×30循环；72℃×3分钟。

第六步，报告DNA的PCR扩增结果检测。将PCR后的SNP测定混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，凝胶中添加了终浓度为0.5微克/毫升的溴化乙啶，水平电泳检测报告DNA扩增结果；利用水平电泳仪，在200V电压下电泳10-20分钟，在紫外光下或凝胶成像系统中观测报告DNA的扩增结果。加入寡核苷酸探针CpendoIV-21A、CpendoIV-21T、CpendoIV-21C的3个反应管可以扩增出250bp的报告DNA；加入寡核苷酸探针CpendoIV-21G的反应管无任何长度的DNA扩增片断，包括250bp的报告DNA。根据报告DNA的这一扩增结果，推定衣原体内切核酸酶IV第21位的单核苷酸为C。

基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法原理：dU或dI寡核苷酸探针的序列特征是：全长30-40个核苷酸，其中5’端第15-25位的一个核苷酸与待检SNP位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检SNP位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对(SNP位点除外)。dU或dI寡核苷酸与待测DNA杂交后，若SNP位点处形成错配碱基，则mutS结合在错配碱基上，而pfu DNA聚合酶游离出来，可以扩增出报告DNA；若SNP位点处形成正确配对碱基，则mutS不能结合在正确配对碱基上，而pfu DNA聚合酶结合在dU或dI寡核苷酸探针上，不能扩增出报告DNA。根据与待测SNP位点配对的dU或dI寡核苷酸探针上的碱基种类及报告DNA扩增结果，可以推定待测SNP位点碱基种类。

Claims (1)

1.一种基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计合成测定单核苷酸多态性的dU或dI寡核苷酸探针，dU或dI寡核苷酸探针的序列特征是：探针全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待测单链DNA的待检单核苷酸多态性位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检单核苷酸多态性位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；

2)设计合成用于扩增报告DNA的特异性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整条引物与报告DNA模板分子中报告DNA两端的碱基序列配对；

3)采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，聚合酶链式反应体系组成：热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测单链DNA模板分子、待测单链DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶，其中待测单链DNA特异性引物中的一条采用5’端生物素标记；扩增双链DNA后，将双链DNA变性，与采用链亲和素包被的磁珠温育，在变性条件下洗涤磁珠，再用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的待测单链DNA；

4)在pfu DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应缓冲液中，加入待测单链DNA、dU或dI寡核苷酸探针、热稳定性mutS蛋白、报告DNA特异性的正向引物与反向引物、报告DNA模板分子、dNTPs和pfu DNA聚合酶，配制单核苷酸多态性测定反应混合物；

5)将单核苷酸多态性测定反应混合物进行聚合酶链式反应，扩增报告DNA，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性；

6)将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，水平电泳检测报告DNA扩增结果；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点处正确配对，则扩增不出报告DNA；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点为错配碱基，则扩增出报告DNA；根据报告DNA扩增结果，推定待测单链DNA待测位点单核苷酸多态性。